CN107530370B - 用于培养哺乳动物细胞的微载体、基质和支架及其制造方法 - Google Patents

用于培养哺乳动物细胞的微载体、基质和支架及其制造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107530370B
CN107530370B CN201680017235.9A CN201680017235A CN107530370B CN 107530370 B CN107530370 B CN 107530370B CN 201680017235 A CN201680017235 A CN 201680017235A CN 107530370 B CN107530370 B CN 107530370B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
copolymer
selectively oxidized
glycoprotein
polyamine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680017235.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107530370A (zh
Inventor
J.W.米歇尔
杨达志
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Dingsheng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN107530370A publication Critical patent/CN107530370A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107530370B publication Critical patent/CN107530370B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B15/00—Preparation of other cellulose derivatives or modified cellulose, e.g. complexes
    • C08B15/005—Crosslinking of cellulose derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B15/00—Preparation of other cellulose derivatives or modified cellulose, e.g. complexes
    • C08B15/02—Oxycellulose; Hydrocellulose; Cellulosehydrate, e.g. microcrystalline cellulose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B15/00—Preparation of other cellulose derivatives or modified cellulose, e.g. complexes
    • C08B15/05—Derivatives containing elements other than carbon, hydrogen, oxygen, halogens or sulfur
    • C08B15/06—Derivatives containing elements other than carbon, hydrogen, oxygen, halogens or sulfur containing nitrogen, e.g. carbamates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本文公开了用于生长哺乳动物细胞的微载体、基质和支架，包括由多糖‑多胺共聚物构成的共聚物颗粒和基质。该共聚物颗粒和基质具有至少50微米的孔尺寸并允许哺乳动物细胞在颗粒和基质的外表面上和在颗粒和基质的内部都生长。本文还公开了制备这种微载体、基质和支架以及组合的方法。此外，本文还提供了使用这种微载体、基质和支架以及组合生长哺乳动物细胞的方法。

