JP3387891B2 - 加齢した皮膚等価物、それらの調製方法及びそれらの用途 - Google Patents

加齢した皮膚等価物、それらの調製方法及びそれらの用途

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な皮膚等価物
(skin equivalent)、それらの製造方法、及び該皮膚等
価物に含まれる表皮等価物(epidermis equivalent)と真
皮等価物(dermisequivalent)に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】機械的
領域と生理学的領域における皮膚の役割をよりよく理解
するために必要な研究を行うことを可能にする再構築(r
econstructed)皮膚モデルを完成させるための研究が数
年にわたってなされている。
【０００３】しかして、程度の差はあれヒトの皮膚に近
いモデルを完成させることは可能である。引用できるモ
デルは、例えば、欧州特許公開第２８５４７１号、欧州
特許公開第２８５４７４号、欧州特許公開第７８９０７
４号、欧州特許公開第５０２１７２号、欧州特許第４１
８０３５号、国際公開第９１１６０１０号、欧州特許公
開第１９７０９０号、欧州特許公開第２０７５３号、仏
国特許公開第２６６５１７５号及び仏国特許公開第２６
８９９０４号に記載されているモデルである。
【０００４】これらの公報に記載されている最も一般的
な再構築皮膚モデルは、支持体上に、多くの場合は真皮
等価物上に付着させられ、表皮等価物の形成に至る分化
プログラムになるような条件下で培養されてなる、他の
皮膚細胞、例えばメラノサイト及び／又はランゲルハン
ス細胞を伴って又は伴わないでヒトケラチノサイトを含
んでなる。
【０００５】今日までに開示された真皮等価物は、人工
膜、例えばミリポア(Millipore)フィルター、コラーゲ
ンベースの皮下代替品、プラスチック又は細胞生存性と
適合性のある任意の他の支持体、又は自然の真皮により
近くなるように開発された支持体、例えば以前に脱表皮
化された(de-epidermilized)真皮又はコラーゲン／繊維
芽細胞の混合格子(lattices)である。
【０００６】コラーゲン／繊維芽細胞の混合格子におい
て、天然のコラーゲンと単離されたヒトの繊維芽細胞と
が接合して、気象の作用を被っていない真皮を模倣する
真皮等価物が製造されるようになる。前記格子の調製の
ために使用されるプロトコールでは、一般的に若い組織
から得られたコラーゲンが使用されており、このコラー
ゲンは、その複雑ではあるが正常な生合成プロセスに介
入する重要な翻訳後修飾を受けるが、特に加齢の間に介
入し得る修飾の全てを受けているものではない。
【０００７】特に、加齢の間、またある種の病気、例え
ば糖尿病の間、コラーゲンのアミノ基(例えばリジン残
基)とメイラード反応に従い反応して、シッフ塩基を形
成するオース(ose)(グルコース又はリボース)に関連し
た非酵素的プロセスが起こることが知られている。この
塩基は、アマドリ分子転位を受けた後に、連続的に反応
して、例えばペントシジン(pentosidine)型の分子内架
橋に至る。コラーゲンのグリケーション(glycation)と
呼ばれるこの現象は、加齢に伴い一様に増加し、皮膚に
おけるグリケーション生成物の量が一様に増加するよう
になる。これらのグリケーション生成物は、例えばピラ
リン(pyrraline)、カルボキシメチル-リジン、ペントシ
ジン、クロスライン(crosslines)、Ｎε-(２-カルボキ
シエチル)リジン(CEL)、グリオキサール-リジン二量体
(GOLD)、メチルグリオキサール-リジン二量体(MOLD)、
３ＤＧ-ＡＲＧイミダゾロン(imidazolone)、バースパー
リジン(versperlysines)Ａ、Ｂ、Ｃ、スレオシジン(thr
eosidine)又は高度のグリケーション化最終産物(advanc
ed glycosylation end products)すなわちＡＧＥ類であ
る。この現象はある種の病気、例えば糖尿病において増
幅される。
【０００８】皮膚の加齢に関して何らかの理論を持ち込
むことを望むわけではないが、これらのグリケーション
現象の結果であるかもしれない他の特徴、例えば熱変性
の減少、耐酵素消化性の増加及び分子間架橋の増加が、
皮膚の加齢の間に実証されていることに留意されたい(T
anaka S.ら, 1988, J. Mol. Biol., 203, 495-505；Tak
ahashi M.ら, 1995, Analytical Biochemistry, 232, 1
58-162)。加えて、基底膜のある種の構成成分、例えば
コラーゲンＩＶ、ラミニン及びフィブロネクチンのグリ
ケーションによる改変が実証されている(Tarsio JF.ら,
1985, Diabetes, 34, 477-484；Tarsio JF.ら, 1988,
Diabetes, 37, 532-539；Sternberg M.ら, 1995, C.R.
