WO2011033228A1 - Equivalent de peau in vitro et procédé de préparation - Google Patents

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WO2011033228A1
WO2011033228A1 PCT/FR2010/051930 FR2010051930W WO2011033228A1 WO 2011033228 A1 WO2011033228 A1 WO 2011033228A1 FR 2010051930 W FR2010051930 W FR 2010051930W WO 2011033228 A1 WO2011033228 A1 WO 2011033228A1
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skin
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extracellular matrix
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Sarah Girardeau
Hervé Pageon
Daniel Asselineau
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L'oreal
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Definitions

  • the invention relates to the field of fillers, and the evaluation of their activity.
  • fillers also called “fillers”
  • the use of fillers has developed significantly in recent years. They represent an interesting alternative solution in the treatment or the diminution of the signs of aging.
  • the main clinical signs of skin aging include the appearance of fine lines and / or wrinkles, increasing with age. These wrinkles can be deep, medium or superficial, and particularly affect the nasolabial folds, the periorbital area, the contour of the lips, the forehead (lion's wrinkle); these lines and wrinkles result in depression or furrows on the surface of the skin.
  • the fillers are injected into the cutaneous or subcutaneous tissues, subcutaneously or intradermally.
  • This is a dermal implant, that is to say substances injected directly into the skin to remedy disorders occurring at different levels of the skin or subcutaneous (dermis, hypodermis, etc.). It may be an injection into a single site, or in a limited number of points of the cutaneous or subcutaneous tissues. Subcutaneous, subdermal and / or intradermal lapping of said composition is then carried out precisely at the level of the body area to be treated.
  • This filling can be achieved by the use of non-resorbable products, such as polyacrylamide gels or polymethylmethacrylate (PMMA) particles. Nevertheless, these compounds can cause intolerance reactions of the inflammation or hypersensitivity type.
  • non-resorbable products such as polyacrylamide gels or polymethylmethacrylate (PMMA) particles. Nevertheless, these compounds can cause intolerance reactions of the inflammation or hypersensitivity type.
  • absorbable components such as proteins, fats, collagen or hyaluronic acid is preferred. But these compounds are degraded fairly quickly in the body, which reduces their effectiveness. To remedy this, it is necessary to carry out a more or less extensive crosslinking of these components. It is therefore desirable to be able to evaluate the physicochemical properties and / or the biological modifications likely to be caused by the injection of the fillers before their use in vivo in humans. For ethical reasons, it is not desirable to test this type of product in animals.
  • the use of skin equivalents based on known biomaterials is not satisfactory because the injection of fillers through the skin equivalent causes rupture of the epidermis and disorganization of the structure. Indeed, the current design of the skin equivalents does not allow sufficient thickness for an evaluation of an average amount of filling product by the injection method.
  • WO96 / 33750 discloses the reconstructed skin preparation comprising a nonwoven material based on a hyaluronic acid derivative, on which fibroblasts are seeded; various constituents may be mixed with this base, on which there is a microperforated membrane of a hyaluronic acid derivative.
  • the reconstructed skin is used for the treatment of burns or skin lesions.
  • No. 4,481,001 discloses a skin model for testing the intradermal injection of a filler such as a crosslinked collagen based on synthetic materials.
  • This model comprises an elastomeric layer mimicking the subcutaneous tissue, a dermis equivalent consisting of an elastomeric silicone gel and a layer of high tensile elastomer mimicking an epidermis.
  • This model does not contain living cells and its constituents being very different from those of the skin, it can not allow to anticipate the reactions induced by the injection of filling product in vivo. There is therefore a need to have a three-dimensional model in vitro that can mimic the cosmetic reality to evaluate the effect of filling materials on a biophysical, biomechanical or biological level.
  • the subject of the present invention is an in vitro skin equivalent comprising at least one dermis equivalent containing living fibroblasts and an extracellular matrix equivalent, characterized in that it comprises at least one inclusion of at least one filling product not containing fibroblasts, the composition of said filler being at least partially distinct from that of the extracellular matrix equivalent and in that the fibroblasts are contracted.
  • the dermis equivalent consists of a continuous gel comprising at least collagen, in which live fibroblasts are distributed.
  • the dermis equivalent comprises a so-called "free" matrix, that is to say in which the fibroblasts are oriented along axes that may be different from each other; in particular, in such a dermis equivalent, the percentage of fibroblasts oriented longitudinally with respect to the surface of the dermis equivalent is less than 50%.
  • the invention also relates to a filler product evaluation method, implementing such skin equivalent in vitro.
  • a three-dimensional structure different from a film, for example different from a collagen film.
  • it comprises at least 2 layers.
  • the fibroblasts and / or the keratinocytes are alive.
  • the smallest dimension of the inclusion is preferably greater than or equal to 0.1 cm, in particular greater than or equal to 0.5 cm, especially greater than or equal to 1 cm, these dimensions being adapted by those skilled in the art according to the desired characteristics, in particular according to the number of inclusions.
  • the one or more inclusions are arranged in the dermis equivalent so that there is at least one continuous layer of extracellular matrix containing fibroblasts on the surface and / or at the base of said dermis equivalent, according to a variant of the invention, there is no continuous layer of extracellular matrix containing the fibroblasts at the upper surface of the inclusion.
  • the constituents of the extracellular matrix will be close to those found in the skin, and will be adapted by those skilled in the art.
  • the dermis equivalent comprises at least one type I collagen matrix in which the fibroblasts are distributed. It may further contain other constituents of the extracellular matrix.
  • the term "extracellular matrix constituent" denotes molecules such as collagens, in particular collagen IV, laminins, entactin, fibronectin, proteoglycans, glycosaminoglycans, hyaluronic acid, elastin and fibrillin.
  • the dermis equivalent contains at least collagen IV and laminin; preferably, it also contains entactin.
  • the concentrations of these various constituents may be adapted by those skilled in the art and will for example be for laminin between 1 and 15% of the final volume, for collagen IV between 0.3 and 4.5% of the final volume and for entactin between 0.05 and 1% of the final volume.
  • the constituents of the extracellular matrix comprise at least collagen I, collagen III, or mixtures thereof.
  • the collagen used may be collagen of bovine origin, rat tail or fish or any other source of native collagen or genetically engineered for contraction in the presence of fibroblasts.
  • the thickness of the dermis equivalent may vary but will generally be at least 0.05 cm, in particular about 0.05 to 2 cm but may be increased without inconvenience. Similarly, its diameter will be adapted by those skilled in the art from about 3 mm to 20 cm or more.
  • the dermis equivalent may contain a mixture of papillary and reticular fibroblasts in all proportions. According to variants of the invention, the dermis equivalent essentially comprises papillary fibroblasts, according to another variant the dermis equivalent essentially comprises reticular fibroblasts.
  • the skin equivalent further comprises at least one epidermal equivalent containing keratinocytes.
  • the epidermis equivalent is differentiated stratified, and comprises at least one surface layer and at least one basal layer.
  • the keratinocytes reproduce the characteristics of an epidermis in vivo, namely a stratified multilayer epithelium with a basal layer in contact with the dermis equivalent and whose upper strata show a differentiation, reproducing depth towards the periphery. a supra-basal layer (or thorny layer), a granular layer (stratum granulosum) and a horny layer (stratum corneum) of an epidermis.
  • the keratinocytes used in the epidermis equivalent may be prepared according to any known method of the prior art. By way of example, mention may be made of culture from dissociated epidermis originating from normal or pathological skin removal.
  • the keratinocytes used are prepared from dissociated epidermis originating from normal or pathological human skin samples, in particular according to the method described in Asselineau et al. (Exp Cell Res., 159 (2): 536-9, 1985).
  • Dermal product means any natural or synthetic material, solid or liquid mixed with solid (other material), capable of being injected into the soft tissues, in particular cutaneous or subcutaneous face or body to change the shape or outlines. These may be absorbable or permanent fillers. The total duration of presence of the product in the presence of the cells may vary, for example, from 18 to 22 days.
  • Such fillers may be selected from biopolymers, synthetic polymers and autologous or allogeneic cells or transplants.
