KR101739330B1 - 진피 모사체를 이용한 피부 탄력 증진력 평가법 - Google Patents

진피 모사체를 이용한 피부 탄력 증진력 평가법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실제 진피와 유사한 구조를 가지는 진피 모사체를 제작하여 진피 모사체의 변형 정도 차이를 3차원으로 시각화하여 나타냄으로써 피부 탄력 증진 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다.

Description

진피 모사체를 이용한 피부 탄력 증진력 평가법{Method for evaluating improving ability of skin elasticity using corium mimic}
본 발명은 실제 진피와 유사한 3차원의 진피 모사체를 제작하여 진피 모사체의 변형 정도 차이를 측정함으로써 피부 탄력 증진 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다.
피부 진피(dermis)의 콜라겐(collagen)은 교원 섬유, 엘라스틴(elastin)은 탄력섬유라고 부르는 단백질로 진피를 구성하는 결합조직의 주성분으로서 피부의 인장강도를 결정하는 중요한 구성 성분이다. 건강한 피부 속의 콜라겐과 섬유아세포는 상호 작용을 통해 우수한 수축력을 발휘하여 피부의 탱탱함과 탄력을 유지해 준다. 그러나 나이가 들어가면서 섬유아세포가 건강하지 못하거나 콜라겐의 질이 떨어지거나, 둘 사이의 부착 포인트가 단단하지 못할 경우에는 피부를 잡아주는 힘이 느슨해져 피부의 신축성이 떨어지고 탄력을 잃어 주름살의 원인이 된다.
피부 탄력에 있어서 핵심 요소가 진피 콜라겐과 섬유아세포간의 상호작용 및 결합력이므로, 기존에는 콜라겐 겔 수축 분석법(collagen gel contraction assay, Experimental Dermatology, 17, 788-789)을 이용하여 콜라겐과 섬유아세포들의 상호작용을 측정하였다. 구체적으로 섬유아세포와 콜라겐을 혼합하여 겔을 만들고, 일반배양접시에서 배양한 다음, 각 겔의 수축 정도를 비교해서 물질처리에 의한 콜라겐과 섬유아세포들의 상호작용의 변화를 관찰하고, 디지털 이미지(사진)를 이용하여 각 겔들의 표면적을 계산함으로써 피부 탄력도를 평가하였다.
그러나, 이와 같은 방법은 2차원적인 결과를 나타내는 것이므로, 실제 피부에서 일어날 수 있는 변화를 3차원적으로 나타내어 보다 시각적으로 보여줄 수 없다는 단점이 있다.
본 발명자들은 배양 삽입체(culture insert)를 이용하여 3차원적 형태로 구축한 진피 모사체를 제조하고, 물질처리 후 상기 진피 모사체의 구조 붕괴 정도를 관찰함으로써 실제 피부에서 나타낼 수 있는 변화를 예측할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 피부의 탄력 증진 효과를 3차원적으로 평가할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 콜라겐과 당을 반응시킨 당화 콜라겐 대조군; 및 콜라겐, 당 및 피부 탄력 증진력을 평가하고자 하는 후보물질을 반응시킨 당화 콜라겐 실험군을 제조하고, 대조군 및 실험군 각각에 섬유아세포를 혼합하여 겔을 만드는 단계; b) 배양 삽입체를 이용하여 3차원적 형태를 구축하는 단계, c) 상기 b) 단계의 배양 삽입체 내부에 a) 단계에서 만든 대조군 및 실험군의 겔을 각각 넣고 배양하여 진피 모사체를 제조하는 단계; d) 제조한 모사체의 형태를 3차원으로 이미지화하는 단계; 및 e) 상기 d) 단계의 이미지화 결과로부터 탄력 변화를 평가하는 단계;를 포함하는 진피 모사체를 이용한 피부 탄력 증진력 평가법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기한 피부 탄력 증진력 평가법을 이용한 피부 탄력을 증진시키는 화장료의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 진피 모사체를 이용하여 물질처리에 따른 진피 모사체의 붕괴 정도를 3차원 이미지로 평가함으로써 물질처리에 의한 섬유아세포와 콜라겐 섬유간의 결합력 및 상호작용 변화를 관찰하는 것 뿐만 아니라 상기 변화들이 실제 피부에서 일으킬 수 변화를 예측할 수 있어 탄력저하, 처짐 등의 현상을 시각적으로 나타낼 수 있으며, 또한 본 발명의 평가법으로 피부 탄력을 증진시킬 수 있는 제품을 용이하게 스크리닝할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 진피 모사체의 단면도를 HE 염색 사진을 통해 나타낸 것이다.