Soc. Biol., 189, 967-985)。
【０００９】よって、皮膚の加齢の間に、コラーゲンの
物理化学的性質が変化し、コラーゲンの溶解がより困難
になり、分解がより難しくなるものと理解される。しか
して、加齢した皮膚の成分の一つは実際はグリケーショ
ン化コラーゲンであると思われる。
【００１０】皮膚は、それを構成する少なくとも２つの
区画、すなわち表皮と真皮とが密接に結合してなること
は非常によく知られている。真皮と表皮の相互作用は、
一方の改変が他方にも帰結すると考えるのが合理的であ
るようなものである。真皮の加齢、特にそのグリケーシ
ョン現象を伴うものは、それが接合している表皮のみに
帰結し得るものであると推量される。よって、皮膚加齢
において、コラーゲンのグリケーションは、必ず表皮の
加齢に関与する表皮の改変に至るに違いない。
【００１１】この点に関し、本出願人は、正常な表皮の
構成タンパク質、すなわちβ１型インテグリン、細胞外
マトリックスレセプター(Ruoslahti E., 1991, Cell bi
ology of Extracellular Matrix, Plenum press New Yo
rk, 343363を参照)が、若い表皮とは非常に異なる加齢
した表皮において、その発現の分布が見られることを今
示すことができた。特に、若い表皮、すなわち本出願人
の目的のために若い被験者から得られた表皮において、
この状況は、このタンパク質が表皮の非常に深い層、す
なわち最大で第２の基底上層(suprabasal layer)まで発
現されている、加齢した表皮、すなわち、本出願人の目
的のために、このタンパク質が、角化層のすぐ下の最後
の基底上層まで、表皮の殆どの層に発現される高齢被験
者の表皮においては全く異なる。
【００１２】調製のために使用されるプロトコール、又
は一度再構築されると改変を受けないという簡単な事実
から、少なくとも１つの成分が皮膚加齢の要素の１つを
有している皮膚等価物を製造可能なインビトロでの再構
築皮膚のモデルは今日までない。従って、インビトロで
の再構築された皮膚のモデルは、加齢した皮膚の特性を
有しておらず、あるいは加齢に至るプロセスの研究、又
は少なくともこの／これらのプロセスを遅延させ得る化
合物及び／又は組成物の研究を可能にするものではなか
った。これらの現象の唯一の既知の評価は、動物であろ
うとヒトであろうと、インビボでの研究に関連してい
る。特に、倫理上の理由から、このようなモデルが有す
る利点を理解することができる。
【００１３】グリケーションに関する研究は従来から知
られている。例えば、グリケーション化コラーゲンと繊
維芽細胞の格子の形態である結合組織等価物を得るため
の方法が開示されている(この点に関しては、Freyら, 1
992, C. R. Soc. Biol., 187, 223-231を参照)。しかし
ながら、Freyらは、それらの格子から皮膚等価物を調製
する可能性を決して研究しなかったし又は示唆すらしな
かったばかりでなく、任意の真皮等価物とこの格子を全
く比較していない。さらに、Freyらの結合組織モデルの
有用性は認めるが、これらの著者により使用されたプロ
トコールでは、本出願人が目的とするもの、すなわち加
齢した皮膚の全て又は一部の性質を有するインビトロで
の皮膚、従って表皮と真皮の再生には至ることはできな
いということは認められなければならない。４℃の温度
で９時間コラーゲンと糖をインキュベートすることによ
り、Freyらはコラーゲンのグリケーション化反応を開始
させ、ついでこの反応が格子中で連続し、そこでコラー
ゲンがこのようにしてプレグリケーションされる。加齢
した皮膚を模倣するために、十分なレベルのグリケーシ
ョンに達することが望まれるのであれば、このようにし
て形成された格子において、すなわち収縮プロセスにお
いて、グリケーション化反応を継続させ、所望のレベル
に達するのに十分な更なる時間の間、反応を続ける必要
がある。しかし、当業者は、コラーゲン／繊維芽細胞の
格子型の真皮等価物上に、少なくともケラチノサイトを
含有する表皮等価物を定着させるためには、ケラチノサ
イトの播種は確定した収縮段階を過ぎていない格子上で
行わなければならないことを知っている。従って、これ
から、Freyのプロトコールでは、加齢した又は非常に加
齢した真皮、すなわち高度に又は非常に高度にグリケー
ション化したものを模倣する真皮等価物を得ることがで
きないということになる。
【００１４】よって、本出願人の知るところでは、加齢
した真皮等価物上、特に少なくともグリケーション化コ
ラーゲンと繊維芽細胞を含有する格子上に得られた表皮
等価物を含む皮膚等価物の製造法は今だ開示されていな
い。従って、成分の少なくとも１つが加齢した皮膚の側
面の１つを有する再構築皮膚モデルを得ることの大きな
利点を理解することができる。
【００１５】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本
出願人は、永年にわたり、再構築(reconstructed)皮膚
のインビトロモデルの製造に興味を抱いていたところ、
表皮等価物と真皮等価物を含有してなる再構築皮膚モデ
ルであって、該真皮等価物が加齢した真皮等価物、特に
少なくともグリケーション化コラーゲンと繊維芽細胞を
含有する格子(lattice)を含むことを特徴とする新規な
再構築皮膚モデルを完成させた。よって、本発明の第１
の主題は、少なくともグリケーション化コラーゲンと繊
維芽細胞を含有する新規の加齢した真皮等価物にある。
【００１６】グリケーション生成物を形成させるための
種々の方法が、従来技術において記述されている。この
点に関して、例えばCefalu W. T.ら(Journal of geront
ology；Biological sciences, 1995, vol.50A, No.6, 1
3337-13341)、Sell D. R.(Diabetes/Metabolism, 1991,
vol.7, No.4, 239-251)、Miyata T.ら(Journal of the
american society of nephrology, 1996, vol.7, No.
