CN115368626B - 一种用于细胞体外培养的复合型材料及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于细胞体外培养的复合型材料及培养方法，本发明用于细胞体外培养的复合型材料是一种基于PMMA精确粒径微球为核包裹低脂果胶的复合型多孔微球，同时在复合微球表面偶联多聚精氨酸和多聚赖氨酸替代猪源变性明胶不引入外源生物污染。本发明解决了目前聚多糖微球制备工艺复杂问题以及降低引入外源生物污染风险；本发明用于细胞体外培养的复合型材料有较广泛的细胞培养适用性，适用疫苗和抗体药的制备。

Description

一种用于细胞体外培养的复合型材料及培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于细胞体外培养的复合型材料及培养方法。
背景技术
体外微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，已被广泛用于生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体以及具有特殊功能的效应细胞等，已成为医药生物高技术产业的关键技术。
动物细胞培养常常需要贴壁生长，在悬浮状态下细胞生长缓慢，停止，甚至死亡。微载体培养其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使贴壁细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。它将细胞的贴壁培养变为悬浮培养，这样可以大大增加细胞生长的表面积以提高细胞的生长密度。细胞采用均匀悬浮培养，无营养物或产物梯度；可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况；细胞收获过程相对简单，培养基利用率高，占地面积小；放大容易等优点，是目前公认的最有发展前途的一种培养模式。目前主要的基质材料有交联葡聚糖、纤维素、蛋白质、高分子合成材料、无机玻璃材料以及液膜微载体等。交联葡聚糖是目前使用最广泛的一类微载体。如GE的Cytodex系列微载体基质都是交联葡聚糖材质。但均匀粒径可控的葡聚糖微球合成工艺较繁琐，有一定的技术壁垒，所以用精确粒径的高分子合成微球表面偶联多糖类聚合物合成微球较容易，功能和成本上也具有一定的优势。
细胞贴壁主要是靠静电引力和范德华力，取决于细胞与微载体表面理化性质和微载体接触概率有关。微载体其工作原理即是在经过共价交联的载体微球 ( 主要提供固相吸附表面 ) 上引入电荷，使细胞以其表面所带的性质相反的电荷互相吸引以达到贴壁目的。而一般细胞在进入生理 PH 值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。目前常用的微载体有两类，一类是以带正电荷的化合物二乙基氨基乙基 (DEAE) 作为配基，用于一般的动物细胞培养，如 GE 的 Cytodex 1 ；另一类微载体用变性的动物明胶-猪胶原蛋白 (Pig collagen) 作为配基，通过共价交联在葡聚糖微球表面形成一层明胶膜，为细胞的贴壁生长提供附着，从而增加细胞附着和增殖。如 GE 的Cytodex 3。 Cytodex3常被选用作体外贴壁培养困难的细胞的微载体。特别是对上皮形态细胞的贴壁培养，更有其独特的优点。其他细胞如肝细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成肌细胞等，也用这种微载体进行过常规培养。利用猪胶原蛋白生产微载体，是将变性的猪胶原蛋白化学交联于葡聚糖表面。但因这种微载体含有猪胶原蛋白，当用于生物制品的产业化过程会遇到很多的困难并增加很多工作量。首先，添加动物来源成分，会给生物制品下游纯化增加负担，并且会在最终产品中存在残留 ；注入健康人体会产生副反应 ；另外，添加动物来源成分会增加生物制品外源性病毒的风险。因此，对细胞大规模培养原辅材料的质量控制，除了对其支持细胞增殖能力的控制之外，还应考虑是否含有动物来源成分从而引起的安全性问题。目前已有的微载体大多以动物胶原及其衍生物作为包被材料，但随着对生物制品安全性和质量要求的不断提高和行业对药品生产GMP要求的不断完善，在生产过程中添加含动物源性材料一直是各国的监管机构在生物安全性方面监管时高度关注的一项内容。使用不含有任何动物来源成分的原辅材料进行疫苗等生物制品的生产，必然会成为生物制药领域的发展趋势。
