CN101538555B - 功能性色素皮肤等同物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能性色素皮肤等同物。本发明涉及一种体外皮肤等同物，其特征在于，其含有至少一种真皮等同物和至少一种表皮等同物，以及其中它含有组成型产生黑色素的黑色细胞，和成纤维细胞。本发明还涉及制备皮肤等同物的方法。

Description

功能性色素皮肤等同物
技术领域
本发明涉及具有组成型色素形成的重建皮肤，和它们在评估皮肤色素形成现象的方法中的应用；因此，本发明涉及评估能够调节该色素形成的试剂的方法，无论所述色素形成是组成型的还是诱导的。本发明还涉及制备这类皮肤模型的方法。
背景技术
皮肤颜色主要由于在表皮中存在色素、黑色素。黑色素是由位于表皮基底层的特殊树突细胞，黑色素细胞合成的。黑素原生成发生在细胞器官中，负载黑色素的黑色素体经过树突被转移到附近的表皮细胞，角质细胞。
能够通过物理因子来调节色素形成，例如UV射线、或者化学因素，例如脱色(depigmenting)或者促色素形成(propigmenting)产品，和/或在皮肤功能的生理或病理修饰的过程中。
因此，期望一种模型，一方面能够实施同时在机械的和生理学方面对更好地理解皮肤的作用所必要的研究，另一方面，建立测试用于预测化妆品和/或药物制剂活性剂活性，或者局部用成分或口服剂的副作用。
目前，存在体外模型用于评估色素形成的调节。特别地，它们是下述模型：
-在试管中(ub tubo)，抑制重组人或真菌酪氨酸酶(唯一的生物化学非细胞模型)(Virador Analytical Biochem 1999)；
-正常的或来自黑色素瘤的黑色素细胞的单层单种培养(ViradorAnalytical Biochem 1999，Ni-komatsu JID 2007)；
-正常的或者无限增殖的人类黑色素细胞-角质细胞的单层共培养(Régnier Cell Mol Biol 1999，Yoon Pigment Cell Res 2003)；
-在去表皮的死真皮上或者在惰性聚碳酸酯过滤器上重建的色素表皮：仅仅由黑色素细胞和角质细胞组成的3D模型。
多年来，已经努力开发重建皮肤模型，其一方面，能够进行对于在机械的和生理学方面更好地理解皮肤的作用的必要研究，另一方面，构成化妆品和/或药物制剂活性剂活性等作为口服成分的副作用的预测测试。
EP 285471因此描述了用于从来源于毛囊鞘的角质细胞培养物制备皮肤等同物的方法；其通过在真皮等同物、分化表皮上进行接种，其中获得了结构域人表皮结构接近的皮肤等同物。
随后已经提出了各种皮肤等同物，并且已经暗示将黑色素细胞引入这些模型中。
专利FR 2689904和WO 95/10600描述了含有角质细胞和黑色素细胞的表皮等同物的制备，以及它们在在晒黑测试中的应用。然而，这些表皮等同物是在惰性载体上获得的，其没有再现与真皮的生理相互作用，并且不含油成纤维细胞或基质环境(matrix environment)。此外，由于使用种子启动子(TPA或PMA)，因此培养条件不可能将黑细胞维持于正常表型。
然而，这些模型都不能够得到对通过真皮(成纤维细胞、细胞外基质、真皮-表皮连接成分)参与的调节色素形成的理解，因为它们都不含有活性真皮。
即使开发了含有活性成纤维细胞的人类器官型模型，它们也不可能评价在生理环境下色素形成的调节，因为它们具有功能缺陷(缺乏组成型色素形成或者能够特别通过UV暴露诱导的色素形成)。
已经在去表皮的死真皮上或在海绵(胶原+GAG基质)上通过成纤维细胞的再次形成集落(recolonize)开发了色素皮肤模型。然而，黑色素细胞在其中的定位常常是不完美的，并且这些模型显现出功能缺陷。具体地，它们显示出非常少或者没有组成型色素形成，以及在这些模型中不能观察到通过UV射线或者生理学色素形成剂刺激色素形成。
植入在自由胶原(非拉紧的)基质的成纤维细胞也被用于重建色素皮肤。然而，这些模型具有不能够用于评估色素形成调节的缺点。
Bertaux等(Br J Dermatol 1988)开发了一种色素皮肤的模型，其通过将皮肤活组织样品(biopsy)引入到真皮等同物上，以使表皮细胞离开表皮并在格架表面增殖。在这种技术的缺点中，需要提到缺乏对表皮细胞的控制，以及利用活组织样品仅可能有一种皮肤重建：因此没有实验可以用于与其他进行比较(无可再现性)。此外，如Haake和Scott开发的模型(Scott and Haake，J.InvestDermatol 1991)，这种模型不能显示任何实际的功能：组成型或诱导性出现黑色素都没有被观察到。
在Archambault等人的模型中(J Invest Dermatol.1995)，在UVB射线诱导之后刺激黑色素形成，但是诱导表皮改变的剂量(细胞毒性剂量)构成了完全不能被接受的条件以能够研究在接近生理环境的体外环境中研究细胞形成及其调节。
最近，已经进行了其他的努力以在自由格架支持物(free lattice support)上重建色素重建皮肤；然而，所获得的模型不对应正常人皮肤的模型；因为，它们是使用小鼠黑色素细胞形成的(Yoshimura J Dermatol Sci 2001)，或者在存在TPA时在诱导肿瘤转化的条件下培养黑色素细胞而形成的(Liu Cell Biol Int2007)。至于由Martinhao Sauto等人(Sao Paulo Med J 2006)开发的模型，不存在黑色素细胞，或者其不显示在表皮中。
因而，需要一种模型，其能够获得对皮肤及其破环、再现人皮肤生理相互作用的相关理解。
还需要一种用于评估皮肤色素色素形成调节的方法，其能够获得对所有参与皮肤色素形成及其破坏、再现人皮肤生理相互作用的机制的理解。
特别地，需要一种皮肤等同物，其含有功能活黑色素细胞，该活黑色素细胞具有与存在于人皮肤中的相似定位，以及带有活成纤维细胞的真皮区室(dermal compartment)。
发明内容