8, 1198-1206)、又はFurth A. J.(Analytical biochemi
stry, 1991, 192, 109-111)により記載されている方法
を挙げることができる。例えば、反応後に残存している
グリケーション化化合物のレベル及び／又はコラーゲン
に結合しているグリケーション化化合物のレベルを測定
することができる。上述したように、コラーゲンのグリ
ケーションにより、グリケーション化生成物が形成さ
れ、例えばピラリン、カルボキシメチル-リジン、ペン
トシジン、クロスライン、Ｎε-(２-カルボキシエチル)
リジン(CEL)、グリオキサール-リジン二量体(GOLD)、メ
チルグリオキサール-リジン二量体(MOLD)、３ＤＧ-ＡＲ
Ｇイミダゾロン、バースパーリジンＡ、Ｂ及びＣ、スレ
オシジン又は高度のグリケーション化最終生成物すなわ
ちＡＧＥ類の形成に至る。これらグリケーション化生成
物のいくつかは、励起後に測定可能な蛍光を発するとい
う特定の特徴を有する。例えば、ペントシジンは３２８
ｎｍの波長(λｅｘ)で励起されたとき、３７８ｎｍの波
長(λｅｍ)で蛍光を放射する。同様に、ＡＧＥは３７０
ｎｍの波長(λｅｘ)で励起されたとき、４４０ｎｍの波
長(λｅｍ)で蛍光を放射する。同じ実験条件下で測定さ
れた、少なくとも非グリケーション化コラーゲンと繊維
芽細胞を含有する対照真皮等価物において同じグリケー
ション化生成物により放射される蛍光に対する、少なく
ともグリケーション化コラーゲンと繊維芽細胞を含有す
る真皮等価物において与えられたグリケーション化生成
物により放射される蛍光の割合により、加齢した真皮等
価物のグリケーションレベルを特徴付けることが可能に
なる。
【００１７】特に、本発明においては、ペントシジン及
び／又はＡＧＥの蛍光が、グリケーション化コラーゲン
を含有する加齢した真皮等価物、及び非グリケーション
化コラーゲンを含有する対照の両方において測定され
る。よって、本発明において加齢した真皮等価物は、２
〜３０、好ましくは８〜１８のグリケーションレベルを
有する。
【００１８】本発明において、コラーゲンは、任意の由
来の任意のタイプのコラーゲンとすることができる。こ
の点に関し、再考として、Van der Rest及びGaronne, 1
990,Biochem, vol.72, 473-484、又は1991, Faseb Jour
nal, vol.5, 2814-2823に引用されている種々のタイプ
のコラーゲンが参照される。よって、本発明において、
コラーゲンは、好ましくはＩ、ＩＩＩ又はＶ型の繊維状
コラーゲン(fibrillary collagens)から選択される。本
発明において好ましくは、動物由来のコラーゲン、特に
ウシ由来のコラーゲンが使用される。本発明で好ましく
使用されるコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンである、本発
明において特に好ましくは、ウシのＩ型コラーゲンが使
用される。本発明において、異なる由来及び／又は任意
の割合での異なるタイプのコラーゲンの混合物を使用し
てもよいことは明らかである。
【００１９】本発明において、繊維芽細胞は任意の由来
のものであってよいが、ヒト由来の繊維芽細胞が好まし
い。それらは、従来から公知の任意の方法に従って調製
することができ、例えば外植体から繊維芽細胞を成長さ
せるか、又は真皮の細胞外マトリックスの巨大分子を機
械的及び／又は酵素的に解離させることにより調製され
る。本発明の真皮等価物は、少なくともグリケーション
化コラーゲンと繊維芽細胞を含有するが、そこに導入す
ると利点が生じる任意の他の成分、例えば内皮細胞、マ
クロファージ又は神経細胞をさらに含有してもよいこと
は明らかである。
【００２０】本発明の第２の主題は、少なくともグリケ
ーション化コラーゲンと繊維芽細胞を含有する真皮等価
物上に、少なくともケラチノサイトを播種することによ
り得られることを特徴とする、少なくともケラチノサイ
トを含有する表皮等価物にある。
【００２１】上述にて示したように、年齢に応じて、表
皮のある種のマーカーが、それらの量又はそれらの発現
の局在性において修飾を被り得る。特に本出願人は、表
皮におけるβ１インテグリンの発現が、表皮の加齢と共
に、その局在性において変化することを示した。特に、
若い表皮において、このタンパク質は、厳密に言えば、
最大で最初の２つの基底上層に発現されるが、加齢と共
にこの発現は、最初の２つの基底上層でのその局在化を
保存しながら、角質層に隣接した最後の層を含む、全て
の基底上層に現れる点までますます表層にまで現れるよ
うになる。
【００２２】よって、本発明の変形例では、表皮等価物
は、β１インテグリンの発現、特に少なくとも最初の３
つの基底上層の細胞内におけるβ１インテグリンの発現
を改変したことを特徴とするものである。より好ましく
は、本発明において、少なくともケラチノサイトを含有
する表皮等価物は、β１インテグリンの発現、特に少な
くとも最初の３つの基底上層の細胞内におけるβ１イン
テグリンの発現が改変し、少なくともグリケーション化
コラーゲンと繊維芽細胞を含有する真皮等価物上に、少
なくともケラチノサイトを播種することにより得られる
ものであることを特徴とするものである。
【００２３】β１インテグリンの発現を示すことのでき
る任意の方法を、本発明の表皮の特徴付けに使用可能で
あることは明らかである。抗β１インテグリン抗体によ
る標識化を例として引用できる。
【００２４】本発明において使用されるケラチノサイト
は、任意の由来のものでよいが、ヒト由来の繊維芽細胞
が好ましい。それらは、従来から公知の任意の方法に従
い調製することができる。毛髪の濾胞鞘(sheath)から得
られたケラチノサイトの培養、又は正常な皮膚サンプル
から得られた分離表皮からの培養が例として引用され
る。
【００２５】本発明において好ましくは、正常なヒトの
皮膚からのケラチノサイトが使用される。本発明におい
て好ましくは、使用されるケラチノサイトはRegnierら,
Frontier of Matrix Biology, Vol.9, 4-35(Karger, B
asle 1981)に記載されている方法に従って正常なヒトの
皮膚サンプル由来の分離ヒト表皮から調製される。
【００２６】本発明の表皮等価物は少なくともケラチノ
サイトを含有するが、そこに導入され得る他の任意の細
胞型、例えばランゲルハンス細胞及び／又はランゲルハ
ンス細胞前駆体及び／又はメラノサイトを含有してもよ
い。
【００２７】正常な皮膚と最良の類似性を有する皮膚等
