CN104911143B

CN104911143B - 一种无蛋白、无水解物的无血清培养基及其制备方法

Info

Publication number: CN104911143B
Application number: CN201510364132.7A
Authority: CN
Inventors: 扶星星; 吴福文; 王永胜
Original assignee: Sichuan Bainuoji Technology Co Ltd
Current assignee: Sichuan Bainuoji Technology Co Ltd
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2019-01-22
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: CN104911143A

Abstract

本发明涉及一种无蛋白、无水解物的无血清培养基及其制备方法，该培养基包含有：葡萄糖酸锰、柠檬酸苹果酸钙、依地酸二钠、孕酮、丙谷二肽、β甘油磷酸钠、果糖、维生素C、维生素E、亚硒酸钠、羟丙基‑β‑环糊精、胆固醇、苹果酸、草酰乙酸、维生素B12、硫辛酸、硫酸亚铁、柠檬酸铁、尿酸、牛磺酸、还原型谷胱甘肽、硫酸锌、硫酸铜和硝酸铁等物质，本发明提供的培养基具有成本低、产品批间差异小，简化了下游产品的纯化步骤，降低安全隐患等优点。

Description

一种无蛋白、无水解物的无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种无蛋白、无水解物的无血清培养基及其制备方法，特别涉及一种适用于PK15细胞贴壁培养的无蛋白、无水解物的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

无血清细胞培养是体外细胞代谢研究的基础，也是生物制品领域、干细胞治疗领域常见的技术手段之一。现有的用于动物细胞无血清培养的培养基绝大部分需要加入胰岛素、转铁蛋白、白蛋白等蛋白类组分，这些组分虽然具有极佳的细胞生长促进效果，但是与无蛋白细胞培养基相比：其成本高昂；下游产品的纯化更加复杂化；并且，其中可能携带的外源病毒会带来严重的安全隐患。

PK15细胞来源于猪肾，中文名为猪肾上皮细胞，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生长。该细胞对多种病毒敏感，如猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)等，可应用于猪圆环病毒疫苗、猪细小病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗等疫苗的制备。目前，培养PK15细胞生产疫苗的主要是转瓶工艺，培养基为基础培养基DMEM、199或MEM+10％牛血清。牛血清作为疫苗生产原料有其明显的缺点：价格昂贵、成分难以明确、产品批间差异不易控制，并且要求极其严格的检测程序以确保血清中不含有血清来源动物可能携带的细菌、病毒等。同时，PK15细胞也是体外细胞代谢研究的模型之一，培养基中的蛋白水解物、血清等不明确组分会对研究结果产生干扰。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种无蛋白、无水解物的无血清培养基及其制备方法，并针对PK15细胞，优化该培养基。

为解决上述技术问题，首先，本发明公开了一种无蛋白、无水解物的无血清培养基，组分如下：

其中，果糖可以提供碳源，其吸收利用率比较低，有利于维持培养液PH的稳定性；孕酮为激素类营养，可以刺激细胞分裂，促进细胞增殖；亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸为细胞提供脂肪酸营养。

进一步，无蛋白、无水解物的无血清培养基的制备方法为，将5～30mg吐温80溶解于50毫升注射用水中，依次加入0.0003～0.05mg亚油酸、0.0005～0.07mg亚麻酸、0.0001～0.02mg花生四烯酸，待其溶解充分，用注射用水补液至500毫升，再依次加入5～7g氯化钠、1～6g葡萄糖、0.5～5g果糖，搅拌至澄清，用注射用水补液至900毫升，然后依次加入：

搅拌至完全溶解，用注射用水补液至1000毫升，4℃避光保存。

优选的，从成本和达到相似的效果方面考虑，本发明的一种优选方案为：

进一步，为了制得更适于PK15细胞贴壁培养的培养基，还需在上述配方中，添加下列组分：50～500mg/L的羟丙基-β-环糊精、0.2～110mg/L的β甘油磷酸钠、0.5～5mg/L的硫酸亚铁、0.5～34mg/L的依地酸二钠、10～120mg/L的柠檬酸苹果酸钙、5～140mg/L的柠檬酸铁，80～700mg/L的丙谷二肽、0.5～8mg/L的尿酸、0.5～10mg/L的还原型谷胱甘肽、0.0001～0.06mg/L的葡萄糖酸锰、6～210mg/L的草酰乙酸、4～140mg/L的苹果酸和0.5～250mg/L的牛磺酸。

优选的，从成本和达到相似的效果方面考虑，适于PK15细胞贴壁培养的培养基的一种优选方案为：

葡萄糖酸锰有益于锰元素的吸收，同时提供了碳源；柠檬酸铁作为铁螯合物，一方面提供铁离子，另一方面提供的柠檬酸和草酰乙酸、苹果酸作为三羧酸循环的中间产物既提供了碳骨架，又可以促进丙酮酸钠向三羧酸循环流动，提高了葡萄糖的营养贡献率，同时减少了乳酸的产生；柠檬酸苹果酸钙(例如：南通市飞宇精细化学品有限公司10201～10202)是一种有机酸复合物，具有高溶解性、高生物学吸收利用性、减少铁吸收阻碍、且安全无毒，柠檬酸铁和柠檬酸苹果酸钙的配合使用有利于细胞对钙、铁离子的吸收，利于无血清条件下细胞贴壁生长；尿酸、牛磺酸、还原型谷胱甘肽、维生素C和维生素E的抗氧化剂组合可以减少细胞的氧化损伤，保持细胞活性；羟丙基-β-环糊精可以提高营养分子的水溶性，增加营养分子稳定性、提高营养分子生物利用率，可以部分替代血清中白蛋白的作用；β甘油磷酸钠可以增强培养基的缓冲能力，也是磷营养补充剂，另一方面作为铁螯合剂，配合硫酸亚铁、柠檬酸铁和依地酸二钠一起使用，替代血清中转铁蛋白的作用。