Description

用于培养哺乳动物细胞的微载体、基质和支架及其制造方法
本申请要求2015年3月20日提交的美国临时申请号62/136,241的权益，其通过引用整体并入本文。
技术领域
总的来说，本公开涉及用于培养贴壁依赖的(附着依赖的，anchorage-dependnet)哺乳动物细胞的材料，和具体地涉及用于贴壁依赖的哺乳动物细胞的高密度生长的载体、基质和支架，及其制造方法。
背景技术
哺乳动物细胞、特别是人类细胞的培养在生命科学、制药和生物技术研究中是至关重要的，因为可使用人类细胞的培养物来确定细胞功能和相互作用，并且例如制造治疗细胞、大量的蛋白质和开发疫苗用的病原体。人类基因产物通常利用经由细菌、酵母和昆虫的基因表达系统的体外方法产生。然而，许多人类蛋白质的正常生物功能、活动和代谢依赖于翻译后修饰，如糖基化、泛素化、蛋白水解断裂和二硫化桥键(disulfide bridge)。这些翻译后修饰只能在哺乳动物并且有时只在人类细胞中专属地(严格地，properly)进行。此外，具有高于30,000道尔顿(Da)分子量的蛋白质通常无法被微生物表达。为了制造这样的具有其生物功能正常的人类蛋白质，哺乳动物细胞表达系统可能是唯一合适的系统。因此，按比例放大这些蛋白质的制造能力和这样的制造成本取决于哺乳动物细胞培养物的产率，其通常与细胞培养物的细胞密度成比例。
在三维(3-D)悬浮液模型中培养贴壁依赖的哺乳动物细胞是实现细胞高密度培养的一种方式。为了达到更高细胞密度的生长，使用器官型培养和微载体的方法作为两个主要的改进的培养模型。虽然器官型培养是真正的3-D生长，但高密度培养的达到仍然受到营养物扩散的阻碍。微载体方法提供锚定表面并允许在悬浮液模型中培养贴壁依赖的细胞。然而，细胞通常通过温和的搅动而在悬浮在培养基中的微载体的表面上作为单层生长，其不是真正的3-D生长。
源自固体组织的大多数哺乳动物细胞只能以粘附模式生长。受重力影响，贴壁依赖的哺乳动物细胞通常在培养物容器的最低表面上以单层形式生长。因为以常规的粘附生长模式难以实现高细胞密度的生长，所以通过哺乳动物细胞培养工业制造的药品的成本非常高。此外，以单层生长的细胞可能对由于所述培养基或生物反应器的搅动期间细胞的碰撞导致的损害是敏感的。此外，这样的单层生长系统可能容易受到污染，因为它们直接暴露于培养环境中。
此外，通常，为了促进和增强培养的细胞的附着，(例如通过用胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白和聚l-赖氨酸涂覆载体)处理常规的细胞生长微载体的表面。这样的涂覆材料和涂覆工序的使用可显著地增加细胞载体及其相关产品的成本。
由于其已知的高细胞毒性，水溶性阳离子共聚物目前在生物医学领域中的应用非常有限。已知，细胞毒性是由溶液中可溶且可运动的分子的高电荷密度引起的。
因此，需要至少克服上述缺点的哺乳动物细胞的生长系统。
发明内容
本文描述多糖-多胺共聚物基质或支架和阳离子共聚物基质或支架，它们可以用作细胞的微载体。多糖-多胺共聚物当其质子化时，可形成具有阳离子位点的阳离子聚合物基质。在一个形式中，共价交联的共聚物提供三维结构体，当水合时尤其如此。
多糖-多胺共聚物可以用作培养多种类型的细胞如原代细胞、干细胞、癌细胞、无限增殖化细胞等的微载体。通过一个方法，使用微载体促进贴壁依赖的哺乳动物细胞的生长。在一个形式中，由本文所述的多糖-多胺共聚物提供的微载体可以提供用于细胞生长的多层多孔结构体。此外，根据一些形式，本文所述的微载体的孔的直径大于50μm，从而类似于3-D生长方式，有利地使贴壁依赖的哺乳动物细胞在阳离子共聚物颗粒微载体的外表面和内表面两者上生长。这种生长方式促进在细胞生长期间营养物的渗入，并可显著地增大每单位体积的培养基的细胞密度。
根据一些形式，本文所述的微载体的3-D开放构造可降低由培养基的搅动引起的典型的对细胞生长的干扰影响，并为细胞增殖提供稳定的环境，包括温度、pH值、生长因子的浓度和细胞因子，减少和/或防止已知由生物反应器的培养基的搅动例如搅拌、摇动等导致的细胞碰撞而发生的细胞损害。此外，本文所述的微载体的多层多孔结构可为培养细胞的生长提供稳定的微环境，降低了污染的机会，因为在微载体内生长的细胞未直接暴露。此外，本文所述的微载体可以是非细胞毒性的，并且由可再生、生物相容和环境友好的材料制成。此外，因为本文所述的微载体的表面可包括带正电荷的位点，所以不需要另外处理这些微载体的表面以增强培养的细胞的附着，从而允许使利用当前描述的微载体的生物反应器的产量最大化，同时使成本最小化。
在一个形式中，所得的多糖-多胺共聚物属于含有微孔结构和大孔结构两者的大孔微载体。与其他大孔微载体相似，多糖-多胺共聚物相对于单层表面微载体具有许多优点。首先，大孔隙度允许细胞容易地进入载体的内部并以高密度三维生长。在一个形式中，大孔微载体不仅保护所携带的细胞不受生物反应器产生的剪切力的影响，而且可以稳定细胞生长的微环境。第二，在一个形式中，由微载体内部生长的细胞产生的旁分泌和自分泌生长激素减少对外部生长因子的需要，并允许细胞创建用于长期培养的微环境。另外，大孔微载体可以支持各种细胞(包括贴壁依赖细胞、悬浮液中的细胞和半着生细胞)的良好细胞生长。此外，对于大孔微载体，可使用多种培养技术，包括搅拌、流化床和填充床反应器。
根据一个形式，多糖-多胺共聚物基质是两种预先存在的聚合物或大分子的反应的结果。按照一个形式，多糖-多胺共聚物可以被认为是二嵌段共聚物。在一个形式中，多糖-多胺共聚物是具有2,3-二醛部分的选择性氧化的多糖或选择性氧化的多糖侧链与具有能与所述醛部分反应的多官能的氨基官能团的氨基聚合物的反应产物。后一种反应产物包括作为具有三维结构的氨基多糖聚合物如氨基纤维素聚合物的粒状交联聚合物。当多糖-多胺共聚物材料中的氨基官能团被质子化时，氨基官能团提供具有阳离子官能团的阳离子共聚物。
一方面，多糖聚合物选自选择性氧化的纤维素、选择性氧化的淀粉、选择性氧化的壳聚糖、选择性氧化的葡聚糖、选择性氧化的糖原、选择性氧化的几丁质及其混合物。选择性氧化是指使多糖的葡萄糖单元上的C2和C3位置处的羟基氧化为醛，伴随有C2-C3键的断裂，其中该氧化不会产生比醛基更多的羧基，并且不会使多糖链断裂。
在一种非常重要的方面中，多糖聚合物是选自氧化的纤维素、选择性氧化的壳聚糖及其混合物的氧化多糖。如本文所用，选择性氧化的纤维素、选择性氧化的淀粉、选择性氧化的壳聚糖、选择性氧化的葡聚糖、选择性氧化的糖原、选择性氧化的几丁质意味着被氧化成二醛。稍后的选择性氧化的纤维素、选择性氧化的壳聚糖是重要的，因为它们含有无法被人消化的β-1,4糖苷键。聚合物诸如纤维素、淀粉、壳聚糖、葡聚糖、糖原和几丁质可以如下量被氧化：其对于提供能够与所述氨基聚合物反应的2,3-二醛部分，以允许氧化多糖与聚氨基官能的聚合物进行反应，继而提供具有可被质子化的氨基官能团的共价交联的基质或三维结构体。
本文讨论的材料可用于多种不同的用途。例如，大孔微载体可用于工业制造疫苗、治疗基因运载体、靶向蛋白、单克隆抗体和治疗细胞。大孔微载体、聚合物基质和支架也可以应用于人造组织的发育、蛋白水解酶的转种和细胞转移，以及关于细胞通信、功能、代谢和分化的研究。
附图说明
图1是使用纤维素主链(backbone)的示例性多胺纤维素共聚物的合成的示意图；
图2A-2F是示出纤维素和粘蛋白的示例性阳离子共聚物的形态和结构的共焦显微图像；
图3A和3B显示表征天然(原生)纤维素/粘蛋白、氧化的纤维素/粘蛋白和纤维素或粘蛋白阳离子共聚物的傅立叶变换红外光谱；
图4A-4I是显示过量表达绿色荧光蛋白且在涂覆有聚l-赖氨酸(图4A、4D和4G)、纤维素阳离子共聚物(图4B、4E和4H)和粘蛋白阳离子共聚物(图4C、4F和4I)的表面上生长的示例性(人的胚胎肾细胞系HEK-293)细胞的生长和形态的3-D反相荧光显微镜图像、；
图5A是显示在7天时期内细胞数量的倍数变化并且对在涂覆有聚l-赖氨酸、纤维素阳离子共聚物和粘蛋白阳离子共聚物的表面上生长的细胞的增殖加以比较的图表；
图5B是显示在7天时期内荧光强度的倍数变化并且对涂覆有聚1-赖氨酸、纤维素阳离子共聚物和粘蛋白阳离子共聚物表面上生长的细胞的外源(外生)蛋白质表达加以比较的图表；
图6A-6H示出常规起始材料(图6A，6C，6E和6G)向根据本文描述的方法制备的示例性支架(图6B和6D)和微载体(图6F和6H)的示例性变换；
图7A-7C示出利用本文所述的微载体培养人类细胞的示例性方法，其中图7A显示在不搅动的情况下在培养烧瓶中的细胞培养，图7B显示在旋转烧瓶中的细胞培养，图7C显示在不搅动的情况下在试管中的细胞培养；
图8A-8P说明显示过量表达绿色荧光蛋白且在根据本文所述方法制成的示例性微载体上进行生长直到9天的HEK-293细胞的生长和形态的3-D反相荧光显微镜图像；
图9A-9D说明显示过量表达绿色荧光蛋白且在根据本文所述的方法制成的示例性微载体上进行生长直到9天和5周的HEK-293细胞的生长和形态的3-D显微镜图像；
图10A说明显示绿色荧光蛋白的荧光强度的倍数变化并且对在常规的2-D表面上上和在根据本文所述方法制成的示例性微载体上生长的细胞的蛋白质表达加以比较的柱状图；
图10B显示说明在常规的2-D表面上和在根据本文所述方法制成的示例性微载体上生长的细胞的促红细胞生成素表达的Western Blot分析；
图11A-11F是显示过量表达绿色荧光蛋白且在未处理的表面上以及在本文所述的包括阳离子共聚物的涂覆的、和变换的支架上生长的HEK-293细胞的生长和形态的3-D显微镜图像；
图12是由纤维素获得示例性共聚物的方法的示意图；和
图13是纤维素的一般分子结构。
具体实施方式
