FR3054449A1 - Equivalent de peau a compartiments dermiques juxtaposes distincts - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne un équivalent de derme comprenant longitudinalement au moins deux compartiments dermiques juxtaposés distincts de compositions différentes ainsi qu'un équivalent de peau comprenant cet équivalent de derme.

Description

© N° de publication : 3 054 449 (à n’utiliser que pour les commandes de reproduction) (© N° d’enregistrement national : 16 57418 ® RÉPUBLIQUE FRANÇAISE
INSTITUT NATIONAL DE LA PROPRIÉTÉ INDUSTRIELLE
COURBEVOIE © Int Cl8 : A 61 L 27/60 (2017.01), G 01 N 33/50, C12Q 1/02
DEMANDE DE BREVET D'INVENTION A1
©) Date de dépôt : 29.07.16. (© Demandeur(s) : LOREAL Société anonyme— FR.
(30) Priorité :
@ Inventeur(s) : ASSELINEAU DANIEL, PAGEON
HERVE et RICOIS SYLVIE.
(43) Date de mise à la disposition du public de la
demande : 02.02.18 Bulletin 18/05.
©) Liste des documents cités dans le rapport de
recherche préliminaire : Se reporter à la fin du
présent fascicule
(© Références à d’autres documents nationaux ©) Titulaire(s) : LOREAL Société anonyme.
apparentés :
©) Demande(s) d’extension : (© Mandataire(s) : LAVOIX.
EQUIVALENT DE PEAU A COMPARTIMENTS DERMIQUES JUXTAPOSES DISTINCTS.
L'invention concerne un équivalent de derme comprenant longitudinalement au moins deux compartiments dermiques juxtaposés distincts de compositions différentes ainsi qu'un équivalent de peau comprenant cet équivalent de derme.
FR 3 054 449 - A1
Figure FR3054449A1_D0001
Equivalent de peau à compartiments dermiques juxtaposés distincts
La présente invention concerne de nouveaux équivalents de peau à hétérogénéité de surface.
Depuis de nombreuses années, on cherche à mettre au point des modèles de peau reconstruite se rapprochant le plus possible de la peau humaine ou animale afin d'éviter les essais expérimentaux sur animaux.
II est ainsi possible de reproduire un équivalent de derme en mélangeant du collagène et des fibroblastes dans des conditions menant à la formation d'un tissu dermique. Cette étape peut ensuite être suivie d'une reconstruction de la peau en faisant pousser des kératinocytes sur ce substrat afin de construire un épiderme.
Toutefois ces peaux reconstruites classiques sont homogènes et ne sont pas encore assez proches de la peau humaine, qui est, elle, complexe et hétérogène.
II existe donc un besoin important de nouvelles peaux reconstruites capables de reproduire le caractère hétérogène de la peau.
Ce besoin est comblé par la présente invention.
Les présents inventeurs ont en effet mis au point un équivalent de derme comprenant des compartiments dermiques distincts juxtaposés longitudinalement, permettant ainsi d'aborder la question de l'hétérogénéité de la peau non dans le sens de la profondeur mais dans le sens de la longueur.
Ils ont en effet montré qu'en se focalisant sur des compartiments dermiques distincts, il est possible d'obtenir un équivalent de peau présentant une hétérogénéité de surface grâce aux nombreuses interactions existant entre le derme et l'épiderme, la qualité du derme influençant la qualité de l'épiderme et par conséquent l'aspect de l'épiderme et de la peau en surface.
Ils ont ainsi démontré qu'un derme subdivisé en compartiments distincts longitudinalement permettait d'aborder des différences locales au niveau de l'épiderme en termes de différenciation et kératinisation épidermique, se traduisant par des effets en surface, et ainsi d'étudier les problématiques associées à l’hétérogénéité de la peau.
Les inventeurs ont montré qu'il était possible de préparer des dermes présentant des compartiments dermiques distincts dans le sens longitudinal se différenciant de par les sous-populations dermiques présentes (fibroblastes papillaires et réticulaires ou toute autre population fibroblastique) ou de par les caractéristiques du collagène utilisé (glyqué ou non ou ayant subi toute autre modification oxydative).
La présente invention concerne donc un équivalent de derme comprenant longitudinalement au moins deux compartiments dermiques juxtaposés distincts de compositions différentes.
La présente invention concerne également un équivalent de peau présentant une hétérogénéité de surface comprenant un équivalent de derme selon l'invention.
