CN112210542A - 一种用于培养df-1细胞的无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

一种用于培养df-1细胞的无血清培养基及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112210542A
CN112210542A CN202011101169.8A CN202011101169A CN112210542A CN 112210542 A CN112210542 A CN 112210542A CN 202011101169 A CN202011101169 A CN 202011101169A CN 112210542 A CN112210542 A CN 112210542A
Authority
CN
China
Prior art keywords
serum
cells
culture
acid
culturing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011101169.8A
Other languages
English (en)
Inventor
王洪林
刘志亮
孙友君
范娜娜
宋桂才
张恒
卢博
王稼林
马广斌
鹿洪伟
王月华
邹海涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Zhuzi Biotechnology Co ltd
Shandong Sinder Animal Vaccine Co ltd
Original Assignee
Shandong Zhuzi Biotechnology Co ltd
Shandong Sinder Animal Vaccine Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Zhuzi Biotechnology Co ltd, Shandong Sinder Animal Vaccine Co ltd filed Critical Shandong Zhuzi Biotechnology Co ltd
Priority to CN202011101169.8A priority Critical patent/CN112210542A/zh
Publication of CN112210542A publication Critical patent/CN112210542A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/16—Magnesium; Mg chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides or bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种用于培养DF‑1细胞的无血清培养基及其制备方法，所述用于培养DF‑1细胞的无血清培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物、酸碱指示剂和其他添加组分，通过对各种成分具体浓度的限定实现了该培养基能够适用于DF‑1细胞的全悬浮无血清培养。该培养基成分明确，培养的细胞密度高，不含动物血清，有利于下游产品的纯化，提高产品品质，且配制和使用方便，适用于DF‑1细胞全悬浮无血清培养和鸡法氏囊疫苗的规模化生产。

Description

一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于细胞无血清培养基技术领域，具体地说涉及一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基及其制备方法。
背景技术
DF-1细胞为鸭成纤维细胞系，其作为永生化的传代细胞系广泛用于培养繁殖鸡法氏囊病毒。鸡法氏囊病毒感染是主要引起肉仔鸡的一种病毒性传染病。2015年以来该病在国内广泛流行，对3—5周龄肉鸡的致死率高达40％～100％，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。