因此，本发明的主题是一种体外皮肤等同物，其特征在于它含有至少一种表皮等同物和至少一种真皮等同物，以及特征在于它含有黑色素细胞，所述黑色素细胞组成型地合成黑色素；该黑色素被被转移到角质细胞。根据本发明的皮肤等同物还包含活成纤维细胞。
因此，根据本发明的皮肤等同物显示了组成型色素形成，即在不存在任何UV射线或者促色素形成活性剂刺激时的色素形成。术语“组成型色素形成”的意思是指黑色素细胞在未刺激的基础状态上产生黑色素的能力。这种色素形成对应存在一种黑色素细胞，其在生理条件下产生在黑色素体内部的成熟黑色素；通过黑色素细胞的树突，黑色素被移到角质细胞，其在表皮同等物中提供了色素形成的均匀分配。在黑色素细胞和附近的角质细胞中存在黑色素颗粒证明了组成型色素形成。
更特别地，本发明是一种人皮肤等同物。
特别地，本发明涉及整个以及功能性色素形成单元(或者复合物)，其包含正常的人黑色素细胞、角质细胞和成纤维细胞以及基质环境；所述单元(或者复合物)含有至少一种表皮等同物和至少一种真皮等同物，并且含有组成型和功能性色素组分(在生理学条件下是组成型以及可诱导的色素形成)。
本发明的主题还是一种方法，用于评估试剂调节色素形成的能力，其特征在于：
(a)所述试剂被施用到体外皮肤等同物上，所述皮肤等同物含有至少一种含有组成型产生黑色素的黑色素细胞的表皮等同物，和至少一种含有活成纤维细胞的真皮等同物，和
(b)将已经被施用待评估试剂的体外皮肤等同物的色素形成(i)与未被施用所述试剂的对照皮肤等同物的色素形成(ii)进行比较。
除非另外指定，术语“一种(an)”试剂在本申请中应该被理解为意思是“至少一种”。
为了比较的目的，可以广义上对色素形成的调节进行定性和定量分析。可以使用任何下列方法进行分析：
-色素形成和/或皮肤等同物的颜色，以及黑色素的量和性质，及其转移到角质细胞中以及在角质细胞中降解；作为例子，可提及的方法有通过直接或间接比色法(亮度和ITA测量)，通过选择性光谱学((窄谱反射分光光度计(mexameter)测量法)，通过皮内分析分光光度法(siascopy)，通过高效液相色谱HPLC测量法(测量DHI-黑色素，DHICA黑色素，褐色素(pheomelanin))，在使用Soluene或者氢氧化钠溶解皮肤后通过可见分光光度测定法，在使用Fontana-Nasson对黑色素染色后通过图象分析法，通过共聚焦和多光子成像法，通过电子顺磁共振法，通过射电显微镜法；
-黑色素细胞中产生的、转移到角质细胞和/或在角质细胞中被降解的黑色素体的数量，形态和成熟度；
-黑色素体蛋白质的量、成熟度和/或酶活性，例如pmel-17、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2(DCT)、MATP、蛋白质PMART-1、SCL117A、SLC24A5(nckx5)、OA1；
-黑色素细胞的数量、分布、形态(树状细胞(dendricity))；
-细胞膜、胞液和细胞核水平上受体、分子、转录因子的量、成熟度和/或酶活性，其参与黑素原形成、在树突细胞中的转运以及黑色素转移到角质细胞内以及黑色素体转移到角质细胞内。例如，可提及的例子有MC1-R、m-KIT、ETB-R、ETA-R、MITF、USF-1、SOX10、阻凝蛋白Va、Rho、Rac、Rab27A、黑色素亲和素(melanophilin)。
所使用的方法可以是用于评估蛋白质及其编码基因表达的量和活性的方法，例如多巴(Dopa)反应、免疫组织化学技术、组织染色、图像分析、分子生物学(PCR)、分子化学(WB，ELISA酶免疫检验)等技术。
更特别地，该方法使用人皮肤等同物，以及特别地至少包含来自人皮肤的黑色素细胞和/或角质细胞和/或成纤维细胞的皮肤等同物，有利地至少包含来自人皮肤的黑色素细胞。
特别地，因此，该方法应用于整个以及功能性色素形成单元(或者复合物)，其包含正常的人黑色素细胞、角质细胞和成纤维细胞以及基质环境；所述单元含有至少一种表皮等同物和至少一种真皮等同物，并且含有组成型和功能性色素组分(在生理学条件下是组成型以及可诱导的色素形成)。
事实上，在本发明中已经发现可以获得满足上述要求的模型，其具有下列特征：
-它包含参与色素形成的主要细胞参与物，即黑色素细胞，还包含其主要细胞搭档(partner)：角质细胞和成纤维细胞。
-它再现了皮肤的三维结构以考虑和实现细胞搭档之间、真皮-表皮连接和细胞外基质之间天然存在的接触和影响。
-它是功能性的，即在基础状态中色素形成(组成型色素形成)，并且能够被UV射线和/或被促色素形成试剂在再现生理现象的条件下被刺激的色素形成。
根据本发明的模型含有三种在皮肤中出现的参与色素形成的主要细胞类型，其在结构上接近皮肤，并因此能够再现通过其细胞搭档和细胞外基质调节黑色素细胞和色素形成。
事实上，在皮肤中，色素细胞与附近的表皮和真皮细胞紧密联系。利用其在基础层中的定位，在表皮-真皮分界面处，在黑色素细胞和角质细胞之间以及在黑色素细胞和成纤维细胞之间存在物理和化学联系。与这两种细胞类型的这些相互作用的功能是调节黑色素细胞和色素形成。
公认的，通过角质蛋白所释放的旁分泌(paracrine)因子，以及通过由E-钙粘蛋白所建立的直接物理连接，角质细胞调节黑色素细胞的粘附、生长和存活以及所产生黑色素的量和性质。这些因子中，可提及的例如，α黑色细胞刺激激素(MSH)、内皮素(endothelin)1(ET1)、干细胞因子(SCF)、前列腺素E2和F2α(PEG2、PEF2α)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或者神经生长因子(NGF)。
类似的，现在清楚了成纤维细胞在色素形成中所发挥的作用：通过分泌与角质细胞所产生的那些相同的因子例如bFGF、SCF或者肝细胞生长因子(HGF)，或者不同的因子例如dickkopf1和基质蛋白、成纤维细胞调节黑色素细胞的发育、生长形态和分化。