価物は、正常な皮膚に存在する３つの必須の細胞型を含
む皮膚等価物である。よって、有利には、本発明の再構
築皮膚のモデルは、メラノサイト及び／又はランゲルハ
ンス細胞及び／又はランゲルハンス細胞前駆体をさらに
含有する。
【００２８】本発明で使用されるメラノサイトは、それ
らを含む任意の器官、例えば、正常な皮膚又は髪の濾胞
から単離することができる。好ましくは、正常な皮膚か
ら単離されたメラノサイトが使用される。従来から公知
の任意のメラノサイトの調製方法が本発明において使用
することができる。例えば、Olssonらの、Acta Derm. V
enereol., 1994, 74, 226-268に記載されている方法が
引用される。
【００２９】本発明において使用可能なランゲルハンス
細胞及び／又はランゲルハンス細胞前駆体は、欧州特許
出願公開第７８９０７４号において本出願人が開示した
ようなものとできる。
【００３０】本発明の第３の主題は、少なくとも１つの
加齢した真皮等価物と、少なくとも１つの表皮等価物を
含有してなることを特徴とする加齢した皮膚等価物にあ
る。本発明の変形例において、加齢した皮膚等価物は上
述した加齢した真皮等価物を含有する。本発明の他の変
形例において、加齢した皮膚等価物は上述した表皮等価
物を含有する。
【００３１】本発明において非常に好ましい加齢した皮
膚等価物は、β１インテグリンの発現、特に少なくとも
最初の３つの基底上層の細胞におけるβ１インテグリン
の発現を改変し、少なくともグリケーション化コラーゲ
ンと繊維芽細胞を含有する加齢した真皮等価物上に、少
なくともケラチノサイトを播種することにより得ること
ができる、少なくともケラチノサイトを含有する表皮等
価物を含んでなり、該加齢した真皮等価物は、２〜３
０、特に８〜１８のグリケーションレベルを有すること
を特徴とするものである。
【００３２】本発明の第４の主題は、それ自身が少なく
ともグリケーション化コラーゲンと繊維芽細胞を含有す
る格子を含む真皮等価物と表皮等価物とを含有する加齢
した皮膚等価物の調製方法において、第１工程におい
て、少なくともグリケーション化コラーゲンと繊維芽細
胞を含有する格子を調製し、第２工程において、第１工
程で得られた格子上に、少なくともケラチノサイトを含
有する表皮等価物を再生させることを特徴とする方法に
ある。
【００３３】使用されるコラーゲンが格子の形成前、形
成中又は形成後にグリケーション化することができるな
らば、第１工程は従来から公知の任意の方法で実施する
ことができる。好適には、本発明において、格子の形成
中又は格子の形成後にグリケーションを引き起こさせる
ために、格子の形成前にグリケーション化されるコラー
ゲンが使用されるか、又はグリケーション化剤が使用さ
れるコラーゲンと繊維芽細胞の混合物に添加される格子
が調製される。本発明において好ましくは、格子はプレ
グリケーション化コラーゲンを使用して調製される。本
発明において好ましくは、格子は、プレグリケーション
化コラーゲンを使用し、Asselineauら, 1987,(Models i
n dermato., vol.III, Ed. Lowe & Maibach,1-7)により
記載された方法に従い調製される。
【００３４】グリケーションのための任意の公知の方法
が、グリケーション化コラーゲンを得るために使用でき
る。例えば、Tanakaら,( J. Mol. Biol., 1988, 203, 4
95-505)、Tarsio JF.ら(1985, Diabetes, 34, 477-48
4)、Tarsio JF.ら(1988, Diabetes, 37, 532-539)、又
はFrey J.ら(1992, C. R. Soc. Biol., 187, 223-231)
により記載されている方法が挙げられる。
【００３５】本発明において好ましくは、グリケーショ
ンは、細胞の不在下でインビトロでのコラーゲンのグリ
ケーション化反応を誘発させるように、少なくとも１つ
のグリケーション化剤の溶液と、少なくとも１つのコラ
ーゲンの溶液とを一緒に合わせることにより得られる。
【００３６】上述したように、使用されるコラーゲン
は、任意のタイプで、任意の由来のコラーゲンの、単独
物又は混合物であってよい。本発明において好ましく
は、動物由来のコラーゲン、特にウシ由来のコラーゲン
が使用される。本発明で好ましく使用されるコラーゲン
はＩ型コラーゲンである。本発明において特に好ましく
は、ウシのＩ型コラーゲンが使用される。コラーゲン溶
液は、２ｍｇ／ｍｌ〜６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは３ｍｇ
／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【００３７】グリケーション化剤は、グリケーションを
可能にする任意の薬剤、すなわちメイラード反応に従
い、コラーゲンのアミノ基と反応してシッフ塩基を形成
可能な任意の薬剤であってよい。この点に関し、例えば
メイラード反応のある種の中間生成物、例えばグルコソ
ン、３-デオキシグルコソン、グリオキサール、メチル
グリオキサール又は糖類が挙げられる。
【００３８】本発明においては、モノマー形態にせよポ
リマー形態にせよ、任意の種類の糖を使用することがで
きる。本発明では、モノマー糖が好ましく使用される。
本発明において、糖とは、少なくとも１つのアルデヒド
基とアルコール基を有する生成物を意味する。オース類
(oses)を特に挙げることができる。
【００３９】本発明で使用可能な糖類としては、リボー
ス、フルクトース又はグルコースを、とりわけ挙げるこ
とができる。本発明において好ましくはリボース又はグ
ルコースが使用される。糖は右旋性又は左旋性の立体配
座を有する任意のものであってよい。本発明において好
ましくは、右旋性の立体配座を有する糖が使用される。
特に、本発明において、Ｄ-フルクトース、Ｄ-リボース
又はＤ-グルコースが使用される。さらに好ましくは、
Ｄ-リボース又はＤ-グルコースが使用される。
【００４０】グリケーション化剤は単独で又は混合物と
して使用され得ることは明らかである。本発明で使用可
能なグリケーション化剤の量は、シッフ塩基の形成に至
る非酵素的反応の開始を可能にするのに十分な量とすべ
きである。この量を変えることにより、比較的グリケー
ション化されていないものから、非常に高度にグリケー
ション化されているものまで、そのグリケーションレベ
ルが変わる最終生成物であるグリケーション化コラーゲ