目前国内外使用体外哺乳细胞培养的微载体都是聚多糖类的材料（葡聚糖、果糖等），主要目的增加微载体的亲水性，但在制备聚多糖微载体微球工艺比较繁琐，微球粒径不易控制；同时在细胞贴壁采用的材料是-DEAE基团和猪源变性明胶，-DEAE基团对一些上皮组织类细胞贴壁效果不好，猪源变性明胶会引入动物源性的生物污染。
鉴于此，申请此专利。
发明内容
针对微载体存在的问题，本发明提供了一种基于PMMA精确粒径微球为核包裹低脂果胶的复合型多孔微球，同时在复合微球表面偶联多聚精氨酸和多聚赖氨酸替代猪源变性明胶不引入外源生物污染。本发明解决了目前聚多糖微球制备工艺复杂问题以及如何降低引入外源生物污染风险。
本发明的目的是提供一种用于细胞体外培养的复合型材料。
本发明的另一目的是提供一种用于细胞体外培养的复合型材料培养方法。
根据本发明的具体实施方式的用于细胞体外培养的复合型材料，所述复合型材料由包括以下步骤的方法制备得到：
（1）种球制备：在将聚乙烯吡咯烷酮，甲基丙烯酸甲酯，偶氮二异丁腈，去离子水和无水乙醇加入带有冷凝管、搅拌器和氮气进出口的四口烧瓶中，搅拌待所有固体完全溶解之后，持续通入氮气后烧瓶开始升温至65-75℃，持续搅拌的同时打开超声波发生器进行超声搅拌反应1-2h；向反应溶液中加入乙二醇二甲基丙烯酸酯，停止超声，继续搅拌反应得到白色产物；将所得到的产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤，真空干燥得到白色交联PMMA微球即为种子微球；
（2）大粒径 PMMA微球制备：向步骤（1）得到的所述种子微球中加入十二烷基苯磺酸钠水溶液进行超声分散，加入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；
将甲苯和SDBS 溶液混合超声至形成稳定乳液，将所述稳定乳液加入到四口烧瓶中，搅拌并升温到35-45℃，通入氮气使PMMA种球活化；
向甲基丙烯酸甲酯和偶氮二异丁腈中加入蒸馏水至溶解完全，加入SDBS 溶液，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯搅拌均匀后，超声至形成稳定乳液，加入四口烧瓶中，搅拌均匀，再加入聚乙烯吡咯烷酮，持续通入氮气后开始升温至65-75℃，持续搅拌的同时进行超声搅拌反应1.5-2.5小时，停止超声，继续搅拌反应完成，得到白色产物；将所得到的白色产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤，真空干燥得到白色交联PMMA微球；
以制备的PMMA微球为种球，经过多次重复微乳液包裹，真空干燥得到白色交联大粒径PMMA微球；
（3）多聚糖-PMMA复合微球制备：向步骤（2）得到的所述大粒径PMMA微球中加入碱性水溶液 进行超声分散，加入二氯甲烷致孔剂，导入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；将低脂果胶和蒸馏水加热至75-85℃搅拌溶解至形成稳定的果胶溶液，将果胶溶液加入四口烧瓶中，搅拌均匀后通入氮气，滴加入环氧氯丙烷，继续搅拌至均匀，再加入聚乙烯吡咯烷酮，通入氮气后烧瓶开始升温至75-85℃，持续超声搅拌反应1.5-2.5小时，停止超声，继续搅拌反应完成，得到白色产物；将所得到的白色产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤，真空干燥得到淡黄色多聚糖-PMMA复合微球；
（4）氨基酸偶联多聚糖-PMMA复合微球的制备：向步骤（2）得到的所述多聚糖-PMMA复合微球中加入碱性水溶液进行超声分散，加入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；将精氨酸盐酸盐和赖氨酸盐酸盐的水溶液混合搅拌溶解，形成氨基酸溶液，将所述氨基酸溶液加入四口烧瓶中，搅拌并通入氮气保持3.5-4.5小时，滴加入γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，搅拌均匀，再加入聚乙烯吡咯烷酮，持续通入氮气后持续搅拌的同时打开超声波发生器，超声搅拌反应完成，得到白色产物；将所得到的白色产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤，真空干燥得到白色氨基酸偶联多聚糖-PMMA复合微球即为用于细胞体外培养的复合型材料（微载体）。
进一步的，步骤（1）中，将2-4重量份聚乙烯吡咯烷酮，5-15重量份甲基丙烯酸甲酯，0.05-0.35重量份偶氮二异丁腈，40重量份去离子水和60重量份无水乙醇加入四口烧瓶中。
