CN1411471A - 大孔脱乙酰壳多糖小珠及其制备方法 - Google Patents

大孔脱乙酰壳多糖小珠及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及大孔脱乙酰壳多糖小珠，它具有大小为5－200μm的孔，这些孔相对较大且均匀分布到小珠表面和核区，以及所述小珠的制备方法包括下列步骤：将脱乙酰壳多糖溶液、脱乙酰壳多糖水溶液或它们的混合物滴加到低温有机溶剂或液氮中；通过由温度差异所致的相分离法调整孔径大小。本发明的大孔脱乙酰壳多糖小珠比现有基体使细胞培养更有效，因为由于这些小珠具有较大表面积而使细胞能够有效地附着其上，由于这些小珠的三维结构，注射到小珠中的细胞和附着于小珠的细胞能够容易地长期存在，因此它们能够用于研究生产蛋白质、抗生素、抗癌物质、多糖、生理活性物质、动物激素、或植物激素，以及用于研究代谢器官，软骨或骨的替代品。

Description

大孔脱乙酰壳多糖小珠及其制备方法
发明领域
本发明涉及大孔脱乙酰壳多糖小珠，以及制备大孔脱乙酰壳多糖小珠的方法。更具体地，本发明涉及细胞附着性、生物相容性和生物降解性均优异的大孔脱乙酰壳多糖小珠，由此用于细胞生长、血管生成和营养扩散，以及制备大孔脱乙酰壳多糖小珠的方法。此外，本发明还涉及应用该大孔脱乙酰壳多糖小珠培养动物和植物细胞的方法。
背景技术
近年来，很多研究涉及用于制备代谢组织如肝和胰脏以及软骨或骨的替代品的细胞培养物。为了有效培养细胞，要求该培养基体具有细胞附着能力，易于细胞生长，并能帮助细胞维持其功能，此外它还要具有生物相容性、生物降解性、塑性和多孔性。尤其是，为了在有限的空间内提供尽可能多的细胞，细胞基体必须是多孔的。在这方面，必须根据细胞生长、血管生成和营养扩散仔细确定孔的大小和三维结构。
到目前为止，已有许多天然聚合物和合成聚合物用作细胞培养的基体。例如，PGA(聚乙醇酸)网用于制备三维、多孔骨替代物，它可以使许多细胞附着到其上，除了能够支持快速组织再生外，它还具有优异的生物可降解性(Vunjak-Nonakovi，G.等，Journal of Biotechnology Progress，Vol.14，193-202，1998)。Du，C.等合成了nHAC(纳-HAp/胶原)(Journal ofBiomedical Materials Research，Vol.44，407-415，1999)。PLLA(聚-L乳酸)成功地用于培养成骨细胞(Lo等，Journal of Biomedical Materials Research，Vol.30，475-484，1996；Evans，G.R.等，Journal of Biomaterials，Vol.20，1109-1115，1999)。应用溶剂-灌制、微粒-沥滤方法，PGA和PLLA能形成网或三维多孔支架结构，软骨细胞能在其上生长(Freed等，Journal of BiomedicalMaterials Research Vol.27，11-23，1993)。并试图从与纤维蛋白原结合的PEG(聚乙二醇)制备的多孔性基体培养成纤维细胞(Pandit，A.S.等，Journalof Biomaterials Application，vol.12，222-236)。应用PLLA或PLGA(聚-D，L-乳酸-共-羟基乙酸)的氯仿溶液喷雾-灌制方法形成的管状PGA，也能成功地培养成纤维细胞，表明其具有改善的抗压强度。
为了进行有效的细胞培养，多孔基体最基本的是允许一些细胞在有限的空间内容易且均匀地尽可能附着其上，并且有助于细胞生长。然而，上述基体不能令人满意地符合这些需要。