ンを得ることができることが理解される。しかして、グ
リケーション化剤の量は、コラーゲン溶液の全重量に対
して０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％で
あり得る。
【００４１】グリケーション化反応は室温に近い温度で
行われる。例えば、該反応は１５℃〜３０℃、好ましく
は２０℃〜２５℃の温度で行われる。グリケーション化
反応の継続時間は、所望のグリケーションレベルに依存
する。時間を長くすればするほど、グリケーションレベ
ルは高くなると理解される。例えば、グリケーション化
反応の継続時間は１５日〜２ヶ月、好ましくは２５〜３
５日である。
【００４２】格子の調製の前にグリケーションを行うこ
とを選択した場合、最も純度の高い可能性のある生成物
を生成するために必要な以下に続く全ての工程をグリケ
ーション化コラーゲンに施すことができる。よって、反
応中に反応しない痕跡量のグリケーション化剤を除去し
ようとすることが可能である。このために、任意の公知
の技術が使用できる。例えば、プレグリケーション化コ
ラーゲン溶液を、水及び／又は酢酸に対しての一連の透
析工程にかける。
【００４３】本発明の変形例において、得られた「プレ
グリケーション化」コラーゲン溶液を、真皮等価物の調
製のために、使用前に天然コラーゲンと混合することが
できる。この場合、非グリケーション化コラーゲンに対
するグリケーション化コラーゲンの割合は、２５〜７
５、好ましくは４５〜５５である。この割合を変えるこ
とにより、格子のグリケーションレベルを調節すること
ができる。本発明において好ましくは、グリケーション
化コラーゲンと非グリケーション化コラーゲンの混合
物、より好ましくはグリケーション化コラーゲンと非グ
リケーション化コラーゲンが５０／５０の割合にある混
合物が使用される。
【００４４】本発明の方法の第２工程は、従来から公知
の任意の方法により行うことができる。この点に関して
は、例えば欧州特許公開第２８５４７１号、欧州特許公
開第２８５４７４号、欧州特許公開第７８９０７４号、
欧州特許公開第５０２１７２号、欧州特許公開第４１８
０３５号、国際公開第９１１６０１０号、欧州特許公開
第１９７０９０号、欧州特許公開第２０７５３号、仏国
特許公開第２６６５１７５号及び仏国特許公開第２６８
９９０４号、又はAsselineauら, 1985,(Exp. Cel. Re
s., 536-539)及び1987,(Models in dermato., vol.III,
Lowe及びMaibach編, 1-7)に記載されている方法が挙げ
られる。本発明において好ましくは、Asselineauとその
共同研究者により記載されている方法が使用される。
【００４５】本発明において使用されるケラチノサイト
は任意の由来のものであってよいが、好ましくはヒト由
来のケラチノサイトである。それらは、従来から公知の
任意の方法で調製され得る。例としては、正常な皮膚サ
ンプル由来の分離した表皮の培養、又は髪の濾胞鞘から
得られたケラチノサイトの培養が挙げられる。本発明で
好ましくは、使用されるケラチノサイトは、Regnierら,
Frontier ofMatrix Biology, vol.9, 4-35(Karger, Ba
sel 1981)に記載されている方法で、正常なヒトの皮膚
サンプル由来の分離したヒト表皮から調製される。
【００４６】有利には、支持体上にケラチノサイトを播
種した後、栄養培地、例えばRheinwaldとGreen, 1975,
(Cell, 6, (3), 317-330)により記載された培地(本明細
書の他の箇所では３Ｆ培地と称する)に浸し続け、この
培地でケラチン物質を増殖させて培養する。３〜１５
日、好ましくは７〜９日間インキュベートした後、例え
ば、金属製のグリッド上に配することにより、皮膚等価
物を空気／液体の界面に保持する。そして、液体は好ま
しくは上述したものと同じ栄養培地からなる。ついで、
皮膚の性質を有する皮膚等価物が、すなわち、通常の４
タイプの細胞層、すなわち、基底層、基底上層、顆粒層
及び角化層を有する表皮等価物が上にある支持体が得ら
れるまで、インキュベーションを続ける。しかして、イ
ンキュベーションは、５〜３０日、好ましくは７〜１０
日、継続する。
【００４７】このようにして製造された再構築皮膚モデ
ルは、物理的に互いに分離することができる支持体と表
皮等価物の２つの実体物からなる。よって、表皮等価物
は支持体から分離させて使用することができる。
【００４８】上述したように、加齢した皮膚の性質を有
し、加齢に至るプロセスの研究、又はそのプロセスを少
なくとも改変することを可能にする化合物及び／又は組
成物の研究を可能にするインビトロでの再構築皮膚モデ
ルは今日までなかった。本発明で得られた皮膚等価物
は、加齢した皮膚の少なくとも１つの特性、すなわちグ
リケーション化コラーゲンを有しているため、これらの
問題を解決することができる。それらのモデル及び方法
が任意の割合で変えることを可能にするというこの重要
な特性により、それ自身のグリケーション現象及びこの
現象のモジュレーター(インヒビター又はアクチベータ
ー)の研究、加齢した皮膚に関連した現象、例えばシワ
の研究、シワの出現に関するモジュレーター(単離され
た化合物及び／又は組成物)(特にインヒビター)の研
究、紫外線の皮膚における影響及び光加齢並びにこの影
響のモジュレーター(保護性化合物及び／又は組成物、
フィルター等)の研究、皮膚成分(剛毛及び／又は毛髪、
血管、神経繊維等)に対するグリケーションの影響の研
究、及び治療の分野においてはグリケーションを介した
糖尿病に起因する合併症の研究を行うことが可能にな
る。
【００４９】よって、本発明の主題は、上述した加齢し
た皮膚及び／又は加齢した真皮等価物及び／又は加齢し
た表皮等価物の、それ自身のグリケーション化現象及び
この現象のモジュレーター(インヒビター又はアクチベ
ーター)の研究、加齢した皮膚に関連した現象、例えば
シワの研究、シワの出現に関するモジュレーター(単離
された化合物及び／又は組成物)(特にインヒビター)の
研究、紫外線の皮膚における影響及び光加齢並びにこの
影響のモジュレーター(保護性化合物及び／又は組成
物、フィルター等)の研究、皮膚成分(剛毛及び／又は毛
髪、血管、神経繊維等)におけるグリケーションの影響
の研究、及び治療の分野においてはグリケーションを介
した糖尿病に起因する合併症の研究のための使用にあ
る。
【００５０】また、本発明によれば、少なくともグリケ
ーション化コラーゲンと繊維芽細胞を含有する真皮等価
