CN109475666B - 具有有区别的、并列的真皮隔室的皮肤等同物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种真皮等同物，其纵向上包括至少两个有区别的、并列的不同组成的真皮隔室，以及包含该真皮等同物的皮肤等同物。

Description

具有有区别的、并列的真皮隔室的皮肤等同物
技术领域
本发明涉及具有表面异质性的新的皮肤等同物。
背景技术
多年来，已经尝试开发尽可能接近地类似于人或动物皮肤的重建皮肤模型，以避免对动物进行实验性试验。
因此，可以在引起真皮组织形成的条件下通过混合胶原蛋白和成纤维细胞来复制真皮等同物。然后，该步骤之后可以通过使得角质形成细胞在该基质上生长以产生表皮而进行皮肤重建。
然而，这些传统的重建皮肤是同质的并且还不够与人类皮肤相似，人类皮肤是复杂和异质的。
因此强烈需要能够再现皮肤的异质性的性质的新的重建皮肤。
发明内容
本发明满足了这种需要。
实际上，本发明人已经开发出包括有区别的、纵向上并列的真皮隔室的真皮等同物，因此不是在深度方向上，而是在长度方向上能够解决皮肤异质性的问题。
他们确实证明，由于真皮和表皮之间存在的大量相互作用，真皮的质量影响表皮的质量并因此影响表皮和皮肤表面的外观，通过专注于有区别的真皮隔室，能够获得表现出表面异质性的皮肤等同物。
因此，他们证明细分成纵向上有区别的隔室的真皮，能够解决表皮分化和角质化方面的局部表皮差异、能够产生表面效应，从而使得能够研究皮肤异质性相关问题。
发明人证明，可以制备表现出纵向上有区别的真皮隔室的真皮，通过存在的真皮亚群(乳头状成纤维细胞和网状成纤维细胞，或任何其他成纤维细胞群)，或者通过所使用的胶原蛋白的特征(糖基化或未糖基化，或经过任何其他氧化修饰)来区别。
因此，本发明涉及纵向上包括至少两个有区别的、并列的具有不同组成的真皮隔室的真皮等同物。
本发明还涉及包括根据本发明的真皮等同物的皮肤等同物，所述皮肤等同物表现出表面异质性。
根据本发明的皮肤等同物的实例，图1示出了包括纵向上三个有区别的、并列的具有不同组成的真皮隔室的真皮等同物。
本发明的另一个目的涉及制备根据本发明的真皮等同物的方法，包括由制备至少两个有区别的、纵向上并列的不同组成的格子组成的步骤，所述至少两个格子中的一个在模具内部制备，而另一个是在模具的外围制备。
本发明的另一个目的涉及根据本发明的制备皮肤等同物的方法，包括通过本发明的真皮等同物的制备的方法制备真皮等同物的步骤。
本发明还涉及根据本发明的真皮等同物在制备表现出表面异质性的皮肤等同物中的用途。
本发明的另一个目的涉及根据本发明的真皮等同物或根据本发明的皮肤等同物，在研究皮肤异质性或皮肤异质性相关病症(诸如皮肤老化和/或炎症和/或色素沉着)中的用途，优选在体外的用途。
本发明的另一个目的涉及筛选在局部施用到皮肤上后具有活性的化合物的方法，特别是在表现出异质性的皮肤上，特别是在抗衰老领域(诸如用于治疗皱纹和纹路)和/或在炎症领域和/或色素沉着领域(诸如用于治疗色素沉着斑)，所述筛选方法包括将候选化合物施用到根据本发明的真皮等同物上，或施用到根据本发明的皮肤等同物上。
对本发明的详述
真皮等同物和制备方法
“真皮隔室”在本文中是指包含成纤维细胞和胶原蛋白的真皮等同物区域。
因此，根据本发明的真皮等同物包括纵向上至少两个有区别的、并列的真皮隔室，特别是包含成纤维细胞和胶原蛋白，但具有不同的组成的真皮隔室。
根据本发明的真皮等同物纵向上包括至少两个，优选至少3个有区别的、并列的不同组成的真皮隔室。
“并列的真皮隔室”在本文中是指真皮隔室通过其侧面中的一个彼此接触。