被推荐用来补充上述基体缺陷的是小珠样基体。在外伤情况下对有止血作用的具有生长因子特性的各种生物相容性材料的研究中，发现带正电荷的小珠有更好的止血效果(Wu，L.等，Journal of Surgical Research，vol.85，43-50，1999)。藻酸盐小珠用于培养软骨细胞，细胞培养1-2天后，加入IL-1β(白细胞介素-1β)，促进形成胞外基体(Beekman，B.等，OsteoarthritisCartilage，Vol.5，330-340，1998)。
另外，已经从明胶、胶原、透明质酸、纤维素和玻璃研制出用于细胞培养的其他多孔基体。通过加入HEMA(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)和EDM(乙二醇二甲基丙烯酸酯)使多孔明胶小珠聚合，并通过反复冷冻和解冻循环使之形成多孔。
这种明胶小珠可以允许各种细胞附着于其上。之后，将细胞移植到组织，以便研究组织取代。小珠可以根据材料改变尺寸，但不适用于细胞培养，因为它们的孔径太小，仅为0.7到2.6μm。小珠基体具有这样的优点，即在有限空间内容纳大量细胞，能够使细胞生长良好，并有效释放产物。然而，藻酸盐或明胶制成的小珠基体难以形成理想孔径的小孔，难以使细胞在其上或其中均匀分布。胶原或玻璃制成的小珠，在生物相容性方面较差。因此，考虑到细胞的多功能性和吸附强度，这些小珠不适于用作细胞吸附的基体。
为了在通过细胞移植而进行的组织取代研究中有效使用，聚合物需要具有细胞附着能力和生物相容性、生物降解、可塑性和多孔性。合成聚合物在尺寸和形状的可塑性方面优越于天然聚合物，然后它们在生物相容性和生物降解性方面却较差。因此，合成聚合物在直接组织移植时易于造成各种副作用。基于这些原因，对安全且具有广泛用途的天然聚合物的研究很活跃。
壳多糖，脱乙酰壳多糖的前体，发现在甲壳类动物例如螃蟹和小虾的贝壳中，昆虫，真菌的细胞壁中，蘑菇和细菌中大量存在。它是彼此经(1→4)-β-糖苷键连接而成的由N-乙酰-D-氨基葡萄糖重复单元构成的聚合物。脱乙酰壳多糖，一种用高浓度碱对壳多糖进行N-脱乙基化而制备的碱性多糖，已知具有比上述合成聚合物更优越的细胞附着性、生物相容性、生物降解性、和可塑性。
由于具有这些优点，已经进行了一些尝试用脱乙酰壳多糖作为细胞培养的基体。例如，戊二醛-交联的脱乙酰壳多糖和果糖修饰的脱乙酰壳多糖用作培养肝细胞的基体(Yagi，等，Biological Pharmaceutical Bulletin，Vol.20，No.6，708-710 & Vol.20，No.12，1290-1294，1997)。这些脱乙酰壳多糖基体可以通过将戊二醛或果糖与纯化的脱乙酰壳多糖混合制备，以增强细胞附着能力和形成所需的性状。然而，用这些修饰的脱乙酰壳多糖基体进行的细胞培养不能超越二维培养系统，因为细胞仅被吸附在基体表面。
通过各种冷冻干燥技术研制出具有理想孔径的脱乙酰壳多糖薄膜并用于组织培养工程(Madihally，S.V.等，Journal of Biomatials，Vol.20，1133-1142，1999)。这些脱乙酰壳多糖薄膜在提供理想尺寸的孔方面非常有意义，但仍然限于二维细胞培养技术。
另外，报道了通过冷冻干燥制备的脱乙酰壳多糖小珠(Tzu-Yang，等，Joumal of Industrial Engineering Chemical Research，Vol.36，3631-3638，1997)。通过将戊二醛交联到脱乙酰壳多糖小珠的氨基残基上而修饰脱乙酰壳多糖小珠，测定显示对镉离子具有高吸附率。
在来自USPTO，1999的Wolfgang，G.等的文件中还发现新的脱乙酰壳多糖小珠。他们报道使用非磁性琥珀酸酐使脱乙酰壳多糖小珠附带羧基。将它们与FeCl2反应，然后用过量水冲洗，提供磁性脱乙酰壳多糖小珠，其可以用于纯化蛋白质或吸附磁性材料。由于它们孔径很小，这种多孔脱乙酰壳多糖被用于吸附和/或纯化离子或磁性材料。然而，没有发现使用多孔脱乙酰壳多糖小珠作为细胞培养的基体。