도 2는 기존 콜라겐 겔 수축 분석법 및 본 발명에 따른 진피 모사체를 이용한 평가법을 이용할 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 진피 모사체를 이용하여 피부 탄력 증진 효능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 진피 모사체 이용하여 피부의 탄력 변화를 3차원으로 나타냄으로써 화장품이 제공하는 피부 탄력 증진력을 시각적으로 표현할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 진피 모사체를 이용하여 피부 탄력 증진력을 평가하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 콜라겐과 당을 반응시킨 당화 콜라겐 대조군; 및 콜라겐, 당 및 피부 탄력 증진력을 평가하고자 하는 후보 물질을 반응시킨 당화 콜라겐 실험군을 제조하고, 대조군 및 실험군 각각에 섬유아세포를 혼합하여 겔을 만드는 단계; b) 배양 삽입체를 이용하여 3차원적 형태를 구축하는 단계, c) 상기 b) 단계의 배양 삽입체 내부에 a) 단계에서 만든 대조군 및 실험군의 겔을 각각 넣고 배양하여 진피 모사체를 제조하는 단계; d) 제조한 모사체의 형태를 3차원으로 이미지화하는 단계; 및 e) 상기 d) 단계의 이미지화 결과로부터 탄력 변화를 평가하는 단계.
종래의 평가방법인 콜라겐 겔 수축 분석법은 섬유아세포와 콜라겐을 혼합해서 겔을 만든 후 일반 배양 접시에서 배양하여 콜라겐 겔을 제조하고, 제조기간 동안 콜라겐 겔은 배지 속에 떠 있는 상태이다. 반면, 본 발명에 따른 평가법을 배양 삽입체(culture insert)를 이용하여 3차원적인 형태를 구축하고, 콜라겐 겔을 일반 배양 접시가 아닌 배양 삽입체 내부체 부착시켜 배양시킨다는 점에서 차이가 있다. 이 때 배양과정 중 섬유아세포에 의한 진피 개조 과정(dermal remodeling)이 일어난다. 진피 개조 과정은 섬유아세포가 콜라겐 섬유와 결합하고 콜라겐 섬유들의 배열을 조절함으로써 진피 모사체를 구조적으로 안정화시키는 과정이다.
상기와 같이 제조된 진피 모사체의 단면도를 도 1에 나타내었다. 도 1의 사진은 HE(hematoxylin-eosin) 염색한 것이며, 이를 보면 본 발명의 진피 모사체는 섬유아세포에 의한 진피 개조 과정을 통해 실제 진피층과 같이 콜라겐 매트릭스에서 섬유아세포들이 네트워크를 형성하고 있어, 본 발명의 진피 모사체가 실제 진피와 구조적으로 매우 유사함을 확인할 수 있다.
본 발명에서는 진피 모사체의 제조를 위하여 콜라겐과 당을 반응시켜 콜라겐 당화(glycation)가 유도된 것으로 콜라겐 겔을 만든다. 피부 노화로 콜라겐 당화가 일어나고, 이는 콜라겐과 섬유아세포의 결합을 저하시켜 피부 탄력이 저하되고 피부 처짐 현상이 일어나게 된다. 따라서 본 발명에서는 탄력이 떨어지는 진피 모사체를 제조하기 위하여 실제 피부에서 일어나는 콜라겐 당화를 유도하였다. 당화된 콜라겐의 경우에는 진피 개조 과정이 콜라겐 섬유에 붙어 있는 당 때문에 원활하게 이루어지지 않아서 당화된 콜라겐으로 제작된 진피 모사체는 구조적으로 불안정하게 된다. 이 때 콜라겐 당화를 유도하기 위하여 사용되는 당의 종류로는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 리보오스를 사용한다.