此外，真皮-表皮连接的组分，真皮细胞外基质(ECM)的分子对黑色素细胞和色素形成也具有影响。这是因为黑色素细胞通过整合素(integrin)和受体粘附到基膜(basal membrane)的分子上，特别是粘附到层粘连蛋白(laminin)和IV型胶原，并且基膜分子的存在对于纠正黑色素细胞的基础位置是必要的。真皮-表皮连接(或者DEJ)的质量(其组分和它们的定位由成纤维细胞和角质细胞之间的相互作用而产生)，会影响在DEJ的锚定(整合素)类型。
来自成纤维细胞的ECM蛋白的调节也会影响增殖，形态和正常黑色素细胞的黑素原活性。特别的，胶原I、IV型胶原、成纤维细胞和层粘连蛋白(laminin)刺激酪氨酸酶活性，和调节黑色素细胞的树突(dendricity)和它们的增殖。
此外，存在调节的细胞循环：角质细胞能够直接作用于黑色素细胞或者间接作用于成纤维细胞，其接着会调节黑色素细胞：例如，角质细胞分泌的IL-1α和TNF-α能够刺激成纤维细胞产生HGF和SCF，这接着会激活黑色素细胞。类似的，成纤维细胞可以释放细胞因子，其刺激角质细胞(例如KGF)。这些角质细胞接着会产生色素形成调节因子。
同样还已知，将皮肤暴露到阳光下会诱导色素形成的刺激；这就是晒黑，其对应黑色素细胞的瞬时激活以及黑色素合成的提高。
这种应答主要应归于搭档细胞、角质细胞和成纤维细胞的旁分泌因子，UV射线提高了所述旁分泌因子的产生。
根据本发明的模型出乎意料的能够再现这些现象并因此能够测试物质或者能够改变皮肤色素形成的刺激(stimuli)。
根据本发明的评估方法能够考虑所有这些现象，并因此评估物质或能够直接和/或间接地调节皮肤色素形成的刺激的能力。
根据本发明的皮肤等同物或者重建皮肤具有分层分化(stratifieddifferentiated)的含有至少一种表面层和至少一种基层(basal layer)的表皮等同物。有利地，角质细胞在体内再现了表皮的特征，即具有与真皮等同物接触的基层的分层的多层上皮，其上层反应了分化，从深底至外周再现了表皮的基底(suprabasal)层(或棘细胞层)、颗粒层(stratum granulosum)和表皮的角质层(Stratum corneum)。表皮等同物的表面层应被理解为意思是至少一层，其对应基底层、颗粒层或角质层。
可以根据现有技术中任何已知的方法制备用于表皮等同物的角质细胞。例如，可提及的是培养从来源于正常或病理状态皮肤样品的分离的表皮。
优选地，根据本发明，从来源于正常或病理状态的人皮肤样品的分离的表皮样品制备所使用的角质细胞，特别是根据描述在Rheinwald和Green，Cell，vol.6，331-334，1975中的方法。它们可以来源于高加索人、亚洲或者非洲人皮肤，来源于不同的解剖学位置(例如，特别是背部、脸部、胸部、手背、手掌等)，来源于暴露或者未暴露于阳光的区域。可以使用来源于正常皮肤的角质细胞。根据本发明的特定实施方案，同样可以使用来源于病理状态皮肤，例如老年斑(光化学的斑点)、黑斑病(melasma)、白癜风、痣、着色性干皮病或者黑素瘤的角质细胞。它们也可用是过表达(overexpressing)或表达不足(underexpressing)某些基因的遗传修饰的角质细胞。
黑色素细胞被整合到表皮中并且被定位在本发明表皮等同物的基层中。这些黑色素细胞被均匀地分布在表皮等同物中，即，它们的分配密度在与所述真皮等同物平行的表面中是基本上恒定的，并且与在人类皮肤中发现的那些基本上类似。因此，所有这些黑色素细胞都在本发明表皮等同物的基层中，在表皮等同物的上基层(suprabasal layer)和角质层中黑色素细胞的缺乏证明了重建的质量。
黑色素细胞是最初来源于成人、年轻人或者婴儿皮肤，特别是成人皮肤的黑色素细胞。这些黑色素细胞表达TRP-2酶，不同于毛囊的黑色素细胞。因此，所合成的黑色素的性质不同：表皮中的黑色素细胞产生由DHI-黑色素和DHICA-黑色素构成的真黑色素，然而，由于缺乏TRP-2的表达，因此，毛发中的黑色素细胞仅主要产生DHI-黑色素。
此外，皮肤黑色素细胞的主要生理学刺激是UV射线，其通过激活黑色素的黑素原形成和黑色素的重新分配，而诱导皮肤变棕色，晒黑。这种生理学功能不包括毛发黑色素细胞，其色素形成也不是由UV射线诱导的。
该黑色素细胞可以是来源于高加索人、亚洲或者非洲人皮肤，来源于各种解剖学位点(例如，特别是背部、脸部、胸、手臂部、手掌等)，来源于暴露或未暴露于阳光的区域。可使用来源于正常皮肤的黑色素细胞。根据本发明的特定实施方案，还可以使用来源于病理状态的皮肤例如老年斑(光化学斑点)、黑斑病(melasma)、白癜风、痣、干皮病黑素沉着或者黑素瘤。它们也可以是过表达(overexpressing)或者表达不足(underexpressing)某些基因的遗传修饰黑色素细胞。
定位于在基层的黑色素细胞产生黑色素体和黑色素，黑色素体和黑色素被转移到附近的角质细胞中。因此，可以再现皮肤的表型，即具有与该类型黑色素细胞相关的或多或少强烈组成型色素形成的皮肤。可以通过任何测量色素形成或黑色素量的方法，例如通过分光光度法(spectrocolorimetry)(亮度测量法)，通过高效液相色谱HPLC测量法，通过在用soluene或者氢氧化钠溶解皮肤之后的可见分光光度法，或者使用Fotana-Masson对黑色素染色后通过图像分析，通过共聚焦成像或者多光子成像，对组成型色素形成进行定量。
有利地，根据Chardon等人的技术测量(在Biological responses to ultravioletAradiation，Ed Urbach 1992)，根据本发明的皮肤等同物在不存在任何UV射线暴露和/或促色素形成试剂时，具有小于或等于80的亮度。该数值可以更低，特别是在非洲人皮肤等同物中，并且对于在非常亮到黑色的表型，该数值特别地可以在+80至-40的范围内。通常，在缺乏UV射线时，根据本发明的色素重建皮肤与不包含黑色素细胞的重建皮肤相比，具有具有至少1.5的亮度差异(ΔL)。
根据本发明的真皮等同物含有主轴定位为至少两个垂直方向的成纤维细胞。有利的，相对于真皮等同物表面，纵向定位的成纤维细胞的百分比为低于50％。