发明概述
基于脱乙酰壳多糖的优秀细胞吸附能力、生物相容性、生物降解性和可塑生，研究它用于制备具有均匀分布的大孔，从而可以很好培养细胞的大孔小珠。本发明人经过完全深入的研究，发现脱乙酰壳多糖溶液在有机溶剂中发生相分离，从而大孔脱乙酰壳多糖小珠在其上和其内能够形成均匀的孔，因而完成本发明。
因此，本发明的一个目的是克服现有技术中出现的问题，提供在其上和其内具有均匀孔的大孔脱乙酰壳多糖小珠。
本发明的另一个目的是提供具有较大表面积从而将细胞吸附到其上的大孔脱乙酰壳多糖小珠。
本发明的再一个目的是提供在细胞附着能力、生物相容性、和生物降解性方面表现优越的大孔脱乙酰壳多糖小珠，因此用于细胞生长、血管发生和营养扩散。
本发明的再一个目的是提供制备大孔脱乙酰壳多糖小珠的方法。
本发明的进一步目的是提供用大孔脱乙酰壳多糖小珠培养动物细胞和植物细胞的方法。
附图简述
图1是细胞尚未在小珠表面和内部培养前，本发明的多孔脱乙酰壳多糖小珠表面的SEM照片。
图2是细胞尚未在小珠表面和内部培养前，本发明的多孔脱乙酰壳多糖小珠的横截面的SEM照片。
图3是将肝细胞在多孔脱乙酰壳多糖小珠表面和内部培养10天后，本发明的多孔脱乙酰壳多糖小珠表面的SEM照片。
发明详述
在公开和描述本发明的大孔脱乙酰壳多糖小珠和其制备方法之前，应当理解其中使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，不是为了限制目的。
本发明使用的术语“脱乙酰壳多糖溶液”意味着含脱乙酰壳多糖的乙酸水溶液。本发明使用的术语“脱乙酰壳多糖水溶液”意味着水溶性脱乙酰壳多糖在去离子水中的溶液。
另外，本发明使用的术语“脱乙酰壳多糖小珠”或“多孔脱乙酰壳多糖小珠”意味着从脱乙酰壳多糖溶液、脱乙酰壳多糖水溶液或其混合物制备的具有相对均匀孔的1-4mm的多孔脱乙酰壳多糖颗粒。
同时，本发明使用的术语“基体”或“细胞培养的基体”指固体支持物或载体，细胞附着其上，在培养基中培养从而增殖。
一方面，本发明涉及用于细胞培养的多孔小珠，它具有优秀的生物相容性、生物降解性、细胞附着能力和可塑性，并且它具有尺寸大而均匀的孔。由于具有这些优点，多孔脱乙酰壳多糖小珠上非常有用的基体，各种动物细胞和植物细胞都能够在其上培养。本发明的多孔脱乙酰壳多糖小珠能够用作培养各种动物和植物细胞的基体，具体地用于培养肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、上皮细胞和病毒包装细胞。
至于本发明的多孔脱乙酰壳多糖小珠的孔，它们优选在1-500μm范围内，更优选在5-200μm范围内。小珠大小优选在0.1到10mm范围内，更优选1到4mm。
另一方面，本发明涉及制备多孔脱乙酰壳多糖小珠的方法。从脱乙酰壳多糖溶液、脱乙酰壳多糖水溶液或其混合物开始制备脱乙酰壳多糖小珠。如上所述，脱乙酰壳多糖溶液通过将脱乙酰壳多糖溶解到乙酸水溶液中制备，而脱乙酰壳多糖水溶液通过将水溶性脱乙酰壳多糖溶解到去离子水中而制备。接下来，将上述溶液滴加到低温的有机溶剂中或液氮中，得到小珠。最后，将脱乙酰壳多糖小珠冷冻干燥。
因为脱乙酰壳多糖在酸中是可溶的，水溶性脱乙酰壳多糖在水中表现良好溶解性。在本发明中有用的脱乙酰壳多糖具有平均分子量5,000-1,000,000。优选的水溶性脱乙酰壳多糖的平均分子量范围为5,000-1,000,000。对于溶解脱乙酰壳多糖，乙酸溶液优选浓度为0.1-10％重量。溶解完成后，脱乙酰壳多糖在乙酸溶液中的优选存在量以重量计为0.1-20％。当被溶解于去离子水时，水溶性脱乙酰壳多糖优选浓度以重量计为0.5到1.5％。浓度越高导致孔径越小。因此，当脱乙酰壳多糖的浓度高于4％时，形成非常小的孔，只能限于诱导和生长细胞。