在一个形式中，共价交联的共聚物是多糖-多胺共聚物，其通常包括两种组分，即主链分子和与主链分子共价交联的官能的阳离子聚合物基团。在一个方法中，在水溶性阳离子聚合物和大的聚合物分子之间形成的稳定的共价键提供不溶于水的阳离子共聚物。水溶性阳离子聚合物的这样的固定有利地降低或消除阳离子聚合物在细胞培养应用中的细胞毒性。
多糖-多胺共聚物可用作培养贴壁依赖的哺乳动物细胞的细胞载体、基质和支架，从而与现有的细胞培养微载体系统相比，有利地实现显著更高密度的细胞生长。多糖-多胺共聚物可以用作施加到用于培养哺乳动物细胞的多种表面，例如细胞培养管、平板、或其它材料(包括纸、玻璃、金属和陶瓷)的涂覆材料，并且有利地提供适用于培养贴壁依赖的哺乳动物细胞的多孔结构。所述多糖-多胺共聚物还可以颗粒形式提供并用作在三维悬浮液模型中培养哺乳动物细胞的细胞载体。还描述制备这样的多糖-多胺共聚物和包含这样的不溶解的阳离子共聚物的支持细胞培养的表面的示例性方法以及阳离子共聚物类(copolymer-based)作为细胞载体、基质和支架的一些可能的应用。
在一个形式中，交联的共聚物提供三维结构，当其水合时尤其如此。在一些形式中，多糖-多胺共聚物可甚至更特别地以包括形成多糖组分的衍生自纤维素的材料的多胺-纤维素共聚物为特征。
在一个方法中，如本文所述的多糖-多胺共聚物的制造方法包括氧化反应和亲核羰基加成反应。在一个方法中，氧化反应可包括糖化物、多糖例如微晶纤维素、支链淀粉、淀粉、壳聚糖、几丁质、葡聚糖、糖原等的通过一个步骤的氧化。在另一个方法中，氧化反应可包括含糖的糖蛋白如粘蛋白等的氧化。所述聚合物可制备成具有不同水平的胺和/或阳离子位点。不同类型的哺乳动物细胞需要不同强度的由细胞附着的表面携带的电荷，以促进细胞的附着和生长。由具有不同密度的阳离子电荷(带正电荷)载体的共聚物制成的微载体可应用于培养具有特定的电荷要求的多种类型的细胞。
一方面，多糖聚合物和糖蛋白选自选择性氧化的纤维素、选择性氧化的淀粉、选择性氧化的壳聚糖、选择性氧化的葡聚糖、选择性氧化的糖原、选择性氧化的几丁质和选择性氧化的粘蛋白、其混合物。选择性氧化是指使在多糖的葡萄糖单元上的C2和C3位置处的羟基进行二醛氧化(di-aldehyde oxidize)，伴随有C2-C3键的断裂，其中该氧化不会产生比醛基更多的羧基，并且不会使多糖链断裂。
在一方面中，氨基聚合物为作为具有包括胺基团的芯或中心和如下分支的大分子胺的支化聚合物或树枝状大分子：其包括可以所述芯或中心处的官能团为起点通过迭代(iterative)反应形成的这些官能团以提供高度支化的胺聚合物。在一个方面中，树枝状聚合物分子可以是球形的或近球形的或者具有如下的三维形态：其是球状的或由曲线而成的或由曲线界定的外周。
氨基聚合物与多糖聚合物或糖蛋白(例如(具有二醛部分的)氧化的纤维素和粘蛋白)进行交联以提供衍生自多糖的“主链”和衍生自糖蛋白的“主链”的三维结构，其中多个多糖链与多个氨基聚合物链连接。这些多糖聚合物和糖蛋白是预先存在的聚合物，其是通过也作为离散的氨基嵌段预先存在的氨基聚合物连接在一起的“嵌段”或“主链”。在一个形式中，多糖-多胺共聚物可以被认为是二嵌段共聚物。连接的主链作为胺聚合物(其形成交联嵌段)和选择性氧化的多糖或选择性氧化的糖蛋白的共价交联的产物键合在一起，以提供可被质子化的具有高百分比的胺含量的交联的嵌段共聚物和共聚物基质。
纤维素和壳聚糖含有无法被哺乳动物消化的β-1,4-糖苷键。淀粉、葡聚糖和糖原含有β-1,6-糖苷键并且能被人所消化。不希望被理论限制，纤维素和类似的多糖可提供比粘蛋白和类似的糖蛋白更长期限的细胞生长。纤维素通常是代谢惰性的，因为哺乳动物细胞在其上生长时通常不消耗纤维素，而粘蛋白通常被认为易于细菌消化。
氨基聚合物与多糖聚合物或糖蛋白进行交联，以提供其中多个多糖链与多个氨基聚合物链连接的衍生自多糖的“主链”和衍生自糖蛋白(glycolprotein)的“主链”的三维结构。这些多糖聚合物和糖蛋白是预先存在的聚合物，其是通过也作为离散的氨基嵌段的预先存在的氨基聚合物连接在一起的“嵌段”或“主链”。在一个形式中，多糖-多胺共聚物可以被认为是二嵌段共聚物。连接的主链作为胺聚合物(其形成交联嵌段)和选择性氧化的多糖或选择性氧化的糖蛋白的共价交联产物键合在一起，以提供可被质子化的具有高百分比的胺含量的交联的嵌段共聚物和共聚物基质。
共价交联的共聚物可以多种方式制备。在一个形式中，所述制备分三步进行。首先，经由氧化反应，通过选择性地氧化葡萄糖单元的C2和C3上的羟基而在多糖或多糖侧链上产生大量醛基。在一个形式中，选择性氧化通常是指将多糖的葡萄糖单元上的C2和C3位置处的羟基氧化成相应的醛，伴随有C2-C3键的断裂。这样的氧化不会产生比醛基多的羧基并且不会导致多糖链的断裂。羧基无法在氧化反应的条件下与胺聚合物进行共价交联，并且如果形成羧基(carboxylic)，则羧基将在水性环境中不合意地形成羧酸。此外，羧酸如果形成则将携带负电荷，其将不合意地干扰当胺基团质子化时所形成的阳离子电荷。
通过多糖的选择性氧化产生的醛基与氨基聚合物的伯胺进行反应形成亚胺衍生物，具有不稳定的碳-氮双键的中间体多糖-多胺共聚物。在一个形式中，这些被认为是二嵌段共聚物。接下来，为了制造稳定的多糖-多胺共聚物，进行还原反应以将所述亚胺的碳-氮双键转化为胺的碳-氮单键。
根据一个形式，多糖-多胺共聚物基质是两种预先存在的聚合物或大分子的反应的结果。根据一个形式，多糖-多胺共聚物可被认为是二嵌段共聚物。在一个形式中，多糖-多胺共聚物是具有2,3-二醛部分的氧化多糖或氧化糖蛋白和具有能与所述醛部分反应的多官能的氨基官能团的氨基聚合物的反应产物。稍后的反应产物包括具有三维结构的作为多糖-多胺共聚物如纤维素-多胺共聚物的粒状交联共聚物。当多糖-多胺共聚物材料中的氨基官能团被质子化时，氨基官能团提供具有阳离子官能团的阳离子共聚物。
由上述氧化反应产生的中间体聚合物可具有以下通式：
Figure BDA0001413513700000081
如图12所示的反应1显示由纤维素获得示例性聚合物的方法的示意图。纤维素是包括通过β-1,4-糖苷键互连的葡萄糖单元的天然存在的聚合物。形成衍生自纤维素的聚合物的主链的纤维素的分子结构通常在图13中表示。
如图12所示，多糖如微晶纤维素可被氧化而形成纤维素的中间体。在一种方法中，富含羰基的中间体如醛通过多糖主链的氧化而产生。特别地，反应性醛基可以通过沿多糖主链打开多个葡萄糖单元而产生。
在图12中，式“A”通常表示纤维素，其可以是任何市售纤维素，式“B”通常表示由纤维素的氧化产生的2,3-二醛纤维素。如图12所示，2,3-二醛纤维素是具有与纤维素类似的结构的线型聚合物，并且包括每个葡萄糖单元的一个或多个(且在所示方法中，两个)反应性醛基。通过一种方法，可用硫酸将纤维素预处理到降低的结晶度和尺寸。
虽然图12中的示例性化学反应使用高碘酸钠(NaIO4)作为氧化剂，但是应当认识到，纤维素的氧化可通过高碘酸、高碘酸钾或高碘酸的其它阳离子衍生物和盐等。其它氧化剂包括氯气、过氧化氢、过乙酸、二氧化氯、二氧化氮、过硫酸盐、高锰酸盐、重铬酸盐-硫酸、次氯酸、次卤酸盐(hypohalite)或高碘酸盐和多种金属催化剂。取决于氧化剂的性质和反应条件，除了起始材料的原始羟基之外，包括氧化纤维素的氧化多糖可还包含羧酸、醛和/或酮基团。
高碘酸盐是特殊形式的氧化剂。已知，包括纤维素的多糖的高碘酸盐介导的氧化可将多糖葡萄糖单元上的C2和C3位置处的羟基在伴随有C2-C3键的断裂的情况下选择性地氧化成相应的醛，并且是用于多糖修饰的最有效的方法之一。然而，其它氧化剂会产生比醛基多的羧基，并导致多糖链的断裂。在所述的反应条件下，羧基无法与胺聚合物进行共价交联。另外，它会离子化并在水溶液中变成羧酸。羧酸携带负电荷并干扰所述共聚物的阳离子功能。
在一种方法中，然后，可将如上所述的作为多糖氧化的结果而形成的聚合物中间体和一种或多种支化的阳离子官能团(例如氨基/亚胺基)聚合物进行亲核羰基加成(例如，氢化物还原)反应。通常，多官能的含伯胺的分子可与衍生自多糖例如纤维素等或糖蛋白等的含醛寡糖进行交联。通过一种方法，使用大分子量的多官能的伯胺试剂可实现在随后质子化时在衍生的糖化物上形成高密度的阳离子位点。对于大多数方法，可使用含有多个伯胺的任何多胺(线型的和支化的)作为亲核试剂。
高分子量的多胺如聚乙烯亚胺与衍生自纤维素的含醛基的糖化物的上述反应导致在水溶性阳离子共聚物和纤维素主链分子之间形成稳定的共价键，从而提供通常由上式“C”表示并在下文更详细地讨论的不溶于水的阳离子聚合物。在以上说明的示例性反应中，对作为用高碘酸钠氧化纤维素的结果形成的含反应性醛基的纤维素中间体和阳离子官能聚合物如聚乙烯亚胺进行亲核羰基加成反应，且在该实例中进行氢化物还原反应，以衍生出通常由式“C”表示的示例性不溶解的阳离子的衍生自纤维素的共聚物。
虽然上述示例性反应使用聚乙烯亚胺作为亲核剂，但是其它示例性阳离子共聚物可用作在与上述包括反应性醛基的纤维素中间体的反应中的亲核试剂。一些示例性的阳离子官能的聚合物包括例如聚(烯丙胺)、聚(酰氨基胺)、聚丙烯亚胺四胺等。聚乙烯亚胺、聚(烯丙胺)和聚丙烯亚胺四胺是通常被认为是分支聚合物或树枝状聚合物的包含合成多胺的聚合物。多肽通常包含高百分比的氨基酸，包括精氨酸、赖氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，并且在本文描述反应中可采用某些多肽代替所述合成多胺。
此外，如国际公布No.WO 2014/029888中所述的分支或大环多胺可适用于本文所述的反应，该国际公布的全部内容通过引用并入本文。此外，适用于本文中所述的反应的一些示例性线型多胺以下列出：
Figure BDA0001413513700000101