“不同组成的不同隔室”在本文中是指真皮等同物的真皮隔室可以通过它们的组成彼此区分，特别是通过包含在隔室中的细胞的性质，特别是成纤维细胞的性质，和/或通过包含在隔室中的胶原蛋白的性质，和/或通过施加到隔室的一个成分上的处理来彼此区分。
存在于根据本发明的真皮等同物的真皮隔室中的胶原蛋白可以是任何类型和任何来源的。优选地，胶原蛋白选自I、III或V型纤维状胶原蛋白。优选地，胶原蛋白是I型。优选地，胶原蛋白是动物来源的，特别是牛来源的。特别优选地，胶原蛋白是牛I型胶原蛋白。或者，胶原蛋白可以是任何比例和/或各种来源的不同类型胶原蛋白的混合物。
在一个特定实施方案中，真皮隔室中的一个包含经历氧化修饰的胶原蛋白，而真皮隔室中的另一个包含未经历氧化修饰的胶原蛋白，或经历了与第一隔室中的胶原蛋白不同的另一种氧化修饰的胶原蛋白。
氧化修饰的一些实例包括糖基化、羰基化和氨甲酰化。
在一个特定实施方案中，真皮隔室中的一个包含糖基化胶原蛋白，真皮隔室中的另一个包含非糖基化胶原蛋白。
“糖基化胶原蛋白”在本文中是指已经经历糖基化的胶原蛋白，即根据美拉德反应与糖(特别是葡萄糖或核糖)反应形成席夫碱的胶原蛋白，其在所谓的阿马多里分子重排后通过一系列反应，能引起分子内桥形成(诸如戊糖苷桥)。
用于监测糖基化产物形成的各种方法是本领域技术人员熟知的，诸如在Cefaluet al.(1995)J.Gerontol A Biol Sci Med Sci 50A：B337-B341中、在Sell et al.(1991)Diabetes Metab.Rev.7：239-251中、在Miyata et al.(1996)J.Am.Soc.Nephrol.7：1198-1206or in Ahmed et al.(1991)Anal.Biochem.192：109-111中描述的方法。因此测量与胶原蛋白结合的糖基化化合物的水平和/或反应后剩余的糖基化化合物的水平是可能。如前所述，胶原蛋白糖基化引起例如，糖基化产物或高级糖基化终产物(AGE)(诸如吡咯素、羧甲基-赖氨酸、戊糖苷，Nε(2-羧乙基)-赖氨酸(CEL)、乙二醛-赖氨酸二聚体(GOLD)、甲基乙二醛-赖氨酸二聚体(MOLD)、3DG-ARG咪唑酮或葡萄糖格(glucosepane))的形成。这些糖基化产物中的一些具有在激发时发射可测量荧光的特殊性。例如，当在328nm的波长(λex)处激发时，戊糖素在378nm的波长(λem)下发射荧光。类似地，当在370nm波长(λex)激发时，AGE在440nm波长(λem)下发射荧光。通常，在同样的实验条件下测量的包含至少糖基化胶原蛋白和成纤维细胞的真皮隔室中的给定糖基化产物发射的荧光与由包含至少非糖基化胶原蛋白和成纤维细胞的真皮隔室中的相同糖基化产物发射的荧光的比率，使得能够表征包含糖基化胶原蛋白的真皮隔室的糖基化水平。优选地，在本发明的上下文中，通过测量戊糖素和/或AGE荧光来确定包含糖基化胶原蛋白的真皮隔室的糖基化水平。糖基化胶原蛋白可以通过本领域技术人员熟知的任何技术获得，特别是在用于制备真皮隔室之前，通过将胶原蛋白与糖(特别是核糖或葡萄糖)预孵育获得。
存在于根据本发明的真皮等同物的真皮隔室中的成纤维细胞可以是任何来源的，但它们优选是人源的成纤维细胞。它们可以通过本领域技术人员熟知的任何方法制备，例如通过真皮细胞外基质大分子的机械和/或酶促解离制备，或通过从外植体生长成纤维细胞制备。
存在于根据本发明的真皮等同物的真皮隔室中的成纤维细胞尤其可以是乳头状成纤维细胞和/或网状成纤维细胞。