Un exemple d'équivalent de peau selon l'invention dont l'équivalent de derme comprend longitudinalement trois compartiments dermiques juxtaposés distincts de compositions différentes est représenté sur la Figure 1.
Un autre objet de l'invention a trait à un procédé de préparation d'un équivalent de derme selon l'invention comprenant une étape consistant à préparer au moins deux lattices distinctes de compositions différentes juxtaposées longitudinalement, l'une des au moins deux lattices étant préparée à l'intérieur d'un moule et l'autre étant préparée à la périphérie du moule.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un équivalent de peau selon l’invention comprenant une étape de préparation d'un équivalent de derme par le procédé de préparation d'équivalent de derme selon l'invention.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un équivalent de derme selon l'invention pour la préparation d'un équivalent de peau présentant une hétérogénéité de surface.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation, de préférence in vitro, d'un équivalent de derme selon l'invention ou d'un équivalent de peau selon l'invention pour étudier les hétérogénéités de la peau ou les désordres liés à l'hétérogénéité de la peau, tels que le vieillissement et/ou l’inflammation et/ou la pigmentation de la peau.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de criblage d'un composé présentant une activité après application topique sur la peau, en particulier sur la peau présentant des hétérogénéités, en particulier dans le domaine de l’anti-âge comme pour le traitement des rides et ridules, et/ou dans le domaine de l’inflammation et/ou dans le domaine de la pigmentation comme par exemple pour le traitement des taches pigmentaires, ledit procédé de criblage comprenant l'application d'un composé candidat sur l'équivalent de derme selon l'invention ou l'équivalent de peau selon l'invention.
Description détaillée de l'invention
Equivalent de derme et procédé de préparation
Par compartiment dermique on entend ici une zone d'un équivalent de derme comprenant des fibroblastes et du collagène.
L'équivalent de derme selon l'invention comprend, dans le sens longitudinal, au moins deux compartiments dermiques, de manière préférée au moins 3 compartiments dermiques, juxtaposés, distincts de compositions différentes.
Par compartiments dermiques juxtaposés, on entend ici que les compartiments dermiques sont en contact par l'un de leurs côtés latéraux.
Par compartiments distincts de compositions différentes, on entend ici que les compartiments dermiques de l'équivalent dermique peuvent être différenciés les uns des autres de par leur composition, en particulier de par la nature des cellules, en particulier des fibroblastes, comprises dans le compartiment et/ou de par la nature du collagène compris dans le compartiment et/ou de par le traitement appliqué à l'un des constituants du compartiment.
Le collagène présent dans les compartiments dermiques de l'équivalent de derme selon l'invention peut être tout type de collagène de toute origine. De préférence, le collagène est choisi parmi les collagènes fibrillaires de type I, III ou V. De préférence, le collagène est du collagène de type I. De préférence, le collagène est d'origine animale, en particulier d'origine bovine. De manière particulièrement préférée, le collagène est du collagène bovin de type I. Alternativement, le collagène peut être un mélange de collagène de différents types en toute proportion et/ou de différentes origines.
Dans un mode de réalisation particulier, l'un des compartiments dermiques comprend du collagène ayant subi une modification oxydative et un autre des compartiments dermiques comprend du collagène n'ayant pas subi de modification oxydative ou ayant subi une autre modification oxydative, différente de celle du premier compartiment.
Des exemples de modification oxydative incluent la glycation, la carbonylation et la carbamylation.
Dans un mode de réalisation particulier, l'un des compartiments dermiques comprend du collagène glyqué et un autre des compartiments dermiques comprend du collagène non-glyqué.
Par collagène glyqué, on entend ici du collagène ayant subi une glycation, c'està-dire du collagène ayant réagi selon la réaction de Maillard avec un ose (en particulier glucose ou ribose) pour former une base de Schiff, qui, après un réarrangement moléculaire dit d'Amadori, peut conduire, par une succession de réactions à un pontage intramoléculaire par exemple de type pentosidine.