또한, 본 발명에서는 피부 탄력 증진 효능을 평가하고자 하는 후보 물질을 당과 함께 동시에 첨가하고 콜라겐과 반응시킴으로써 후보 물질의 콜라겐 당화 억제능을 평가함으로써, 이를 통해 후보 물질의 피부 탄력 증진 효능을 평가한다. 이 때, 기존의 콜라겐 겔 수축 분석법은 콜라겐 겔의 2차원적인 결과를 제공하여 콜라겐 겔의 수축 정도를 겔의 표면적 변화로 판단하였다. 그러나, 본 발명의 진피 모사체를 이용한 평가법은 3차원적인 결과를 제공하여 진피 모사체의 구조 붕괴 정도를 진피 모사체의 부피 변화로 판단할 수 있다.
본 발명에 따른 진피 모사체를 이용한 피부 탄력 증진력 평가법을 이용함으로써 피부 탄력 증진에 효과가 있을 것으로 추측되는 후보 물질을 처리하여 이들이 탄력 증진에 미치는 효능을 시각적으로 나타내어 평가할 수 있으므로, 피부 탄력 증진력을 가지는 물질들을 용이하게 스크리닝할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다.
[참고예 1] 진피 모사체의 제조방법
본 발명에서 사용하는 진피 모사체는 하기의 방법으로 제조할 수 있다.
1. 에피튜브(Epi tube)에 40μl의 10X P 버퍼(DMEM(Dulbeccos's Modified Eagle Medium(DMEM 분말, Gibco, USA)) 3개, Ham's F-12 영양분 혼합물(F-12 분말, Gibco, USA) 1개, 항생제-항진균제(PSF, Gibco, USA) 4ml를 멸균한 증류수 400ml에 넣고 녹인 것}, 40μl의 재구성 버퍼(Reconstitution buffer)(0.05M NaOH 100ml에 2.2g의 NaHCO3와 4.77g의 HEPES를 녹인 후 여과한 것), 2μl의 5M NaOH를 넣고 잘 섞는다.
2. 상기 1.에 정상 콜라겐 수용액 또는 당화된 콜라겐 수용액 320μl를 넣고 파이펫을 이용하여 잘 섞는다.
3. 상기 2.에 104개의 섬유아세포(human neonatal Fibroblast, HDFn, Cascade biologics, USA)를 넣고 파이펫으로 잘 혼합하여 섬유아세포가 용액 중에 균일하게 분포하도록 한다.
4. 12웰 세포배양 접시의 내부에 배양 삽입체(culture insert, 12mm Transwell®, Corning, USA)를 장착하고, 상기 3.의 혼합액을 배양 삽입체 내부에 넣어준 후, 37℃에서 30분간 반응시켜 콜라겐 수용액을 굳힌다.
5. 콜라겐이 완전히 굳으면 배양 삽입체의 내부와 외부에 모두 섬유아세포 배양배지(M106, Cascade Biologics, USA)를 넣어주고 하루 밤 동안 배양한다. 이후 3일에 한번씩 배지를 교환하면서 약 일주일간 진피 모사체를 배양한다. 이 과정에서 섬유아세포와 콜라젠 섬유간의 상호작용으로 진피 개조 과정이 일어난다.
[실시예1] 콜라겐 겔 수축 분석법과 진피 모사체를 이용한 평가법의 비교
콜라겐과 리보오스를 반응시켜 콜라겐 당화(glycation)를 유도한 후, 콜라겐 겔과 진피 모사체를 각각 만들어서 콜라겐 당화가 피부에 주는 영향을 평가하였다.