进一步的，步骤（1）中，所述搅拌的速率均为200r/min。
进一步的，步骤（1）中，乙二醇二甲基丙烯酸酯的添加量为0.02-0.18重量份。
进一步的，步骤（1）中，种子微球粒径D50为3.43μm，分散系数为1.0。
进一步的，步骤（2）中，0.5-3.5g甲基丙烯酸甲酯，0.05-0.15g偶氮二异丁腈加入45ml蒸馏水溶解完全，加入45ml 0.4%的SDBS 溶液进行混合，再加入0.5-0.35g乙二醇二甲基丙烯酸酯，超声至形成稳定乳液。
进一步的，步骤（2）中，白色交联大粒径PMMA微球的粒径D50为181.40μm，分散系数为1.06。
进一步的，步骤（3）中，向2.0g 所述大粒径PMMA微球中加入 PH为10的水溶液进行超声分散，加入0.2ml二氯甲烷致孔剂，导入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；将1.5g低脂果胶和90mL蒸馏水加热至75-85℃搅拌溶解至形成稳定的果胶溶液，将果胶溶液加入四口烧瓶中，搅拌速率400r/min 逐步降温到室温，通入氮气保持4小时，滴加入20ml 环氧氯丙烷，搅拌速率调至500r/min ,室温保持24小时，再加入终浓度3%的聚乙烯吡咯烷酮，用氮气置换烧瓶内空气30分钟，持续通入氮气后烧瓶开始升温至75-85℃，持续超声搅拌反应1.5-2.5小时，停止超声，继续保持80℃搅拌反应24小时，得到白色产物。
进一步的，步骤（4）中，在烧杯中称量 2.0g的所述多聚糖-PMMA复合微球，加入 PH为9的水溶液45mL超声分散，加入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；在另一个烧杯中称入120mM的精氨酸盐酸盐和80mM的赖氨酸盐酸盐的90mL蒸馏水的混合溶液搅拌溶解后，将氨基酸溶液加入四口烧瓶中，搅拌速率为200r/min ，通入氮气保持4小时，滴加入2ml γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，搅拌速率调至400r/min ,室温保持24小时，再加入终浓度3%的聚乙烯吡咯烷酮，用氮气置换烧瓶内空气30分钟，持续通入氮气后持续搅拌的同时打开超声波发生器，超声搅拌反应2小时，停止超声，得到白色产物。
一种培养方法，采用所述的用于细胞体外培养的复合型材料对细胞进行培养。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明是一种基于PMMA精确粒径微球为核包裹低脂果胶的复合型多孔微球，同时按3:1在复合微球表面偶联多聚精氨酸和多聚赖氨酸替代猪源变性明胶不引入外源生物污染。本发明解决了目前聚多糖微球制备工艺复杂问题以及降低引入外源生物污染风险。
（2）本发明用于细胞体外培养的复合型材料制备全流程水相合成，无动物源性材料引入；
（3）本发明首次细胞培养引入PMMA复合材料，亲水材料可溶胀，微载体粒径在150-200μm之间；
（4）首次将精氨酸和赖氨酸按比例偶联多糖复合PMMA材料；
（5）最早GE的Cytodex1.0 是偶联的DEAE化合物，有一些难贴壁的细胞不适用，本发明采用偶联多糖复合PMMA材料，通过共价交联在葡聚糖微球表面形成一层明胶膜，为细胞的贴壁生长提供附着，从而增加细胞附着和增殖，有较广泛的细胞培养适用性，适用疫苗和抗体药的制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为显微镜下本发明微载体的电镜图（100×）；
图2为显微镜下本发明微载体的电镜图（400×）；
图3为复合微载体培养Vero细胞8小时照片；
图4为复合微载体培养L929细胞120小时照片；
图5为复合微载体培养CHO22H11细胞96小时照片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
在一些较为具体的实施方案中，所述用于细胞体外培养的复合型材料的制备方法包括以下步骤：
（1）种球制备：在将聚乙烯吡咯烷酮，甲基丙烯酸甲酯，偶氮二异丁腈，去离子水和无水乙醇加入带有冷凝管、搅拌器和氮气进出口的四口烧瓶中，搅拌待所有固体完全溶解之后，持续通入氮气后烧瓶开始升温至65-75℃，持续搅拌的同时打开超声波发生器进行超声搅拌反应1-2h；向反应溶液中加入乙二醇二甲基丙烯酸酯，停止超声，继续搅拌反应得到白色产物；将所得到的产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤，真空干燥得到白色交联PMMA微球即为种子微球；