Différentes méthodes pour suivre la formation des produits de glycation sont bien connues de l'homme du métier telles que les méthodes décrites dans Cefalu et al. (1995)
J. Gerontol A Biol Soi Med Soi 50A:B337-B341, dans Sell et al. (1991) Diabètes Metab.
Rev. 7:239-251, dans Miyata et al. (1996) J. Am. Soc. Nephrol. 7:1198-1206 ou dans Ahmed et al. (1991) Anal. Biochem. 192:109-111. Ainsi, il est possible de mesurer le taux de composé glyquant lié au collagène et/ou le taux de composé glyquant restant après la réaction. Comme décrit précédemment, la glycation du collagène conduit à la formation de produits de glycation ou produits finaux de glycosylation avancée (advanced glycosylation ends products ou AGEs) comme par exemple la pyrraline, la carboxyméthyl-lysine, la pentosidine, la Ne(2-carboxyéthyl)-lysine (CEL), la glyoxal-lysine dimer (GOLD), la méthylglyoxal-lysine dimer (MOLD), la 3DG-ARG imidazolone ou le glucosepane. Certains de ces produits de glycation présentent la particularité d'émettre après excitation une fluorescence mesurable. Par exemple, la pentosidine, lorsqu'elle est excitée à une longueur d'onde (λεχ) de 328 nm, émet une fluorescence à une longueur d'onde (Àem) de 378 nm. De même, les AGEs, lorsqu'ils sont excités à une longueur d'onde (λεχ) de 370 nm, émettent une fluorescence à une longueur d'onde (Àem) de 440 nm. Le rapport de la fluorescence émise par une produit de glycation donné dans un compartiment dermique comprenant au moins du collagène glyqué et des fibroblastes à la fluorescence émise par le même produit de glycation dans un compartiment dermique comprenant au moins du collagène non glyqué et des fibroblastes, mesurée dans les mêmes conditions expérimentales, permet typiquement de caractériser le taux de glycation du compartiment dermique comprenant du collagène glyqué. De préférence, dans le contexte de l'invention, le taux de glycation du compartiment dermique comprenant du collagène glyqué est mesuré par la mesure de la fluorescence de la pentosidine et/ou des AGEs. Le collagène glyqué peut être obtenu par toute technique bien connue de l'homme du métier, en particulier par préincubation du collagène avec un sucre, en particulier du ribose ou du glucose, avant utilisation pour la préparation du compartiment dermique.
Les fibroblastes présents dans les compartiments dermiques de l'équivalent de derme selon l'invention peuvent provenir de toute origine, mais sont de préférence des fibroblastes d'origine humaine. Ils peuvent être préparés par n'importe quelle méthode bien connue de l'homme du métier, par exemple par dissociation mécanique et/ou enzymatique des macromolécules de la matrice extracellulaire du derme ou par croissance des fibroblastes à partir d'explants.
Les fibroblastes présents dans les compartiments dermiques de l'équivalent de derme selon l'invention peuvent en particulier être des fibroblastes papillaires et/ou des fibroblastes réticulaires.
Par fibroblaste papillaire, on entend ici des fibroblastes provenant du derme papillaire.
Par fibroblaste réticulaire, on entend ici des fibroblastes provenant du derme réticulaire.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'un des compartiments dermiques comprend des fibroblastes papillaires et un autre des compartiments dermiques comprend des fibroblastes réticulaires.
Les compartiments dermiques de l'équivalent de derme selon l'invention peuvent également contenir tout autre composant pouvant être présent constitutivement dans la peau comme des cellules endothéliales, des macrophages, des monocytes, des précurseurs de macrophages, des précurseurs de cellules dendritiques ou des cellules nerveuses.
L'équivalent de derme selon l'invention comprend, dans le sens de la longueur, au moins deux compartiments dermiques juxtaposés distincts de compositions différentes. Il peut en outre présenter des différences de composition dans le sens de la hauteur. En particulier, il peut inclure différentes couches de compartiments dermiques de compositions différentes.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un équivalent de derme tel que défini ci-dessus comprenant une étape consistant à préparer au moins deux lattices distinctes de compositions différentes juxtaposées longitudinalement, l'une des au moins deux lattices étant préparée à l'intérieur d'un moule et l'autre étant préparée à la périphérie du moule.
Les au moins deux lattices comprennent du collagène et des fibroblastes tels que définis ci-dessus, mais présentent des compositions différentes.
De préférence, l'étape de préparation des au moins deux lattices comprend la préparation d'au moins deux solutions distinctes de compositions différentes, l'une étant pour l'intérieur du moule et l'autre étant pour la périphérie du moule.
Les au moins deux solutions servant à préparer les lattices comprennent du collagène et une suspension cellulaire de fibroblastes, et présentent des compositions différentes.