1,3-二氨基丙烷(DAP)
丙烷-1,3-二胺
Figure BDA0001413513700000102
腐胺(PUT)
丁烷-1,4-二胺
Figure BDA0001413513700000103
尸胺(CAD)
戊烷-1,5-二胺
Figure BDA0001413513700000104
亚精胺(SPD)
N-(3-氨基丙基)-1,4-二胺
Figure BDA0001413513700000105
精胺(SPM)
N,N’-二(3-氨基丙基)丁烷-1,4-二胺
Figure BDA0001413513700000106
二乙基去甲精胺(Norspermine,NSPM)
N,N’-二(3-氨基丙基)丙烷-1,3-二胺
Figure BDA0001413513700000111
高精胺(HSPM)
N,N’-二(4-氨基丁基)丁烷-1,4-二胺
Figure BDA0001413513700000112
N1-乙酰基亚精胺(N1-AcSPD)
N-[3-(4-氨基丁基氨基)丙基]乙酰胺
Figure BDA0001413513700000113
N1-乙酰基精胺(N1-AcSPM)
N-[3-[4-(3-氨基丙基氨基)丁基氨基]丙基]乙酰胺
Figure BDA0001413513700000114
N1,N12-二乙酰基精胺(N1,N12-DiAcSPD)
N-[3-[4-(3-乙酰氨基丙基氨基)丁基氨基]丙基]乙酰胺
在衍生的多糖和亲核试剂的上述反应之后，所得产物可通过冻干、蒸发或沉淀进行干燥，只要该方法不使颗粒的内部三维结构坍塌。通过一种方法，可通过使干燥的材料通过合适的筛网进行筛分而实现均匀粒度的阳离子共聚物材料，例如具有约100μm至约10mm尺寸的中值粒度。
通过一种方法，所得的阳离子共聚物的氨基密度还受到聚合度、亲核试剂的尺寸和多糖底物主链和亲核试剂的相对比率的控制。如本申请中所使用的，电荷密度是指阳离子共聚物内的伯、仲和叔铵阳离子的数量。在一个重要方面中，支化多胺具有基于支化多胺的重量的至少24.5重量％的氮含量，其对于当质子化(导致阳离子共聚物基质)时提供具有基于阳离子材料的重量的不超过30重量％、和优选地0.5-20重量％范围内的氮含量的多糖-多胺共聚物材料是有效的。
基于衍生的含醛的糖化物和官能的伯胺亲核试剂的摩尔比，所述范围可定性地描述为低、中等和高。在一种方法中，通过定量滴定法测定所述反应物的醛含量和伯胺含量，而最终产物的NH2+含量通过核磁共振光谱(NMR)测定。
由上述氧化和亲核羰基加成反应产生的多糖-多胺共聚物的物理特性可以通过操纵上述反应的条件，例如通过改变底物主链和亲核试剂的相对比率、改变用于与底物主链的反应的官能团的类型和/或改变反应的时间、pH和/或温度而控制。例如，提高所述反应进行的温度可导致所得多糖-多胺共聚物的尺寸的相应增加。在另一实例中，增加反应时间可导致所得多糖-多胺共聚物的尺寸的相应增加。在又一实例中，增加反应条件的pH可导致所得多糖-多胺共聚物的尺寸的相应增加。在又一实例中，所得的多糖-多胺共聚物产物的尺寸可经由分子量和两种主要反应物即衍生物(多)糖(例如2,3-二醛纤维素)和多胺亲核试剂(例如聚乙烯亚胺)的比率的选择而控制。
在一种方法中，可使用具有约15,000Da至约900,000Da平均分子量的聚(烯丙胺)(PLA)或具有约25,000Da至约750,000Da平均分子量的聚乙烯亚胺(PEI)。例如，可使用得自Sigma-Aldrich的约15,000Da、17,000Da、65,000Da或900,000Da平均分子量的PLA，或约25,000Da或750,000Da平均分子量的PEI。反应中使用的多糖主链组分(如纤维素)对形成阳离子位点的官能聚合物(如聚乙烯亚胺)的比率可取决于形成阳离子位点的官能聚合物的分子量。例如，对于约15,000Da至约25,000Da分子量的PEI和PLA，衍生的纤维素对多胺的比率可在约1:1至约1:8的范围内。在一种方法中，当使用分子量范围为约65,000至约750,000的PEI和PLA时，衍生的纤维素对多胺的比率在约1:5至约1:20的范围内。
然而，已经发现，这些阳离子共聚物并非所有均可适用于构成细胞微载体，因为一些共聚物通过质子化变成带强正电荷的材料并显示出不容忽视的细胞毒性。例如，对于约15,000Da至约25,000Da分子量的PEI和PLA，衍生的纤维素对多胺的比率可在约50:1至约1:8的范围内。在一个形式中，仅在约50:1至约1:1范围内的共聚物适用于构成大载体。在一种方法中，当使用具有约65,000至约750,000分子量范围内的PEI和PLA时，衍生的纤维素对多胺的比率在约10:1至约1:20的范围内。但是，仅在约10:1至约1:5范围内的共聚物适用于构成大载体。
不溶解的阳离子共聚物产物的粒度可通过将交联的多官能伯胺(例如，聚乙烯亚胺)与氧化的多糖衍生物(2,3-二醛纤维素)和具有低、中、和非常高的分子量(例如在约15,000Da至750,000Da范围内)的选择性氧化的糖蛋白进行偶联而调节，以获得约10nm至约5mm范围内的颗粒。
通过一种方法，纳米颗粒级的阳离子共聚物颗粒可用作转染剂，毫米级(或更大的)阳离子共聚物颗粒可用作3-D生长载体，并且微米级阳离子共聚物颗粒可以是用于在细胞培养平板、塑料管上进行涂覆，且通常可涂覆适用于细胞生长的任何表面。
能通过上述反应获得的阳离子共聚物可用作培养多种类型的细胞如原代细胞、干细胞、癌细胞、无限增殖化细胞等的微载体。通过一种方法，微载体用于促进贴壁依赖的哺乳动物细胞的生长。虽然常规的微载体通常是允许细胞在珠粒表面上以单层生长的固体珠粒，但是现有的微载体的表面通常需要(例如通过附着蛋白质)进行处理以增强所培养的细胞与微载体的附着。另外，虽然常规的微载体通常用于通过在微载体的表面上以单层增殖细胞培养处于悬浮状态中的细胞，但是由本文所述的阳离子共聚物提供的微载体有利地提供用于细胞生长的多层、多孔结构体。另外，虽然一些已知的微载体具有约30μm的平均孔尺寸，但是本文所述的微载体的孔直径大于50μm，从而类似于3-D生长方式，有利地使贴壁依赖的哺乳动物细胞在阳离子聚合物颗粒微载体的外表面和内表面两者上生长。该生长方式有利地促进在细胞生长期间的营养物渗入，并且有利地显著增大每单位体积培养基的细胞密度。
不希望受理论限制，本文所述的微载体的3-D开放结构有利地减少由培养基的搅动导致的典型干扰对细胞生长的影响，并为细胞增殖提供稳定的环境，其包括温度、pH值、生长因子浓度和细胞因子，从而减少和/或防止由通过生物反应器的培养基的搅动例如搅拌、摇动等导致的细胞碰撞而发生的已知的细胞损伤。另外，本文所述的微载体的多层、多孔结构为所培养的细胞的生长提供稳定的微环境，从而有利地降低污染的机会，因为在微载体内生长的细胞未直接地被暴露。另外，本文所述的微载体是非细胞毒性的，并且由可再生、生物相容且环境友好的材料制成。此外，由于本文所述的微载体的表面包括带正电荷的位点，因此不需要为了增强培养的细胞的附着而另外处理这些微载体的表面，从而使利用当前(本文)描述的微载体的生物反应器的产量最大化，同时使成本最小化。
图2A-2F显示由Keyence VHX-2000系列的数字显微镜产生的图像，并且描绘如上所述的通过氧化-亲核加成反应能获得的一些示例性的纤维素阳离子共聚物和粘蛋白阳离子共聚物的形态和结构。例如，图2A显示微晶纤维素的形态和结构，而图2B和2C显示不溶于水的纤维素阳离子共聚物的形态和结构，其中图2B描绘用曙红(阴离子染料)着色的纤维素阳离子共聚物的20X图像，且图2C描绘在未进行曙红染色的情况下的以400X的纤维素阳离子共聚物。图2D-2F显示相似的图像，而是针对粘蛋白而不是微晶纤维素。图2A-图2B和2C的比较以及图2D-图2E和2F的比较显示，与天然纤维素和粘蛋白相比，纤维素和粘蛋白阳离子共聚物分别具有显著的形态差异。例如，纤维素阳离子共聚物和粘蛋白阳离子共聚物与曙红结合，而天然纤维素和天然粘蛋白将不与曙红结合。另外，图2C和图2F显示，与天然纤维素和粘蛋白不同，纤维素阳离子共聚物和粘蛋白阳离子共聚物分别具有多层、多孔结构。
图4A-4I描绘通过3-D显微镜获得、且描绘涂覆有多种材料的表面的形态和研究所涂覆的表面上的细胞生长的图像。在一种方法中，未处理的聚苯乙烯盘状表面用聚l-赖氨酸、纤维素阳离子共聚物或粘蛋白阳离子共聚物涂覆。然后，将所涂覆的表面用曙红着色并通过3-D显微镜进行检查，其中结果示于图4A-4C中。通过一种方法，将过量表达绿色荧光蛋白(GFP)的人胚胎肾细胞系(HEK-293)在所涂覆的表面上接种和生长，并通过荧光显微术和相对比显微术在3天时(结果示于图4D-4F)和在7天时(结果示于图4G-4I)研究细胞的形态和生长。如在图4A-4C中可见，纤维素阳离子共聚物和粘蛋白阳离子共聚物在聚苯乙烯表面上形成多孔涂层，并且HEK-293细胞在涂覆的表面上附着和生长。如图4D-4I可见，由在涂覆有所述阳离子共聚物的表面上生长的细胞比在涂覆有聚l-赖氨酸的表面上生长的细胞获得更强的GFP荧光强度，从而表明在涂覆有所述阳离子共聚物的表面上生长的细胞比在经聚l-赖氨酸处理的表面上生长的细胞要健康得多。
傅里叶变换红外光谱法(FTIR)是用于获得固体、液体或气体的吸收或发射光谱的技术。图3A和3B分别描绘阳离子纤维素和阳离子粘蛋白III的聚合物的傅里叶变换红外光谱法(FTIR)表征。具体地，图3A描绘纤维素、氧化的(2,3-二醛)纤维素和通过使2,3-二醛纤维素与具有约25,000分子量的聚乙烯亚胺(PEI)反应而获得的纤维素阳离子共聚物的FTIR吸收光谱。图3B描绘粘蛋白III、氧化粘蛋白III和通过使衍生的氧化粘蛋白与具有约25,000分子量的聚乙烯亚胺反应而获得的粘蛋白III的阳离子共聚物的FTIR吸收光谱。如在图3A和3B中可见，与天然的纤维素和粘蛋白相比，纤维素和粘蛋白的阳离子共聚物分别具有显著不同的吸收。