（2）大粒径 PMMA微球制备：向步骤（1）得到的所述种子微球中加入十二烷基苯磺酸钠水溶液进行超声分散，加入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；
将甲苯和SDBS 溶液混合超声至形成稳定乳液，将所述稳定乳液加入到四口烧瓶中，搅拌并升温到35-45℃，通入氮气使PMMA种球活化；
向甲基丙烯酸甲酯和偶氮二异丁腈中加入蒸馏水至溶解完全，加入SDBS 溶液，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯搅拌均匀后，超声至形成稳定乳液，加入四口烧瓶中，搅拌均匀，再加入聚乙烯吡咯烷酮，持续通入氮气后开始升温至65-75℃，持续搅拌的同时进行超声搅拌反应1.5-2.5小时，停止超声，继续搅拌反应完成，得到白色产物；将所得到的白色产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤，真空干燥得到白色交联PMMA微球；
以制备的PMMA微球为种球，经过多次重复微乳液包裹，真空干燥得到白色交联大粒径PMMA微球；
（3）多聚糖-PMMA复合微球制备：向步骤（2）得到的所述大粒径PMMA微球中加入碱性水溶液 进行超声分散，加入二氯甲烷致孔剂，导入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；将低脂果胶和蒸馏水加热至75-85℃搅拌溶解至形成稳定的果胶溶液，将果胶溶液加入四口烧瓶中，搅拌均匀后通入氮气，滴加入环氧氯丙烷，继续搅拌至均匀，再加入聚乙烯吡咯烷酮，通入氮气后烧瓶开始升温至75-85℃，持续超声搅拌反应1.5-2.5小时，停止超声，继续搅拌反应完成，得到白色产物；将所得到的白色产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤，真空干燥得到淡黄色多聚糖-PMMA复合微球；
（4）氨基酸偶联多聚糖-PMMA复合微球的制备：向步骤（2）得到的所述多聚糖-PMMA复合微球中加入碱性水溶液进行超声分散，加入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；将精氨酸盐酸盐和赖氨酸盐酸盐的水溶液混合搅拌溶解，形成氨基酸溶液，将所述氨基酸溶液加入四口烧瓶中，搅拌并通入氮气保持3.5-4.5小时，滴加入γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，搅拌均匀，再加入聚乙烯吡咯烷酮，持续通入氮气后持续搅拌的同时打开超声波发生器，超声搅拌反应完成，得到白色产物；将所得到的白色产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤，真空干燥得到白色氨基酸偶联多聚糖-PMMA复合微球。
进一步的，步骤（1）中，将2-4重量份聚乙烯吡咯烷酮，5-15重量份甲基丙烯酸甲酯，0.05-0.35重量份偶氮二异丁腈，40重量份去离子水和60重量份无水乙醇加入四口烧瓶中。
进一步的，步骤（1）中，所述搅拌的速率均为200r/min。
进一步的，步骤（1）中，乙二醇二甲基丙烯酸酯的添加量为0.02-0.18重量份。
进一步的，步骤（1）中，种子微球粒径D50为3.43μm，分散系数为1.0。
进一步的，步骤（2）中，0.5-3.5g甲基丙烯酸甲酯，0.05-0.15g偶氮二异丁腈加入45ml蒸馏水溶解完全，加入45ml 0.4%的SDBS 溶液进行混合，再加入0.5-0.35g乙二醇二甲基丙烯酸酯，超声至形成稳定乳液。
进一步的，步骤（2）中，白色交联大粒径PMMA微球的粒径D50为181.40μm，分散系数为1.06。
进一步的，步骤（3）中，向2.0g 所述大粒径PMMA微球中加入 PH为10的水溶液进行超声分散，加入0.2ml二氯甲烷致孔剂，导入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；将1.5g低脂果胶和90mL蒸馏水加热至75-85℃搅拌溶解至形成稳定的果胶溶液，将果胶溶液加入四口烧瓶中，搅拌速率400r/min 逐步降温到室温，通入氮气保持4小时，滴加入20ml 环氧氯丙烷，搅拌速率调至500r/min ,室温保持24小时，再加入终浓度3%的聚乙烯吡咯烷酮，用氮气置换烧瓶内空气30分钟，持续通入氮气后烧瓶开始升温至75-85℃，持续超声搅拌反应1.5-2.5小时，停止超声，继续保持80℃搅拌反应24小时，得到白色产物。