Dans un mode de réalisation, l'une des au moins deux solutions comprend une suspension cellulaire de fibroblastes papillaires et l'autre des au moins deux solutions comprend une suspension cellulaire de fibroblastes réticulaires, tels que définis ci-dessus.
Dans un autre mode de réalisation, l'une des au moins deux solutions comprend du collagène glyqué et l'autre des au moins deux solutions comprend du collagène nonglyqué, tels que définis ci-dessus.
De préférence, les au moins deux solutions comprennent en outre du milieu MEM 1,76X, du SVF, du NaOH et du milieu MEM 25 mM Hepes 10% SVF.
Comme indiqué précédemment, le collagène utilisé peut être tout type de collagène, de toute origine, seul ou en mélange.
La solution peut comprendre du collagène à une concentration comprise entre 2 mg/ml et 6 mg/ml, de préférence entre 3 mg/ml et 5 mg/ml.
Lorsque du collagène glyqué est utilisé, la glycation peut être mise en œuvre par toute technique bien connue de l'homme du métier, comme par exemple décrit dans la demande de brevet français FR2792650.
De préférence, la solution comprend des fibroblastes à une concentration de 1x105 à 5x106 cellules / ml, de préférence à une concentration de 2x105 à 2x106 cellules / ml.
Dans le cadre de l'invention, les au moins deux lattices sont préparées de part de d'autre d'un moule : l'une des au moins deux lattices est préparée à l'intérieur d'un moule et l'autre est préparée à la périphérie ou extérieur du moule.
Chacune des lattices préparées de part et d'autre du moule peuvent être préparées par toute technique bien connue de l'homme du métier.
En particulier, chaque solution telle que définie ci-dessus, comprenant du collagène et une suspension cellulaire de fibroblastes, peut être déposée sur un support comprenant le moule.
De préférence, les solutions sont incubées de manière à permettre la gélification du collagène, par exemple pendant 10 à 30 min.
De préférence, le moule est retiré une fois la gélification des lattices obtenue, et les lattices sont de préférence maintenues à incuber pour permettre leur contraction. De préférence, les lattices sont ainsi maintenues à incuber pendant 1 à 7 jours, de manière encore préférée pendant 3 jours.
Le moule utilisé dans le cadre de l'invention peut être de toute forme et de toute matière adaptée à la culture cellulaire. Le moule utilisé dans le cadre de l'invention peut ainsi de forme rectangulaire ou circulaire. De manière préférée, le moule utilisé dans le cadre de l'invention est en téflon.
Dans la mesure où le contenu dermique influence la différenciation du compartiment épidermique, l'équivalent de derme comprenant longitudinalement au moins deux compartiments dermiques juxtaposés distincts selon l'invention peut servir de support pour la formation d'un équivalent de peau présentant une hétérogénéité à sa surface, hétérogénéité induite par les différents compartiments dermiques sous-jacents.
Ainsi, la présente invention concerne également l'utilisation d'un équivalent de derme selon l'invention pour la préparation d'un équivalent de peau présentant une hétérogénéité de surface.
Equivalent de peau
La présente invention concerne également un équivalent de peau présentant une hétérogénéité de surface comprenant un équivalent de derme tel que défini à la section Equivalent de derme et procédé de préparation ci-dessus.
Par hétérogénéité de surface, on entend ici que la surface de l'équivalent de peau présente des propriétés ou caractéristiques qui varient sur sa longueur, par exemple des différences de pigmentation, de différenciation de la zone épidermique de surface, de souplesse de la surface, ....
L'équivalent de peau selon l'invention comprend, sur l'équivalent de derme, un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes.
Les kératinocytes peuvent provenir de toute origine mais sont préférentiellement des kératinocytes d'origine humaine. Ils peuvent être préparés par n'importe quelle méthode bien connue de l'homme du métier. Ainsi, les kératinocytes peuvent être préparés par culture d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou par culture de kératinocytes issus de la gaine du follicule pileux.
De préférence, les kératinocytes sont des kératinocytes de peau humaine normale.
De manière encore préférée, les kératinocytes sont préparés à partir d'épiderme humain dissocié provenant de prélèvement de peau humaine normale selon la méthode décrite dans Régnier étal., Frontier of Matrix Biology, Vol. 9, 4-35 (Karger, Basel, 1981).
L'équivalent d'épiderme peut comprendre tout autre type cellulaire, tel que des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs de cellules de Langerhans et/ou des mélanocytes.