通过傅里叶变换红外光谱法(FTIR)确认纤维素、2,3-二醛纤维素和纤维素共聚物的化学结构，并且结果示于图3A中。在新颖的纤维素共聚物的谱图中可发现在2940-2830cm-1(-C-H伸缩)、1576cm-1(-N-H弯曲)和1350-1000cm-1(-C-N伸缩)处的特征峰。与PEI不同，新颖的阳离子聚合物的FTIR谱图在1656cm-1处显现作为-C＝N的伸缩谱带的区别峰，从而证明在PEI的胺基和2,3-二醛纤维素的醛基之间的希夫(Schiff)反应。
通过傅里叶变换红外光谱法(FTIR)确认粘蛋白、氧化粘蛋白和粘蛋白共聚物的化学结构，且结果示于图3B中。在粘蛋白共聚物的谱图中可发现在2940-2830cm-1(-C-H伸缩)、1576cm-1(-N-H弯曲)和1350-1000cm-1(-C-N伸缩)处的特征峰。
微载体的尺寸以及微载体的孔尺寸可通过反应条件、例如通过取决于多胺的分子量的底物主链组分对形成阳离子位点的聚合物的比率而控制。例如，具有约15,000Da至约25,000Da分子量的聚乙烯亚胺(PEI)或聚(烯丙胺)(PLA)，氧化纤维素对多胺的比率可在约50:1至约1:8的范围内。在一种方法中，当使用具有约65,000至约750,000分子量范围内的PEI和PLA时，氧化纤维素对多胺的比率在约10:1至约1:20的范围内。在一个形式中，为了制造具有均匀尺寸的微载体，通过使湿材料筛分通过合适的筛网(16-150筛目)而使所述共聚物变得更均匀，例如具有约100μm至约1mm尺寸的中值粒度。
如上所提到的，由上述反应得到的多糖-多胺共聚物和糖蛋白-多胺共聚物可具有以下通式：
Figure BDA0001413513700000151
可以多种方式使用多糖-多胺共聚物和糖蛋白-多胺共聚物来促进基于细胞培养物的细胞生长。例如，细胞生长支架可借助用本文所述的阳离子共聚物材料涂覆现有的细胞培养支架的表面以产生新的支架而制备。在一些方法中，如本文所述的阳离子共聚物可以作为涂覆材料施加，从而提供具有高密度的阳离子位点的聚合物、玻璃、金属和纸的中性或带负电荷的表面，其有利地促进多个哺乳动物细胞的附着和生长。
在其它方法中，包含多糖和糖蛋白的现有的细胞生长支架可通过将多糖或糖蛋白变成阳离子共聚物而转化成阳离子支架。例如，通过将包含的多糖变为阳离子共聚物，可将纤维素支架转化为阳离子支架或生长基质，其允许哺乳动物细胞的3-D生长并可用作用于产生人造组织的支架。
图5A和5B说明在涂覆有多种材料(在该方法中，聚l-赖氨酸(正对照)、纤维素阳离子共聚物和粘蛋白阳离子共聚物)的表面上生长的细胞HEK-293的增殖和外源蛋白质表达的比较。具体地，图5A说明所选择的涂层材料对细胞增殖的影响。在图5A中可以看出，与涂覆有聚l-赖氨酸的表面相比，细胞当它们在涂覆有纤维素阳离子共聚物和粘蛋白聚合物的阳离子共聚物的表面上生长时增殖更慢。图5B说明所选择的涂层材料对外源蛋白质表达水平的影响。在图5B中可以看出，与涂覆有聚l-赖氨酸的表面相比，细胞当它们在涂覆有纤维素阳离子共聚物和粘蛋白阳离子共聚物的表面上生长时表达更高的外源蛋白质水平。如此，与涂覆有聚l-赖氨酸的底物的表面相比，涂覆有阳离子共聚物的表面有利地支持更长时期的细胞生长，同时表达更高的外源蛋白质生产水平。
本文所述的微载体可用于生长例如在包括微载体的介质中悬浮且在如图7A中所示的在培养瓶中在不搅拌的情况下、如图7B中所示的在旋转烧瓶中和如图7C中所示的在管中在不搅拌的情况下的细胞。如此，微载体可显著地简化培养哺乳动物细胞的工序和条件。通过一种方法，例如，由聚乙烯亚胺纤维素共聚物制成的微载体可以细胞生长介质的约1重量％至约50重量％悬浮在细胞生长介质中。
本文所述的微载体可有利地以3-D悬浮方式实现哺乳动物细胞的生长。这例如显示在图8A-8P中，其说明使用由多种阳离子聚合物制成的多种微载体过量表达绿色荧光蛋白(GFP)的HEK-293细胞的培养物的反相荧光相对比显微镜图像。在一种方法中，通过具有约50％氧化的葡萄糖单元的低水平氧化的与具有约25,000或750,000分子量的聚乙烯亚胺聚合的纤维素培养HEK-293细胞，并且在第1天(图8A)、第3天(图8B)、第6天(图8C)和第9天(图8D)获得显微镜图像。
在另一种方法中，通过具有约80％氧化的葡萄糖单元的高水平氧化的与约25,000分子量的聚乙烯亚胺聚合的纤维素培养HEK-293细胞，并在第1天(图8E)、第3天(图8F)、第6天(图8G)和第9天(图8H)获得3-D显微镜图像。在又一种方法中，通过具有约80％氧化的葡萄糖单元的高度氧化的与约750,000分子量的聚乙烯亚胺聚合的纤维素培养HEK-293细胞，并在第1天(图8I)、第3天(图8J)、第6天(图8K)和第9天(图8L)获得3-D显微镜图像。在又一种方法中，通过具有约90％氧化的葡萄糖单元的高度氧化的与约25,000分子量的聚乙烯亚胺聚合的粘蛋白培养HEK-293细胞，并在第1天(图8M)、第3天(图8N)、第6天(图8O)和第9天(图8P)获得3-D显微镜图像。如在图8D、8H、8K和8P中最明显地看出，氨基纤维素共聚物(图8D、8H和8K)和氨基纤维素共聚物有利地实现以3-D悬浮方式的哺乳动物细胞的生长。
虽然图8A-8P表明阳离子微载体可以3-D悬浮方式支持长达9天的HEK-293细胞生长，但是应当认识到，阳离子微载体支持显著长于9天的时间段的以3-D悬浮方式的HEK-293细胞的生长。例如，图9A-9D表明阳离子微载体支持哺乳动物细胞例如HEK-293的以3-D悬浮方式的长期生长(例如在9天和35天之间)。应当认识到，取决于所使用的微载体，哺乳动物细胞可以由微载体提供的3-D悬浮方式生长长于35天(例如约35至约45天)和长于45天的时间段。仅以实例的方式对HEK-293细胞进行说明，并且可使用如本文所述的微载体成功地生长其它的哺乳动物细胞。在一种示例性方法中，通过将所述多孔微载体施加到合适的表面可支持异种接种肿瘤的生长。
图6A-6H显示使用上述方法将起始材料如无尘布(Texwipe)(图6A)、棉过滤垫(图6B)、粘蛋白III(图6C)和微晶纤维素(图6D)变换成由阳离子无尘布制成的支架(图6E)、由阳离子棉过滤垫制成的支架(图6F)、由阳离子粘蛋白制成的微载体(图6G)和由阳离子纤维素制成的微载体(图6H)。在一种方法中，基于纸和布的支架可通过在支架材料上进行反应而制造，从而直接变换所述支架材料本身。在一种方法中，可预先制造如本文所述的阳离子聚合物材料，并且然后可将支架诸如基于玻璃或塑料的支架浸入到所述阳离子聚合物材料中。
应当理解，图6A-6H显示仅几种可能的微载体、基质和支架，且根据本文所述的原理为了有利地提供高密度细胞的生长可使用其它微载体、基质和支架。这样的基于阳离子聚合物的支架有利地增强了哺乳动物细胞的生长，例如显示在图11B、11C、11E和11F中的，其显示出不同于在未处理的纤维素纸(图11A)和过滤垫(图11D)中形成单个菌落，过度表达绿色荧光蛋白的细胞在纤维素阳离子支架中有利地扩散和生长的3-D显微镜图像。
实施例
实施例1
可溶性2,3-二醛纤维素(DAC)或选择性氧化的粘蛋白(SOM)可通过纤维素的高碘酸钠氧化而制备。可通过200mL去离子水将10g纤维素(尺寸：<100nm，20μm，50μm，或纤维)或5g粘蛋白(II型或III型)再悬浮。然后，加入20g高碘酸钠，且然后用6X HCl将pH调节至3.0。接下来，将组合物脱气并用氮气吹扫，且然后使其在60℃下在搅拌的情况下在黑暗(无光，dark)中在pH 3下反应4小时。通过加入10mL乙二醇使所述反应停止。将产物相对于去离子水渗析3天。通过以40,000xg离心30分钟以除去作为粒料(pallet)的不溶解的DAC或SOM而收集作为上清液的可溶性DAC或SOM。然后，将收集的上清液冷冻干燥(任选的)。
实施例2
在另一实例中，(低氧化的)不溶解的2,3-二醛纤维素(DAC)或选择性氧化的粘蛋白(SOM)可以通过纤维素的高碘酸钠氧化而制备。用200mL去离子水将10g纤维素(尺寸：<100nm，20μm，50μm，或纤维)或5g粘蛋白(II型或III型)再悬浮，且然后加入10g高碘酸钠。然后，用6X HCl将pH调节至3.0，随后脱气并用氮气进行吹扫。然后，使组合物在60℃下在搅拌的情况下在黑暗中在pH 3下反应4小时。可通过加入10mL乙二醇使反应停止。产物用4升去离子水洗涤3次，每次1小时。通过以800xg离心10分钟收集不溶解的DAC或SOM。然后，用DI水(去离子水)将洗涤的不溶解的DAC或SOM溶液再悬浮。然后，可将洗涤的不溶解的DAC溶液冷冻干燥(任选的)。
实施例3
多糖-多胺共聚物和糖蛋白-多胺共聚物可通过使DAC或SOM与支化聚乙烯亚胺(PEI)(MW 750K)进行反应而合成。DAC/SOM对PEI的比率为50：1至1:10。将支化聚乙烯亚胺10g(MW 750K，在H2O中50重量％)加入到500mL烧杯中。用37％HCl将PEI的pH调节至5.0。通过加入6X HCl将含有适量DAC或SOM的100ml DAC溶液或SOM溶液的pH调至5.0。将PEI溶液和DAC或SOM的溶液在冰上培育(incubate)10分钟。将含有10g PEI的溶液和含有适量DAC或SOM的溶液混合并且在冰上以1000RPM培育5分钟。将混合物在没有搅动的情况下保持在冰上直到产物完全形成。将混合物在70℃下培育60分钟。每10分钟检查悬浮液的pH，并用5M氢氧化钠溶液将其调节至8.5。迫使产物通过筛网以获得具有均匀尺寸的直径的颗粒。将颗粒与4升50mM Na2CO3溶液在搅拌的情况下培育30分钟并通过重力使其沉淀。在吸出上清液后，将沉淀的颗粒用4升去离子水一次性洗涤10分钟，并通过重力使其沉淀。除去上清液后，将沉淀的颗粒在pH 5.5的4升乙酸钠溶液中或在pH 8.5的4升100mM碳酸氢钠溶液中、在搅拌的情况下、在室温下悬浮和培育72小时。然后，通过沉淀收集颗粒。在吸出上清液后，将沉淀的颗粒用4升去离子水一次性洗涤60分钟，并通过重力使其沉淀。用500mL去离子水将沉淀的颗粒再悬浮，和通过加入10g硼氢化钠使其还原，并且在室温下培育72小时。用去离子水将还原的颗粒洗涤以除去过多的硼氢化钠和PEI直到溶液的pH为5至6。将颗粒保存在室温下的25％乙醇中。然后，将洗涤的颗粒冷冻干燥(任选的)。