如果脱乙酰壳多糖单独与水溶性脱乙酰壳多糖一起使用，脱乙酰壳多糖优选与水溶性脱乙酰壳多糖以1∶9-9∶1的重量比混合。水溶性脱乙酰壳多糖的比例越高，孔的尺寸越大。
本发明使用的有机溶剂的例子包括氯代环己烷、氯代戊烷、正己烷、二氯甲烷、氯仿、和乙酸乙酯。由于溶解性和溶解温度方面的差异，这些低熔点而又不溶解脱乙酰壳多糖的有机溶剂在通过相分离固化脱乙酰壳多糖中非常有用。从不同有机溶剂对孔大小影响的试验中可以看出，氯代戊烷比二氯代戊烷制成的孔更大。
优选有机溶剂维持在稳定的低温条件下。如果维持恒定的温度出现波动，多孔小珠表面突然溶解，从而失去了它的多孔性，以至于破坏了细胞附着和帮助细胞发挥它们功能必需的三维结构。有机溶剂优选维持在-5到-65℃，液氮在大约-198℃。例如，低温导致较小孔径。另一方面，如果有机溶剂维持太高温度，基于温度差异的相分离将不会发生。本发明最优选的条件包括：将1％脱乙酰壳多糖溶液加入温度维持在-5到-25℃的氯代戊烷中和将1％脱乙酰壳多糖水溶液加入温度维持在-5到-25℃的氯仿中。
为了维持有机溶剂的低温，使用干冰或通过冷冻仪冷冻的冰乙醇。或者，可以使用约-198℃的液氮。
由此制备的多孔脱乙酰壳多糖小珠是大小均匀的，粒径分布在1到4mm范围内。为了用作细胞培养的基体，多孔脱乙酰壳多糖小珠必须进行各种预处理，例如，冷冻干燥、中和以除去残留的酸和有机溶剂、用乙醇消毒、填充培养基、然后再次冷冻干燥。
在进一步方面，本发明涉及用多孔脱乙酰壳多糖小珠培养动物细胞和植物细胞的方法。首先，将制成的多孔脱乙酰壳多糖小珠浸没到培养基中后，进行预培养，以使细胞附着到多孔脱乙酰壳多糖小珠上。除去未附着细胞后，增殖附着细胞，同时用新鲜培养基更换老培养基。为细胞附着的预培养优选进行4-6小时。优选培养基每两到三天更换一次。
在涉及脱乙酰壳多糖和乙酸的浓度以及有机溶剂的种类和温度的多种条件下，制备多孔脱乙酰壳多糖小珠，并用作培养包括肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞、和病毒包装细胞在内的各种细胞的基体。
结果，根据制备条件形成各种尺寸的孔。具体地说，当有机溶剂维持在较低温度下或脱乙酰壳多糖溶液或脱乙酰壳多糖水溶液浓度增加时，发现多孔脱乙酰壳多糖小珠的孔变小。也就是说，脱乙酰壳多糖溶液或脱乙酰壳多糖水溶液发生相分离的温度和脱乙酰壳多糖溶液或脱乙酰壳多糖水溶液的浓度确定孔大小。有机溶剂的种类也影响脱乙酰壳多糖小珠孔大小的确定。使用氯代戊烷时，测定的孔径最大。另一方面，二氯代戊烷产生最小的孔。在使用脱乙酰壳多糖和水溶性脱乙酰壳多糖混合物时，当脱乙酰壳多糖和水溶性脱乙酰壳多糖的比例为4∶6时得到最大的孔。相同浓度的脱乙酰壳多糖和水溶性脱乙酰壳多糖之间的比较得出这样的结论，即脱乙酰壳多糖比水溶性脱乙酰壳多糖在增加孔径方面更为有利。
结果发现，1％脱乙酰壳多糖水溶液和温度为-5到-25℃的氯仿、或者1％脱乙酰壳多糖溶液和温度为-5到-25℃的氯代戊烷能够得到孔最大的脱乙酰壳多糖小珠。
与常规基体相比，通过本发明方法制备的多孔脱乙酰壳多糖小珠在吸附各种动物和植物细胞方面表现优越性。当被吸附到多孔脱乙酰壳多糖小珠上后2-3天中，细胞生长到小珠内部以及覆盖小珠表面。另外，用本发明的基体培养的肝细胞通过各种生化试验测定发现，维持了它们的细胞功能。
实施例
在参考结合附图说明的下列实施例下，可以更好地了解本发明，但这些实施例不应当构成对本发明的限制。实施例1：用1％脱乙酰壳多糖溶液和氯代戊烷制备多孔小珠