目前最有效的预防措施为疫苗，制备高效疫苗的关键是获得高滴度的病毒，传统的疫苗制造是用含血清的培养基贴壁培养DF-1细胞后进行接毒培养，此培养方法所得细胞浓度低，病毒滴度较低，需要高倍浓缩才能满足制备疫苗的要求，而且培养工艺繁琐，不能满足疫苗规模化生产需要。
随着生物制品质量安全性标准的提高和动物细胞生物反应器高密度培养技术的推广应用，研究和生产全悬浮DF-1细胞培养的鸡法氏囊病毒疫苗具有广泛的应用前景。生物反应器高密度培养工艺中细胞全悬浮培养比贴壁细胞培养更具优势，主要表现在：第一，全悬浮培养可用无血清培养基，降低了生产成本，提高了下游产品的生物安全性；第二，全悬浮培养规模可线性放大，国际上细胞生物反应器全悬浮培养的规模可达20000L/罐，国内已生产和运用的细胞生物反应器全悬浮培养的规模可达3000L/罐。目前还没有商品化的DF-1细胞无血清培养基，并且有关DF-1细胞无血清培养基的研究也尚未见报道。
针对上述问题，特提出本发明。
发明内容
针对现有技术的种种不足，为了解决上述问题，现提出一种低成本、成分明确的适用于DF-1细胞全悬浮培养的无血清培养基及其制备方法。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基，包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物、酸碱指示剂和其他添加组分，其中，
所述氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
所述维生素为生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、硫胺素和硫辛酸；
所述盐类为氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和丙酮酸钠；
所述脂类为胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温和嵌段式聚醚F68；
所述微量元素为硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁和亚硒酸钠；
所述缓冲剂为碳酸氢钠和羟乙基哌嗪乙磺酸；
所述蛋白水解物为大豆水解物和小麦水解物；
所述酸碱指示剂为酚红；
所述的其他添加组分为葡萄糖、次黄嘌呤和胸苷。
优选的，所述氨基酸中各成分的终浓度分别为丙氨酸4～8毫克/升、精氨酸100～200毫克/升、天冬酰胺6～20毫克/升、天冬氨酸9～16毫克/升、胱氨酸15～25毫克/升、半胱氨酸20～35毫克/升、谷氨酸7～15毫克/升、谷氨酰胺200～800毫克/升、甘氨酸10～25毫克/升、组氨酸20～50毫克/升、异亮氨酸30～60毫克/升、亮氨酸50～70毫克/升、赖氨酸100～150毫克/升、甲硫氨酸15～30毫克/升、苯丙氨酸30～50毫克/升、脯氨酸15～30毫克/升、丝氨酸20～40毫克/升、苏氨酸30～60毫克/升、色氨酸15～30毫克/升、酪氨酸40～70毫克/升、缬氨酸40～70毫克/升；
所述维生素中各成分的终浓度分别为生物素0.003～0.01毫克/升、叶酸2～5毫克/升、烟酰胺5～10毫克/升、吡哆醇2～5毫克/升、硫胺素2～5毫克/升、硫辛酸0.2～0.5毫克/升；
所述盐类中各成分的终浓度分别为氯化镁30～100毫克/升、硫酸镁30～100毫克/升、氯化钙150～200毫克/升、氯化钾300～500毫克/升、氯化钠1000～6000毫克/升、磷酸氢二钠50～100毫克/升、磷酸二氢钠50～100毫克/升、丙酮酸钠60～150毫克/升；
所述脂类中各成分的终浓度分别为胆固醇2～5毫克/升、生育酚醋酸酯0.005～0.01毫克/升、豆蔻酸0.005～0.01毫克/升、棕榈酸0.005～0.01毫克/升、棕榈油酸0.005～0.01毫克/升、硬脂酸0.005～0.01毫克/升、吐温801～3.0毫克/升、嵌段式聚醚F6810～2000毫克/升；
所述微量元素中各成分的终浓度分别为硫酸铜10～20毫克/升、硝酸铁50～100毫克/升、硫酸亚铁0.1～0.6毫克/升、亚硒酸钠80～150毫克/升；
所述缓冲剂中各成分的终浓度分别为碳酸氢钠1000～3700毫克/升、羟乙基哌嗪乙磺酸1000～5000毫克/升；