物上に再構築された表皮等価物は、β１インテグリンの
発現分布が改変されていてよい。この場合、このマーカ
ーの分布の変化が表皮の加齢に関連しているならば、本
発明の加齢した皮膚等価物を使用し、表皮等価物におけ
るβ１インテグリンの発現分布の改変に作用する影響に
より、その影響を測定して、加齢した皮膚を処置するこ
とができる任意の生成物を評価することができる。
【００５１】図１により、本発明をよりよく例証するこ
とができるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５２】
【実施例】本発明の実施例を以下に付与するが、本発明
を何ら限定するものではない。 実施例： 培地及びバッファーについては特に示さない限りは；実
施例で使用される全ての培地及びバッファーは、Bell
ら, 1979,(P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278)、Asselineau
とPrunieras, 1984, (British J. of Derm., 111, 219-
222)又はAsselineauら, 1987,(Models in dermato., vo
l.III,Lowe及びMaibach編, 1-7)に記載されているもの
である。
【００５３】 実施例１：ウシグリケーション化コラーゲンＩの調製 １０ｍｌの３ｍｇ／ｍｌ濃度のウシのコラーゲンＩ溶
液、酸性のコラーゲン溶液を中和させるための０．８ｍ
ｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウム、及び１００μｌのＤ-
リボースの１Ｍ水溶液を、５０ｍｌのファルコン(Falco
n)チューブに入れた。光に対して不透明にしたチューブ
を水平に配し、室温(２５℃)で１ヶ月、ゆっくりと振盪
した。
【００５４】「プレグリケーション」の終わりに、溶液
を透析チューブ(Spectra／Polylabo32mm No.132655/857
16)に入れ、連続した一連の透析を施した：４℃の脱塩
水に対して２４時間行い、未結合糖又はコラーゲンの分
解生成物を除去した；３．５日ずつ２つの槽中で、０．
５Ｎの酢酸で７日間行い、コラーゲンを再溶解させた；
槽を毎日変え、０．０１７Ｎの酢酸で３ｘ２４時間行っ
た。
【００５５】最後の透析後に、透析チューブの内容物を
滅菌ビーカーに回収し、溶液を光に対して不透明にした
５０ｍｌの滅菌ファルコンチューブに移した。しかし
て、「プレグリケーション化」されたコラーゲン溶液の
使用準備が整った。これは４℃で貯蔵することができ
る。
【００５６】実施例２：加齢した真皮等価物の調製 ３．２２ｍｌの１．７６ｘＭＥＭ培地、０．６３ｍｌの
子ウシ胎児血清、０．３５ｍｌの０．１Ｎ水酸化ナトリ
ウム及び１０％の子ウシ胎児血清を含有する０．２０ｍ
ｌのＭＥＭ培地／Ｈｅｐｅｓ混合物(ＭＥＭ／Ｈｅｐｅ
ｓ／ＦＣＳ１０)を滅菌ファルコンチューブに入れた。
ついで、Bellら, 1979,(P.N.A.S. USA, 76, 1274-127
8)、AsselineauとPrunieras, 1984, (British J. of De
rm., 111, 219-222)又はAsselineauら, 1987,(Models i
n dermato., vol.III, Lowe及びMaibach編, 1-7)に記載
された方法に従い予め調製された、ヒト乳房の形成外科
手術により得られた繊維芽細胞を含有する、０．５０ｍ
ｌのＭＥＭ培地／Ｈｅｐｅｓ／ＦＣＳ１０を、０．５ｍ
ｌの培地に１ｘ１０６細胞の濃度になるように添加し
た。
【００５７】１／１０００の酢酸に３ｍｇ／ｍｌの濃度
で、実施例１のプレグリケーション化コラーゲンの調製
において提供した非グリケーション化コラーゲンと、実
施例１のプレグリケーション化コラーゲンとの同容量の
混合物２ｍｌを、白みがかった曇りの出現が観察できる
ような方法で、チューブの壁に対してゆっくりと添加し
た。ついで、全体を注意深く混合し、６０ｍｍ直径のペ
トリ皿(６０ｍｍのファルコン型、参照番号１０１６)に
蒔いた。ついでペトリ皿を３７℃のインキュベータに入
れ、約２時間３０分放置した。２つの相(ゲル＋培地)の
出現が観察されたときに、格子をその支持体から注意深
く分離させ、このようにして支持体から分離された格子
を４日間、インキュベータ内に放置した。
【００５８】 実施例３：実施例２の加齢した真皮等価物のグリケーシ
ョンレベルの測定： 実施例２の加齢した真皮等価物の製造と並行して、グリ
ケーション化コラーゲンを有さない真皮等価物(しか
し、非グリケーション化コラーゲンを含有する)を製造
した。この等価物を、実施例２のグリケーション化され
た真皮等価物のグリケーションレベルの測定において対
照として使用した。
【００５９】実施例２で調製された２つの格子(一つは
加齢したもので、もう一つは対照)をリン酸緩衝溶液(Ｐ
ＢＳ)で３回すすぎ、ついで乾燥させた。ついで格子を
エペンドルフ(Eppendorf)チューブに配し、０．５ｍｌ
の０．５Ｎ酢酸内に、一格子当たりペプシン５００μｇ
の割合でペプシン(Sigma P-6887)を使用し、一晩(１２
時間)、３７℃の水浴中で消化させた。ついで、５１５
μｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウムを各チューブに添加
し、各チューブの内容物を０．２２μｍのスピンフィル
ター(Sigma社製)で濾過した。ついで日立製分光蛍光
計、モデルＦ２０００により、蛍光を測定した。このよ
うにして、ペントシジンではλｅｘ＝３２８ｎｍで励起
した後、λｅｍ＝３７８ｎｍで放射された蛍光を、ＡＥ
Ｇではλｅｘ＝３７０ｎｍで励起した後、λｅｍ＝４４
０ｎｍで放射された蛍光を測定した。
【００６０】得られた結果を次の表に示す：
【表１】
【００６１】この実施例において、加齢した真皮等価物
のグリケーションレベルは、ペントシジンで９．４、Ａ
ＧＥで４であることが立証された。
【００６２】実施例４：加齢した皮膚等価物の調製 実施例２で調製されたような加齢した真皮等価物を用意
し、コラーゲン「糊」(０．６ｍｌ)の小滴上に置かれた
コーニングθ６０ｍｍ培養皿によく広げ、ついで、２０
〜３０分、３７℃でインキュベータ内に保持した。滅菌
したスチールリングを格子上に配し、ＭＥＭ培地１０％
ＦＣＳ＋３Ｆに、１０００００細胞／ｍｌの割合になる
よう、Regnierら,(Frontier of Matrix Biology, Vol.