  • Calcium hydroxyapatite or calcium triphosphate particles from 10 to 80 ⁇ , possibly contained in hyaluronic acid or polysaccharide gel, eg Atléan ® , Radiesse TM)
  • Human fibroblasts eg Isolagen Therapy TM, 10 million autologous cells injected
  • hyaluronic acid in particular hyaluronic acid having different degrees of crosslinking, collagen, elastin, polylactic acid and mixtures thereof.
  • Hyaluronic acid is formed by the repetition of a hydrophilic disaccharide unit, wherein the sodium D-glucuronate is linked to N-acetylglucosamine by ⁇ 1-4 glycosidic linkages. Its chemical structure is simple, linear and uniform, without species specificity.
  • the polysaccharide In physiological condition, the polysaccharide is not in acid form but in the form of a sodium salt, sodium hyaluronate, polyanionic molecule.
  • hyaluronan In healthy tissues, its molecular weight varies from 4 to 10 million daltons (400D per unit), which gives a final product that can reach ⁇ ⁇ . Only the length and concentration of hyaluronan varies in nature. The molecular mass of dermal hyaluronan averages 2.5 million daltons. Its content varies according to age.
  • hyaluronic acid By hyaluronic acid (HA) is meant in the present description hyaluronic acid or a salt thereof, in particular its sodium salts, potassium, manganese, magnesium, and calcium.
  • hyaluronic acid is also understood to mean a mixture of molecules of different molecular masses, corresponding to more or less repetitions of the basic disaccharide unit.
  • hyaluronic acid can be obtained by extraction of tissues (for example from rooster crests) or by bacterial fermentation (such as Streptococcus equi)
  • Hyaluronic acid is soluble in water, its dissolution rate being mass dependent molecular (the higher the molecular mass, the more slowly it will be soluble), the process can be accelerated by stirring.
  • the product Because of its short half life, for use in the treatment of wrinkles by filling, the product must generally undergo crosslinking.
  • Crosslinking is essentially in an alkaline medium, using the carboxylic and hydroxyl sites of the molecule. But this crosslinking can be carried out in acidic medium, although the bonds created in this medium are significantly less resistant than in alkaline medium.
  • the crosslinking process does not change the polyanionic character of the polysaccharide, but substantially reduces the miscibility with water of the gel obtained.
  • the hyaluronic acid used is of pharmaceutical grade.
  • the conventional crosslinking technique comprises 3 steps. A step of preparation of a pharmaceutical grade hyaluronic acid, followed by drying, leaving the hyaluronan in the form of fibers. The skein of hyaluronan fiber obtained is redissolved in a buffer solution. For example, hyaluronic acid of low molecular weight is mixed with a high molecular weight acid. At this stage, the crosslinking agent is added in an alkaline medium to give a gelled mass.
  • the different crosslinking agents used to make the gels available in cosmetic surgery are:
  • BDDE 1,4 butanediol diglycidyl ether
  • a 4 th step or by addition of hyaluronic acid or by a second step of crosslinking in an acid medium In some cases a 4 th step or by addition of hyaluronic acid or by a second step of crosslinking in an acid medium.
  • the term "hyaluronic acid derivatives” is intended to mean chemically modified and / or crosslinked derivatives (having intra- or inter-chain bridges).
  • the crosslinked derivative is chosen from crosslinked derivatives of molecular weight greater than or equal to 10 6 daltons and in particular greater than or equal to 2 million. of daltons. However, this molecular weight is generally less than or equal to 15. 10 6 daltons.
  • Collagen can be of various origins, for example: human, bovine or porcine.
  • the collagen may be free or crosslinked and is preferably used at a high concentration of 35 mg / ml.
  • the crosslinking optionally leading to cross-linking between the collagen chains, after reaction with an aldehyde function, may be carried out randomly (eg with the crosslinking agent Glutaraldehyde or reducing sugar) or in a precise and specific manner.
  • the crosslinking reaction is called a glycation reaction. This reaction if it is done randomly can lead to products harmful to the biology of the skin.
  • the collagen may be crosslinked and / or specifically modified leading to the formation of beneficial glycation products for the skin.
  • the dermis equivalent contains a plurality of inclusions, in particular at least two, and in particular at least 5.
  • the inclusions may especially have a size of 10 to 15 ⁇ .
  • the volume of the filling product inclusions will represent at least 1% relative to the volume of the extracellular matrix equivalent before contraction, and will especially be between 1: 100 and 1:25, depending on the type of product. of filling used.
  • the ratio (volumic filling product / extracellular matrix equivalent) in the dermis equivalent may vary for example from 1: 2 to 1:50, especially from 1: 2 at 1: 5.
  • the skin equivalent useful in the process according to the invention may also contain endothelial cells, melanocytes, dermal papilla cells, cells of the immune system, such as lymphocytes, dendritic cells, monocyte macrophages or Langerhans cells, adipocytes, nerve cells, and mixtures thereof.
  • the model thus makes it possible to study the biological effect of a filler on inflammatory signaling and to provide information on the possible inflammatory component of a product.
  • the filling products are intended, according to the manufacturer's indications and their composition, to be injected either into the superficial part of the skin (papillary dermis) or into the middle to deep part of the skin (reticular dermis).
  • the use of dermis counterparts with a controlled content of papillary and / or reticular fibroblasts according to the present invention thus makes it possible to specifically test the effect of the product according to the depth to which it is intended or vice versa, makes it possible to determine to what depth the product will have the most beneficial effect.
  • Another aspect of the invention relates to a method for preparing a skin equivalent for evaluating biological, biophysical, biomechanical, physical effects, visual appearance changes, morphology, relief, color, in accordance with the invention.
  • Such a method comprises the following steps:
  • step b) the mixture obtained in step a is brought into contact with at least one finished volume of at least one filler
  • step a) the mixture is left in contact for a time sufficient to allow the fibroblasts to contract to obtain a gel of extracellular matrix constituents in which the fibroblasts are distributed and containing inclusions of the dermal equivalent filling product.
  • step a) the mixture of extracellular matrix components and fibroblasts is left in contact to obtain a partial gelation before carrying out step b).
  • This contact time in step a is generally short, less than 1 hour and preferably less than or equal to 15 minutes.
  • step c can vary from 3 to 6 days, for example be about 4 days ....
  • step c the surface of the dermis equivalent is seeded with keratinocytes and the culture is continued under conditions allowing one epidermis equivalent to be obtained.
  • the culture can be kept immersed in a nutrient medium which can be for example the medium described by Rheinwald and Green, 1975, (Cell, 6, (3), 317-330). which allows the proliferation of keratinocytes (named elsewhere in the text middle 3F).
  • a nutrient medium which can be for example the medium described by Rheinwald and Green, 1975, (Cell, 6, (3), 317-330). which allows the proliferation of keratinocytes (named elsewhere in the text middle 3F).
  • the skin equivalent is maintained at the air / liquid interface, for example by deposition on a metal grid.
  • the liquid is then preferably composed of the same nutrient medium as the previous one.
  • the incubation then continues until obtaining a skin equivalent having the characteristics of a skin, namely the support on which there is an epidermis equivalent having the four types of conventional cell layers, namely the layers basal, suprabasal, granular and cornea.
  • the incubation is continued for a period of between 5 and 30 days, preferably between 7 and 10 days.
  • the production method makes it possible to achieve a distinct and acellularized inclusion / zone for the exogenous filler (such as hyaluronic acid) using tools and steps determined in the collagen matrix.
  • the inclusion of filler in the gelled collagen matrix changes the conformation thereof as would have the injection of these products (fillers) into a soft tissue (mechanical effect).
  • the model according to the invention makes it possible to take into account all the physical, chemical and biological effects in the skin of the injection of the filling product.
  • the precursor mixture of lattice (extracellular matrix constituents and fibroblasts) is distributed in a enclosure in which a volume has been formed by an imprint or any means making it possible to define an area in which the precursor mixture of lattice can not be distributed.
  • Said mixture of extracellular matrix constituents and fibroblasts is distributed in the chamber with the exception of volume v1, and sufficient time is left to allow the mixture to gel, said means or imprint is then removed leaving a subsist volume v1 within the gelled mixture.
  • step b the finished volume of filling product is introduced at least partly into the volume v1 thus delimited.
  • the assembly is covered with a precursor mixture of lattice similar to that used in step a.
  • the volume v1 may be delimited by any appropriate means, in particular means at least partially sealed, such as needle, ring, core, opposing the diffusion of the precursor mixture lattice.