De manière avantageuse, l'équivalent d'épiderme comprend en outre des mélanocytes, et/ou des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs de cellules de Langerhans.
Les mélanocytes peuvent être isolés à partir de tout organe en contenant tel que la peau normale ou le follicule de cheveu. Préférentiellement, les mélanocytes sont isolés à partir de peau normale. Toute méthode de préparation des mélanocytes connue de l'homme du métier peut être utilisée, telle que la méthode décrite dans Olsson et al.
(1994) Acta. Derm. Venereol. 74:226-268.
Les cellules de Langerhans et/ou les précurseurs de cellules de Langerhans peuvent être tels que décrits dans la demande de brevet européen EP 789074.
De préférence, l'équivalent d'épiderme est non compartimenté longitudinalement.
Par équivalent d'épiderme non compartimenté longitudinalement, on entend ici que l'équivalent d'épiderme est préparé à partir d'une seule composition ensemencée sur les au moins deux compartiments dermiques juxtaposés distincts. Il est toutefois à noter que le derme et l'épiderme interagissant fortement, les différences dans les compartiments dermiques juxtaposés distincts peuvent induire des différences dans les propriétés de l'équivalent d'épiderme formé dans le sens longitudinal.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un équivalent de peau tel que défini ci-dessus comprenant une étape de préparation d'un équivalent de derme par le procédé de préparation d'équivalent de derme tel que défini à la section Equivalent de derme et procédé de préparation.
De préférence, le procédé de préparation d'un équivalent de peau comprend, après l'étape de préparation de l'équivalent de derme, une étape de reconstitution, sur l'équivalent de derme, d'un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes.
Cette étape de reconstitution d'un équivalent d'épiderme peut être réalisée par toute technique bien connue de l'homme du métier, telle que les techniques décrites dans les demandes de brevet EP 285471, EP285474, EP789074, EP502172, EP418035, W091/16010, EP197090, EP20753, FR2665175, FR2689904 ou celle décrite dans Asselineau et al. (1985) Exp. Cell. Res. 159:536-539, dans Asselineau et al. (1987), Models in dermato., col III, Ed. Lowe&Mailbach, 1-7 ou dans Asselineau étal. (1984) Br J Dermatol. 111 Suppl 27:219-22.
Cette étape de reconstitution peut être avantageusement précédée d'une étape de collage, dans une boite de culture, de l'équivalent de derme préparé, par exemple avec une solution de colle comprenant du milieu MEM 1,76X, du SVF, du NaOH 0,1 N et du MEM 25 mM Hepes 10% SVF.
De préférence, l'étape de reconstitution est mise en œuvre par ensemencement de kératinocytes sur l'équivalent de derme, de préférence dans un anneau d'ensemencement.
Avantageusement, après ensemencement des kératinocytes sur l'équivalent de derme, la culture peut être maintenue immergée dans un milieu nutritif qui peut être par exemple le milieu décrit par Rheinwald et Green (1975) Cell 6:317-330, milieu qui permet la prolifération des kératinocytes.
Après un temps d'incubation de préférence de 3 à 15 jours, de manière davantage préférée de 7 à 9 jours, l'équivalent de peau est de préférence maintenu à l'interface air/liquide par exemple par dépôt sur une grille métallique. Le liquide est alors préférentiellement constitué du même milieu nutritif que précédemment.
L'incubation se poursuit alors ensuite de préférence jusqu'à l'obtention d'un équivalent de peau présentant les caractéristiques d'un peau, à savoir un équivalent de derme recouvert d'un équivalent d'épiderme présentant les quatre types de couches cellulaires classiques, à savoir les couches basale, suprabasale, granuleuse et cornée. Ainsi, l'incubation se poursuit de préférence pendant une durée comprise entre 5 et 30 jours, de préférence entre 7 et 10 jours.
Utilisations
La présente invention concerne également l'utilisation d'un équivalent de derme tel que défini à la section Equivalent de derme et procédé de préparation ci-dessus ou d'un équivalent de peau tel que défini à la section Equivalent de peau et procédé de préparation ci-dessus, pour étudier les hétérogénéités de la peau ou les désordres liés à l’hétérogénéité de la peau tels que le vieillissement et/ou l'inflammation et/ou la pigmentation de la peau.