9, 4-35, Karger, Basle 1981)の方法に従って調製され
る乳房の形成外科手術により得られたヒトのケラチノサ
イトの細胞懸濁液０．５ｍｌをリング内部に入れた。約
６ｍｌの培地(ＭＥＭ培地１０％ＦＣＳ＋３Ｆ)をリング
の周囲に配し、皿を３７℃のインキュベータ内に２時間
置いた。ついでリングを除去し、インキュベータから皿
を取り出した。８日後、培養物を空気／液体の界面に配
した。該液体は上述した同様の培地からなる。ついで、
組織学的に満足のいく表皮等価物、すなわち通常の４つ
の細胞層、すなわち、基底層、基底上層、顆粒層及び角
化層を有する表皮等価物が得られるまで、１週間培養し
続けた。
【００６３】 実施例５：実施例４で得られた表皮等価物におけるβ１
インテグリン発現の特徴付け： 実施例４で得られた表皮等価物におけるβ１インテグリ
ンの発現を、β１インテグリンに対するマウスモノクロ
ーナル抗体で免疫標識した後に観察した(Immunotech, M
arseille, France, Cat. 1151)：凍結後、実施例４で得
られた皮膚等価物を、クリオスタット(作製／モデル)に
より５μｍの厚みの薄片に切断した。ついで、断片をＰ
ＢＳで２回洗浄し、１／５０に希釈された２５μｌの抗
β１インテグリン抗体(Immunotech, Marseille, Franc
e, Cat. 1151)を各断片に付着させ、室温(２５℃)で３
０分間放置した。ついで、断片をＰＢＳで２回洗浄し、
２５μｌのＦＩＴＣ抱合抗体(ウサギ抗マウスＦＩＴ
Ｃ、ダコ(Dako)Ｆ２３２)を各断片に付着させ、室温(２
５℃)で３０分間放置した。各断片をＰＢＳで２回洗浄
し、ライカ社製蛍光顕微鏡、モデルＬＥＩＴＺ・ＤＭＲ
Ｂの下で、搭載後に観察した。
【００６４】観察によれば、対照においては、β１イン
テグリンは非グリケーション化真皮等価物上に再生され
た表皮の基底層、及び最初の基底上層に出現しているが
(図１、写真１)、これに対し、加齢した真皮等価物上に
再生された表皮における角質層の真下まで、全ての基底
上層に出現していることが分かった(図２、写真２)。
【００６５】これらの結果は、老齢のヒトの皮膚の基底
層と少なくとも最初の３つの基底上層と、若い被験者の
皮膚における基底層と最初の基底上層におけるβ１イン
テグリンの発現のインビボでの分布の観察と相関関係が
ある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 皮膚等価物の断面を示す写真であり、非グリ
ケーション化コラーゲンで調製された真皮等価物上に再
生された表皮等価物を含有する免疫標識された皮膚等価
物を表す。
【図２】 グリケーション化コラーゲンで調製された真
皮等価物上に再生された表皮等価物を含有する免疫標識
された本発明に係る皮膚等価物を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピエール タション フランス国 92160 アントニ，アヴニ ュー ジャンヌ ダルク 15 (56)参考文献 特開 平４−231061（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−201410（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−503735（ＪＰ，Ａ) 米国特許4971954（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61L 15/00 - 33/18 ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／Ｅ ＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)

Claims (44)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくともグリケーション化コラーゲン
    と繊維芽細胞を含有してなり、前記コラーゲンが２〜３
    ０のグリケーションレベルを有することを特徴とする、
    加齢した再構築真皮等価物。
  2. 【請求項２】 ８〜１８のグリケーションレベルを有す
    ることを特徴とする請求項１に記載の加齢した再構築真
    皮等価物。
  3. 【請求項３】 グリケーション化コラーゲンが動物又は
    ヒト由来のものであることを特徴とする請求項１又は２
    に記載の加齢した再構築真皮等価物。
  4. 【請求項４】 グリケーション化コラーゲンが動物由来
    のものであることを特徴とする請求項１ないし３のいず
    れか１項に記載の加齢した再構築真皮等価物。
  5. 【請求項５】 グリケーション化コラーゲンがウシ由来
    のものであることを特徴とする請求項１ないし４のいず
    れか１項に記載の加齢した再構築真皮等価物。
  6. 【請求項６】 グリケーション化コラーゲンがＩ型コラ
    ーゲン由来であることを特徴とする請求項１ないし５の
    いずれか１項に記載の加齢した再構築真皮等価物。
  7. 【請求項７】 繊維芽細胞がヒト由来のものであること
    を特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の
    加齢した再構築真皮等価物。
  8. 【請求項８】 請求項１ないし７のいずれか１項に記載
    の真皮等価物上に少なくともケラチノサイトを播種して
    得られるものであることを特徴とする少なくともケラチ
    ノサイトを含有する再構築表皮等価物。
  9. 【請求項９】 β１インテグリンの発現を改変したこと
    を特徴とする請求項８に記載の再構築表皮等価物。
  10. 【請求項１０】 少なくとも最初の３つの基底上層の細
    胞内におけるβ１インテグリンの発現を改変したことを
    特徴とする請求項９に記載の再構築表皮等価物。
  11. 【請求項１１】 少なくとも最初の３つの基底上層の細
    胞内においてβ１インテグリンの発現を有することを特
    徴とする請求項８に記載の表皮等価物。
  12. 【請求項１２】 ケラチノサイトがヒト由来のものであ
    ることを特徴とする請求項８ないし１１のいずれか１項
    に記載の再構築表皮等価物。
  13. 【請求項１３】 メラノサイト及び／又はランゲルハン
    ス細胞及び／又はランゲルハンス細胞前駆体をさらに含
    有することを特徴とする請求項８ないし１２のいずれか
    １項に記載の再構築表皮等価物。
  14. 【請求項１４】 請求項１ないし７のいずれか１項に記
    載の少なくとも１つの加齢した再構築真皮等価物と、当
    該加齢した真皮等価物上に少なくとも１つのケラチノサ
    イトを播種することにより再構築された表皮等価物とを
    含んでなることを特徴とする加齢した再構築皮膚等価
    物。
  15. 【請求項１５】 少なくともグリケーションレベル２〜
    ３０のグリケーション化コラーゲンと繊維芽細胞を含有
    する格子を含む加齢した真皮等価物と表皮等価物とを含
    有する加齢した再構築皮膚等価物の調製方法において、
    第１工程において、少なくともグリケーション化コラー
    ゲンと繊維芽細胞を含有する格子を調製し、第２工程に
    おいて、第１工程で得られた格子上に、少なくともケラ
    チノサイトを含有する表皮等価物を再構築することを特
    徴とする方法。
  16. 【請求項１６】 第１工程において、使用されるコラー
    ゲンを格子の形成前にグリケーション化することを特徴
    とする請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 グリケーション化が、細胞の不在下で
    インビトロでのグリケーション化反応を誘発させるよう
    に、少なくとも１つのグリケーション化剤の溶液と、少