将脱乙酰壳多糖(Fluka，USA)以1％重量比溶解于1％乙酸水溶液中，此后通过10ml注射器将脱乙酰壳多糖溶液缓慢加入到通过含有乙醇的干冰(Sigma，USA)维持在-5至-25℃、-25至-45℃和-45至-65℃的氯代戊烷(Sigma USA)中。加入后5-10秒形成小珠，然后通过小勺分离，在-70℃下冷冻一天，然后在冷冻干燥器(Cole-Parmer Instrument Company，USA)中冷冻干燥2-3天。通过扫描电子显微镜观察其表面形态，并测定孔径大小。结果如下表1和图1和2所示。
表1：有机溶剂温度变化对小珠孔径大小的改变
  编号   脱乙酰壳多糖的浓度(％)   有机溶剂 有机溶剂的温度(℃)   孔径大小(μm)
    1     1   氯代戊烷   -5～-25     50～150
    2     1   氯代戊烷   -25～-45     30～100
    3     1   氯代戊烷   -45～-65     10～70
如表1所示，当在除了有机溶剂的温度以外所有参数相同的条件下应用1％脱乙酰壳多糖制备多孔脱乙酰壳多糖小珠时，在更低温度下得到的孔径更小。实施例2：应用1％脱乙酰壳多糖和多种有机溶剂制备多孔小珠
按照类似于实施例1的方法制备脱乙酰壳多糖小珠，除了使用含有1％重量脱乙酰壳多糖的1％乙酸水溶液，和各种有机溶剂如氯代戊烷、正己烷、二氯代戊烷、氯仿和乙酸乙酯，温度维持在-5至-25℃。
借助扫描电子显微镜观察脱乙酰壳多糖小珠，并测定孔径。结果如下表2所示。
表2：不同有机溶剂对小珠孔径大小的改变
  编号     脱乙酰壳多糖的浓度(％)     有机溶剂 有机溶剂的温度(℃)    孔径大小(μm)
    1     1     氯代戊烷     -5～-25     50～150
    4     1     正己烷     -5～-25     20～120
    5     1     二氯代戊烷     -5～-25     20～100
    6     1     氯仿     -5～-25     20～80
    7     1     乙酸乙酯     -5～-25     40～100
在除了有机溶剂以外所有参数相同的条件下，测定脱乙酰壳多糖小珠的平均孔径大小为应用氯仿的最小，应用氯代戊烷的最大。实施例3：应用2％脱乙酰壳多糖和氯代戊烷制备多孔小珠
按照类似于实施例1的方法制备脱乙酰壳多糖小珠，除了使用含有2％重量脱乙酰壳多糖的1％乙酸水溶液，和温度维持在-5至-15℃和-15至-25℃的氯代戊烷。
借助扫描电子显微镜观察脱乙酰壳多糖小珠，并测定孔径。脱乙酰壳多糖的浓度对孔径大小改变的结果如下表2所示。
表3：脱乙酰壳多糖的浓度对孔径大小改变
  编号   脱乙酰壳多糖的浓度(％)   有机溶剂 有机溶剂的温度(℃)   孔径大小(μm)
    1     1   氯代戊烷     -5～-25     50～150
    8     2   氯代戊烷     -5～-15     10～100
    9     2   氯代戊烷     -15～-25     10～50
从表3可以明显发现：随脱乙酰壳多糖溶液浓度的增加脱乙酰壳多糖小珠具有更小的平均孔径。实施例4：应用在1-4％乙酸水溶液中的2％脱乙酰壳多糖溶液和氯代戊烷制备多孔小珠
按照类似于实施例1的方法制备脱乙酰壳多糖小珠，除了使用在1、2、3和4％乙酸水溶液中的2％(wt)脱乙酰壳多糖和温度维持在-15至-25℃的氯代戊烷。
借助扫描电子显微镜观察显示多孔脱乙酰壳多糖小珠的孔径大小范围在10至80μm。观察结果以及实施例3的结果在下表4中给出。从表4发现乙酸溶液的浓度越高导致更大的孔径。表4：乙酸的浓度对孔径大小改变
  编号   乙酸的浓度(％) 脱乙酰壳多糖的浓度(％)   有机溶剂   有机溶剂的温度(℃)   孔径大小(μm)
  9     1     2   氯代戊烷     -15～-25   10～50
  10     1～4     2   氯代戊烷     -15～-25   30～80