  • the model obtained by this embodiment is close to a final implant-type injection, namely in practice the filling of the facial wrinkle by continuous injection of the product (serial) into the skin.
  • the precursor mixture of lattice is poured into an enclosure and left in rest for a time sufficient to allow it to gel.
  • Step b is then carried out by introducing several finite volumes of filler into the gelled mixture, for example by injection or any equivalent means.
  • the model thus obtained is to be compared to a final injection of the imlerant type in serial practice in practice (multipuncture: filling a wrinkle by several injections close together and then area of the face massaged to distribute the product).
  • the time allowing the precursor mix of the gelatin to vary will vary according to the type of components and will be adapted by those skilled in the art but may vary from a few minutes to a few hours, especially from 5 to 50 minutes, for example from 6 minutes to 15 minutes. , especially about 10 minutes.
  • the matrix thus obtained is in the form of a gel and must not be solid.
  • the subject of the invention is also a method for evaluating a filling product, characterized in that a skin equivalent is prepared according to the process as described above, and in that at least one measuring device is measured. physical, chemical or biological parameter of the skin equivalent containing said filling product.
  • the measurement can be qualitative, quantitative, or semi-quantitative.
  • the evaluation procedure may also be useful for comparing several fillers and for example classifying them according to their structure and correlating with their biological effects.
  • This method makes it possible to determine in vitro the effect of a filler on all the mechanisms, and in particular its effect on cellular metabolism.
  • the measurement (or the dosage) of the level of proteins expressed by the equivalent of dermis or epidermis comprising the filling product in particular proteins expressed by the various cell types present in particularly by fibroblasts and / or keratinocytes.
  • This measurement can be carried out within the equivalent of dermis or epidermis, in particular by measuring the concentration of proteins of the extracellular matrix; it may also relate to the determination of the proteins released by the equivalent of dermis or skin in the culture supernatant.
  • the measured biological parameter may also comprise the evaluation of the proliferation rate of the cells constituting the equivalent of dermis or skin containing the filling product, in particular fibroblasts or keratinocytes.
  • the evaluation may include visualization of protein expression, or fibroblast morphology.
  • the method and the skin equivalent according to the invention make it possible to evaluate the biological, biophysical, biomechanical, physical effects, changes in visual appearance, morphology, relief, color induced by the injection of a filling product.
  • the measurement of physical, chemical or biological parameters representative of these effects may be qualitative, quantitative or semi-quantitative, and will be performed by methods known to those skilled in the art.
  • Another subject of the invention is the use of a skin equivalent as defined in the foregoing for evaluating at least one product that can be formulated as an inclusion in an extracellular matrix equivalent. and especially fillers as defined above, or mixtures thereof in all proportions.
  • Figure 1 Schematic section of a single inclusion model
  • FIG. 2 Schematic section of a series injection model
  • Example 1 Preparation of an inclusion model
  • the 'final solution lattis' is prepared in a Falcon tube.
  • a lattice 4.6 ml of MEM 1, 76X, 0.9 ml of fetal calf serum (FCS), 0.5 ml of 0.1 N NaOH, 0.28 ml of MEM Hepes 10 % FCS.
  • Fibroblasts derived from mammoplasty were previously isolated and amplified according to the method described by Bell et al, 1979 (PNAS USA, 76, 1274-1278), Asselineau and Prunieras, 1984 (Br J Derm, 1 1 1, 219-222 and Asselineau et al., 1987 (Models Derm, Vol III, Lowe and Maibach, 1/7).
  • the lattice is 'glued' to the bottom of a Corning box (60mm diameter) treated for cell culture using the following mixture: 0.46 ml MEM 1.76 X, 0.09 ml FCS, 0.05 ml NaOH, 0.1 N, 0.1 ml MEM Hépes 10% FCS. Place the can and the lattis contained, without culture medium, in the incubator for 20 min to allow the mixture of 'glue' to settle and thus fix the lattis at the bottom of the box. Place a metal ring on the lath and inoculate in the 0.5 ml ring of keratinocyte suspension initially concentrated at 100,000 cells / ml in MEM10% FCS + 3F culture medium. In the rest of the dish, add culture medium MEM10% SVF + 3F. Place all in the incubator 37 ° C, 5% C0 2 for 2 hours. At the end of this time, remove the ring.
  • FIG. 1 represents a schematic section of the model thus obtained
  • the media and buffers are prepared as described in Example 1.
  • the preparation thus produced is placed in the incubator 37 ° C., 5% CO 2 for 4 days, at the end of which the lattice has contracted to 90%. During this time, check that the lath does not adhere to the bottom of the petri dish.
  • the lattice is 'glued' to the bottom of a Corning box (60mm diameter) treated for cell culture using the following mixture: 0.46 ml MEM 1.76 X, 0.09 ml FCS, 0.05 ml NaOH, 0.1 N, 0.1 ml MEM Hépes 10% FCS. Place the can and the lattis contained, without culture medium, in the incubator for 20 min to allow the mixture of 'glue' to settle and thus fix the lattis at the bottom of the box. Place a metal ring on the lath and seed in the ring 0.5ml concentrated keratinocyte suspension initially at 100,000 cells / ml in MEM10% FCS + 3F culture medium. In the rest of the dish, add MEM10% FCS + 3F culture medium. Place all in the incubator 37 ° C, 5% C0 2 for 2 hours. At the end of this time, remove the ring.
  • the proliferation of keratinocytes on the dermis equivalent is allowed for at least 7 days.
  • the culture is then placed at an air / liquid interface using a metal grid in a petri dish in MEM10% SVF + 3F culture medium.
  • the culture is prolonged for at least one week, at the end of which the differentiation of the epidermis can be accomplished (presence of the epidermal layers: basal, suprabasal, granular and cornea).
  • Figure 2 shows a schematic section of the model thus obtained.
  • Frozen tissue sections of a reconstructed skin control (no product / no inclusion) and a reconstructed skin 'inclusion' prepared as described in Example 1 are performed for a thickness of 5 ⁇ at the cryostat.
  • the sections are rinsed with PBS and then incubated with a human anti-procollagen I primary antibody made in rats (Chemicon Ref.MAB1912) for 30 min at RT.
  • the sections are rinsed with PBS and then incubated with a secondary anti-rat antibody made in the goat and coupled to a FITC (Jackson Immunoresearch Ref.1 12095068) for 30 min at RT.
  • the sections are rinsed with PBS and counter-stained with Hoechst for 5 ", rinsed again and mounted in underlayment mounting medium.
  • the observation is carried out under a fluorescence microscope (DMDR model, Leica Microsystems).
  • the inclusion model shows an increase in procollagen I (collagen precursor which is neosynthesized) directly or in the vicinity above the inclusion of hyaluronic acid.

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Abstract

L'invention concerne un équivalent de peau in vitro comprenant au moins un équivalent de derme contenant des fibroblastes vivants et un équivalent de matrice extracellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une inclusion d'au moins un produit de comblement ne contenant pas de fibroblastes, la composition dudit produit de comblement étant au moins partiellement distincte de celle de l'équivalent de matrice extracellulaire et en ce que les fibroblastes sont contractés. Elle concerne également un procédé de préparation d'un tel équivalent de peau et un procédé d'évaluation d'un produit de comblement le mettant en œuvre.

Description

Equivalent de peau in vitro et procédé de préparation
L'invention se rapporte au domaine des produits de comblement, et à l'évaluation de leur activité.
L'utilisation de produits de comblement (aussi appelés "fillers") s'est développé de façon importante au cours de ces dernières années. Ils représentent une solution alternative intéressante dans le traitement ou la diminution des signes du vieillissement. Les principaux signes cliniques du vieillissement cutané sont notamment l'apparition de ridules et/ou de rides, en augmentation avec l'âge. Ces rides peuvent être profondes, moyennes ou superficielles, et touchent en particulier les sillons nasogéniens, la zone périorbitaire, le contour des lèvres, le front (ride du lion); ces rides et ridules se traduisent par une dépression ou des sillons à la surface de la peau.
De plus, on constate avec l'âge une perte de volume de la partie supérieure du visage, notamment au niveau des pommettes et des joues.