“乳头状成纤维细胞”在本文中是指来自乳头状真皮的成纤维细胞。
“网状成纤维细胞”在本文中是指来自网状真皮的成纤维细胞。
在本发明的一个特定实施方案中，真皮隔室中的一个包含乳头状成纤维细胞，真皮隔室中的另一个包含网状成纤维细胞。
根据本发明的真皮等同物的真皮隔室还可以包含可以构成型地存在于皮肤中的任何其他组分(诸如内皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、巨噬细胞前体、树突细胞前体或神经细胞)。
根据本发明的真皮等同物包括纵向上至少两个有区别的、并列的不同组成的真皮隔室。而且，它可以在组成上表现垂直的差异。特别地，它可包括不同组成的真皮隔室的不同层。
本发明还涉及制备如上定义的真皮等同物的方法，包括由制备至少两个有区别的、纵向上并列的不同组成的格子组成的步骤，所述至少两个格子中的一个在模具内制备，而另一个在模具的外围制备。
所述至少两个格子包含如上定义的胶原蛋白和成纤维细胞，但表现出不同的组成。
优选地，所述至少两个格子的制备步骤包括制备至少两种不同组成的有区别的溶液，一种用于模具内部，另一种用于模具外围。
用于制备格子的至少两种溶液包含胶原蛋白和成纤维细胞的细胞悬浮液，并表现出不同的组成。
在一个实施方案中，所述至少两种溶液中的一种包含如上定义的乳头状成纤维细胞的细胞悬浮液，并且所述至少两种溶液中的另一种包含如上定义的网状成纤维细胞的细胞悬浮液。
在另一个实施方案中，所述至少两种溶液中的一种包含如上定义的糖基化胶原蛋白，而所述至少两种溶液中的另一种包含如上定义的非糖基化胶原蛋白。
优选地，所述至少两种溶液进一步包含MEM 1.76X培养基、FCS、NaOH和MEM 25mMHepes 10％FCS培养基。
如前所述，使用的胶原蛋白可以是来自任何来源的任何类型的胶原蛋白，可以单独使用或混合使用。
该溶液可包含浓度为2mg/ml至6mg/ml，优选3mg/ml至5mg/ml的胶原蛋白。
当使用糖基化胶原蛋白时，可以通过本领域技术人员熟知的任何技术进行糖基化，诸如法国专利申请FR2792650中所述。
优选地，该溶液包含浓度为1×105至5×106个细胞/ml的成纤维细胞，优选浓度为2×105至2×106个细胞/ml。
在本发明的上下文中，在模具的两侧制备至少两个格子：在模具内制备至少两个格子中的一个，并在模具的外围或外部制备另一个格子。
在模具任一侧上制备的每个格子可以通过本领域技术人员熟知的任何技术制备。
特别地，可以将包含胶原蛋白和成纤维细胞的细胞悬浮液的如上定义的每种溶液沉积在包含模具的基质上。
优选地，将溶液以能够使胶原蛋白胶凝的方式孵育例如10至30分钟。
优选地，一旦获得格子胶凝就移除模具，并且优选将格子保持在孵育中以使它们能够收缩。优选地，格子因此在孵育中保持1至7天，甚至更优选保持3天。
在本发明的上下文中使用的模具可以是适于细胞培养的任何形状和任何材料。因此，在本发明的上下文中使用的模具可以是矩形或圆形。在本发明的上下文中使用的模具优选由聚四氟乙烯制成。
在真皮内容物影响表皮隔室分化的程度内，根据本发明的包括纵向上至少两个有区别的、并列的真皮隔室的真皮等同物，能够用作由不同的下层真皮隔室诱导形成呈现表面异质性的皮肤等同物的基质。
因此，本发明还涉及根据本发明的真皮等同物用于制备表现出表面异质性的皮肤等同物的用途。
皮肤等同物
本发明还涉及表现出表面异质性的皮肤等同物，包括如上面“真皮等同物和制备方法”部分中定义的真皮等同物。
“表面异质性”在本文中是指皮肤等同物的表面表现出的沿其长度变化的性质或特征，例如：色素沉着、表面表皮区域的分化、表面柔软性等方面的差异。