L'équivalent de derme et/ou l'équivalent de peau selon l'invention sont en particulier utiles pour étudier l'apparition de rides, l'apparition de taches pigmentaires, ou tout autre phénomène associé au vieillissement de la peau et/ou à la pigmentation de la peau, en particulier associé au photovieillissement, plus particulièrement associé à l'effet des rayonnements ultraviolets sur la peau, tel que les kératoses actiniques.
La présente invention concerne également un procédé de criblage d'un composé présentant une activité après application topique sur la peau, en particulier la peau présentant des hétérogénéités, en particulier dans le domaine de l’anti-âge comme pour le traitement des rides et ridules, et/ou dans le domaine de l’inflammation et/ou dans le domaine de la pigmentation comme par exemple pour le traitement des taches pigmentaires, ledit procédé de criblage comprenant l'application d'un composé candidat sur l'équivalent de derme selon l'invention ou l'équivalent de peau selon l'invention.
La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples cidessous.
Brève description des figures
Figure 1 : Schéma représentatif de l'équivalent de peau selon l'invention comprenant l'équivalent de derme comprenant longitudinalement au moins deux compartiments dermiques juxtaposés distincts de compositions différentes selon l'invention.
Figure 2 : (A) Histologie de l'équivalent de peau obtenu dans l'exemple, comprenant 3 compartiments dermiques juxtaposés distincts : un compartiment comprenant des fibroblastes réticulaires encadré par deux compartiments comprenant des fibroblastes papillaires. (B) Marquage de la filaggrine présente dans l'équivalent de peau obtenu dans l'exemple.
Exemple
Cet exemple montre une peau reconstruite présentant en alternance au niveau du derme des zones à fibroblastes papillaires ou réticulaires.
Préparation de l'équivalent de derme avec trois compartiments distincts
Deux solutions de fibroblastes humains, l'une comprenant des fibroblastes papillaires, l'autre comprenant des fibroblastes réticulaires, sont préparées en milieu MEM 25 mM Hepes, 10% SVF à 2x106 cellules / ml.
A partir de ces solutions de fibroblastes, deux solutions distinctes de préparation de lattices sont préparées, l'une (solution A) pour la périphérie d'un moule rectangulaire pour inclusion en téflon de 1,5 cm x 3,8 cm, l'autre (solution B) pour l'intérieur de ce moule.
La solution A comprend 3,22 ml de milieu MEM 1,76X, 0,63 ml de FXS, 0,35 ml de
NaOH 0,1 N, 0,2 ml de milieu MEM 25 mM Hepes, 10% SVF et 0,5 ml solution de fibroblastes papillaires.
La solution B comprend 3,22 ml de milieu MEM 1,76X, 0,63 ml de FXS, 0,35 ml de
NaOH 0,1 N et 0,2 ml de milieu MEM 25 mM Hepes, 10% SVF et 0,5 ml solution de fibroblastes réticulaires.
2,1 ml de collagène I en solution acido-soluble à 5 mg/ml froid sont ajoutés lentement aux solutions A et B.
Les solutions sont mélangées à la pipette jusqu'à homogénéisation.
Au centre d'une boite carrée pour microscopie de 4 cm x 4 cm, recouverte d'une solution comprenant 3,22 ml de milieu MEM 1,76X, 0,63 ml de FXS, 0,35 ml de NaOH 0,1
N et 0,2 ml de milieu MEM 25 mM Hepes, 10% SVF, est disposé le moule rectangulaire. L'ensemble est placé à 37°C.
1,7 ml de solution B sont versés dans le moule et 5,3 ml de solution A sont versés en périphérie du moule. Le tout est laissé à incubé pendant 15 à 20 min de manière à attendre la gélification.
Une fois la gélification obtenue, le moule est retiré et la boite transférée à 37°C, 5% CO2.
La préparation est ensuite maintenue à 37°C, 5% CQ> pendant 3 jours, le temps que les lattices se contractent.
Préparation de l'équivalent de peau
L'ensemencement en kératinocytes pour obtenir l'équivalent de peau complet se fait après 3 jours de contraction des lattices.
Une colle est préparée en mélangeant 0,46 ml de MEM 1,76X, 0,09 ml de SVF, 0,05 ml de NaOH 0,1 N, 0,1 ml MEM Hepes 10% SVF et 0,3 ml de collagène dialysé.