真皮等同物含有自由胶原基质或者格架，其能够在所有方向上收缩，并且在没有活组织样品时是均匀收缩的；如合适，在连续的胶原凝胶体中分布有其他细胞。
真皮等同物含有至少一种I型胶原基质，成纤维细胞分布在其中。它也可以含有其他的细胞外基质成分。术语“细胞外基质成分”特别地表示分子例如胶原，特别是IV型胶原、层粘连蛋白(laminin)、巢蛋白(entactin)、纤连蛋白(fibronectin)、蛋白聚糖、糖胺聚糖或者透明质酸。根据本发明的一个实施方案，真皮等同物至少含有IV型胶原和层粘连蛋白；优选地，它还含有巢蛋白。本领域技术人员可以对这些各种成分的浓度进行调节，例如对于层粘连蛋白，在最终体积的1％至15％之间，对于IV型胶原，在最终体积为0.3％至4.5％之间，对于巢蛋白在最终体积为0.5％至1％之间。
所使用的胶原可以是来源于牛的胶原，来自大鼠尾部或者来自鱼，或者任何其他天然胶原来源或通过在存在成纤维细胞时，允许收缩的遗传工程所制造的胶原。
该基质是通过水平和垂直的收缩获得的非拉紧胶原凝胶，其不利用成纤维细胞的优先组织。这样的基质，也称术语“自由”(free)，不会黏附到支持体上，并且它们的体积能够被无限制地更改，为其提供了不同的厚度和直径；真皮等同物的厚度通常为至少0.05cm，特别地为大约0.05至2cm，但是可以得到提高而不破坏本发明皮肤等同物的有利性质；同样地，本领域技术人员将其厚度从大约3mm调节到20cm或更大。
在含有活成纤维细胞的真皮区室与多层(multistratified)表皮等同物之间，接触是直接的，并且构成与体内所存在的类似的真皮-表皮连接，两者都来自结构观点和来自于生物化学观点。从生物化学观点，它含有基膜；致密板、透明板和基底下部分的组分，例如，尤其是IV型胶原、VII型胶原、层粘连蛋白(laminin)5、巢蛋白或者纤连蛋白。
用于根据本发明评估方法的皮肤等同物，可以还含有内皮细胞、真皮乳头细胞、免疫细胞例如淋巴细胞、树枝状细胞、巨噬细胞或朗格汉斯细胞(Langerhans)、脂肪细胞、神经细胞及其混合物。
如上所述，皮肤等同物表现出组成型色素形成，和色素形成也可以通过暴露到促色素形成剂和/或暴露到UV射线而得到增加。
特别的，在通过相当于个体的人皮肤在生理条件下所受到的每日或露天(zenithal)辐射的剂量下以UV射线刺激之后，根据本发明的模型的成纤维细胞产生了胞液因子例如参与色素形成和/或其调节的细胞因子(cytokines)或者增长因子。
此外，在UV射线刺激后，基层中黑色素细胞的数量提高到特别至少1.5倍，所述黑色素细胞的形态被改变：它们通过树突数量和它们延长的提高而显示了显著地树突度(dendricity)的提高；通过合成以及通过提高转移到表皮层，黑色素的量也提高到大于或等于1.5倍。
通过测量皮肤亮度的变化或其他定量黑色素的方法而评估色素形成的提高，例如通过使用高效液相HPLC测量、在使用soluene或者氢氧化钠溶解皮肤之后可见光分光光度测量、使用Fontana-Masson染色黑色素后图像分析或者通过共聚焦或者多光子成像。
因此，在UV射线之后，根据本发明的模型的生理学功能表现出了下列参数的改变：
-宏观颜色：暴露到UV射线的皮肤比未暴露的皮肤黑得多：通过亮度的降低而对色素形成的这种宏观刺激进行定量(DL＝4.38)。
-黑色素细胞密度：如同正常皮肤，UV射线之后，黑色素细胞密度得到提高。
-黑色素量：在UV射线之后，色素形成的确得到刺激；黑色素的量得到提高，并且通过在Fontana-Masson染色(染色以显示黑色素颗粒)之后的图像分析，或者通过在使用soluene或氢氧化钠提取之后的检验，对该提高进行定量。
本发明的主题还包括制备这类皮肤等同物的方法。特别地，该方法包括下列步骤：
a)使成纤维细胞和胶原溶液进行接触，然后孵育充分的时间，以获得在其中分布成纤维细胞的收缩的胶原基质，这构成了真皮等同物，
b)为a)中所获得的真皮等同物接种角质细胞和黑色素细胞的混合物，并在液体培养基中进行浸没式培养(immersion culture)，
c)使得在b)中获得的整个培养物(接种在真皮等同物上的角质细胞和黑色素细胞)浮现(emersion)，并在气-液界面继续培养，直到在胶原基质中含有成纤维细胞的表皮等同物上获得了分层的含有黑色素细胞的表皮等同物，这构成了皮肤等同物。
优选地，表皮等同物形成了角质层，黑色素定位于基底层之上。
可以将所获得的皮肤等同物取出，或者在其支持物上用于各种评估方法中。
可以使用I型胶原进行步骤a，特别是牛来源的或者在均匀悬浮液中的I型胶原和III型胶原的混合物(相对于格架的中终体积为大约30％)。有利地，向其添加其他成分，例如层粘连蛋白(特别地，相对于终体积的1％-15％)、IV型胶原(特别地，相对于终体积的0.3％-4.5％)和/或巢蛋白(特别地，相对于终体积的0.05％-1％)，以便获得均匀的悬浮液。
从人皮肤获得成纤维细胞，有利地来自成人皮肤。它们可以是乳头状和/或网状成纤维细胞，单独地或者任何比例的混合物，来自高加索人、亚洲人或者非洲人皮肤，来自不同解剖学位点(背部、脸部、胸部、手背、手掌等)，来自暴露或者没有暴露到光照的区域。在一个特定的实施方案中，使用来自病理状态皮肤，例如老年斑(光化学斑点)、黑斑病(melasma)、白癜风、痣、黑素瘤或者干皮病黑素沉着的成纤维细胞。它们也可以是过表达(overexpressing)或者表达不足(underexpressing)某些基因的遗传修饰成纤维细胞。
将它们培养在本领域技术人员已知的适当培养基中，接着悬浮，随后与胶原和生长因子的悬浮液混合。在大约37℃温度下，通常在36℃和37.5℃之间，将混合物孵育1-6天，优选4或5天。有利的，将混合物孵育在支持物上，所述支持物不允许混合物附着，特别是，防止混合物附着到支持物的边缘；特别地，可以通过对其表面进行预处理而获得这类支持物，例如通过为所述表面涂覆牛白蛋白或血清。因此获得了胶原凝胶，其中当除掉营养培养基时，获得的胶原凝胶在多个方向上是自由收缩的，并且在所述胶原凝胶中植入了成纤维细胞。