实施例4
多糖-多胺共聚物和糖蛋白-多胺共聚物可通过DAC或SOM与支化聚乙烯亚胺(PEI)(MW 25K)进行反应而合成。DAC/SOM对PEI的比率为50:1至1:5w/w。将支化聚乙烯亚胺10g(MW 25K)加入到500mL烧杯中。用37％HCl将PEI的pH调节至5.0。通过加入6X HCl将100ml含有适量DAC或SOM的DAC溶液或SOM溶液的pH调至5.0。将PEI溶液和DAC溶液或SOM溶液在冰上培育10分钟。将含有10g PEI的溶液和含有适量DAC或SOM的溶液混合并在冰上以1000RPM培育5分钟。将混合物在不搅拌的情况下保持在冰上直到产物完全形成。将混合物在70℃下培育60分钟。每10分钟检查悬浮液的pH，并用5M氢氧化钠溶液将其调节至8.5。迫使产物通过筛网以获得具有均匀直径的颗粒。将颗粒与4升50mM Na2CO3溶液在搅拌的情况下培育30分钟，并通过重力使其沉淀。在吸出上清液后，用4升去离子水将沉淀的颗粒洗涤10分钟并通过重力使其沉淀。在除去上清液后，将沉淀的颗粒在4升pH 5.5的乙酸钠溶液中或在4升pH8.5的100mM碳酸氢钠溶液中、在搅拌的情况下、在室温下悬浮和培育72小时。然后通过沉淀收集颗粒。在吸出上清液后，用4升去离子水将沉淀的颗粒一次性洗涤60分钟，并通过重力使其沉淀。用500mL去离子水将沉淀的颗粒再悬浮，并通过加入10g硼氢化钠将其还原，并在室温下培育72小时。用去离子水对还原的颗粒进行洗涤以除去过多的硼氢化钠和PEI，直到溶液的pH为5至6。将颗粒保存在室温下的25％乙醇中。然后，可将洗涤的颗粒冷冻干燥(任选的)。
实施例5
多糖-多胺共聚物和糖蛋白-多胺共聚物可通过使DAC或SOM与支化聚乙烯亚胺(PEI)(MW 750K)进行反应而合成。DAC/SOM对PEI的比率为50:1至1:10w/w(滴定法)。将支化聚乙烯亚胺10g(MW 750K，在H2O中50重量％)加入到500mL烧杯中。用37％HCl将PEI的pH调节至5.0。通过加入去离子水将PEI的总体积增加至50ml。通过加入6X HCl将50ml含有适量DAC或SOM的DAC溶液或SOM溶液的pH调节至5.0。在800RPM下的搅拌的情况下将DAC溶液或SOM溶液以5mL/分钟的流速缓慢加入到PEI溶液中。将混合物在搅拌的情况下在室温下保持1小时。每10分钟检查悬浮液的pH，并用5M氢氧化钠溶液将其调节至8.5。将混合物在70℃下培育60分钟。每10分钟检查悬浮液的pH，并用5M氢氧化钠溶液将其调节至8.5。迫使产物通过筛网以获得具有均匀直径的颗粒。将颗粒与4升50mM Na2CO3溶液在搅拌的情况下培育30分钟，并通过重力使其沉淀。在吸出上清液后，用4升去离子水将沉淀的颗粒洗涤10分钟，并通过使其重力沉淀。在除去上清液后，将沉淀的颗粒在4升pH 5.5的乙酸钠溶液中或4升pH8.5的100mM碳酸氢钠溶液中、在搅拌的情况下、在室温下悬浮和培育72小时。然后，通过沉淀收集颗粒。在吸出上清液后，将沉淀的颗粒用4升去离子水洗涤60分钟，并通过重力使其沉淀。用500mL去离子水将沉淀的颗粒再悬浮并通过加入10g硼氢化钠使其还原，并在室温下培育72小时。将还原的颗粒用去离子水洗涤以除去过多的硼氢化钠和PEI，直到溶液的pH为5至6。将颗粒保存在室温下的25％乙醇中。可将洗涤的颗粒冷冻干燥(任选的)。
实施例6
多糖-多胺共聚物和糖蛋白-多胺共聚物可通过DAC或SOM与支化聚乙烯亚胺(PEI)(MW 25K)进行反应而合成。DAC/SOM对PEI的比率为50:1至1:5w/w(滴定法)。将支化聚乙烯亚胺10g(MW 25K)加入到500mL烧杯中。用37％HCl将PEI的pH调节至5.0。通过加入去离子水将PEI的总体积增加至50ml。通过加入6X HCl将50ml含有适量DAC或SOM的DAC溶液或SOM溶液的pH调节至5.0。在800RPM的搅拌的情况下将DAC溶液或SOM溶液以5mL/分钟流速缓慢地加入到PEI溶液中。将混合物在室温下在搅动的情况下保持1小时。每10分钟检查悬浮液的pH，并用5M氢氧化钠溶液将其调节至8.5。将混合物在70℃下培育60分钟。每10分钟检查悬浮液的pH，并用5M氢氧化钠溶液将其调节至8.5。迫使产物通过筛网以获得具有均匀直径的颗粒。将颗粒与4升50mM Na2CO3溶液在搅拌的情况下培育30分钟并通过重力使其沉淀。在吸出上清液后，用4升去离子水将沉淀的颗粒洗涤10分钟并通过重力使其沉淀。在除去上清液后，将沉淀的颗粒在4升pH 5.5的乙酸钠溶液中或在4升pH 8.5的100mM碳酸氢钠溶液中、在搅拌的情况下、在室温下悬浮和培育72小时。然后，通过沉淀收集颗粒。在吸出上清液后，用4升去离子水将沉淀的颗粒洗涤60分钟，并通过重力使其沉淀。用500mL去离子水将沉淀的颗粒再悬浮并通过加入10g硼氢化钠使其还原，并在室温下培育72小时。用去离子水将还原的颗粒进行洗涤以除去过多的硼氢化钠和PEI，直到溶液的pH为5至6。将颗粒保存在室温下的25％乙醇中。可将洗涤的颗粒冷冻干燥(任选的)。
实施例7
将细胞微载体用75％乙醇培育60分钟，且然后将其用pH 7.0的1X PBS缓冲液洗涤三次和然后用培养基RPMI 1640洗涤一次。然后，将微载体用完全生长培养基RPMI 1640在37℃下在5％CO2中培育过夜，至少12小时。用0.5％胰蛋白酶EDTA在37℃下将过量表达GFP(绿色荧光蛋白)和EPO(促红细胞生成素)的人胚胎肾细胞(HEK-293)处理5分钟，然后用所述完全生长培养基进行中和。然后，将细胞簇通过移液分离且通过离心收集。
然后，将细胞与细胞载体混合，并在37℃在5％CO2中培育4小时，然后加入10倍(柱)床体积的完全生长培养基，并静置培养另外48小时。将具有附着的细胞的细胞载体转移到细胞培养旋转烧瓶中。以低搅拌速度(20-100rpm)以悬浮方式培养细胞。必要时，所述培养基通过重力使细胞沉淀和更换上清培养基而更换。
收集细胞并用相同体积的裂解缓冲液(50mM Tris，0.8％Triton，0.2％SDS，pH7.4)使其裂解，并通过分光荧光法分析总细胞裂解物的荧光强度。如图10A中所示，通过在利用阳离子共聚物微载体的培养容器例如T25(生长面积＝25cm2)细胞培养聚苯乙烯烧瓶中生长过量表达绿色荧光蛋白的细胞而产生更多的绿色荧光蛋白，表明与在常规的T25烧瓶的底表面上生长的细胞(T25)相比，在使用阳离子纤维素聚合物(CC)和阳离子粘蛋白共聚物(CM)的T25烧瓶中生长的细胞中的绿色荧光蛋白的表达显著更高。图10B显示含有30μg总蛋白质的样品的Western Blot Assay结果，表明与在常规的T75烧瓶中通过常规的2-D方法培养的细胞相比，通过所述阳离子聚合物微载体培养的HEK-293细胞产生更多的促红细胞生成素(EPO)。
如本文所述的阳离子共聚物微载体、基质和支架有利地提供多层的多孔的海绵状结构体，其允许贴壁依赖的细胞以三维方式而不是以常规载体提供的单层活性表面生长。如此，阳离子共聚物微载体、基质和支架显著地增加每单位体积培养基的细胞密度或细胞生长表面。另外，如本文所述的由微载体、基质和支架提供的3-D开放构造使由培养基的搅动导致的细胞生长的干扰最小化，并为细胞增殖提供相对稳定的微环境。本发明的阳离子共聚物微载体、基质和支架的表面包含带正电荷的位点，并促进细胞在其上的附着和生长，而与常规的微载体不同，不需要施加外部(额外)的生长或附着试剂。
包括本文所述的共价交联的阳离子共聚物的微载体、基质和支架可用在除细胞培养以外的各种应用中。例如，阳离子共聚物的颗粒可悬浮在溶液中，并且可将该溶液施加到开放性伤口的组织，以便于开放性伤口的愈合。代替将这种溶液直接施加到伤口，包括如本文所述的阳离子共聚物颗粒的溶液可施加到材料例如伤口绷带，其然后可被施加到人患者(受试者)的伤口以促进伤口愈合。类似地，包含本文所述的悬浮的阳离子微载体颗粒的溶液可施加到骨组织以促进骨骼生长、可施加到皮肤组织以促进皮肤移植(graft)。
与市售的大载体相比，本文所述的多糖-多胺共聚物载体表现出相比于其它载体独有的性质和优点。例如，多糖-多胺载体可通过简单的环境友好的聚合反应代替应用于制造材料诸如Cytopore的复杂交联反应而制备。不同于含有两个主要组分的Cytoline，多糖-多胺共聚物仅由单一的合成化合物(所述共聚物)组成。因此，制造工艺要简单得多。Cultispher G和Cultispher S由交联明胶制成，该交联明胶衍生自多种动物副产物的胶原。与本文所述的多糖-多胺共聚物载体相比，明胶的不带电表面和相对较高的制造成本是Cultispher G和Cultispher S的两个缺点。
上述描述并不旨在描绘可用作新颖的细胞生长微载体、支架和涂层的阳离子共聚物的唯一形式。类似地，虽然结合具体实施方案在本文中已经对方法进行了描述，但是在前述描述的指引下，许多替代、修饰和变型对于本领域技术人员将是显而易见的。