所述酚红的终浓度为5～10毫克/升；
所述蛋白水解物中各成分的终浓度分别为大豆水解物2000～4000毫克/升、小麦水解物2000～4000毫克/升；
所述其他添加组分中各成分的终浓度分别为葡萄糖2000～6000毫克/升、次黄嘌呤5～10毫克/升、胸苷0.1～0.8毫克/升。
优选的，所述氨基酸中各成分的终浓度分别为丙氨酸5.2毫克/升、精氨酸168.1毫克/升、天冬酰胺7.92毫克/升、天冬氨酸9.34毫克/升、胱氨酸20.0毫克/升、半胱氨酸31.1毫克/升、谷氨酸12.5毫克/升、谷氨酰胺699.5毫克/升、甘氨酸19毫克/升、组氨酸36.9毫克/升、异亮氨酸53.7毫克/升、亮氨酸61.5毫克/升、赖氨酸134.4毫克/升、甲硫氨酸23.6毫克/升、苯丙氨酸40.2毫克/升、脯氨酸28.8毫克/升、丝氨酸28.0毫克/升、苏氨酸43.3毫克/升、色氨酸25.5毫克/升、酪氨酸51.7毫克/升、缬氨酸60.1毫克/升；
所述维生素中各成分的终浓度分别为生物素0.0039毫克/升、叶酸2.95毫克/升、烟酰胺7.98毫克/升、吡哆醇3.33毫克/升、硫胺素4.08毫克/升、硫辛酸0.37毫克/升；
所述盐类中各成分的终浓度分别为氯化镁70.4毫克/升、硫酸镁57.9毫克/升、氯化钙158.9毫克/升、氯化钾423.0毫克/升、氯化钠4908.7毫克/升、磷酸氢二钠69.21毫克/升、磷酸二氢钠90.75毫克/升、丙酮酸钠129.90毫克/升；
所述脂类中各成分的终浓度分别为胆固醇2.91毫克/升、生育酚醋酸酯0.0072毫克/升、豆蔻酸0.0058毫克/升、棕榈酸0.0065毫克/升、棕榈油酸0.0092毫克/升、硬脂酸0.0085毫克/升、吐温80 2.4毫克/升、嵌段式聚醚F68 1599.8毫克/升；
所述微量元素中各成分的终浓度分别为硫酸铜15.5毫克/升、硝酸铁84.2毫克/升、硫酸亚铁0.29毫克/升、亚硒酸钠131.2毫克/升。
优选的，所述缓冲剂中各成分的终浓度分别为碳酸氢钠2680.0毫克/升、羟乙基哌嗪乙磺酸3毫克/升；
所述酚红的终浓度为6.5毫克/升；
所述蛋白水解物中各成分的终浓度分别为大豆水解物3600毫克/升、小麦水解物2400毫克/升；
所述其他添加组分中各成分的终浓度分别为葡萄糖3000毫克/升、次黄嘌呤6毫克/升、胸苷0.65毫克/升。
优选的，所述无血清培养基应用于DF-1细胞的培养和鸡法氏囊疫苗的规模化生产。
优选的，所述无血清培养基应用于DF-1细胞的全悬浮驯化，所述DF-1细胞的全悬浮驯化方法为：
(1)对贴壁培养型DF-1细胞用含有血清的培养基进行培养至形成致密单层，选用生长正常且边缘清晰的细胞用于驯化；
(2)将步骤(1)中培养的DF-1细胞用胰酶消化后用无血清培养基悬浮培养若干次后，将悬浮细胞离心弃上清，将离心后获得的DF-1细胞用含有血清的培养基中重悬至贴壁状态并培养若干次；
(3)将步骤(2)最终获得的DF-1细胞重复采用步骤(2)的方法培养多次；
(4)将步骤(3)最终获得的DF-1细胞用胰酶消化后用无血清培养基悬浮培养，用无血清培养基悬浮培养若干次后获得的DF-1细胞即为驯化得到的全悬浮培养型DF-1细胞系。
优选的，步骤(1)中选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性的贴壁培养型DF-1细胞进行培养，具体的培养方法为：将贴壁培养型DF-1细胞培养至形成致密单层后用含10％胎牛血清的DMEM培养液按1：5比例分瓶传代，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养，在48-72h内细胞形成致密单层，选用生长正常且边缘清晰的细胞用于驯化。
优选的，步骤(2)和步骤(4)中的无血清培养基中添加有用于降低细胞团结率的肝素钠，步骤(2)中DF-1细胞用胰酶消化后用无血清培养基悬浮培养时，用无血清培养基调整细胞密度，培养48h-72h取样计细胞密度与细胞活率，根据细胞密度与细胞活率决定是否需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，若不需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，则用新鲜无血清培养基稀释调整细胞密度继续培养，重复上述培养方式若干次即无血清培养基悬浮培养若干次后，将悬浮细胞离心弃上清，将离心后获得的DF-1细胞用含胎牛血清的培养基重悬至贴壁状态并培养传代若干次。