为了实施步骤b，使用来源于人皮肤的角质细胞，优选来自成人皮肤。它们可以来源于高加索人、亚洲人或者非洲人，来源于不同的解剖学位点(背部、脸部、胸部、手背、手掌等)，来源于暴露或者没有暴露在光照的区域。在一个特定的实施方案中，使用来源于病理状态皮肤的角质细胞，例如老年斑(光化学斑点)、黑斑病(melasma)、白癜风、痣或者黑素瘤。它们也可以是过表达(overexpressing)或者表达不足(underexpressing)某些基因的遗传修饰角质细胞。
可以根据常规的细胞培养方法获得角质细胞的制备物。
特别地，可以使用从个体提取的皮肤外植体(explant)实施下列程序：
-使用解剖刀取出皮下组织；
-通过抗生素处理来净化皮肤样品(例如：庆大霉素)；
-通过蛋白质水解处理从表皮上分离真皮(例如：胰蛋白酶和分散酶)，接着切片；
-随后在存在0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的溶液时，促进细胞的解离；通过添加含有10％血清的DMEM培养载体来中和胰蛋白酶的效果；
-对细胞悬浮液进行匀浆，并随后根据Rheinwald和Green(Cell，1975)的技术在角质细胞培养基中进行清洗。
在根据Rheinwald和Green(Cell，vol.6，331-344，1975)的技术进行接种之前，通过在本领域技术人员已知的合适培养其中在由3T3成纤维细胞构成的滋养支持物上的培养，在存在生长因子特别是氨基酸、血清、霍乱毒素、胰岛素、三碘甲状腺氨酸和pH缓冲溶液时，对角质细胞进行扩增。特别地，这类培养基可以特别地含有至少一种角质细胞的有丝分裂原生长因子(例如表皮生长因子(EGF)和/或角质细胞生长因子(KGF)，特别是KGF)，胰岛素，氢化可的松，以及任选地抗生素(例如：庆大霉素、两性霉素B)。
有利地，所述培养基还可以含有血清或者垂体提取物，例如牛来源、肾上腺素、铁传递蛋白和/或非必需氨基酸的提取物。
黑色素细胞是来源于年轻人或者成年人皮肤的黑色素细胞，来自高加索人、亚洲人或者非洲人皮肤，来自不同的解剖学位点(背部、脸部、胸部、包皮、手背、手掌等)，来自暴露或者没有暴露在光照的区域。在一个特定的实施方案中，使用来源于病理学的皮肤的黑色素细胞，例如老年斑(光化学斑点)、黑斑病(melasma)、白癜风、痣或者黑素瘤。它们也可以是过表达(overexpressing)或者表达不足(underexpressing)某些基因的遗传修饰黑色素细胞。
在不存在佛波醇酯时，通过在适当的培养基中的培养对它们进行扩增，所述适当的培养基包括基础培养基例如DMEM/F12或者MCDB153，并且补充了黑色素细胞特异性生长因子(例如，bFGF、SCF、ET-1、ET3或者αMSH)，和特别地，在M2培养基(Promocell)或者其他培养基例如M254(CascadesBiologicsTM)中。
黑色素细胞以及角质细胞的细胞悬浮液是从这些培养物制备的，并且被混合以获得混合的角质细胞/黑色素细胞悬浮液。黑色素细胞/角质细胞的比例可以在1∶10和2∶1之间，以及通常为大约1∶1。
因此，根据本发明的皮肤等同物的制备方法包括分别在它们各自生长培养基中扩增角质细胞和黑色素细胞的步骤。然后，使细胞分离，并直接以限定的密度和限定的比例共接种到真皮等同物上。
该方法包括在扩增过程中，以及将表皮细胞接种到真皮等同物上的过程中，对每种类型细胞的更好适应性和可能的控制。对所接种每种细胞的量以及比例的这种控制代表了工业应用上就控制表皮重建以及再现性而言的优点。
因此，根据本发明的变型，可以看出，可以使用来自正常皮肤的角质细胞和黑色素细胞，或者可以使用来自病理状态皮肤的黑色素细胞和角质细胞，甚至可以使用一半来自病理状态皮肤的细胞类型，另一半对应正常的健康细胞。
将这种混合的悬浮液沉积在真皮等同物上；并有利地将真皮等同物通过生物材料例如胶原贴到支持物上。将黑色素细胞/角质细胞悬浮液沉积在环上或者任何等同的装置上以将其维持在划界的表面部分(delimited surface part)上。液体营养培养基以一种覆盖细胞混合物的方式添加进去；该培养基含有本领域技术人员已知的生长因子，特别是EGF和/或KGF。定期更换培养基，并以浸没方式继续培养，通常持续2到10天之间，特别是5至8天，大约7天。有利地，培养基从浸没的第2天开始含有KGF，以及理想地在沉浸的第4天开始。
如上所述，皮肤等同物可以含有正常的成纤维细胞和/或病理来源的成纤维细胞。这些不同类型的真皮可以从正常或病例状态角质细胞/黑色素细胞的混合物制备的表皮等同物结合。
随后，将皮肤以本身已知的方式浮现，以获得角质细胞的分化以及分层表皮等同物的形成。该步骤c对应对空气-液体界面处作为高出水面的部分(emersion)继续进行培养，直到获得分化的结构，通常大约为7天。然而，步骤c可以延续更长实践，例如大约28天，而同时保存了具有上文中所限定有利特征的皮肤等同物。营养培养基可以被定期更换。随后，取出皮肤等同物已进行必需的测试。
制备方法不使用诱变物质例如TPA或PMA，并且细胞没有展示出任何肿瘤类型的变化。
可以根据本发明获得的皮肤模型显示出组成型色素形成，以及允许可诱导色素形成的功能，对于没有任何移植到更完整活生物的体外模型就是如此。
根据本发明的皮肤模型能够从各种角度理解调节黑色素原形成的途径。这可以由对黑色素细胞的直接活性反映，也可以由角质细胞、成纤维细胞、整体三位环境以及微环境影响所介导的(促色素形成或抗色素形成)活性反映。
特别地，其可以用于各种评估方法。
在实施本发明方法中要被评估的试剂可以是任何化学或生物学物质或化合物或物理处理或现象，其可以调节或者能够直接或间接调节色素形成。
作为可以根据本发明来评估的物理处理的例子，可提及的有光辐射，例如UV或者IR射线，特别是利用LED(发光二极管)处理。