Claims (14)

1.一种制造多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物的方法，所述方法包括以下步骤：
提供具有醛部分的氧化多糖或氧化糖蛋白；
使氧化多糖或氧化糖蛋白与氨基聚合物反应以形成含有亚胺衍生物的聚合物；和
将所述聚合物上的亚胺衍生物转化成胺以形成多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物，具有氨基官能团的所述多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物当质子化时将提供具有拥有阳离子位点的三维结构的阳离子共聚物材料，
其中氧化多糖或氧化糖蛋白选自选择性氧化的纤维素、选择性氧化的淀粉、选择性氧化的壳聚糖、选择性氧化的葡聚糖、选择性氧化的糖原、多糖侧链的粘蛋白及其混合物，所述多糖已经以对于提供能与所述氨基聚合物反应的2,3-二醛部分有效的量被氧化；
其中所述氨基聚合物选自聚乙烯亚胺、聚(烯丙胺)和聚丙烯亚胺四胺、蛋白质、多肽及其混合物；
其中所述氨基聚合物具有基于氨基聚合物的重量的至少0.5重量％且不大于30重量％的氮含量和从15,000到900,000范围内的分子量。
2.权利要求1所述的方法，其中所述多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物是二嵌段共聚物。
3.权利要求1所述的方法，其中所述醛部分是通过选择性氧化葡萄糖单元的C2和C3上的羟基而产生的，并且所述氧化不产生比醛基更进一步的羧基或不导致多糖链的断裂。
4.权利要求1所述的方法，还包括干燥所述多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物以形成多糖-多胺共聚物颗粒或糖蛋白-多胺共聚物颗粒的步骤。
5.权利要求1所述的方法，其中氧化多糖选自选择性氧化的纤维素、选择性氧化的直链淀粉、选择性氧化的壳聚糖、选择性氧化的葡聚糖、选择性氧化的糖原。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述阳离子共聚物材料具有大于50μm平均孔尺寸的粒子。
7.多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物，其具有氨基官能团，所述多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物当质子化时将提供具有拥有阳离子位点的三维结构体的阳离子共聚物材料，所述多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物包括：
具有2,3-二醛部分的选择性氧化的多糖或选择性氧化的糖蛋白；和提供氨基官能团的氨基聚合物，
所述选择性氧化的多糖或选择性氧化的糖蛋白和所述氨基聚合物和进行交联以提供具有氨基官能团的粒状多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物，所述多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物具有配置成在内表面上支持细胞的孔径，
其中所述选择性氧化的多糖或选择性氧化的糖蛋白选自选择性氧化的纤维素、选择性氧化的淀粉、选择性氧化的壳聚糖、选择性氧化的葡聚糖、选择性氧化的糖原、多糖侧链的粘蛋白及其混合物，所述多糖已经以对于提供能与所述氨基聚合物反应的2,3-二醛部分有效的量被氧化；
其中所述氨基聚合物选自聚乙烯亚胺、聚(烯丙胺)和聚丙烯亚胺四胺、蛋白质、多肽及其混合物；
其中所述氨基聚合物具有基于氨基聚合物的重量的至少0.5重量％且不大于30重量％的氮含量和从15,000到900,000范围内的分子量。
8.权利要求7所述的多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物，其中所述阳离子共聚物材料具有拥有大于50μm平均孔径的粒子。
9.权利要求7所述的多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物，其中所述选择性氧化的多糖选自选择性氧化的纤维素、选择性氧化的直链淀粉、选择性氧化的壳聚糖、选择性氧化的葡聚糖、选择性氧化的糖原。
10.权利要求7所述的多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物，其中所述选择性氧化的多糖具有β-1,4-糖苷键或β-1,6-糖苷键。
11.权利要求7所述的多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物，其中所述选择性氧化的多糖具有β-1,4-糖苷键。
12.权利要求7所述的多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物，其中所述选择性氧化的多糖选自选择性氧化的纤维素、选择性氧化的壳聚糖、选择性氧化的淀粉和其混合物。
13.权利要求7至12中任一项所述的多糖-多胺共聚物或糖蛋白-多胺共聚物，其中所述氨基聚合物为线型、分支或枝状的形式。
14.权利要求13所述的多糖-多胺共聚物或氨基糖蛋白共聚物，其中多糖-多胺共聚物或氨基糖蛋白共聚物和阳离子共聚物材料的粒子具有在100μm至10mm范围内的尺寸。
CN201680017235.9A 2015-03-20 2016-03-18 用于培养哺乳动物细胞的微载体、基质和支架及其制造方法 Active CN107530370B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562136241P 2015-03-20 2015-03-20
US62/136,241 2015-03-20
PCT/US2016/023248 WO2016154048A1 (en) 2015-03-20 2016-03-18 Microcarriers, matrices and scaffolds for culturing mammalian cells and methods of manufacture