Par ailleurs, il existe différentes situations où il est souhaitable de remédier à la perte de tissus et de combler des dépressions cutanées telles que des déplétions fibroblastiques, les blessures, l'ablation chirurgicale partielle de tissus (par exemple dans les cas de tumeur), y compris le comblement des « dépressions » cutanées secondaires à la prise d'un traitement entraînant une lipodystrophie qui se caractérise le plus souvent par une lipoatrophie faciale et pour favoriser la cicatrisation.
Les produits de comblement sont injectés dans les tissus cutanés ou sous-cutanés, par voie sous-cutanée ou intradermique. Il s'agit ainsi d'implant dermique, c'est-à-dire des substances injectées directement dans la peau en vue de remédier aux désordres intervenant aux différents niveaux cutanés ou sous-cutanés (derme, hypoderme, etc.). Il peut s'agir d'une injection en un site unique, ou dans un nombre de points limité des tissus cutanés ou sous-cutanés. On réalise alors un nappage sous-cutané, sous- dermique et/ou intradermique de ladite composition, précisément au niveau de la zone corporelle à traiter.
Ce comblement peut être réalisé par l'utilisation de produits non résorbables, tels que des gels de polyacrylamide ou des particules de polyméthylméthacrylate (PMMA) Néanmoins, ces composés peuvent entraîner des réactions d'intolérance du type inflammation ou hypersensibilité.
On privilégie l'utilisation de composants résorbables, tels que les protéines, les graisses le collagène ou l'acide hyaluronique. Mais ces composés sont dégradés assez rapidement dans l'organisme, ce qui réduit leur efficacité. Pour y remédier il faut donc procéder à une réticulation plus ou moins poussée de ces composants. Il est donc souhaitable de pouvoir évaluer les propriétés physico-chimiques et/ou les modifications biologiques susceptibles d'être provoquées par l'injection des produits de comblement avant leur utilisation in vivo chez l'homme. Pour des raisons éthiques, il n'est pas souhaitable de tester ce type de produit chez l'animal. L'utilisation d'équivalent de peau à base de biomatériaux connus n'est pas satisfaisante car l'injection de produit de comblement à travers l'équivalent de peau provoque une rupture de l'épiderme et une désorganisation de la structure. En effet, la conception actuelle des équivalents de peau ne permet pas une épaisseur suffisante pour une évaluation d'une quantité moyenne de produit de comblement par la méthode d'injection.
Wang et al (Arch. Dermatol., 2007, 143, 155-163) décrivent les effets in vivo de l'injection d'acide hyaluronique NASHA dans la peau. Les auteurs indiquent que l'organisation de fibroblastes sur un film de collagène serait modifiée en présence d'acide hyaluronique. WO96/33750 décrit la préparation de peau reconstruite comprenant un matériau non tissé à base d'un dérivé d'acide hyaluronique, sur lequel des fibroblastes sont ensemencés; différents constituants peuvent être mélangés à cette base, sur laquelle se trouve une membrane microperforée d'un dérivé d'acide hyaluronique. Les peaux reconstruites sont utilisée pour le traitement des brûlures ou des lésions cutanées.
Le brevet US 4,481 ,001 décrit un modèle de peau pour tester l'injection intra-dermique d'un produit de comblement tel qu'un collagène réticulé, à base de matériaux synthétiques. Ce modèle comprend une couche élastomère mimant le tissu sous-cutané, un équivalent de derme constitué d'un gel de silicone élastomère et une couche d'élastomère à haut pouvoir tenseur mimant un épiderme. Ce modèle ne contient pas de cellules vivantes et ses constituants étant très différents de ceux de la peau, il ne peut permettre d'anticiper les réactions induites par l'injection de produit de comblement in vivo. II existe donc un besoin de disposer d'un modèle tri-dimensionnel in vitro pouvant mimer la réalité cosmétique pour évaluer l'effet des matériaux de comblement aussi bien sur un plan biophysique, biomécanique ou biologique.
De manière inattendue, il a été trouvé dans le cadre de la présente invention qu'il était possible d'obtenir un tel modèle en incorporant le produit de comblement au cours de la reconstruction de l'équivalent de peau. Plus particulièrement, il est désormais possible d'obtenir un modèle tridimensionnel contenant des cellules vivantes telles que des fibroblastes et permettant d'évaluer in vitro le comportement des produits de comblement lorsqu'ils seront injectés in vivo, en incorporant le produit de comblement dans la matrice extra-cellulaire avant la contraction des fibroblastes conduisant à la lattice.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un équivalent de peau in vitro comprenant au moins un équivalent de derme contenant des fibroblastes vivants et un équivalent de matrice extracellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une inclusion d'au moins un produit de comblement ne contenant pas de fibroblastes, la composition dudit produit de comblement étant au moins partiellement distincte de celle de l'équivalent de matrice extracellulaire et en ce que les fibroblastes sont contractés. L'équivalent de derme est constitué d'un gel continu comprenant au moins du collagène, au sein duquel sont répartis les fibroblastes vivants.
Avantageusement, l'équivalent de derme comprend une matrice dite "libre", c'est-à dire dans laquelle les fibroblastes sont orientés selon des axes qui peuvent être différents les uns des autres; en particulier, dans un tel équivalent de derme, le pourcentage des fibroblastes orientés longitudinalement par rapport à la surface de l'équivalent de derme est inférieur à 50%. L'invention concerne également un procédé d'évaluation de produit de comblement, mettant en œuvre un tel équivalent de peau in vitro.
Par équivalent de derme on entend une structure tridimensionnelle, différente d'un film, par exemple différente d'un film de collagène. De préférence, elle comprend au moins 2 couches.
Avantageusement, les fibroblastes et/ou les kératinocytes sont vivants.
Par inclusion au sens de la présente invention on entend un volume dont la forme et les contours peuvent être variables, mais qui est délimité par rapport à la matrice environnante. Dans un plan parallèle à la surface de l'équivalent de derme, avant la contraction de la lattis, la plus petite dimension de l'inclusion est de préférence supérieure ou égale à 0,1 cm, en particulier supérieure ou égale à 0,5 cm, notamment supérieure ou égale à 1 cm, ces dimensions étant adaptées par l'homme du métier selon les caractéristiques recherchées, notamment selon le nombre d'inclusions. De préférence, la ou les inclusions sont disposées dans l'équivalent de derme de telle sorte qu'il existe au moins une couche continue de matrice extra-cellulaire contenant des fibroblastes à la surface et/ou à la base dudit équivalent de derme, selon une variante de l'invention, il n'existe pas de couche continue de matrice extracellulaire contenant les fibroblastes à la surface supérieure de l'inclusion.
Les constituants de la matrice extra-cellulaire seront proches de ceux trouvés dans la peau, et seront adaptés par l'homme du métier. L'équivalent de derme comporte au moins une matrice de collagène de type I dans laquelle sont répartis les fibroblastes. Elle peut contenir en outre d'autres constituants de la matrice extracellulaire. Par 'constituant de matrices extracellulaires', on désigne notamment des molécules telles que les collagènes en particulier le collagène IV, les laminines, l'entactine, la fibronectine, les protéoglycanes, les glycosaminoglycans, l'acide hyaluronique, l'élastine, la fibrilline. Selon l'un des modes de réalisation de l'invention, l'équivalent de derme contient au moins du collagène IV et de la laminine; de préférence, il contient aussi de l'entactine. Les concentrations de ces différents constituants pourront être adaptées par l'homme du métier et seront par exemple pour la laminine comprises entre 1 et 15% du volume final, pour le collagène IV entre 0,3 et 4,5% du volume final et pour l'entactine entre 0,05 et 1 % du volume final. Dans l'un des modes de réalisation, les constituants de la matrice extra-cellulaire comprennent au moins du collagène I, du collagène III ou leurs mélanges.
Le collagène utilisé peut être du collagène d'origine bovine, de queue de rat ou de poisson ou toute autre source de collagène natif ou produit par génie génétique permettant une contraction en présence de fibroblastes.
L'épaisseur de l'équivalent de derme pourra varier mais sera en général d'au moins 0,05 cm, notamment d'environ 0,05 à 2 cm mais pourra être augmenté sans inconvénient. De même, son diamètre sera adapté par l'homme du métier d'environ 3 mm à 20 cm ou plus. L'équivalent de derme peut contenir un mélange de fibroblastes papillaires et réticulaires, en toutes proportions. Selon des variantes de l'invention, l'équivalent de derme comprend essentiellement des fibroblastes papillaires, selon une autre variante l'équivalent de derme comprend essentiellement des fibroblastes réticulaires.