Une goutte de cette solution est déposée dans le milieu d'une boite de culture. Les lattices comprenant les 3 compartiments dermiques préparées ci-dessus sont prélevées et déposées sur la goutte de colle puis mises à l'étuve à 37°C, 5% CQ pendant 20-30 min.
Les kératinocytes sont mis en solution dans du milieu MEM 10% SVF + 3F à une concentration de 1x105 cellules / ml.
Un anneau d'ensemencement est placé sur les lattices collées et 0,5 ml de suspension cellulaire de kératinocytes sont déposés sur cet anneau. Du MEM 10% SVF+3F sont ajoutés autour de l'anneau.
L'ensemble est ensuite placé à 37°C 5% CQ> pendant 2 h.
L'anneau d'ensemencement est ensuite retiré et les boites replacées à 37 °C, 5% CO2, et incubées pendant 7 jours, le milieu étant changé deux fois par semaine.
Après 7 jours de culture en immersion les peaux sont mises en émersion : la colle autour de la peau à émerger est découpée et l'équivalent de peau transféré sur une grille d'émersion placée dans une boite comprenant du milieu MEM 10% SVF + 3F.
Les boites sont mises à 37 °C 5% CQ> et incubées pendant 7 jours, le milieu étant changé deux fois par semaine.
Analyse des équivalents de peau obtenus
L'équivalent de peau obtenu a été étudié par histologie et marquée pour mettre en évidence la filaggrine. Comme apparent sur la Figure 2, on observe sur les histologies correspondant aux zones de compartiment dermique à fibroblastes papillaires et de compartiment dermique à fibroblastes réticulaires que les zones épidermiques correspondant à ces compartiments se distinguent par la qualité de leur différenciation, moins marquée pour le compartiment à fibroblastes réticulaires par comparaison au compartiment à fibroblastes papillaires.
Ceci est confirmé, au niveau des couches granuleuses, par le marquage filaggrine qui est plus fort en présence d'une partie dermique contenant les fibroblastes papillaires par comparaison à une partie dermiques contenant des fibroblastes réticulaires.

Claims (10)

  1. REVENDICATIONS
    1. Equivalent de derme comprenant longitudinalement au moins deux compartiments dermiques juxtaposés distincts comprenant des fibroblastes et du collagène mais de compositions différentes.
  2. 2. Equivalent de derme selon la revendication 1, dans lequel au moins un des au moins deux compartiments dermiques comprend du collagène ayant subi une modification oxydative et au moins un autre des au moins deux compartiments dermiques comprend du collagène n'ayant pas subi de modification oxydative ou ayant subi une autre modification oxydative, différente du premier compartiment.
  3. 3. Equivalent de derme selon la revendication 1 ou 2, dans lequel au moins un des au moins deux compartiments dermiques comprend des fibroblastes papillaires et au moins un autre des au moins deux compartiments dermiques comprend des fibroblastes réticulaires.
  4. 4. Equivalent de peau présentant une hétérogénéité de surface comprenant un équivalent de derme selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
  5. 5. Procédé de préparation d'un équivalent de derme selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant une étape consistant à préparer au moins deux lattices distinctes comprenant du collagène et des fibroblastes mais de compositions différentes juxtaposées longitudinalement, l'une des au moins deux lattices étant préparée à l'intérieur d'un moule et l'autre étant préparée à la périphérie du moule.
  6. 6. Procédé de préparation selon la revendication 5, dans lequel l'étape de préparation des au moins deux lattices comprend la préparation d'au moins deux solutions distinctes comprenant du collagène et une suspension cellulaire de fibroblastes mais de compositions différentes, l'une étant pour l'intérieur du moule et l'autre étant pour la périphérie du moule.
  7. 7. Procédé de préparation d'un équivalent de peau selon la revendication 4, comprenant une étape de préparation d'un équivalent de derme par le procédé selon la revendication 5 ou 6.
  8. 8. Utilisation d'un équivalent de derme selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour la préparation d'un équivalent de peau présentant une hétérogénéité de surface.
  9. 9. Utilisation d'un équivalent de derme selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou
    5 d'un équivalent de peau selon la revendication 4 pour étudier les hétérogénéités de la peau telles que le vieillissement et/ou l’inflammation et/ou la pigmentation de la peau.