实施例5：应用2％脱乙酰壳多糖和液氮制备多孔小珠
按照类似于实施例1的方法制备脱乙酰壳多糖小珠，除了使用在1％乙酸水溶液中的2％(wt)脱乙酰壳多糖和液氮。
借助扫描电子显微镜观察显示多孔脱乙酰壳多糖小珠的孔径大小范围在5至50μm。该观察结果与实施例1的数据一致，其推导出的结论是低温使孔径变小，原因是液氮的温度远远低于有机溶剂。实施例6：应用2％脱乙酰壳多糖和氯代环己烷制备多孔小珠
按照类似于实施例1的方法制备脱乙酰壳多糖小珠，除了使用在1％乙酸水溶液中的2％(wt)脱乙酰壳多糖，和温度维持在-5至-15℃、-15至-25℃和-25至-50℃的氯代环己烷。
借助扫描电子显微镜观察显示多孔脱乙酰壳多糖小珠的孔径大小范围在10至150μm。这些观察结果在下表5中给出。表5：应用2％脱乙酰壳多糖得到的有机溶剂温度变化对小珠孔径大小的改变
  编号 脱乙酰壳多糖的浓度(％)   有机溶剂 有机溶剂的温度(℃)   孔径大小(μm)
    12     2   氯代环己烷     -5～-15     50～150
    13     2   氯代环己烷     -15～-25     20～80
    14     2   氯代环己烷     -25～-50     10～60
如表5所示，在除了有机溶剂温度以外所有参数相同的条件下，测定的脱乙酰壳多糖小珠的平均孔径与应用氯代戊烷得到的结果相似，即随温度下降孔径变小。实施例7：应用脱乙酰壳多糖和水溶性脱乙酰壳多糖的混合物在氯代戊烷中制备多孔小珠
按照类似于实施例1的方法制备脱乙酰壳多糖小珠，除了使用1％(wt)的脱乙酰壳多糖和水溶性脱乙酰壳多糖的混合物(Jakwang Co.Ltd.，Korea)的溶液，二者的比例分别为8∶2、6∶4、4∶6和2∶8，温度维持在-5至-25℃和-25至-45℃的氯代戊烷。
借助扫描电子显微镜观察显示多孔脱乙酰壳多糖小珠的孔径大小范围在10至120μm。混合物的比例和有机溶剂的温度对孔径大小的改变在下表6中给出。表6：脱乙酰壳多糖和水溶件脱乙酰壳多糖的比例对小珠孔径大小的改变
  编号   脱乙酰壳多糖∶水溶性脱乙酰壳多糖   有机溶剂 有机溶剂的温度(℃)  孔径大小(μm)
    15     8∶2   氯代戊烷   -5～-25   10～80
    16     6∶4   氯代戊烷   -5～-25   20～70
    17     4∶6   氯代戊烷   -5～-25   30～120
    18     2∶8   氯代戊烷   -5～-25   20～100
    19     8∶2   氯代戊烷   -25～-45   10～60
    20     6∶4   氯代戊烷   -25～-45   20～80
    21     4∶6   氯代戊烷   -25～-45   20～120
    22     2∶8   氯代戊烷   -25～-45   20～100
如表6所示，水溶性脱乙酰壳多糖的比例越高，使孔径变大，而氯代戊烷的温度几乎不影响孔径大小。特别是应用脱乙酰壳多糖和水溶性脱乙酰壳多糖4∶6的混合物，脱乙酰壳多糖小珠显示出最大的平均孔径，其测定范围在30至120μm。实施例8：应用水溶性脱乙酰壳多糖在氯代戊烷中制备多孔小珠
按照类似于实施例1的方法制备脱乙酰壳多糖小珠，除了使用1％(wt)的水溶性脱乙酰壳多糖在去离子水中的溶液，和温度维持在-5至-25℃、-25至-45℃和-45至-65℃的氯代戊烷。
借助扫描电子显微镜观察显示多孔脱乙酰壳多糖小珠的孔径大小范围在10至70μm。测定小珠的孔径大小，结果在下表7中给出。表7：应用水溶性脱乙酰壳多糖得到的有机溶剂温度变化对小珠孔径大小的改变