Selon l'un des modes de réalisation avantageux de l'invention, l'équivalent de peau comprend en outre au moins un équivalent d'épiderme contenant des kératinocytes. De préférence, l'équivalent d'épiderme est différencié stratifié, et comprend au moins une couche superficielle et au moins une couche basale. Avantageusement, les kératinocytes reproduisent les caractéristiques d'un épiderme in vivo, à savoir un épithélium multicouche stratifié avec une couche basale au contact de l'équivalent de derme et dont les strates supérieures témoignent d'une différenciation, reproduisant de la profondeur vers la périphérie une couche supra-basale (ou couche épineuse), une couche granuleuse (stratum granulosum) et une couche cornée (stratum corneum) d'un épiderme.
Les kératinocytes utilisés dans l'équivalent d'épiderme peuvent être préparés selon toute méthode connue de l'art antérieur. On peut citer à titre d'exemple la culture à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou pathologique.
Préférentiellement, selon l'invention les kératinocytes utilisés sont préparés à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau humaine normale ou pathologique, en particulier selon la méthode décrite dans Asselineau et al. (Exp. Cell Res., 159(2): 536-9, 1985).
Par produit de comblement, on entend tout matériau naturel ou synthétique, solide ou liquide en mélange avec du solide (autre matériau), susceptible d'être injecté dans les tissus mous, en particulier cutané ou sous-cutané du visage ou du corps pour en modifier la forme ou les contours. Il peut s'agir de produits de comblement résorbables ou permanents. La durée totale de présence du produit en présence des cellules peut varier par exemple de 18 à 22 jours.
De tels produits de comblement peuvent être choisis parmi les biopolymères, les polymères synthétiques et les cellules ou transplants autologues ou allogéniques.
A titre d'exemples de produits de comblement, on peut citer:
Biopolymères :
• Acides hyaluroniques biotechnologiques ou aviaires, réticulés ou non (de 8 à 25 mg/ml, le plus souvent : 20mg/ml et le plus souvent à PM 3MDa ; commercialisés par exemple sous les marques Evenor®, Restylane® de Q-
Med, Juvederm® de Cornéal)
• Collagènes humains, bovins ou porcins ; réticulés ou non (ex : 35 ou 65 mg/ml ; ex2 : Evolence™, Cosmoplast® ...)
• Elastine (à partir de la tropoelastine humaine biotechnologique)
- Polymères synthétiques et autres :
• Polyacrylamide (ex : Aquamid®) • Acide polylactique (ex : NewfilF)
• Acide polyvinylique
• Hydroxyapatite de calcium ou triphosphate de Calcium (particules de 10 à 80μηΊ, peut-être contenues dans de l'acide hyaluronique ou gel de polysaccharide ; ex : Atléan®, Radiesse™)
• Polyméthylmétacrylate (ex ArtefilP, microsphères contenues dans du collagène bovin)
• Alkylimides
Cellules ou transplants (autologues/allogenic)
• Fibroblastes humains (ex : Isolagen Therapy™, 10 millions de cellules autologues injectées)
• Graisse ( injection de graisse autologue)
Avantageusement, ils sont choisis parmi l'acide hyaluronique modifié ou non, notamment l'acide hyaluronique comportant différents degrés de réticulation, le collagène, l'élastine, l'acide polylactique et leurs mélanges.
L'acide hyaluronique est formé par la répétition d'une unité disaccharidique hydrophile, dans laquelle le D-glucuronate de sodium est relié à la N-acétyl-glucosamine par des liaisons β1 -4 glycosidique. Sa structure chimique est simple, linéaire et uniforme, sans spécificité d'espèce.
En condition physiologique, le polysaccharide se trouve non sous forme acide mais sous la forme d'un sel sodique, l'hyaluronate de sodium, molécule polyanionique. Par convention, on parle d'hyaluronane. Dans les tissus sains, son poids moléculaire varie de 4 à 10 millions de daltons (400D par unité), ce qui donne un produit final pouvant atteindre Ι Ομηη. Seule la longueur et la concentration d'hyaluronane varie dans la nature. La masse moléculaire de Γ hyaluronane dermique est en moyenne de 2,5 millions de daltons. Son contenu varie en fonction de l'âge .
Par acide hyaluronique (AH) on entend dans la présente description l'acide hyaluronique ou l'un de ses sels, en particulier ses sels de sodium, potassium, manganèse, magnésium , et calcium.
Son poids moléculaire peut varier, et est généralement supérieur à 106 daltons. Au sens de l'invention, on entend également désigner par acide hyaluronique un mélange de molécules de différentes masses moléculaires, correspondant à des répétitions plus ou moins nombreuses de l'unité disaccharidique de base.
Au niveau industriel, l'acide hyaluronique peut être obtenu par extraction des tissus (par exemple de crêtes de coq) ou par fermentation bactérienne (tel que Streptococcus equi) L'acide hyaluronique est soluble dans l'eau, sa vitesse de dissolution étant masse moléculaire dépendante (plus la masse moléculaire est élevée, plus lentement il sera soluble), le processus peut être accéléré par agitation. Du fait de sa courte demi vie, pour son utilisation dans le cadre du traitement des rides par comblement, le produit doit généralement subir une réticulation. La réticulation se fait, essentiellement, en milieu alcalin, utilisant les sites carboxyliques et hydroxyles de la molécule. Mais cette réticulation peut être réalisée en milieu acide, bien que les liaisons créées dans ce milieu soient nettement moins résistantes qu'en milieu alcalin. Le procédé de réticulation ne change pas le caractère polyanionique du polysaccharide, mais diminue sensiblement la miscibilité à l'eau du gel obtenu.
Dans les procédés de réticulation, l'acide hyaluronique utilisé est de qualité pharmaceutique. La technique de réticulation classique comporte 3 étapes. Une étape de préparation d'une acide hyaluronique de qualité pharmaceutique, suivi d'un séchage , laissant l'hyaluronane sous forme de fibres. L'écheveau de fibre d'hyaluronane obtenu est remis en solution dans une solution tampon . Par exemple, l'acide hyaluronique de faible masse moléculaire est mélangé à un acide de forte masse moléculaire. A ce stade le réticulant est ajouté, en milieu alcalin pour donner une masse gélifiée. Les différents réticulants utilisés pour réaliser les gels disponibles en chirurgie esthétique sont :
- divinyl sulfone,
1 ,2,7,8 diépoxyoctane
1 ,4 butanediol diglycidyl éther (BDDE) , pour un grand nombre de produits actuellement sur le marché
Dans certains cas une 4eme étape soit par addition d'acide hyaluronique soit par une seconde étape de réticulation en milieu acide.
Au sens de l'invention, on entend par dérivés de l'acide hyaluronique notamment les dérivés modifiés chimiquement et/ou réticulés (présentant des ponts intra ou inter chaînes). De préférence, le dérivé réticulé est choisi parmi les dérivés réticulés de poids moléculaire supérieur ou égal à 106 daltons et notamment supérieur ou égal à 2 millions de daltons. Toutefois, ce poids moléculaire est généralement inférieur ou égal à 15. 106 daltons.
Le collagène peut être de diverses origines, par exemple : humain, bovin ou porcin. Le collagène peut-être libre ou réticulé et est utilisé de préférence à une concentration élevée à 35mg/ml. La réticulation conduisant éventuellement à des pontages entre les chaînes de collagène, après réaction avec une fonction aldéhyde, peut-être réalisée de façon aléatoire (ex avec le réticulant Glutaraldéhyde ou sucre réducteur) ou de façon précise et spécifique. La réaction de réticulation est appelée réaction de glycation. Cette réaction si elle se fait de façon aléatoire peut conduire à des produits néfastes pour la biologie de la peau. Le collagène peut-être réticulé et/ou modifié de façon spécifique conduisant à la formation de produits de glycation bénéfiques pour la peau.
Selon l'un des modes de réalisation de l'invention, l'équivalent de derme contient une pluralité d'inclusions, notamment au moins deux, et en particulier au moins 5.
A titre indicatif, les inclusions pourront notamment avoir une taille de 10 à 15μΙ.