优选的，步骤(4)中DF-1细胞用胰酶消化后用无血清培养基悬浮培养时，用无血清培养基调整细胞密度，培养48h-72h取样计细胞密度与细胞活率，根据细胞密度与细胞活率决定是否需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，若不需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，则用新鲜无血清培养基稀释调整细胞密度继续培养，重复上述培养方式若干次即用无血清培养基悬浮培养若干次后，将获得的DF-1细胞用无血清培养基重新调整细胞密度，培养48h-72h取样计细胞密度与细胞活率，根据细胞密度与细胞活率决定是否需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，若不需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，则用新鲜无血清培养基稀释调整细胞密度继续培养，若连续培养多代，每代细胞在48h-72h检测细胞密度时，均达到设定数值以上，则无血清培养基中不再添加肝素钠，此时驯化得到的细胞即为全悬浮培养型DF-1细胞系。
上述用于培养DF-1细胞的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：无血清培养基中的各组分根据自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于30℃混合，调节所得混合液的pH值至6.95，定容后即得用于培养DF-1细胞的无血清培养基。
有益效果：
本发明提供了一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基，该培养基成分明确，培养的细胞密度高，不含动物血清，有利于下游产品的纯化，提高产品品质，且配制和使用方便，适用于DF-1细胞全悬浮无血清培养和鸡法氏囊疫苗的规模化生产。
附图说明
图1为用于培养DF-1细胞的无血清培养基的培养验证实验结果图。
具体实施方式
实施例1
本具体实施例提供了一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基，由氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物、酸碱指示剂和其他添加组分组成，其中，
氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
维生素为生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、硫胺素和硫辛酸；
盐类为氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和丙酮酸钠；
脂类为胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温和嵌段式聚醚F68；
微量元素为硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁和亚硒酸钠；
缓冲剂为碳酸氢钠和羟乙基哌嗪乙磺酸；
蛋白水解物为大豆水解物和小麦水解物；
酸碱指示剂为酚红；
其他添加组分为葡萄糖、次黄嘌呤和胸苷。
上述各组分的含量如下：
氨基酸中各成分的终浓度分别为丙氨酸4～8毫克/升、精氨酸100～200毫克/升、天冬酰胺6～20毫克/升、天冬氨酸9～16毫克/升、胱氨酸15～25毫克/升、半胱氨酸20～35毫克/升、谷氨酸7～15毫克/升、谷氨酰胺200～800毫克/升、甘氨酸10～25毫克/升、组氨酸20～50毫克/升、异亮氨酸30～60毫克/升、亮氨酸50～70毫克/升、赖氨酸100～150毫克/升、甲硫氨酸15～30毫克/升、苯丙氨酸30～50毫克/升、脯氨酸15～30毫克/升、丝氨酸20～40毫克/升、苏氨酸30～60毫克/升、色氨酸15～30毫克/升、酪氨酸40～70毫克/升、缬氨酸40～70毫克/升；