表述“将试剂应用到皮肤等同物”的意思是激发待评估的试剂与至少一部分皮肤等同物之间的相互作用的事实，而不管是通过直接接触，还是通过其他方式。
特别地，本发明涉及筛选可以调节色素形成的试剂的方法，所述试剂可以是化合物或化合物的混合物，特别是通过化学合成或者通过从植物或者细菌/酵母原材料提取而获得的。该方法特别可以用于筛选并鉴定用于化妆品领域的中的活性剂。因此，所述试剂可以是任何分子、生长因子、维甲酸衍生物、激素或者能够影响表皮、真皮或者连接区室(compartment)的植物提取物。调节器可以是siRNA或者antagomirs。
该方法还可以用于评估用于制药领域特别是皮肤病领域的活性剂的色素形成调节。
根据其他方面，根据本发明的方法能够评估当施用色素形成调节剂时，所参与的各种因子的修饰作用。
术语“调节色素形成”的意思是，根据本发明，改变组成型或者诱导的皮肤色素形成，无论是提高，还是降低或者抑制，不管是直接还是间接。
在根据本发明的方法中，对照皮肤等同物将在与施用待评估试剂的皮肤等同物的那些相同的条件下制备和储存，并在相同的时间对对照皮肤等同物和已经接受待评估试剂的皮肤等同物进行色素形成的测量。
根据一个实施方案，通过直接与一部分皮肤等同物接触，而施用待评估的试剂。根据另外一个实施方案，还可以在所述皮肤等同物的培养基中施用试剂，甚至通过将试剂与皮肤等同物的成分之一进行间接接触的方法。作为向皮肤等同物施用试剂的非限制性可替换方法，特别需要提到注射、中胚层疗法(mesotherapy)或者离子导入法。
特别地，待评估的试剂可以被施用到皮肤等同物，所述皮肤等同物至少包含来自色素异常例如老年斑(光化学斑点)的成纤维细胞和/或角质细胞和/或黑色素细胞。
根据本发明方法的实施方案之一，待评估的试剂是色素形成抑制剂，其中期望测量其脱色素(depigmenting)和/或抗色素形成活性。特别地，该方法能够评估期望防止，减缓或者减小色素斑点和/或色素紊乱的产品的效果。
根据其一方面，该方法能够评估脱色剂，也就是评估所述减少组成型或者诱导的色素形成试剂的能力。
根据其他方面，该方法针对评估抗-色素形成剂，即测试所述试剂防止和/或减少所诱导的色素形成的能力。
根据本发明的一方面，待评估的产品被将施用在上述的病理模型中，例如过度色素形成或不足色素形成的异样，例如白癜风、黑素瘤、痣、光化学斑点、malasma等，使用从这些病理状态分离的或者已经遗传修饰(沉默、过表达等)的细胞(黑色素细胞以及角质细胞或者成纤维细胞)
根据本发明的方法的另一个实施方案，待评估的活性剂是单独或者同UV射线联合促进色素形成的试剂。
另外，根据一个特定的实施方案中，皮肤等同物还被接受了UV射线，其中UV射线是在实施待评估试剂之前、同时和/或之后施用，或者施用了与对照皮肤等同物相同的时间。
特别地，根据本发明的方法将用于评估防晒剂。
本发明还能够评估色素形成-调节剂的光防护(photoprotective)能力。这将包括在所述试剂刺激或抑制色素形成前或后UV曝光所诱导的损伤水平进行比较，特别是对日灼细胞(sunburn cell)的形成，对DNA的损伤以及氧化应激等。
如上所述，皮肤等同物展示出组成型色素形成，并且另外可以通过暴露到促色素形成剂(propigmenting agent)和/或UV射线而提高色素形成。
特别地，在使用UV射线以等价于在生理条件下个体的人皮肤所接受的每日或露天辐射的剂量刺激之后，根据本发明模型的成纤维细胞产生胞液因子(cytosoluble factors)，例如参与色素形成和/或其调节的细胞因子或者生长因子。
此外，在UV刺激后，基层中黑色素细胞的数量提高到特别是至少1.5倍，所述黑色素细胞的形态被改变：它们由于树突数量和它们延长的提高而显示了显著地树突度(dendricity)的提高；黑色素的数量也被增加，并通过到表皮层的增加的转移，所述增加是大于或等于1.5倍。
通过测量皮肤亮度的变化或其他定量黑色素的方法而评估色素形成的提高，例如通过使用高效液相HPLC测量、在使用soluene或者氢氧化钠溶解皮肤之后可见光分光光度测量、使用Fontana-Masson染色黑色素后图像分析或者通过共聚焦或者多光子成像。
根据本发明的方法能够评估UV射线对色素形成的影响，该UV射线能够直接作用于黑色素细胞和/或间接作用于角质细胞，这又激活黑色素细胞(对黑色素原形成，或黑色素细胞增值或粘附发挥作用)。
其还可以独特地评估UV射线对色素形成的影响，其中UV射线能够作用于：
-成纤维细胞，细胞外的基质蛋白质，和真皮-表皮连接处的成分。作为应答，这些诱导的因子或者改变能够直接刺激黑色素细胞和/或间接刺激角质细胞，这又将刺激黑色素细胞。
·角质细胞，这又将调节成纤维细胞，细胞外基质蛋白质，和真皮-表皮连接成分，进而调节色素形成。
它还可以测试干扰组成型色素形成或阳光诱导的色素形成(晒黑)的产品或者分子：减缓、抑制或者刺激，局部地或者全身地。
-脱色剂，抗色素形成剂
-促色素形成试剂(单独或结合UV射线的色素形成激活剂)。
根据本发明的评估方法的一个变型，还利用对其色素形成促进活性或，相反地，其色素抑制活性已知的对照产品，进行附加组的测量。
在该变型中，还将已经被施用待评估试剂的体外皮肤等同物的色素形成(i)，与已经被施用色素形成促进或色素形成抑制对照物质的皮肤等同物的色素形成(iii)进行了比较。
还可以，例如，在色素形成促进剂的情况中，选择保留的试剂，对于该试剂色素形成至少大于或等于对对照物质所观察到的色素形成。相反地，在脱色素试剂的情况中，可以保留该试剂，对于该试剂色素形成低于或等于对对照物质所获得的色素形成。
一方面，还可以比较已经施用待评估试剂的皮肤等同物与对照皮肤等同物(i)-(ii)之间所测量的色素形成中的变化，且另一方面，可以比较已经施用对照物的皮肤等同物与对照皮肤之间(iii)-(ii)之间所测量的色素形成中的变化，所选择的试剂将是色素形成的调节至少等于对照物质所测量的那些的试剂。
根据一个特定的实施方案，体外的皮肤等同物至少含有角质细胞，黑色素细胞和/或成纤维细胞，其已经被遗传修饰，特别地通过cDNA的过表达，通过经由定点诱变或使用dsRNA，根据siRNA技术或利用shRNA的表达的基因淬灭。