根据本发明的皮肤等同物包含在真皮等同物上包含至少角质形成细胞的表皮等同物。
角质形成细胞可以是任何来源，但优选是人源角质形成细胞。它们可以通过本领域技术人员熟知的任何方法制备。因此，角质形成细胞可以通过培养来自正常皮肤样品中解离的表皮，或通过培养来自毛囊的鞘的角质形成细胞来制备。
优选地，角质形成细胞是正常的人皮肤角质形成细胞。
甚至更优选地，根据Régnier et al.，Frontier of Matrix Biology，Vol.9，4-35(Karger，Basel，1981)中描述的方法，从正常皮肤样品中解离的人表皮制备角质形成细胞。
表皮等同物可包含任何其他细胞类型(诸如朗格汉斯细胞和/或朗格汉斯细胞前体和/或黑色素细胞)。
有利地，表皮等同物进一步包含黑色素细胞和/或朗格汉斯细胞和/或朗格汉斯细胞前体。
黑色素细胞可以从含有它们的任何器官(诸如正常皮肤或毛囊)中分离。优选地，从正常皮肤分离黑色素细胞。可以使用本领域技术人员熟知的任何制备黑素细胞的方法，诸如Olsson et al.(1994)Acta.Derm.Venereol.74：226-268中描述的方法。
朗格汉斯细胞和/或朗格汉斯细胞前体可以为如欧洲专利申请EP 789074中所述的。
优选地，表皮等同物不是纵向地分隔。
“非纵向分隔的表皮等同物”在本文中是指表皮等同物由接种到至少两个有区别的、并列的真皮隔室上的单一组成制备。然而应当注意，当真皮和表皮强烈相互作用时，有区别的、并列的真皮隔室的差异可能在形成的表皮等同物的性质中纵向地引起差异。
本发明还涉及制备如上定义的皮肤等同物的方法，包括通过如“真皮等同物和制备方法”部分所定义的真皮等同物的制备的方法制备真皮等同物的步骤。
优选地，制备至少包含角质形成细胞的皮肤等同物的方法包括，在制备真皮等同物的步骤之后，在真皮等同物上重建表皮等同物的步骤。
这种重建表皮等同物的步骤可以通过本领域技术人员熟知的任何技术进行，诸如专利申请EP285471、EP285474、EP789074、EP502172、EP418035、WO91/16010、EP197090、EP20753、FR2665175和FR2689904中描述的技术，或在Asselineau et al.(1985)Exp.Cell.Res.159：536-539中，在Asselineau et al.(1987)，Models in dermato.，colIII，Ed.Lowe&Mailbach，1-7中，或在Asselineau et al.(1984)Br J Dermatol.111Suppl27：219-22中描述的那些。
该重建步骤可以有利地在培养皿中通过对制备的真皮等同物的拼贴步骤进行，例如使用包含MEM 1.76X培养基、FCS、NaOH 0.1N和MEM 25mM Hepes10％FCS的粘合剂溶液。
优选地，重建步骤通过将角质形成细胞接种到真皮等同物上，优选接种到接种环中来实施。
在将角质形成细胞接种到真皮等同物上之后，可以有利地将培养物保持浸没在营养培养基中，所述营养培养基可以是，例如Rheinwald and Green(1975)Cell 6：317-330描述的培养基，其能够使角质形成细胞增殖。
在孵育期后，优选3至15天，甚至更优选7至9天后，皮肤等同物优选保持在空气/液体界面，例如通过将其沉积在金属网上。然后，该液体优选由与先前相同的营养培养基构成。