维生素中各成分的终浓度分别为生物素0.003～0.01毫克/升、叶酸2～5毫克/升、烟酰胺5～10毫克/升、吡哆醇2～5毫克/升、硫胺素2～5毫克/升、硫辛酸0.2～0.5毫克/升；
盐类中各成分的终浓度分别为氯化镁30～100毫克/升、硫酸镁30～100毫克/升、氯化钙150～200毫克/升、氯化钾300～500毫克/升、氯化钠1000～6000毫克/升、磷酸氢二钠50～100毫克/升、磷酸二氢钠50～100毫克/升、丙酮酸钠60～150毫克/升；
脂类中各成分的终浓度分别为胆固醇2～5毫克/升、生育酚醋酸酯0.005～0.01毫克/升、豆蔻酸0.005～0.01毫克/升、棕榈酸0.005～0.01毫克/升、棕榈油酸0.005～0.01毫克/升、硬脂酸0.005～0.01毫克/升、吐温801～3.0毫克/升、嵌段式聚醚F6810～2000毫克/升；
微量元素中各成分的终浓度分别为硫酸铜10～20毫克/升、硝酸铁50～100毫克/升、硫酸亚铁0.1～0.6毫克/升、亚硒酸钠80～150毫克/升；
缓冲剂中各成分的终浓度分别为碳酸氢钠1000～3700毫克/升、羟乙基哌嗪乙磺酸1000～5000毫克/升；
酚红的终浓度为5～10毫克/升；
蛋白水解物中各成分的终浓度分别为大豆水解物2000～4000毫克/升、小麦水解物2000～4000毫克/升；
其他添加组分中各成分的终浓度分别为葡萄糖2000～6000毫克/升、次黄嘌呤5～10毫克/升、胸苷0.1～0.8毫克/升。
本具体实施例提供的用于培养DF-1细胞的无血清培养基应用于DF-1细胞的培养和鸡法氏囊疫苗的规模化生产，当然其也可以应用于其他一些疫苗的研制生产中。
实施例2
本具体实施例提供了一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基，所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基中各组分的具体含量为：
氨基酸部分：
丙氨酸4毫克/升，
精氨酸100毫克/升，
天冬酰胺6毫克/升，
天冬氨酸9毫克/升，
胱氨酸15毫克/升，
半胱氨酸20毫克/升，
谷氨酸7毫克/升，
谷氨酰胺200毫克/升，
甘氨酸10毫克/升，
组氨酸20毫克/升，
异亮氨酸30毫克/升，
亮氨酸50毫克/升，
赖氨酸100毫克/升，
甲硫氨酸15毫克/升，
苯丙氨酸30毫克/升，
脯氨酸15毫克/升，
丝氨酸20毫克/升，
苏氨酸30毫克/升，
色氨酸15毫克/升，
酪氨酸40毫克/升，
缬氨酸40毫克/升。
所述的维生素的含量为：
生物素0.003毫克/升，
叶酸2毫克/升，
烟酰胺5毫克/升，
吡哆醇2毫克/升，
硫胺素2毫克/升，
硫辛酸0.2毫克/升。
所述的盐类的含量为：
氯化镁30毫克/升，
硫酸镁30毫克/升，
氯化钙150毫克/升，
氯化钾300毫克/升，
氯化钠1000毫克/升，
磷酸氢二钠50毫克/升，
磷酸二氢钠50毫克/升，
丙酮酸钠60毫克/升。
所述的脂类的含量为：
胆固醇2毫克/升，
生育酚醋酸酯0.005毫克/升，
豆蔻酸0.005毫克/升，
棕榈酸0.005毫克/升，
棕榈油酸0.005毫克/升，
硬脂酸0.005毫克/升，
吐温80 1毫克/升，
嵌段式聚醚F68 10毫克/升。
所述的微量元素的含量为：
硫酸铜10毫克/升，
硝酸铁50毫克/升，
硫酸亚铁0.1毫克/升，
亚硒酸钠80毫克/升。
所述的缓冲剂的含量为：
碳酸氢钠1000毫克/升，
羟乙基哌嗪乙磺酸1000毫克/升。
所述的蛋白水解物的含量为：
大豆水解物2000毫克/升。
小麦水解物2000毫克/升。
所述的酸碱指示剂的含量为：
酚红5毫克/升。
所述的其他添加组分的含量为：
葡萄糖2000毫克/升，
次黄嘌呤5毫克/升，
胸苷0.1毫克/升。
上述用于培养DF-1细胞的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：无血清培养基中的各组分根据自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于30℃混合，调节所得混合液的pH值至6.95，定容后即得用于培养DF-1细胞的无血清培养基。