进一步的，步骤（4）中，在烧杯中称量 2.0g的所述多聚糖-PMMA复合微球，加入 PH为9的水溶液45mL超声分散，加入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；在另一个烧杯中称入120mM的精氨酸盐酸盐和80mM的赖氨酸盐酸盐的90mL蒸馏水的混合溶液搅拌溶解后，将氨基酸溶液加入四口烧瓶中，搅拌速率为200r/min ，通入氮气保持4小时，滴加入2ml γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，搅拌速率调至400r/min ,室温保持24小时，再加入终浓度3%的聚乙烯吡咯烷酮，用氮气置换烧瓶内空气30分钟，持续通入氮气后持续搅拌的同时打开超声波发生器，超声搅拌反应2小时，停止超声，得到白色产物。
以下通过实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种用于细胞体外培养的复合型材料，制备方法如下：
（1）种球制备：
将2-4g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），5-15g甲基丙烯酸甲酯（MMA），0.05-0.35g偶氮二异丁腈（AIBN），40g去离子水和60g无水乙醇加入带有冷凝管、搅拌器和氮气进出口的250ml四口烧瓶中，搅拌速率调至200r/min ,待所有固体完全溶解之后，用氮气置换烧瓶内空气30分钟，持续通入氮气后烧瓶开始升温至70℃，持续搅拌的同时打开超声波发生器，超声搅拌反应1.5小时。向反应溶液中加入0.02-0.18g乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDGMA），停止超声，继续保持70℃搅拌反应8.5小时，得到白色产物；将所得到的产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤。重复操作三次以上，以除去多余的单体和分散剂。50℃下进行真空干燥24小时得到白色交联PMMA微球即为种子微球，球形度好，微球粒径D50为3.43μm，分散系数1.06。
（2）大粒径 PMMA微球制备：
在烧杯中称量 2.0g 粒径为 3.43μm PMMA 种球，加入 0.2%十二烷基苯磺酸钠（SDBS）PH值为10的水溶液 45mL 超声分散，加入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的250ml四口烧瓶中；在另一个烧杯中称入1.5g甲苯和 0.2%SDBS 溶液 90mL 超声至形成稳定乳液，将乳液加入四口烧瓶中，搅拌速率120r/min 逐步升温到40℃，通入氮气保持18小时，使PMMA种球活化，在烧杯中称量0.5-3.5g甲基丙烯酸甲酯（MMA），0.05-0.15g偶氮二异丁腈（AIBN）加入45ml蒸馏水溶解完全，加入45ml 0.4%SDBS 溶液，超声至形成稳定乳液，溶液中加入0.5-0.35g乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDGMA）搅拌均匀后，加入四口烧瓶中，搅拌速率调至200r/min ,40℃保持24小时，再加入终浓度3%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），用氮气置换烧瓶内空气30分钟，持续通入氮气后烧瓶开始升温至70℃，持续搅拌的同时打开超声波发生器，超声搅拌反应2小时。停止超声，继续保持70℃搅拌反应24小时，得到白色产物；将所得到的产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤。重复操作三次以上，以除去多余的单体和分散剂。50℃下进行真空干燥24小时得到白色交联PMMA微球，微球粒径D50为28.24μm，分散系数1.05。
以制备的PMMA微球为种球，经过5次重复微乳液包裹合成后除去多余的单体和分散剂。50℃下进行真空干燥24小时得到白色交联PMMA微球，微球粒径D50为181.40μm，分散系数1.06。
（3）多聚糖-PMMA复合微球制备