编号 脱乙酰壳多糖的浓度(％)     有机溶剂 有机溶剂的温度(℃)   孔径大小(μm)
  23     1     氯代戊烷     -5～-25     20～60
  24     1     氯代戊烷     -25～-45     10～70
  25     1     氯代戊烷     -45～-65     10～60
从表7可明显发现：应用水溶性脱乙酰壳多糖溶液制备的脱乙酰壳多糖小珠的孔径尺寸小于脱乙酰壳多糖溶液制备的脱乙酰壳多糖小珠。此外，不像脱乙酰壳多糖溶液制备的脱乙酰壳多糖小珠，这些水溶性脱乙酰壳多糖溶液制备的脱乙酰壳多糖小珠孔径随温度改变不大。实施例9：应用水溶性脱乙酰壳多糖和各种有机溶剂制备多孔小珠
按照类似于实施例1的方法制备脱乙酰壳多糖小珠，除了使用1％(wt)的水溶性脱乙酰壳多糖在去离子水中的溶液，和各种有机溶剂如氯代戊烷、正己烷、二氯代戊烷、氯仿和乙酸乙酯，温度维持在-5至-25℃。
借助扫描电子显微镜观察显示脱乙酰壳多糖小珠的孔径大小范围在20至200μm。当从水溶性脱乙酰壳多糖制备时，测定应用各种溶剂制备的脱乙酰壳多糖小珠。结果在下表8中给出。
表8：不同有机溶剂对水溶性脱乙酰壳多糖小珠孔径大小的改变
编号 脱乙酰壳多糖的浓度(％)   有机溶剂 有机溶剂的温度(℃)   孔径大小(μm)
  23     1     氯代戊烷     -5～-25     20～60
  26     1     正己烷     -5～-25     30～140
  27     1     二氯甲烷     -5～-25     30～150
  28     1     氯仿     -5～-25     50～200
  29     1     乙酸乙酯     -5～-25     40～100
如表8所示，对于从水溶性脱乙酰壳多糖溶液制备的脱乙酰壳多糖小珠，当应用氯仿作为有机溶剂比应用其它有机溶剂形成更大的孔径。另一方面，从脱乙酰壳多糖溶液制备的脱乙酰壳多糖小珠应用氯代戊烷得到最大的孔径(表2)。根据这些结果，从脱乙酰壳多糖溶液或水溶性脱乙酰壳多糖溶液制备的脱乙酰壳多糖小珠的孔径大小受到有机溶剂种类的影响。实验实施例1：肝细胞的培养
实施例1制备的具有50-150μm孔的1-4mm多孔脱乙酰壳多糖小珠用5N氢氧化钠/醇溶液中和，以去除残留的酸和有机溶剂，然后用70％乙醇消毒。将脱乙酰壳多糖小珠浸泡过培养基(DMEM，pH 7.4，GibcoBRL，USA)后，再将其冷冻干燥。将冷冻干燥的脱乙酰壳多糖小珠浸没到培养基中，然后来自大鼠的肝细胞在小珠上附着。为了该附着步骤，进行4-6小时的预培养。为了去除残留的未附着的细胞，用新鲜培养基更换旧培养基。之后，每隔两到三天更换一次培养基，连续1-10天，附着到脱乙酰壳多糖小珠上的肝细胞在37℃培养。成团后，在扫描电镜下观察细胞在脱乙酰壳多糖小珠孔中以及整个表面生长，如图3所示。实验实施例2：NIH3T3细胞的培养
用成纤维细胞NIH3T3(ATCC HB-11601，USA)，按照实验实施例1的同样方法进行细胞培养。
在扫描电镜下观察，发现细胞牢固地附着在脱乙酰壳多糖小珠上，并且在孔中生长。另外，观察到成纤维细胞生长迅速，并且彼此稳定接触。实验实施例3：MC3T3-E1细胞的培养
用成骨细胞MC3T3-E1(汉城国立大学医学院的韩国细胞系库，汉城，韩国)细胞，按照实验实施例1的同样方法进行细胞培养。
在扫描电镜下，观察到这些细胞稳定附着于脱乙酰壳多糖小珠并且生长良好。实验实施例4：CHO-K1细胞的培养
用上皮细胞CHO-K1(ATCC CCL-61，USA)，按照实验实施例1的相同方法，进行细胞培养。
在扫描电镜下，观察到这些细胞牢固附着于脱乙酰壳多糖小珠，并且生长良好。实验实施例5：PT67细胞的培养