De préférence, le volume des inclusions de produit de comblement représentera au moins 1 % par rapport au volume de l'équivalent de matrice extra-cellulaire avant contraction, et sera notamment compris entre 1 :100 et 1 :25, selon le type de produit de comblement utilisé. En fonction du degré de contraction de la matrice extra-cellulaire, le ratio (volumique produit de comblement / équivalent de matrice extracellulaire) dans l'équivalent de derme pourra varier par exemple de 1 :2 à 1 :50, notamment de 1 :2 à 1 :5. L'équivalent de peau utile dans le procédé selon l'invention peut aussi contenir des cellules endothéliales, des mélanocytes, des cellules de papilles dermiques, des cellules du système immunitaire, telles que des lymphocytes, des cellules dendritiques, des macrophages des monocytes ou des cellules de Langerhans, des adipocytes, des cellules nerveuses, et leurs mélanges.
Le modèle permet ainsi d'étudier l'effet biologique d'un produit de comblement sur la signalisation inflammatoire et de donner des informations sur l'éventuelle composante inflammatoire d'un produit.
La présence d'une structure et d'une composition de derme reproduisant la structure de la peau humaine est nécessaire pour évaluer l'ensemble des effets pouvant être induits par l'injection de produits de comblement. En particulier, il a été montré chez l'animal que l'injection d'acide hyaluronique réticulé stimule la production de collagène (Wang et al. arch. Dermatol. 2007; 143:155-163). Il est donc important de pouvoir évaluer ce type d'activité biologique, ce qui est possible avec le modèle selon l'invention.
Les produits de comblement sont destinés, selon les indications du fabricant et leur composition, à être injectés soit dans la partie superficielle de la peau (derme papillaire) soit dans la partie moyenne à profonde de la peau (derme réticulaire).
Les propriétés biologiques étant différentes entre les fibroblastes de la partie papillaire et ceux de la partie réticulaire, les effets d'un actif ou d'un produit peuvent donc être différents selon les cellules qui sont mises en contact. La mise en œuvre d'équivalent de derme à teneur contrôlée en fibroblastes papillaires et/ou réticulaires selon la présente invention permet donc de tester spécifiquement l'effet du produit selon la profondeur à laquelle il est destiné ou inversement, permet de déterminer à quelle profondeur le produit aura l'effet le plus bénéfique.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un équivalent de peau permettant d'évaluer les effets biologiques, biophysiques, biomécaniques, physiques, modifications d'apparence visuelle, morphologie, relief, couleur, conforme à l'invention.
Un tel procédé comprend les étapes suivantes:
a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire et des fibroblastes, ledit mélange étant placé dans une enceinte,
b) on met en contact le mélange obtenu à l'étape a avec au moins un volume fini d'au moins un produit de comblement,
c) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extracellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et contenant des inclusions de produit de comblement qui constitue l'équivalent de derme. Avantageusement, à l'étape a) le mélange des constituant de matrice extra-cellulaire et de fibroblastes est laissé en contact pour obtenir une gélification partielle avant de réaliser l'étape b). Ce temps de contact à l'étape a est généralement court, inférieur à 1 heure et de préférence inférieur ou égal à 15 minutes.
Le temps de l'étape c peut varier de 3 à 6 jours, par exemple être d'environ 4 jours.... Avantageusement, après l'étape c, on ensemence la surface de l'équivalent de derme par des kératinocytes et on poursuit la culture dans des conditions permettant l'obtention d'un équivalent d'épiderme.
De telles conditions sont connues de l'homme du métier. En particulier, après ensemencement des kératinocytes sur le support, la culture peut être maintenue immergée dans un milieu nutritif qui peut être par exemple le milieu décrit par Rheinwald et Green, 1975, (Cell, 6, (3), 317-330) milieu qui permet la prolifération des kératinocytes (nommé par ailleurs dans le texte milieu 3F) . Après un temps d'incubation de 3 à 15 jours, préférentiellement de 7 à 9 jours, l'équivalent de peau est maintenu à l'interface air/liquide par exemple par dépôt sur une grille métallique. Le liquide est alors préférentiellement constitué du même milieu nutritif que le précédent. L'incubation se poursuit ensuite jusqu'à obtention d'un équivalent de peau présentant les caractéristiques d'une peau, à savoir le support sur lequel se trouve un équivalent d'épiderme présentant les quatre types de couches cellulaires classiques, à savoir les couches basale, suprabasale, granuleuse et cornée.
Ainsi, l'incubation se poursuit pendant une durée comprise entre 5 et 30 jours , préférentiellement entre 7 et 10 jours.
Le procédé de réalisation permet de réaliser une inclusion/zone bien distincte et acellularisée pour le produit de comblement (tel que l'acide hyaluronique) exogène à l'aide d'outils et d'étapes déterminés dans la matrice de collagène. L'inclusion de produit de comblement dans la matrice de collagène gélifiée change la conformation de celle-ci telle que l'aurait fait l'injection de ces produits (fillers) dans un tissu mou (effet mécanique). On pourra aussi par exemple observer les modifications induites par le gonflement d'un produit hygroscopique tel que l'acide hylaluronique après son injection dans la peau. Ce mode d'incorporation est ainsi le plus proche de ce qui peut être réalisé dans la réalité dans le comblement de la ride. Le modèle selon l'invention permet de prendre en compte l'ensemble des effets physiques, chimiques et biologiques dans la peau de l'injection du produit de comblement. Il permet en outre de prendre en compte l'interaction entre derme et épiderme, très importante pour un produit de comblement. Selon l'un des modes de réalisation du procédé selon l'invention, on répartit le mélange précurseur de lattice (constituants de matrice extra-cellulaire et fibroblastes) dans une enceinte dans laquelle on a ménagé un volume par une empreinte ou tout moyen permettant de délimiter une zone dans laquelle le mélange précurseur de lattice ne pourra pas se répartir. Ledit mélange des constituants de matrice extra-cellulaire et de fibroblastes est réparti dans l'enceinte à l'exception du volume v1 , et on laisse un temps suffisant pour permettre au mélange de gélifier, lesdits moyens ou empreinte sont ensuite retirés en laissant subsister un volume v1 au sein du mélange gélifié. A l'étape b, on introduit le volume fini de produit de comblement au moins en partie dans le volume v1 ainsi délimité. Avantageusement, on recouvre l'ensemble par un mélange précurseur de lattice similaire à celui mis en œuvre à l'étape a.
Le volume v1 pourra être délimité par tout moyen approprié, en particulier des moyens au moins partiellement étanches, tel que pointeau, anneau, noyau, s'opposant à la diffusion du mélange précurseur de lattice.
Le modèle obtenu de par ce mode de réalisation se rapproche d'une injection finale de type implant, à savoir dans la pratique le comblement de la ride du visage par injection continue du produit (sériai") dans la peau.
Selon un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, le mélange précurseur de lattice est coulé dans une enceinte et laissé en repos pendant un temps suffisant pour lui permettre de gélifier. L'étape b est ensuite effectué en introduisant plusieurs volumes finis de produit de comblement dans le mélange gélifié, par exemple par injection ou tout moyen équivalent.
Le modèle ainsi obtenu est à rapprocher d'une injection finale de type imlant en sériai puncture dans la pratique (multiponcture: comblement d'une ride par plusieurs injections rapprochées et ensuite zone du visage massée pour répartir le produit).
Le temps permettant au mélange précurseur de lattice de gélifier variera selon le type de composants et sera adapté par l'homme du métier mais pourra varier de quelques minutes à quelques heures, notamment de 5 à 50 minutes, par exemple de 6 minutes à 15 minutes, notamment d'environ 10 minutes. La matrice ainsi obtenue est sous forme de gle et ne doit pas être solide.
L'invention a également pour objet un procédé d'évaluation d'un produit de comblement caractérisé en ce qu'on prépare un équivalent de peau selon le procédé tel que décrit dans ce qui précède, et en ce qu'on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de T'équivalent de peau contenant ledit produit de comblement. La mesure peut être qualitative, quantitative, ou semi-quantitative. Le procédé d'évaluation pourra également être utile pour comparer plusieurs produits de comblement et par exemple les classer selon leur structure et établir une corrélation avec leurs effets biologiques.
Ce procédé permet de déterminer in vitro l'effet d'un produit de comblement sur l'ensemble des mécanismes, et notamment son effet sur le métabolisme cellulaire.