在烧杯中称量 2.0g 粒径为 181.40 μm PMMA 微球，加入 PH值为10的水溶液45mL 超声分散，加入0.2ml的二氯甲烷致孔剂，导入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的250ml四口烧瓶中；在另一个烧杯中称入1.5g低脂果胶和 和 90mL蒸馏水加热至80℃搅拌溶解至形成稳定溶液，将果胶溶液加入四口烧瓶中，搅拌速率400r/min 逐步降温到室温，通入氮气保持4小时，滴加入20ml 环氧氯丙烷，搅拌速率调至500r/min ,室温保持24小时，再加入终浓度3%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），用氮气置换烧瓶内空气30分钟，持续通入氮气后烧瓶开始升温至80℃，持续搅拌的同时打开超声波发生器，超声搅拌反应2小时。停止超声，继续保持80℃搅拌反应24小时，得到白色产物；将所得到的产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤。重复操作三次以上，以除去多余的单体和分散剂。50℃下进行真空干燥24小时得到淡黄色多聚糖-PMMA复合微球。
（4）氨基酸偶联多聚糖-PMMA复合微球的制备
在烧杯中称量 2.0g 粒径为 多聚糖-PMMA 微球，加入 PH值为9的水溶液 45mL超声分散，加入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的250ml四口烧瓶中；在另一个烧杯中称入120mM的精氨酸盐酸盐和80mM的赖氨酸盐酸盐的 90mL蒸馏水的混合溶液搅拌溶解后，将氨基酸溶液加入四口烧瓶中，搅拌速率200r/min 通入氮气保持4小时，滴加入2ml γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（KH560），搅拌速率调至400r/min ,室温保持24小时，再加入终浓度3%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），用氮气置换烧瓶内空气30分钟，持续通入氮气后持续搅拌的同时打开超声波发生器，超声搅拌反应2小时。停止超声，得到白色产物；将所得到的产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤。重复操作三次以上，以除去多余的单体和分散剂。50℃下进行真空干燥24小时得到白色氨基酸-多聚糖-PMMA复合微球即为用于细胞体外培养的复合型材料（微载体微球）。
实施例2 物理表征鉴定
本实施例对实施例1所得的白色氨基酸-多聚糖-PMMA复合微球（微载体微球）进行物理表征鉴定
采用粒径仪测定实施例1所得的白色氨基酸-多聚糖-PMMA复合微球，显微镜下微载体如图1和图2所示，微载体微球的粒径：D50=198.23μm，分散系数为1.08。
显微镜下观察微球形态较均一，透光率良好。
实施例3 微载体在不同细胞系培养应用鉴定
（1）制备复合微载体培养Vero细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度1.5-2.0 ×105个细胞/毫升，微载体浓度3-3.5克/升，培养终体积为200毫升，培养基为DMEM/M199(1:1) 加10%胎牛血清，搅拌培养168小时，最终细胞密度可达到2.0-2.2 ×106个细胞/毫升。图3为复合微载体培养Vero细胞8小时照片。
（2）制备复合微载体培养L929细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度2.5-3.0 ×105个细胞/毫升，微载体浓度5克/升，培养终体积为200毫升，培养基为DMEM/M199(1:1) 加10%胎牛血清，搅拌培养168小时，最终细胞密度可达到2.0-2.5 ×106个细胞/毫升。图4为复合微载体培养L929细胞120小时照片。
（3）制备复合微载体培养CHO22H11细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度2.0-2.5×105个细胞/毫升，微载体浓度2.5-3.0克/升，培养终体积为200毫升，培养基为DMEM/F12(1:1) 加10%胎牛血清，搅拌培养172小时，最终细胞密度可达到2.0-2.5 ×106个细胞/毫升。图5为复合微载体培养CHO22H11细胞96小时照片。
试验结果：采用本发明的用于细胞体外培养的复合型材料（微载体微球）对Vero细胞、L929细胞、CHO22H11细胞分别进行培养，都具有较好的效果，培养168小时，细胞密度可达2.0×106 个细胞/毫升以上。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种用于细胞体外培养的复合型材料，其特征在于，所述复合型材料由包括以下步骤的方法制备得到：