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107530370A CN107530370A (zh) 2018-01-02
CN107530370B true CN107530370B (zh) 2021-01-26

Family

ID=56978563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680017235.9A Active CN107530370B (zh) 2015-03-20 2016-03-18 用于培养哺乳动物细胞的微载体、基质和支架及其制造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10723809B2 (zh)
EP (1) EP3270934B1 (zh)
CN (1) CN107530370B (zh)
CA (1) CA2980472C (zh)
HK (1) HK1247849A1 (zh)
WO (1) WO2016154048A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2544748B (en) * 2015-11-24 2020-07-22 The Electrospinning Company Ltd Microscaffold
CN108219009B (zh) * 2018-01-05 2020-10-09 中海石油(中国)有限公司 一种改性纳米纤维素及其制备方法与应用
CN111040983A (zh) * 2019-12-25 2020-04-21 杭州原生生物科技有限公司 一种3d微载体细胞吸附培养的方法
CN113264868B (zh) * 2021-05-31 2022-12-02 山东华素制药有限公司 一种1-苄基-3-哌啶醇的改进合成方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4663163A (en) * 1983-02-14 1987-05-05 Hou Kenneth C Modified polysaccharide supports
US5766908A (en) * 1995-03-08 1998-06-16 Akzo Nobel Nv High-flux semipermeable membrane containing immobilized affinity ligands

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4788280A (en) * 1987-03-19 1988-11-29 National Starch And Chemical Corporation Polysaccharide derivatives containing aldehyde groups on an aromatic ring, their preparation from the corresponding acetals and use in paper
US5496545A (en) 1993-08-11 1996-03-05 Geltex Pharmaceuticals, Inc. Phosphate-binding polymers for oral administration
IL131074A0 (en) 1999-07-23 2001-03-19 Polygene Ltd A biodegradable polycation composition for delivery of an anionic macromolecule
DE19953589B4 (de) 1999-11-08 2005-05-25 Sca Hygiene Products Gmbh Polysaccharid mit funktionellen Gruppen, Verfahren zu dessen Herstellung und daraus hergestellte Produkte
DE10152407A1 (de) 2001-10-24 2003-05-08 Aesculap Ag & Co Kg Zusammensetzung aus mindestens zwei biokompatiblen chemisch vernetzbaren Komponenten
US9238697B2 (en) 2005-02-25 2016-01-19 The Regents Of The University Of California Polymeric materials and methods
US8425887B2 (en) 2006-09-29 2013-04-23 Genzyme Corporation Amide dendrimer compositions
EP2120972A1 (en) 2006-12-14 2009-11-25 Genzyme Corporation Amido-amine polymer compositions
EP2214731B1 (en) 2007-11-14 2014-05-14 Actamax Surgical Materials LLC Oxidized cationic polysaccharide-based polymer tissue adhesive for medical use
US20150239824A1 (en) 2012-08-24 2015-08-27 Universite De Strasbourg Branched or macrocyclic polyamines and uses thereof
US10925893B2 (en) * 2015-03-20 2021-02-23 Dazhi Yang Polysaccharide-polyamine copolymer and use thereof in reducing low density lipolipoprotein (LDL) concentration in plasma

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4663163A (en) * 1983-02-14 1987-05-05 Hou Kenneth C Modified polysaccharide supports
US5766908A (en) * 1995-03-08 1998-06-16 Akzo Nobel Nv High-flux semipermeable membrane containing immobilized affinity ligands

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Polyallylamine-grafted cellulose gel as high-capacity anion-exchanger;Ung-Jin Kim等;《Journal of Chromatography A》;20021231;第284页第2.1-2.4节，第284页第2.1-2.4节 *
Ung-Jin Kim等.Polyallylamine-grafted cellulose gel as high-capacity anion-exchanger.《Journal of Chromatography A》.2002, *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3270934B1 (en) 2022-12-21
US20180094080A1 (en) 2018-04-05
HK1247849A1 (zh) 2018-10-05
CA2980472C (en) 2023-08-29
WO2016154048A1 (en) 2016-09-29
CN107530370A (zh) 2018-01-02
EP3270934A1 (en) 2018-01-24
CA2980472A1 (en) 2016-09-29
EP3270934A4 (en) 2018-12-12
US10723809B2 (en) 2020-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Curvello et al. Engineering nanocellulose hydrogels for biomedical applications
Afshari et al. Materials functionalization with multicomponent reactions: state of the art
Cheng et al. Studies on nerve cell affinity of biodegradable modified chitosan films
CN107530370B (zh) 用于培养哺乳动物细胞的微载体、基质和支架及其制造方法
Bagheri et al. Ionic liquid-based preparation of cellulose− dendrimer films as solid supports for enzyme immobilization
Mingyu et al. Surface modification and characterization of chitosan film blended with poly-L-lysine
Zhang et al. Thermo-responsive microcarriers based on poly (N-isopropylacrylamide)
KR101196365B1 (ko) Ｉｐｎ 하이드로젤 및 그 제조방법
Martins et al. Dual responsive nanostructured surfaces for biomedical applications
KR20010075288A (ko) 3차원 세포 배양 물질 및 이것을 사용한 세포 배양 방법
US11311481B2 (en) Injectable and shearing-thinning microbeads gel, use thereof, and method for preparing the same
Gattás-Asfura et al. Covalent layer-by-layer assembly of hyperbranched polymers on alginate microcapsules to impart stability and permselectivity
Li et al. Alginate/PEG based microcarriers with cleavable crosslinkage for expansion and non-invasive harvest of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells
CN114957730A (zh) 一种高反应活性水凝胶微球及其制备方法和应用
JP7125398B2 (ja) 生体表面のコンフォーマルコーティング
Fardjahromi et al. Mussel inspired ZIF8 microcarriers: a new approach for large-scale production of stem cells
CN111471193A (zh) 一种双醛多糖纳米颗粒交联胶原水凝胶及其制备方法
Andrade et al. Bacterial cellulose: properties, production and applications
KR20190082133A (ko) 단백질 약물 전달용 광가교 마이크로젤 및 그의 제조 방법
CN109810265B (zh) 一种溶剂驱动体积变化的dna-多糖杂化水凝胶及制备方法
Yokota et al. Biofunctionality of self-assembled nanolayers composed of cellulosic polymers
CN1119172C (zh) 脂肪族聚酯表面的壳聚糖／明胶网络修饰方法
Darge et al. Thermo/redox-responsive dissolvable gelatin-based microsphere for efficient cell harvesting during 3D cell culturing
Ehrenfreund-Kleinman et al. Polysaccharide scaffolds prepared by crosslinking of polysaccharides with chitosan or proteins for cell growth
Zhou et al. Microspheres for cell culture

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1247849

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230308

Address after: 22/F, Block B, High-tech Innovation Center, Guangqiao Road, Tianliao Community, Yutang Street, Guangming District, Shenzhen City, Guangdong Province

Patentee after: Shenzhen Dingsheng Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: Maryland, USA

Patentee before: Yang Dazhi

TR01 Transfer of patent right
CI03 Correction of invention patent

Correction item: Patentee

Correct: Yang Dazhi

False: Shenzhen Dingsheng Biotechnology Co.,Ltd.

Number: 12-01

Volume: 39

CI03 Correction of invention patent
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230423

Address after: 22/F, Block B, High-tech Innovation Center, Guangqiao Road, Tianliao Community, Yutang Street, Guangming District, Shenzhen City, Guangdong Province

Patentee after: Shenzhen Dingsheng Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: Maryland, USA

Patentee before: Yang Dazhi