根据另一个实施方案，该真皮等同物含有细胞外基质等同物，所述细胞外基质等同物的成分至少含有I型胶原，并且该成分与来自健康青年皮肤的细胞外基质等同物相比已经经历了至少一次修饰。例如，这可以包括构成真皮等同物的大分子的性质、量或比例的变化和/或化学修饰。所述真皮等同物的组成和/或特别是存在的IV型胶原、层粘连蛋白(laminins)、巢蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、葡胺聚糖和/或透明质酸的比例因此可以改变超出通常使用和上面所指定的浓度。特别地，细胞外基质等同物的成分可以经历选自糖基化(glycation)，交联和氧化的化学修饰。
根据本发明的方法能够从各种角度理解调节黑色素原形成的途径。这可以由对黑色素细胞的直接活性反映，但也可以由被角质细胞、成纤维细胞、整体三位环境以及微环境影响所介导的(促色素形成或抗色素形成)活性反映。
它可以评估试剂对色素形成的影响，其中所述试剂能够作用于：
·成纤维细胞，细胞外的基质蛋白质，和真皮-表皮连接处的成分。作为应答，这些诱导的因子或者改变能够直接刺激黑色素细胞和/或间接刺激角质细胞，这又将刺激黑色素细胞；
·角质细胞，这又将调节成纤维细胞，细胞外基质蛋白质，和真皮-表皮连接成分，并进而调节色素形成。
因此，该方法可以用于：
·测试对来源于过度色素形成(hyperpigmented)或者不足色素形成(hypopigmented)的细胞色素形成的影响，所述过度色素形成或者不足色素形成例如白癜风、黑素瘤、痣、光化学斑点、黑斑病等，这里使用已从这些病理状态分离的或者已经遗传修饰(沉默(silencing)、过表达等)的细胞(黑色素细胞，但也可是角质细胞或者成纤维细胞)；
·研究破坏角质细胞或者成纤维细胞(病理状态角质细胞或者成纤维细胞)对色素形成的影响；
·用于研究破坏细胞外基质对色素形成(糖基化、桥接(交联))、细胞外基质的大分子的氧化或大分子性质、量和比例的改变的影响。
本发明还涉及生产重建皮肤的试剂盒，其含有真皮支持物、黑色素细胞和角质细胞，和上述培养基。
本发明在其后实施例中更详细地解释。在这些实施例中，参考下列附图：
附图说明
图1：人类重建色素皮肤
图2：人类重建色素皮肤，其具有与黑色素细胞类型相关的组成型色素形成。
图3：使用UV射线在重建色素皮肤中诱导色素形成
图4：在重建色素皮肤中使用α-MSH诱导色素形成。
具体实施方式
实施例1：皮肤等同物的制备
格架(lattices)的制备(D-4)
使用牛I型胶原和来源于真皮的人成纤维细胞制备真皮等同物。
根据Asselineau等人1985(Exp Cell Res.vol.159，536-539)和Bernerd和Asselineau1997(Dev Biol，vol.183，123-138)中描述的技术，使用牛I型胶原和来源于真皮的人成纤维细胞制备真皮等同物。该用含有10％血清的MEM对有盖培养皿(Petfi dish)进行预涂覆。
在倒入含有细胞的胶原制剂之前，将层粘连蛋白的溶液(3％/最终体积)、IV型胶原(1.5％/最终体积)和巢蛋白(0.35％/最终体积)加入到混合物中，剧烈搅拌。将该悬浮液置于孵育器(37℃-5％CO2)中，以使格架能够收缩。
接种角质细胞和黑色素细胞(D0)
在格架收缩之后，将角质细胞和黑色素细接种在真皮等同物上。
为此，在接种前，细胞在它们各自的生长培养基中扩增7天：
在黑色素细胞的培养基，缺乏任何佛波醇酯的M2培养基(Promocell)中扩增黑色素细胞。
通过在由3T3成纤维细胞构成的滋养(feeder)支持物上的培养，根据Rheinwald和Green，Cell，vol.6，331-344，1975中的技术对角质细胞进行扩增。
为了在真皮等同物上接种角质细胞和黑色素细胞，首先，将格架使用基于胶原的制剂(对于2个格架，0.46ml的1.76X MEM+0.09ml的FCS+0.05ml的0.1N的NaOH+0.1ml的MEM Hepes 10％FCS+0.3ml的透析胶原)附着到培养皿的底部。
使用胰蛋白酶对黑色素细胞和角质细胞进行处理，并将细胞悬浮液调节到200000个细胞/ml的浓度，均利用由下列构成的培养基：MEM10％FCS+2mM的L-谷氨酰胺+1mM的丙酮酸钠+1X非必需氨基酸+0.2％的青霉素/链霉素+0.1％的抗真菌抗生素+10ng/ml的EGF，10-10M霍乱毒素+0.4μl/ml的氢化可的松+0.625μl/ml的补充混合物(Promocell)＝PRP培养基。
用0.25ml的角质细胞悬浮液和0.25ml的黑色素细胞悬浮液制备黑色素细胞和角质细胞的混合悬浮液。因此最终的悬浮液含有50 000个角质细胞和50 000个黑色素细胞，该最终的悬浮液沉积在置于所附着格架上的环内部(直径为14mm)。在环周围加入6ml的PRP培养基。
将培养皿置于37℃-5％CO2的孵育器中。2小时后，取出环。2天后，更换(refreshed)相同的培养基。
接种4天后，使用KGF(10ng/ml)替换PRP培养基的EGF(10ng/ml)。
重建色素皮肤的浮现的培养(D7)
沉浸-培养7天后，皮肤露出筛子(气-液界面)。每2天更换培养基。
浮现7天后，准备取出与正常人皮肤表现出形态非常相近的皮肤，并进行分析，或者对于各种实验，能够在培养物中保持更长的实验，而培养基则为每2天更换一次。
实施例2：含有3种细胞类型的人重建色素皮肤：黑色素细胞、角质细胞 和纤维源细胞(图1)
浮现7天后，皮肤展示出与人皮肤相近的组织学和三维结构。
它具有分层和分化的由各种细胞层(基底、棘状-细胞、粒状的)和角质层组成的表皮。
该真皮含有植入在胶原基质中的活成纤维细胞(图1A)。