然后继续孵育，优选直至获得表现出皮肤特征的皮肤等同物，即由表现出四个标准细胞层(即基底层、基底上层、颗粒层和角质层)的表皮等同物覆盖的真皮等同物。以这种方式，孵育优选继续进行5至30天，优选7至10天。
用途
本发明还涉及如上“真皮等同物和制备方法”部分中定义的真皮等同物，或如上“皮肤等同物和制备方法”部分中定义的皮肤等同物用途，用以研究皮肤异质性或皮肤异质性相关疾病(诸如皮肤老化和/或炎症和/或色素沉着)的用途。
特别地，根据本发明的真皮等同物和/或皮肤等同物可用于研究皱纹或色素沉着斑的发生，或任何其他皮肤老化和/或皮肤色素沉着相关的现象，特别是与光老化相关，更具体地与紫外线辐射对皮肤的影响相关(诸如光化性角化病)的现象。
本发明还涉及筛选在局部施用到皮肤上后具有活性的化合物的方法，特别是在表现出异质性的皮肤上，特别是在抗衰老领域(诸如用于治疗皱纹和纹路)，和/或在炎症领域，和/或在色素沉着领域(诸如用于治疗色素沉着斑)，所述筛选方法包括将候选化合物施用到根据本发明的真皮等同物上，或施用到根据本发明的皮肤等同物上。
通过下面的附图和实施例更详细地说明本发明。
附图说明
图1：根据本发明的皮肤等同物的示意图，其包含根据本发明的真皮等同物，所述真皮等同物纵向上包含至少两个有区别的、并列的不同组成的真皮隔室。
图2：(A)实施例中获得的皮肤等同物的组织学，包括3个有区别的、并列的真皮隔室：一个包含乳头状成纤维细胞的隔室被两个包含网状成纤维细胞的隔室包围。(B)在实施例中获得的皮肤等同物中存在的丝聚合蛋白的标记。
具体实施方式
实施例
该实施例显示了在皮肤水平上交替表现具有乳头状成纤维细胞或网状成纤维细胞的区域的重建皮肤。
制备具有三个有区别的隔室的真皮等同物
两种人成纤维细胞溶液，一种包含乳头状成纤维细胞，另一种包含网状成纤维细胞，在含有10％FCS的MEM 25mM Hepes培养基中以2×106细胞/ml的比例制备。
从这些成纤维细胞溶液中，制备两种不同格子制备溶液，一种(溶液A)用于1.5cm×3.8cm矩形聚四氟乙烯内含物模具的外围，另一种(溶液B)用于该模具内部。
溶液A包含3.22ml MEM 1.76X培养基、0.63ml FXS、0.35ml NaOH 0.1N、0.2ml MEM25mM Hepes培养基、10％FCS和0.5ml乳头状成纤维细胞溶液。
溶液B包含3.22ml MEM 1.76X培养基、0.63ml FXS、0.35ml NaOH 0.1N和0.2mlMEM 25mM Hepes培养基、10％FCS和0.5ml网状成纤维细胞溶液。
将2.1ml冷的酸溶性胶原蛋白I溶液(5mg/ml)缓慢加入溶液A和B中。
将溶液用移液器混合直至均匀化。
将矩形模具放置在4cm×4cm见方的显微镜培养皿的中心，该培养皿覆盖有包含3.22ml MEM 1.76X培养基、0.63ml FXS、0.35ml NaOH 0.1N和0.2ml MEM 25mM Hepes培养基、10％FCS的溶液。将组件在37℃下孵育。
将1.7ml溶液B倒入模具中，并将5.3ml溶液A倒入模具周边。然后将组件孵育15至20分钟，以使得能够发生胶凝。
一旦获得胶凝，移除模具并将培养皿转移至37℃、5％CO2。
然后将制备物在37℃、5％CO2下孵育3天以使格子能够收缩。
皮肤等同物制备
在格子收缩3天后进行角质形成细胞接种以获得完整的皮肤等同物。
通过混合0.46ml的MEM 1.76X培养基、0.09ml FCS、0.05ml NaOH 0.1N、0.1ml MEMHepes 10％SVF培养基和0.3ml透析胶原蛋白制备粘合剂溶液。