구체적으로 진피 유사체는 상기 참고예 1의 방법으로 제조한 것이며, 이 때 참고예 1의 제조방법에서의 단계 2.에서 사용한 당화된 콜라겐 용액은 콜라겐에 리보오스를 0, 62.5, 125 및 250mM의 농도로 처리하여 콜라겐 당화를 유도한 것이다. 또한, 리보오스로는 D-(-)-리보오스(Sigma, USA)를 물에 녹인 후 0.2μm 필터(Minisart®, sartorious stedim biotech, Germany)로 정제하여 사용하였다.
또한, 구체적인 콜라겐의 당화 방법은 다음과 같다. 콜라겐의 오염방지를 위해서 클린 벤치내에서 콜라겐 수용액(타입 I 콜라겐(Sigma, USA)을 0.1% 아세트산에 녹여서 최종 농도를 3mg/ml로 만든 것)에 특정농도(62.5, 125 및 250mM)로 D-(-)-리보오스를 첨가하고, 360도 회전이 가능한 혼합기(rotation mixer)에 장착한 다음 상온에서 3일간 반응시킴으로써 콜라겐의 당화를 유도하였다.
상기와 같은 방법으로 진피 모사체의 배양이 끝나면, 외과용 메스를 이용하여 진피 모사체를 배양 삽입체에서 분리하고 세포배양접시 위에 얹은 후, 시간의 흐름에 따른 진피 모사체의 부피 변화를 관찰하였다. 일반적으로 진피 모사체는 배양 삽입체에서 분리하고 약 10분 정도 후에 관찰하였으며 DSLR 카메라(Canon Kiss Digital N, Canon Inc., Japan)를 이용하여 3차원 이미지를 얻고 이미지 상의 각 진피 모사체의 높이 차이에 중점을 두고 이미지를 분석하였다.
구조적으로 안정한 진피 모사체는 부피 변화가 크지 않지만, 불안정한 진피 모사체의 경우는 배양 삽입체에서 분리되면 시간이 흐름에 따라 무너지는 현상이 발생하여 이미지상에서 높이가 낮아지게 되어 점차 부피가 감소하게 된다. 따라서 이미지상의 진피 모사체의 높이는 진피 모사체의 구조적 안정성과 비례하게 된다.
또한 비교를 위하여 이와 함께 상기와 같은 농도의 리보오스를 처리하여 얻은 당화된 콜라겐에 섬유아세포를 혼합한 콜라겐 겔을 일반배양접시에서 배양하고 이에 대한 디지털 이미지 사진을 얻어 2차원적 방법인 콜라겐 겔 수축 분석법을 실시하였다.
상기 두 가지 방법으로 얻은 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2의 1)은 콜라겐 겔이 정상적으로 수축하지 못하는 2차원적인 결과를 보여준다. 이는 리보오스 처리에 의하여 콜라겐 겔들이 수축하지 못하여 마치 옆으로 퍼진듯하게 보인다.
또한 도 2의 2)는 콜라겐 당화에 의하여 약해진 진피 모사체가 정상적인 형태를 유지하지 못하고 변형(무너짐)되는 결과를 보여준다. 이 방법은 3차원적인 구조변화를 보여줌으로써 콜라겐 당화로 진피가 탄력을 잃고 변형되어 처짐이 일어나게 됨을 시각적으로 잘 보여준다.
이와 같이 도 2를 보면, 기존의 콜라겐 겔 수축 분석법은 결과를 2차원적으로 제시하지만, 본원발명의 방법은 결과를 3차원적으로 시각화하여 제시할 수 있으므로 실제 피부에서 일어날 수 있는 변화들을 보다 효과적으로 나타낼 수 있다.
[실시예 2] 진피 모사체를 이용한 피부 탄력 증진 효능 평가
피부 탄력 증진에 효과가 있는 물질을 스크리닝하기 위하여 본 발명에 따른 상기 참고예 1의 진피 모사체를 이용하였다.
구체적으로, 본 실험에서는 콜라겐 당화를 유도하지 않은 콜라겐(정상 콜라겐); 62.5mM의 리보오스를 처리하여 콜라겐 당화를 유도한 콜라겐; 62.5mM의 리보오스와 10ppm 토코페롤을 함께 처리하여 콜라겐 당화를 유도한 콜라겐; 및 62.5mM의 리보오스와 1ppm DPHP를 함께 처리하여 콜라겐 당화를 유도한 콜라겐을 준비하였다. 이 때 리보오스는 D-(-)-리보오스(Sigma, USA)를 물에 녹인 후 0.2μm 필터(Minisart®, sartorious stedim biotech, Germany)로 정제하여 사용하였다.