（1）种球制备：将2-4重量份聚乙烯吡咯烷酮，5-15重量份甲基丙烯酸甲酯，0.05-0.35重量份偶氮二异丁腈，40重量份去离子水和60重量份无水乙醇加入带有冷凝管、搅拌器和氮气进出口的四口烧瓶中，搅拌待所有固体完全溶解之后，持续通入氮气后烧瓶开始升温至65-75℃，持续搅拌的同时打开超声波发生器进行超声搅拌反应1-2小时；向反应溶液中加入0.02-0.18重量份乙二醇二甲基丙烯酸酯，停止超声，继续搅拌反应得到白色产物；将所得到的产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤，真空干燥得到白色交联PMMA微球即为种子微球；
（2）大粒径PMMA微球制备：向步骤（1）得到的所述种子微球中加入十二烷基苯磺酸钠水溶液进行超声分散，加入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；
将甲苯和SDBS 溶液混合超声至形成稳定乳液，将所述稳定乳液加入到四口烧瓶中，搅拌并升温到35-45℃，通入氮气使PMMA种球活化；
向0.5-3.5g甲基丙烯酸甲酯，0.05-0.15g偶氮二异丁腈加入45ml蒸馏水至溶解完全，加入45ml 0.4%的SDBS 溶液进行混合，再加入0.5-0.35g乙二醇二甲基丙烯酸酯搅拌均匀后，超声至形成稳定乳液，加入四口烧瓶中，搅拌均匀，再加入聚乙烯吡咯烷酮，持续通入氮气后开始升温至65-75℃，持续搅拌的同时进行超声搅拌反应1.5-2.5小时，停止超声，继续搅拌至反应完成，得到白色产物；将所得到的白色产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤，真空干燥得到白色交联PMMA微球；
以制备的PMMA微球为种球，经过多次重复微乳液包裹，真空干燥得到白色交联大粒径PMMA微球；
（3）多聚糖-PMMA复合微球制备：向2.0g 所述大粒径PMMA微球中加入PH为10的水溶液进行超声分散，加入0.2ml二氯甲烷致孔剂，导入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；将1.5g低脂果胶和90mL蒸馏水加热至75-85℃搅拌溶解至形成稳定的果胶溶液，将果胶溶液加入四口烧瓶中，搅拌速率400r/min 逐步降温到室温，通入氮气保持4小时，滴加入20ml 环氧氯丙烷，搅拌速率调至500r/min，室温保持24小时，再加入终浓度3%的聚乙烯吡咯烷酮，用氮气置换烧瓶内空气30分钟，持续通入氮气后烧瓶开始升温至75-85℃，持续超声搅拌反应1.5-2.5小时，停止超声，继续保持80℃搅拌反应24小时，得到白色产物；将所得到的白色产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤，真空干燥得到淡黄色多聚糖-PMMA复合微球；
（4）氨基酸偶联多聚糖-PMMA复合微球的制备：在烧杯中称量2.0g步骤（3）得到的所述多聚糖-PMMA复合微球，加入PH为9的水溶液45mL超声分散，加入带有冷凝管、搅拌器和氮气出入口的四口烧瓶中；在另一个烧杯中称入120mM的精氨酸盐和80mM的赖氨酸盐和90mL蒸馏水的混合溶液搅拌溶解后，将氨基酸溶液加入四口烧瓶中，搅拌速率为200r/min，通入氮气保持4小时，滴加入2ml γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，搅拌速率调至400r/min，室温保持24小时，再加入终浓度3%的聚乙烯吡咯烷酮，用氮气置换烧瓶内空气30分钟，持续通入氮气后持续搅拌的同时打开超声波发生器，超声搅拌反应2小时，停止超声，得到白色产物；将所得到的白色产物进行过滤，然后用无水乙醇洗涤并进行超声分散，然后再过滤，真空干燥得到白色氨基酸偶联多聚糖-PMMA复合微球，即为用于细胞体外培养的复合型材料。
2.根据权利要求1所述的用于细胞体外培养的复合型材料，其特征在于，步骤（1）中，所述搅拌的速率均为200r/min。
3.根据权利要求1所述的用于细胞体外培养的复合型材料，其特征在于，步骤（1）中，种子微球粒径D50为3.43μm，分散系数为1.0。
4.根据权利要求1所述的用于细胞体外培养的复合型材料，其特征在于，步骤（2）中，白色交联大粒径PMMA微球的粒径D50为181.40μm，分散系数为1.06。
5.一种培养方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一所述的用于细胞体外培养的复合型材料对细胞进行培养。
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