黑色素细胞整合到表皮中并显示出于正常皮肤相似的形态和密度(图1C，在分离的表皮上的DOPA反应)。他们明确地定位在基底层(图1B，TRP1免疫标记，虚白线表示真皮-表皮连接处)，以及产生黑色素体和黑色素，其被转移到附近的角质细胞中(图1D，利用Fontana-Masson染色黑色素)。
实施例3：人重建色素皮肤，其具有与黑色素细胞类相关的组成型色素形 成(图2)
该模型能够整合从最低色素到最高色素(显著模型(sound model))的各种黑色素细胞株，或多或少形成色素的所重建皮肤的表型(phenotype)对应于所使用的黑色素细胞类型(物理维持)：事实上，黑色素细胞株的色素越多(M03～M504)，皮肤的宏观颜色越深，切片上可看到的黑色素的量越大。该宏观色素形成是由亮度的降低反映的(图2，亮度)。
实施例4：使用UV射线在重建色素皮肤中诱导色素形成(图3)
从浮现的7天开始，将重建皮肤进行太阳UV射线以诱导色素形成。使用太阳模拟器：其发出光谱与太阳相当的UVB射线和UVA射线(UVB/UVA比为14)。将皮肤暴露到UVB射线3次，每2天1次。在最后一次曝光之后48小时，取出皮肤。并在不暴露到太阳模拟器时进行对照条件。
在进行UV射线的皮肤中，黑色素细胞仍存在，并明显定位在基层(图3，TRP1免疫标记。虚白线表示真皮-表皮连接处)。它们被UV射线激活：与未暴露皮肤相比，它们的数目多(图3，黑色素细胞密度图表)，树枝状更多，并且多巴反应的反应性更强。与对照皮肤相比，在暴露于光的皮肤中Fontanna-Masson染色之后，测量黑色素量的提高(X1.8倍)(图3，黑色素的量)。通过测量亮度(L*)而对通过UV射线的色素形成刺激进行量化：亮度的减少(ΔL＝4.38)显示UV暴露的皮肤比未暴露的皮肤更黑(图3，亮度)。
实施例5：在重建色素皮肤中使用促色素形成剂诱导色素形成(图4)
在存在已知的促色素形成剂αMSH(被从浮现期开始以50nM的浓度置于培养基中)时，18天后所提取的皮肤宏观上形成色素更多。亮度测量确认了这种变棕色，因为在未处理皮肤和使用αMSH处理的皮肤之间存在6.7点的降低(图4，亮度)。
在存在αMSH时，黑色素细胞树枝状更高，并且通过Fontana-Masson标记产生了多得多的可见得黑色素(图4，Fontana-Masson染色)。

Claims (17)

1.体外皮肤等同物，特征在于其含有至少一种表皮等同物和至少一种真皮等同物，其中所述表皮等同物含有形成至少一层基层和至少一层表面层的角质细胞和所述真皮等同物含有“自由”胶原格架，并且其特征在于，所述皮肤等同物含有组成型产生黑色素的黑色素细胞，以及活成纤维细胞，所有黑色素细胞都位于表皮等同物的基层中，和真皮等同物含有成纤维细胞分布在其中的I型胶原基质，
其中该基质是通过水平和垂直的收缩获得的非拉紧胶原凝胶，其不利用成纤维细胞的优先组织，该基质被称为“自由”的。
2.如前述权利要求所述的体外皮肤等同物，其特征在于，在真皮等同物中，相对于真皮等同物的表面，被纵向定位的成纤维细胞的百分比小于50％。
3.如前述权利要求1和2任一项所述的体外皮肤等同物，其特征在于，所述黑色素细胞是来源于人皮肤的黑色素细胞。
4.如前述权利要求1和2任一项所述的皮肤等同物，其特征在于，它们的色素形成是通过暴露于促色素形成剂和/或UV射线而得到提高。
5.制备前面任意一项权利要求所述的皮肤等同物的方法，其特征在于，该方法包含有下列步骤：
a)使成纤维细胞和胶原溶液进行接触，然后孵育充分的时间，以获得在其中分布成纤维细胞的收缩的胶原基质，这构成了真皮等同物，
b)为a)中所获得的真皮等同物接种角质细胞和黑色素细胞的混合物，并在液体培养基中进行浸没式培养，
c)使得在b)中获得的在真皮等同物上角质细胞和黑色素细胞的培养物浮现，并在气-液界面继续培养，直到在胶原基质中含有成纤维细胞的表皮等同物上获得了分层的含有黑色素细胞的表皮等同物，这构成了皮肤等同物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述黑色素细胞是从成人皮肤获得的人黑色素细胞，并被预先扩增。
7.根据权利要求5和6任一项所述的方法，其特征在于，所述角质细胞和成纤维原细胞是从成人皮肤获得的。
8.根据权利要求5和6任一项所述的方法，其特征在于，在存在IV型胶原、层粘连蛋白和/或巢蛋白时进行步骤a)。
9.评估试剂调节色素形成能力的方法，其特征在于
(a)将所述试剂施用于根据权利要求1-4任一项的体外皮肤等同物，或者通过权利要求5-8任一项方法获得的体外皮肤等同物，
(b)将已经施用待评估试剂的体外皮肤等同物的色素形成(i)与没有进行所述试剂处理的对照皮肤等同物进行比较。
10.根据权利要求9所述的评估方法，其特征在于，通过与所述皮肤等同物的至少一部分的直接接触而将所述试剂施用于皮肤等同物。
11.根据权利要求9-10任一项所述的评估方法，其特征在于，所述皮肤等同物至少含有来源于色素异常的成纤维细胞和/或角质细胞和/或黑色素细胞。
12.根据权利要求9-10任一项所述的评估方法，其特征在于，所述试剂是色素形成-抑制剂。
13.根据权利要求9-10任一项所述的方法，其特征在于，待评估的试剂被施用到皮肤等同物表现出色素增加的区域。
14.根据权利要求9-10任一项所述的评估方法，其特征在于，皮肤等同物还被暴露于UV射线，其中UV射线是在实施待评估试剂之前、同时和/或之后施用，或者施用了与对照皮肤等同物相同的时间。
15.根据权利要求9-10任一项所述的评估方法，其特征在于，还将已经被施用了待评估试剂的体外皮肤等同物的色素形成(i)和已经被施用了色素形成促进或色素形成抑制参照物质的皮肤等同物的色素形成(iii)进行了比较。
16.根据权利要求9-10任一项所述的评估方法，其特征在于，所述待评估的试剂通过至少部分对角质细胞、成纤维细胞、细胞外基质的成分和/或真皮-表皮连接处发挥作用而调节色素形成。
17.根据权利要求14所述的评估方法，其特征在于，所述待评估的试剂含有至少一种防晒剂。
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