    なくとも１つのコラーゲン溶液とを合わせることによ
    り、なされることを特徴とする請求項１５又は１６に記
    載の方法。
  18. 【請求項１８】 コラーゲンがヒト又は動物由来のコラ
    ーゲンであることを特徴とする請求項１５ないし１７の
    いずれか１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 コラーゲンが動物由来のコラーゲンで
    あることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 コラーゲンがウシ由来のコラーゲンで
    あることを特徴とする請求項１５ないし１９のいずれか
    １項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 コラーゲンがＩ、ＩＩＩ又はＶ型コラ
    ーゲンから選択されることを特徴とする請求項１５ない
    し２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 コラーゲンがＩ型コラーゲンであるこ
    とを特徴とする請求項１５ないし２１のいずれか１項に
    記載の方法。
  23. 【請求項２３】 コラーゲンがウシのＩ型コラーゲンで
    あることを特徴とする請求項１５ないし２２のいずれか
    １項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 コラーゲンが、２ｍｇ／ｍｌ〜６ｍｇ
    ／ｍｌの濃度であることを特徴とする請求項１５ないし
    ２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 コラーゲンが、３ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ
    ／ｍｌの濃度であることを特徴とする請求項２４に記載
    の方法。
  26. 【請求項２６】 グリケーション化剤が、メイラード反
    応に従い、コラーゲンのアミノ基と反応してシッフ塩基
    を形成可能にするグリケーションを可能にする薬剤であ
    ることを特徴とする請求項１５ないし２５のいずれか１
    項に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 グリケーション化剤が、グルコソン、
    ３-デオキシグルコソン、グリオキサール、メチルグリ
    オキサール又は糖類から選択されることを特徴とする請
    求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 グリケーション化剤が糖であることを
    特徴とする請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 糖がオース類から選択されることを特
    徴とする請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 オースがリボース、フルクトース又は
    グルコースから選択されることを特徴とする請求項２９
    に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 グリケーション化剤がリボース又はグ
    ルコースから選択されることを特徴とする請求項１５な
    いし３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 グリケーション化剤の量がコラーゲン
    溶液の全重量に対して０．５〜２０重量％であることを
    特徴とする請求項１５ないし３１のいずれか１項に記載
    の方法。
  33. 【請求項３３】 グリケーション化剤の量がコラーゲン
    溶液の全重量に対し て１〜１０重量％であることを特徴
    とする請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 グリケーション化反応が１５℃〜３０
    ℃の温度で行われることを特徴とする請求項１５ないし
    ３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 グリケーション化反応が２０℃〜２５
    ℃の温度で行われることを特徴とする請求項３４に記載
    の方法。
  36. 【請求項３６】 グリケーション化反応の継続時間が、
    １５日〜２ヶ月であることを特徴とする請求項１５ない
    し３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 グリケーション化反応の継続時間が、
    ２５〜３５日であることを特徴とする請求項３６に記載
    の方法。
  38. 【請求項３８】 コラーゲンが、プレグリケーション化
    コラーゲンと非グリケーション化コラーゲンの混合物で
    あることを特徴とする請求項１５ないし３７のいずれか
    １項に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 非グリケーション化コラーゲンに対す
    るグリケーション化コラーゲンの割合が２５〜７５であ
    ることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 非グリケーション化コラーゲンに対す
    るグリケーション化コラーゲンの割合が４５〜５５であ
    ることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 ケラチノサイトがヒト由来のものであ
    ることを特徴とする請求項１５ないし４０のいずれか１
    項に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 請求項１ないし７のいずれか１項に記
    載の加齢した再構築真皮等価物の、それ自身のグリケー
    ション現象及び該現象のモジュレーター(インヒビター
    又はアクチベーター)の研究、紫外線の真皮への影響及
    び光加齢並びに該影響のモジュレーター(保護化合物及
    び／又は組成物、遮蔽剤等)の研究、又は真皮成分への
    グリケーションの影響の研究のための使用。
  43. 【請求項４３】 請求項８ないし１３のいずれか１項に
    記載の加齢した再構築表皮等価物の、それ自身のグリケ
    ーション現象及び該現象のモジュレーター(インヒビタ
    ー又はアクチベータ)の研究、シワ等の加齢した皮膚に
    関連した現象の研究、シワの出現のモジュレーター(単
    離された化合物及び／又は組成物)、特にインヒビター
    の研究、紫外線の表皮への影響及び光加齢並びに該影響
    のモジュレーター(保護性化合物及び／又は組成物、遮
    蔽剤等)の研究、表皮及び皮膚付属物の成分に対するグ
    リケーションの影響の研究のための使用。
  44. 【請求項４４】 請求項１４に記載の加齢した再構築皮
    膚等価物の、それ自身のグリケーション及び該現象のモ
    ジュレーター(インヒビター又はアクチベータ)の研究、
    シワ等の加齢した皮膚及び／又は表皮に関連した現象の
    研究、シワの出現に関するモジュレーター(単離された
    化合物及び／又は組成物)、特にインヒビターの研究、
    紫外線の皮膚及び／又は真皮及び／又は表皮への影響及
    び光加齢並びに該影響のモジュレーター(保護性化合物
    及び／又は組成物、遮蔽剤等)の研究、皮膚及び／又は
    真皮及び／又は表皮の成分及び／又は付属物(剛毛及び
    ／又は毛髪、血管、神経繊維等)へのグリケーションの
    影響の研究、及び治療分野においてグリケーションを介
    した糖尿病に起因する合併症の研究のための使用。
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