Par mesure d'un paramètre biologique, on entend notamment la mesure (ou le dosage) du taux de protéines exprimées par l'équivalent de derme ou d'épiderme comprenant le produit de comblement, notamment des protéines exprimées par les différents types cellulaires présents en particulier par les fibroblastes et/ou les kératinocytes. Cette mesure peut s'effectuer au sein de l'équivalent de derme ou d'épiderme, notamment en mesurant la concentration de protéines de la matrice extracellulaire; elle peut aussi concerner le dosage des protéines libérées par l'équivalent de derme ou de peau dans le surnageant de culture.
Le paramètre biologique mesuré peut aussi comprendre l'évaluation du taux de prolifération des cellules constitutives de l'équivalent de derme ou de peau contenant le produit de comblement, en particulier des fibroblastes ou des kératinocytes. L'évaluation peut comprendre la visualisation de l'expression de protéines, ou la morphologie des fibroblastes.
Le procédé et l'équivalent de peau selon l'invention permettent d'évaluer les effets biologiques, biophysiques, biomécaniques, physiques, modifications d'apparence visuelle, morphologie, relief, couleur induits par l'injection d'un produit de comblement. La mesure des paramètres physiques, chimiques ou biologiques représentatifs de ces effets, peut être qualitative, quantitative ou semi-quantitative, et sera effectuée par des méthodes connues de l'homme du métier.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un équivalent de peau tel que défini dans ce qui précède pour l'évaluation d'au moins un produit susceptible d'être formulé sous forme d'inclusion dans un équivalent de matrice extracellulaire et notamment de produit de comblement tel que défini dans ce qui précède, ou de leurs mélanges en toutes proportions.
L'invention sera illustrée plus en détail par les exemples qui suivent
Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes:
Figure 1 : coupe schématique d'un modèle à inclusion unique
Figure 2: coupe schématique d'un modèle d'injection en série Exemple 1 : préparation d'un modèle inclusion
Les milieux et tampons utilisés sont décrits dans Bell et al, 1979 (PNAS USA, 76, 1274- 1278), Asselineau et Prunieras, 1984 (Br J Derm, 1 1 1 , 219-222) et Asselineau et al, 1987 (Models Derm, vol III, ed. Lowe et Maibach, 1/7).
Stérilement, on prépare la 'solution finale lattis' dans un tube Falcon. Pour la réalisation d'une lattis, on mélange 4,6ml de MEM 1 ,76X, 0,9ml de sérum de veau fœtal (SVF), 0,5ml de NaOH à 0,1 N, 0,28ml de MEM Hépès à 10%SVF.
A cette solution, ajouter 1 ,42 millions de fibroblastes à partir de la solution initiale de fibroblastes concentrés à 2 millions par ml dans du MEM Hépès à 10% SVF, soit 0,71 ml. Les fibroblastes issus de plastie mammaires ont été préalablement isolés et amplifiés selon la méthode décrite par Bell et al, 1979 (PNAS USA, 76, 1274-1278), Asselineau et Prunieras, 1984 (Br J Derm, 1 1 1 , 219-222) et Asselineau et al, 1987 (Models Derm, vol III, ed. Lowe et Maibach, 1/7).
A cette solution, ajouter 3ml de solution de collagène bovin (Ci=5mg/ml soluble dans 0.017N d'acide acétique), on dénommera le mélange ainsi crée solution lattis.
Réalisation technique 1 :
Déposer dans une boite de pétri (60mm de diamètre) un anneau de clonage (ensemencement bactériologique) diamètre externe 0.8 cm. Couler 7 ml de solution lattis autour de l'anneau. Attendre 10 minutes à 37°C, 5% C02 pour avoir gélification de la solution et retirer l'anneau. Dans cette dépression crée par l'anneau, déposer directement 100μΙ d'acide hyaluronique à l'aide de la seringue montée avec une aiguille. Recouvrir ensuite la totalité de cette première couche ainsi formée par 3ml de solution lattis.
L'inclusion du produit de comblement ainsi est bien concentrée au même endroit.
Réalisation technique 2 :
Déposer 9ml de solution lattis dans une boite de pétri (60mm de diamètre). Attendre 10 minutes la gélification de la solution à 37°C, 5% C02. Injecter les 100μΙ d'acide hyaluronique, directement en une seule fois, à l'aide de la seringue montée sur aiguille dans cette pré-lattis. La recouvrir de 1 ml de solution lattis. La préparation ainsi réalisée est placée à l'incubateur 37°C, 5% C02 pendant 4 jours, temps au bout duquel la lattis s'est contractée à 90%. Pendant ce laps de temps, contrôler que la lattis n'adhère pas au fond de la boîte de Pétri.
La lattis est 'collée' au fond d'une boîte Corning (60mm de diamètre) traitée pour la culture cellulaire à l'aide du mélange suivant : 0.46 ml MEM 1.76 X, 0.09 ml FCS, 0.05 ml NaOH, 0.1 N, 0.1 ml MEM Hépes 10% FCS. Placer la boîte et la lattis contenue, sans milieu de culture, à l'incubateur pendant 20 min pour permettre au mélange de 'colle' de se figer et fixer ainsi la lattis au fond de la boîte. Déposer un anneau en métal sur la lattis et ensemencer dans l'anneau 0,5ml de suspension de kératinocytes concentrée initialement à 100 000 cellules/ml dans du milieu de culture MEM10%SVF+3 F. Dans le reste de la boîte, ajouter du milieu de culture MEM10%SVF+3F. Placer le tout dans l'incubateur 37°C, 5% C02 pendant2 heures. A l'issu de ce temps, retirer l'anneau.
La prolifération des kératinocytes sur l'équivalent de derme est permise pendant au moins 7 jours. La culture est alors placée à interface air/liquide à l'aide d'une grille de métal dans une boîte de Pétri dans du milieu de culture MEM10%SVF+3F. La culture est prolongée pendant au moins une semaine, temps au bout duquel la différenciation de l'épiderme peut être accomplie (présence des couches épidermiques : basale, suprabasale, granuleuse et cornée). La figure 1 représente une coupe schématique du modèle ainsi obtenu
Exemple 2: préparation d'un modèle injection en série
Les milieux et tampons sont préparés comme décrit dans l'exemple 1 .
On coule 9ml de solution lattis dans une boite de pétri (60mm de diamètre). Attendre 10 minutes la gélification de la solution à 37°C, 5% C02. 100μΙ d'acide hyaluronique sont délivrés par dose de 10-15μΙ, à l'aide de la seringue montée sur aiguille dans toute la prélattis. Recouvrir de 1 ml de solution lattis.
La préparation ainsi réalisée est placée à l'incubateur 37°C, 5% C02 pendant 4 jours, temps au bout duquel la lattis s'est contractée à 90%. Pendant ce laps de temps, contrôler que la lattis n'adhère pas au fond de la boîte de Pétri.
La lattis est 'collée' au fond d'une boîte Corning (60mm de diamètre) traitée pour la culture cellulaire à l'aide du mélange suivant : 0.46 ml MEM 1.76 X, 0.09 ml FCS, 0.05 ml NaOH, 0.1 N, 0.1 ml MEM Hépes 10% FCS. Placer la boîte et la lattis contenue, sans milieu de culture, à l'incubateur pendant 20 min pour permettre au mélange de 'colle' de se figer et fixer ainsi la lattis au fond de la boîte. Déposer un anneau en métal sur la lattis et ensemencer dans l'anneau 0,5ml de suspension de kératinocytes concentrée initialement à 100 000 cellules/ml dans du milieu de culture MEM10%SVF+3 F. Dans le reste de la boîte, ajouter du milieu de culture MEM10%SVF+3F. Placer le tout dans l'incubateur 37°C, 5% C02 pendant2 heures. A l'issu de ce temps, retirer l'anneau.
La prolifération des kératinocytes sur l'équivalent de derme est permise pendant au moins 7 jours. La culture est alors placée à interface air/liquide à l'aide d'une grille de métal dans une boîte de Pétri dans du milieu de culture MEM10%SVF+3F. La culture est prolongée pendant au moins une semaine, temps au bout duquel la différenciation de l'épiderme peut être accomplie (présence des couches épidermiques : basale, suprabasale, granuleuse et cornée).