将一滴该溶液滴在培养皿的中间。取出如上制备的包含3个真皮隔室的格子并将其置于粘合剂溶液滴上，然后在37℃、5％CO2的烘箱中孵育20-30分钟。
将角质形成细胞以1×105个细胞/ml的浓度置于MEM 10％FCS+3F培养基中的溶液中。
将接种环置于结合的格子上，并将0.5ml角质形成细胞悬浮液放到该环中。在环周围添加MEM 10％FCS+3F培养基。
然后将组件在37℃、5％CO2下孵育2小时。
然后除去接种环，将培养皿在37℃、5％CO2下再孵育7天，每周更换培养基两次。
在浸没培养7天后，出现皮肤：切除将出现皮肤周围的粘合剂并将皮肤等同物转移到包含MEM 10％FCS+3F培养基的培养皿中的出水网(emersion mesh)中。
将培养皿在37℃、5％CO2下孵育7天，每周更换培养基两次。
分析获得的皮肤等同物
通过组织学研究获得的皮肤等同物并标记以检测丝聚合蛋白。如图2所示，在对应于具有乳头状成纤维细胞的真皮隔室区域和具有网状成纤维细胞的真皮隔室的组织学中显而易见的是，对应于这些隔室的表皮区域可以通过其分化的质量来区分，与乳头状成纤维细胞隔室相比，对于网状成纤维细胞隔室的分化不太明显。
在颗粒层中，通过丝聚合蛋白标记证实了这一点，与含有网状成纤维细胞的真皮部分相比，在含有乳头状成纤维细胞的真皮部分的存在下标记更强。

Claims (13)

1.真皮等同物，所述真皮等同物纵向上包括至少两个有区别的、并列的不同组成的真皮隔室，
其中，所述至少两个真皮隔室中的至少一个包含已经历氧化修饰的胶原蛋白，并且所述至少两个真皮隔室中的至少另一个包含未经历氧化修饰的胶原蛋白，或者包含经历与所述第一隔室不同的另一种氧化修饰的胶原蛋白；和/或
其中，所述至少两个真皮隔室中的至少一个包括乳头状成纤维细胞，并且所述至少两个真皮隔室中的至少另一个包括网状成纤维细胞。
2.表现出表面异质性的皮肤等同物，所述皮肤等同物包括根据权利要求1所述的真皮等同物。
3.根据权利要求1所述的真皮等同物的制备方法，所述方法包括由制备至少两种有区别的、纵向上并列的不同组成的格子组成的步骤，所述至少两个格子中的一个在模具内制备，而另一个在所述模具的外围制备。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述制备所述至少两个格子的步骤包括制备至少两种不同组成的有区别的溶液，一种溶液用于所述模具内部，另一种溶液用于所述模具外围。
5.根据权利要求2所述的皮肤等同物的制备方法，所述方法包括通过根据权利要求3或4所述的方法制备真皮等同物的步骤。
6.根据权利要求1所述的真皮等同物在制备表现出表面异质性的皮肤等同物中的用途。
7.根据权利要求1所述的真皮等同物或根据权利要求2所述的皮肤等同物在研究皮肤异质性中用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述皮肤异性是皮肤老化和/或炎症和/或色素沉着。
9.在局部施用到皮肤上后显示出活性的化合物的筛选方法，所述筛选方法包括将候选化合物施用于根据权利要求1所述的真皮等同物上，或者施用于根据权利要求2所述的皮肤等同物上。
10.根据权利要求9所述的筛选方法，其中所述皮肤表现出异质性。
11.根据权利要求9所述的筛选方法，其中所述化合物用于抗衰老领域，和/或炎症领域，和/或色素沉着领域。
12.根据权利要求11所述的筛选方法，其中所述化合物用于治疗皱纹和纹路。
13.根据权利要求11所述的筛选方法，其中所述化合物用于治疗色素沉着斑。
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