  10. 10. Procédé de criblage d'un composé présentant une activité après application topique sur la peau, en particulier la peau présentant des hétérogénéités, en particulier dans le
    10 domaine de l’anti-âge comme pour le traitement des rides et ridules, et/ou dans le domaine de l’inflammation et /ou dans le domaine de la pigmentation comme par exemple pour le traitement des taches pigmentaires, ledit procédé de criblage comprenant l'application d'un composé candidat sur l'équivalent de derme selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou sur l'équivalent de peau selon la revendication 4.
    Fibroblastes papillaires Fibroblastes réticulaires Fibroblastes papillaires
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997041208A1 (fr) * 1996-04-26 1997-11-06 Case Western Reserve University Regeneration de la peau au moyen des cellules souches mesenchymateuses
EP1046402A1 (fr) * 1999-04-20 2000-10-25 L'oreal Equivalent de peau agée, son procédé de préparation et son utilisation
FR2930644A1 (fr) * 2008-04-29 2009-10-30 Oreal Procede d'evaluation de la pigmentation

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1980001350A1 (fr) 1978-12-26 1980-07-10 Massachusetts Inst Technology Substitut de peau
US4604346A (en) 1984-10-09 1986-08-05 Massachusetts Institute Of Technology Skin-equivalent prepared by the use of punch biopsy
FR2612939B1 (fr) 1987-03-26 1989-06-23 Cird Equivalent de peau
FR2612938B1 (fr) 1987-03-26 1989-06-23 Cird Procede d'obtention d'un equivalent de peau et equivalent de peau correspondant
IL95429A (en) 1989-09-15 1997-09-30 Organogenesis Living tissue equivalents comprising hydrated collagen lattice and a collagen gel and their production
JPH0747043B2 (ja) 1990-04-24 1995-05-24 エイゼンバーグ，マーク 合成生体皮膚等価物
FR2665175B1 (fr) 1990-07-27 1993-12-31 Rosdy Martin Equivalent d'epiderme, son procede d'obtention et son utilisation.
FR2667246A1 (fr) 1990-10-02 1992-04-03 Imedex Biomateriau a base de collagene et des applications.
FR2689904B1 (fr) 1992-04-08 1994-12-16 Martin Rosdy Test de bronzage épidermique in vitro.
FR2743817B1 (fr) 1996-01-23 1998-03-13 Oreal Equivalent de peau comprenant des cellules de langerhans
KR100806695B1 (ko) * 2005-11-25 2008-02-27 주식회사 엠씨티티 색소화 질환 치료용 세포치료 약제학적 조성물
FR2895748B1 (fr) * 2006-01-05 2008-04-04 Oreal Modele de culture cellulaire et ses applications
FR2903702B1 (fr) * 2006-07-13 2012-10-19 Oreal Equivalent d'epiderme capable de se pigmenter obtenu a partir de cellules de la matrice, procede de preparation et utilisation
US20090286317A1 (en) * 2006-09-14 2009-11-19 Probiogen Ag Modular culture system for maintenance, differentiation and proliferation of cells
FR2928654B1 (fr) * 2008-03-17 2018-04-27 L'oreal Equivalent de peau pigmentee fonctionnelle.
EP2105499A1 (fr) * 2008-03-28 2009-09-30 Technische Universität Berlin Procédés de production de nouvelles papilles et microfollicules capillaires et leur utilisation dans des tests in vitro et implantations in vivo
FR2946662B1 (fr) * 2009-06-16 2013-06-28 Oreal Procede d'evaluation in vitro de l'activite d'un agent cosmetique ou dermatologique.
FR2950074B1 (fr) * 2009-09-16 2017-10-06 Oreal Equivalent de peau in vitro et procede de preparation

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997041208A1 (fr) * 1996-04-26 1997-11-06 Case Western Reserve University Regeneration de la peau au moyen des cellules souches mesenchymateuses
EP1046402A1 (fr) * 1999-04-20 2000-10-25 L'oreal Equivalent de peau agée, son procédé de préparation et son utilisation
FR2930644A1 (fr) * 2008-04-29 2009-10-30 Oreal Procede d'evaluation de la pigmentation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERNERD F ET AL: "An organotypic model of skin to study photodamage and photoprotection in vitro", JOURNAL OF THE AMERICAN ACADEMY OF DERMATOLOGY, MOSBY, INC, US, vol. 58, no. 5, 1 May 2008 (2008-05-01), pages S155 - S159, XP022617431, ISSN: 0190-9622, [retrieved on 20080412], DOI: 10.1016/J.JAAD.2007.08.050 *

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