本发明所述无蛋白、无水解物的无血清培养基配方组分均为商品化的生化制品。

本发明的有益效果如下：无蛋白添加，无水解物添加，降低了该培养基的生产成本；本发明中的成分简单、明确，产品批间差异小，同时也简化了下游产品的纯化步骤；避免与蛋白中可能存在的外源病毒的接触，从而降低了安全隐患。

附图说明

图1为本发明所提供的无蛋白、无水解物的无血清培养基(PK15SFM)与10％血清浓度的MEM培养基培养PK15细胞的生长曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。

无蛋白、无水解物的无血清培养基的制备方法如下：

在容量为1000毫升的洁净容器中加入吐温80，加入50毫升注射用水进行溶解，依次加入亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸，待其溶解充分，用注射用水补液至500毫升，再依次加入氯化钠、葡萄糖、果糖，搅拌至澄清，用注射用水补液至900毫升，然后依次加入：氯化钙、硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、L盐酸精氨酸、L天冬氨酸、L天冬酰胺、L胱氨酸二盐酸盐、L谷氨酸、L盐酸组氨酸、L亮氨酸、L异亮氨酸、甘氨酸、L盐酸赖氨酸、L甲硫氨酸、L苯丙氨酸、L脯氨酸、L丝氨酸、L苏氨酸、L色氨酸、L酪氨酸二钠盐、L缬氨酸、生物素、维生素C、叶酸、肌醇、烟酰胺、对氨基苯甲酸、D泛酸钙、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、酚红、乙醇胺、丙酮酸钠、L谷氨酰胺、硫酸锌、硫酸铜、硝酸铁、偏钒酸铵、碘化钾、硫辛酸、维生素E、亚硒酸钠、胆固醇、孕酮、氯化胆碱、碳酸氢钠，待搅拌至完全溶解，用注射用水补液至1000毫升，4℃避光保存。

各个物质用量如下：

应用于PK15细胞贴壁培养的无蛋白、无水解物的无血清培养基的制备方法如下：

在容量为1000毫升的洁净容器中加入吐温80，加入50毫升注射用水进行溶解，依次加入亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸，待其溶解充分，用注射用水补液至500毫升，再依次加入氯化钠、葡萄糖、果糖和羟丙基-β-环糊精，搅拌至澄清，用注射用水补液至900毫升，然后依次加入：氯化钙、硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、丙谷二肽、L盐酸精氨酸、L天冬氨酸、L天冬酰胺、L胱氨酸二盐酸盐、L谷氨酸、L盐酸组氨酸、L亮氨酸、L异亮氨酸、甘氨酸、L盐酸赖氨酸、L甲硫氨酸、L苯丙氨酸、L脯氨酸、L丝氨酸、L苏氨酸、L色氨酸、L酪氨酸二钠盐、L缬氨酸、生物素、维生素C、叶酸、肌醇、烟酰胺、对氨基苯甲酸、D泛酸钙、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、酚红、乙醇胺、还原型谷胱甘肽、尿酸、丙酮酸钠、L谷氨酰胺、硫酸锌、硫酸铜、硝酸铁、柠檬酸铁、柠檬酸苹果酸钙、葡萄糖酸锰、偏钒酸铵、碘化钾、硫辛酸、维生素E、亚硒酸钠、依地酸二钠、胆固醇、苹果酸、牛磺酸、草酰乙酸、孕酮、β甘油磷酸钠、氯化胆碱、碳酸氢钠，搅拌至完全溶解，用注射用水补液至1000毫升，4℃避光保存备用。

各个物质用量如下：

将PK15细胞同时接种于实施例6中制得的培养基和含有10％血清浓度的MEM培养基中，连续培养5天，每天观察记录细胞的生长状态，并计算细胞的密度，图1显示两种培养基中细胞密度随天数的变化，由图1可以看出，两种培养基达到相近的细胞生长速率和密度，因此，可以得出：在PK15细胞的培养中，无蛋白、无水解物的无血清培养基的效果与含有10％血清浓度的MEM培养基的效果相似。本发明提供的用于PK15细胞贴壁培养的无蛋白、无水解物的无血清培养基具有成本低、产品批间差异小，简化了下游产品的纯化步骤，降低安全隐患等优点。

本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种无蛋白、无水解物的无血清培养基，其特征在于，所述无蛋白、无水解物的无血清培养基应用于PK15细胞贴壁培养，由如下组分制备而成：

50～500mg/L的羟丙基-β-环糊精、0.2～110mg/L的β甘油磷酸钠、0.5～5mg/L的硫酸亚铁、0.5～34mg/L的依地酸二钠、10～120mg/L的柠檬酸苹果酸钙、5～140mg/L的柠檬酸铁，80～700mg/L的丙谷二肽、0.5～8mg/L的尿酸、0.5～10mg/L的还原型谷胱甘肽、0.0001～0.06mg/L的葡萄糖酸锰、6～210mg/L的草酰乙酸、4～140mg/L的苹果酸和0.5～250mg/L的牛磺酸。

2.如权利要求1所述的无蛋白、无水解物的无血清培养基，其特征在于，下列组分的含量如下：

180mg/L的羟丙基-β-环糊精、40mg/L的β甘油磷酸钠、2mg/L的硫酸亚铁、7mg/L的依地酸二钠、50mg/L的柠檬酸苹果酸钙、16mg/L柠檬酸铁，500mg/L丙谷二肽、2mg/L尿酸、2mg/L还原型谷胱甘肽、0.004mg/L葡萄糖酸锰、42mg/L草酰乙酸、50mg/L苹果酸和60mg/L牛磺酸。