또한, 구체적인 콜라겐의 당화 방법은 다음과 같다. 콜라겐의 오염방지를 위해서 클린 벤치내에서 콜라겐 수용액(타입 I 콜라겐(Sigma, USA)을 0.1% 아세트산에 녹여서 최종 농도를 3mg/ml로 만든 것)에 62.5mM의 농도로 D-(-)-리보오스와 경우에 따라 10ppm 토코페롤 또는 1ppm DPHP를 첨가하고, 360도 회전이 가능한 혼합기(rotation mixer)에 장착한 다음 상온에서 3일간 반응시킴으로써 콜라겐의 당화를 유도하였다.
상기와 같은 방법으로 준비한 콜라겐에 섬유아세포를 혼합한 다음, 이를 3차원적 형태로 구축한 배양 삽입체(12mm Transwell®, Corning, USA) 내부에 부착하여 배양함으로써 진피 모사체를 제조하였다.
진피 모사체의 배양이 끝나면, 외과용 메스를 이용하여 진피 모사체를 배양 삽입체에서 분리하고 세포배양접시 위에 얹은 후, 배양 삽입체에서 분리하고 약 10분 정도 후에 관찰하였으며 DSLR 카메라(Canon Kiss Digital N, Canon Inc., Japan)를 이용하여 3차원 이미지를 얻고 이미지 상의 각 진피 모사체의 높이 차이에 중점을 두고 이미지를 분석하였다. 각각의 진피 모사체에 대한 3차원 이미지는 도 3에 나타내었다.
도 3을 보면 진피 모사체가 리보오스의 처리에 의하여 형태가 무너짐을 확인할 수 있다. 그러나 공지된 항노화물질인 토코페롤 또는 DPHP를 함께 처리한 경우에는 진피 모사체의 무너짐이 억제됨을 확인할 수 있다.
이와 같이 본 발명에 의한 방법을 사용할 시 후보물질들이 피부노화에 의한 콜라겐 당화를 억제하여 피부 탄력을 증가시킬 수 있음을 시각적으로 용이하게 평가할 수 있으며, 본 발명을 이용하여 피부 탄력 증가에 도움이 되는 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

Claims (2)

  1. a) (i) 피부 탄력 증진력을 평가하고자 하는 후보물질을 콜라겐과 당을 반응시킨 당화 콜라겐 대조군; 및 (ii) 콜라겐, 당 및 피부 탄력 증진력을 평가하고자 하는 후보물질을 반응시킨 당화 콜라겐 실험군을 제조하고, 상기 (i)의 대조군 및 (ii)의 실험군 각각에 섬유아세포를 혼합하여 콜라겐 수용액을 만드는 단계;
    b) 상기 (i)의 대조군 및 (ii)의 실험군 각각의 콜라겐 수용액을 배양 삽입체의 내부에 넣고 겔로 굳혀 3차원적 형태를 구축하는 단계,
    c) 상기 b) 단계의 배양 삽입체 내부에서 (i)의 대조군 및 (ii)의 실험군의 겔을 배양하여 진피 모사체를 제조하는 단계;
    d) 제조한 진피 모사체를 배양 삽입체에서 분리한 후, 3차원 이미지 촬영 장치를 이용해 상기 진피 모사체 형태의 3차원 이미지를 취득하는 단계; 및
    e) 상기 d) 단계의 이미지화 결과로부터, 진피 모사체의 높이, 부피, 또는 높이 및 부피의 변화를 측정하는 단계;
    를 포함하는 진피 모사체를 이용한 피부 탄력 증진력 평가법.
  2. 제1항의 피부 탄력 증진력 평가법을 이용한 피부 탄력을 증진시키는 화장료의 스크리닝 방법.
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