La figure 2 représente une coupe schématique du modèle ainsi obtenu.
Exemple 3: stimulation de la production de collagène
Des coupes de tissus congelés d'une peau reconstruite témoin (aucun produit/pas d'inclusion) et d'une peau reconstruite 'inclusion' préparée comme décrit à l'exemple 1 (produit acide hyaluronique réticulé avec BDDE, 20mg/ml) sont réalisées pour une épaisseur de 5μηι au cryostat.
Ces coupes, rincées au PBS, sont incubées pendant 2 heures avec une protéine B- HABP, (couplée à une biotine) qui reconnaît l'acide hyaluronique (Seigakagu Ref.400763-1A) à TA. Les coupes sont rincées au PBS puis incubées avec un anticorps secondaire streptavidine (couplé à un Alexa fluor 555) qui reconnaît la biotine (Invitrogen Ref.S32355) à TA pendant 45 min.
Les coupes sont rincées au PBS puis incubées avec un anticorps primaire anti- procollagène I humain fait chez le rat (Chemicon Ref.MAB1912) pendant 30min à TA. Les coupes sont rincées au PBS puis incubées avec un anticorps secondaire anti-rat fait chez la chèvre et couplé à un FITC (Jackson Immunoresearch Ref.1 12095068) pendant 30min à TA.
Les coupes sont rincées au PBS et contre-colorées avec du Hoechst pendant 5", rincées à nouveau et monter dans milieu de montage sous lamelle. L'observation est réalisée au microscope à fluorescence (modèle DMDR, Leica Microsystems).
Le résultat est représenté sur la figure 3
On observe que le modèle inclusion met en évidence une augmentation du procollagène I (précurseur du collagène qui est néosynthètisé) directement ou à proximité au-dessus de l'inclusion d'acide hyaluronique.
Les résultats sont à rapprocher de résultats in-vivo publiés, observés avec un autre acide hyaluronique réticulé.

Claims

Revendications
1 - Equivalent de peau in vitro comprenant au moins un équivalent de derme contenant des fibroblastes vivants et un équivalent de matrice extracellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une inclusion d'au moins un produit de comblement ne contenant pas de fibroblastes, la composition dudit produit de comblement étant au moins partiellement distincte de celle de l'équivalent de matrice extracellulaire et en ce que les fibroblastes sont contractés.
2- Equivalent de peau in vitro selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un équivalent d'épiderme contenant des kératinocytes.
3- Equivalent de peau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'inclusion contient un produit de comblement choisi parmi l'acide hyaluronique modifié ou non, le collagène, l'élastine, l'acide polylactique les biopolymères, les polymères synthétiques et les cellules ou transplants autologues ou allogéniques et leurs mélanges.
4- Equivalent de peau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'équivalent de derme comprend essentiellement des fibroblastes papillaires.
5- Equivalent de peau selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'équivalent de derme comprend essentiellement des fibroblastes réticulaires.
6- Equivalent de peau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend une pluralité d'inclusions.
7- Equivalent de peau selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les constituants de la matrice extra-cellulaire comprennent au moins du collagène I, du collagène III ou leurs mélanges.
8- Procédé de préparation d'un équivalent de peau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire et des fibroblastes, ledit mélange étant placé dans une enceinte,
b) on met en contact le mélange obtenu à l'étape a avec au moins un volume fini d'au moins un produit de comblement,
c) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extracellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et contenant des inclusions de produit de comblement qui constitue l'équivalent de derme. 9- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'après l'étape c) on ensemence la surface de l'équivalent de derme par des kératinocytes et on poursuit la culture dans des conditions permettant l'obtention d'un équivalent d'épiderme.
10- Procédé de préparation selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'à l'étape a) (i)on délimite un volume v1 dans une enceinte par des moyens au moins partiellement étanches, puis on répartit le mélange des constituants de matrice extra-cellulaire et de fibroblastes dans l'enceinte à l'exception du volume v1 , et on laisse un temps suffisant pour permettre au mélange de gélifier, et (ii) on retire les moyens au moins partiellement étanches, et en ce qu'à l'étape b), (i) on introduit le volume fini de produit de comblement dans le volume v1 délimité à l'étape a) et (ii) on recouvre l'ensemble par un mélange de constituants de matrice extra-cellulaire et de fibroblastes similaire à celui mis en œuvre à l'étape a).
1 1 - Procédé de préparation selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'à l'étape a, on laisse le mélange pendant un temps suffisant pour lui permettre de gélifier, et en ce qu'à l'étape b on introduit plusieurs volumes finis de produit de comblement dans le mélange gélifié.
12- Procédé d'évaluation d'un produit de comblement caractérisé en ce qu'on prépare un équivalent de peau selon le procédé de l'une au moins des revendications 8 à 1 1 , et en ce qu'on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de T'équivalent de peau contenant ledit produit de comblement.
13- Utilisation d'un équivalent de peau tel que défini dans l'une au moins des revendications 1 à 7 pour l'évaluation d'un produit de comblement.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109475666A (zh) * 2016-07-29 2019-03-15 欧莱雅 具有有区别的、并列的真皮隔室的皮肤等同物
WO2020002711A1 (fr) * 2018-06-29 2020-01-02 L'oreal Modèles cellulaires et tissulaires comprenant des fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique et leurs applications
US10729536B2 (en) 2001-02-07 2020-08-04 Avita Medical Ltd Cell suspension preparation technique and device
US11124752B2 (en) 2013-03-14 2021-09-21 Avita Medical Ltd Systems and methods for tissue processing and preparation of cell suspension therefrom

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4481001A (en) 1983-05-26 1984-11-06 Collagen Corporation Human skin model for intradermal injection demonstration or training
WO1996033750A1 (fr) 1995-04-27 1996-10-31 Fidia Advanced Biopolymers S.R.L. Peau artificielle contenant en tant que support des materiaux biocompatibles a base de derives de l'acide hyaluronique

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4481001A (en) 1983-05-26 1984-11-06 Collagen Corporation Human skin model for intradermal injection demonstration or training
WO1996033750A1 (fr) 1995-04-27 1996-10-31 Fidia Advanced Biopolymers S.R.L. Peau artificielle contenant en tant que support des materiaux biocompatibles a base de derives de l'acide hyaluronique

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASSELINEAU ET AL., EXP. CELL RES., vol. 159, no. 2, 1985, pages 536 - 9
ASSELINEAU ET AL.: "Models Derm", 1987
ASSELINEAU; PRUNIERAS, BR J DERM, vol. 111, 1984, pages 219 - 222
BELL ET AL., PNAS USA, vol. 76, 1979, pages 1274 - 1278
GREEN, CELL, vol. 6, no. 3, 1975, pages 317 - 330
PRIYA S G ET AL: "Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration", TISSUE ENGINEERING - PART B: REVIEWS 20080301 US, vol. 14, no. 1, 1 March 2008 (2008-03-01), pages 105 - 118, XP002574141, ISSN: 1937-3368 *
WANG ET AL., ARCH. DERMATOL., vol. 143, 2007, pages 155 - 163
WANG FRANK ET AL: "In vivo stimulation of de novo collagen production caused by cross-linked hyaluronic acid dermal filler injections in photodamaged human skin.", ARCHIVES OF DERMATOLOGY FEB 2007, vol. 143, no. 2, February 2007 (2007-02-01), pages 155 - 163, XP002574140, ISSN: 0003-987X *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10729536B2 (en) 2001-02-07 2020-08-04 Avita Medical Ltd Cell suspension preparation technique and device
US11124752B2 (en) 2013-03-14 2021-09-21 Avita Medical Ltd Systems and methods for tissue processing and preparation of cell suspension therefrom
CN109475666A (zh) * 2016-07-29 2019-03-15 欧莱雅 具有有区别的、并列的真皮隔室的皮肤等同物
CN109475666B (zh) * 2016-07-29 2021-08-10 欧莱雅 具有有区别的、并列的真皮隔室的皮肤等同物
WO2020002711A1 (fr) * 2018-06-29 2020-01-02 L'oreal Modèles cellulaires et tissulaires comprenant des fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique et leurs applications
FR3083246A1 (fr) * 2018-06-29 2020-01-03 L'oreal Modeles cellulaires et tissulaires comprenant des fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique et ses applications

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