用包装细胞PT67(汉城国立大学医学院的韩国细胞系库，汉城，韩国)，按照实验实施例1中的同样方法，进行细胞培养。
在扫描电镜下，观察到这些细胞不仅牢固附着于脱乙酰壳多糖小珠，同时大量分泌胞外基体，而且生长迅速。工业实用性
如上所述，本发明的多孔脱乙酰壳多糖小珠在其上和其中具有均匀孔，因此它们能够用作提供三维结构用于帮助细胞发挥功能的基体。另外，与常规细胞培养的基体相比，本发明的多孔脱乙酰壳多糖小珠在细胞附着能力、生物相容性、和生物降解性，以及在细胞生长、血管发生和营养扩散方面都具有优越性。由于具有这些优点，本发明的多孔脱乙酰壳多糖小珠用作培养动物和植物细胞的基体。进而言之，本发明的多孔脱乙酰壳多糖小珠能够有效地用于研究代谢组织例如肝脏和胰脏、或者软骨或骨组织的替代品，以及用于研究生产生物有用材料，包括蛋白质、抗生素、抗癌物质、多糖、生物活性物质、和动物和植物激素。
本发明已经通过结合附图的方式描述，应当理解，本发明使用的术语是描述的性质而不是限制。根据上面的教导，对本发明作一些修改和改变是可能的。因此，应当理解，在所附权利要求范围内，本发明在具体描述之外也可以实施。

Claims (14)

1.多孔脱乙酰壳多糖小珠，在其上和其中具有大小范围为5到200μm的均匀孔。
2.一种用于细胞培养的基体，包括权利要求1的多孔脱乙酰壳多糖小珠。
3.如权利要求2所述的基体，其中细胞是选自肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、上皮细胞和包装细胞的动物细胞，或者选自CEL、UV18和K-1细胞的植物细胞。
4.一种制备多孔脱乙酰壳多糖小珠的方法，包括以下步骤：
提供一种脱乙酰壳多糖溶解在乙酸水溶液中的脱乙酰壳多糖溶液，一种水溶性脱乙酰壳多糖溶解在去离子水中的脱乙酰壳多糖水溶液，或它们的混合物；
将脱乙酰壳多糖溶液、脱乙酰壳多糖水溶液或它们的混合物逐滴加入低温有机溶剂或液氮中，得到小珠；和
冷冻干燥所述脱乙酰壳多糖小珠，
其中通过控制溶剂的温度进行相分离，使脱乙酰壳多糖小珠具有所需的孔径。
5.如权利要求4所述的方法，其中脱乙酰壳多糖具有平均分子量30,000到100,000，水溶性脱乙酰壳多糖具有平均分子量100,000到400,000。
6.如权利要求4所述的方法，其中乙酸水溶液的浓度为1.0-4.0重量％。
7.如权利要求4所述的方法，其中脱乙酰壳多糖溶液中脱乙酰壳多糖的浓度为0.5-2.0重量％。
8.如权利要求4所述的方法，其中脱乙酰壳多糖水溶液中脱乙酰壳多糖的浓度为0.5-1.54重量％。
9.如权利要求4所述的方法，其中混合物中，脱乙酰壳多糖溶液与脱乙酰壳多糖水溶液的重量比为2∶8到8∶2。
10.如权利要求4所述的方法，其中所述有机溶剂选自氯代环己烷、氯代戊烷、正己烷、二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯。
11.如权利要求4所述的方法，其中有机溶剂维持在-5到-65℃。
12.如权利要求11所述的方法，其中有机溶剂用借助干冰或冷冻仪维持在-5到-65℃的乙醇冷却。
13.一种用权利要求1所述的多孔脱乙酰壳多糖小珠培养动物细胞或植物细胞的方法，包括以下步骤：
冷冻干燥多孔脱乙酰壳多糖小珠；
中和多孔脱乙酰壳多糖小珠，去除酸和有机溶剂，然后对小珠消毒；
将多孔脱乙酰壳多糖小珠预培养4-6小时，使细胞附着到多孔脱乙酰壳多糖小珠上；和
定期更换附着到脱乙酰壳多糖小珠上的细胞的培养基。
14.如权利要求13所述的方法，其中培养所述细胞，用以替代代谢组织例如肝脏和胰脏、或者软骨或骨组织，以及生产生物有用材料，包括蛋白质、抗生素、抗癌物质、多糖、生物活性物质、和动物和植物激素。
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