实施例3
本具体实施例提供了另一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基，所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基中各组分的具体含量为：
氨基酸部分：
丙氨酸8毫克/升，
精氨酸200毫克/升，
天冬酰胺20毫克/升，
天冬氨酸16毫克/升，
胱氨酸25毫克/升，
半胱氨酸35毫克/升，
谷氨酸15毫克/升，
谷氨酰胺800毫克/升，
甘氨酸25毫克/升，
组氨酸50毫克/升，
异亮氨酸60毫克/升，
亮氨酸70毫克/升，
赖氨酸150毫克/升，
甲硫氨酸30毫克/升，
苯丙氨酸50毫克/升，
脯氨酸30毫克/升，
丝氨酸40毫克/升，
苏氨酸60毫克/升，
色氨酸30毫克/升，
酪氨酸70毫克/升，
缬氨酸70毫克/升。
所述的维生素的含量为：
生物素0.01毫克/升，
叶酸5毫克/升，
烟酰胺10毫克/升，
吡哆醇5毫克/升，
硫胺素5毫克/升，
硫辛酸0.5毫克/升。
所述的盐类的含量为：
氯化镁100毫克/升，
硫酸镁100毫克/升，
氯化钙200毫克/升，
氯化钾500毫克/升，
氯化钠6000毫克/升，
磷酸氢二钠100毫克/升，
磷酸二氢钠100毫克/升，
丙酮酸钠150毫克/升。
所述的脂类的含量为：
胆固醇5毫克/升，
生育酚醋酸酯0.01毫克/升，
豆蔻酸0.01毫克/升，
棕榈酸0.01毫克/升，
棕榈油酸0.01毫克/升，
硬脂酸0.01毫克/升，
吐温80 3毫克/升，
嵌段式聚醚F68 2000毫克/升。
所述的微量元素的含量为：
硫酸铜20毫克/升，
硝酸铁100毫克/升，
硫酸亚铁0.6毫克/升，
亚硒酸钠150毫克/升。
所述的缓冲剂的含量为：
碳酸氢钠3700毫克/升，
羟乙基哌嗪乙磺酸5000毫克/升。
所述的蛋白水解物的含量为：
大豆水解物4000毫克/升。
小麦水解物4000毫克/升。
所述的酸碱指示剂的含量为：
酚红10毫克/升。
所述的其他添加物的含量为：
葡萄糖7000毫克/升，
次黄嘌呤10毫克/升，
胸苷0.8毫克/升。
上述用于培养DF-1细胞的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：无血清培养基中的各组分根据自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于30℃混合，调节所得混合液的pH值至6.95，定容后即得用于培养DF-1细胞的无血清培养基。
实施例4
本具体实施例提供了另一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基，所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基中各组分的具体含量为：
氨基酸部分：
丙氨酸5.2毫克/升，
精氨酸168.1毫克/升，
天冬酰胺7.92毫克/升，
天冬氨酸9.34毫克/升，
胱氨酸20.0毫克/升，
半胱氨酸31.1毫克/升，
谷氨酸12.5毫克/升，
谷氨酰胺699.5毫克/升，
甘氨酸19毫克/升，
组氨酸36.9毫克/升，
异亮氨酸53.7毫克/升，
亮氨酸61.5毫克/升，
赖氨酸134.4毫克/升，
甲硫氨酸23.6毫克/升，
苯丙氨酸40.2毫克/升，
脯氨酸28.8毫克/升，
丝氨酸28.0毫克/升，
苏氨酸43.3毫克/升，
色氨酸25.5毫克/升，
酪氨酸51.7毫克/升，
缬氨酸60.1毫克/升。
所述的维生素的含量为：
生物素0.0039毫克/升，
叶酸2.95毫克/升，
烟酰胺7.98毫克/升，
吡哆醇3.33毫克/升，
硫胺素4.08毫克/升，
硫辛酸0.37毫克/升。
所述的盐类的含量为：
氯化镁70.4毫克/升，
硫酸镁57.9毫克/升，
氯化钙158.9毫克/升，
氯化钾423.0毫克/升，
氯化钠4908.7毫克/升，
磷酸氢二钠69.21毫克/升，
磷酸二氢钠90.75毫克/升，
丙酮酸钠129.90毫克/升。
所述的脂类的含量为：
胆固醇2.91毫克/升，
生育酚醋酸酯0.0072毫克/升，
豆蔻酸0.0058毫克/升，
棕榈酸0.0065毫克/升，
棕榈油酸0.0092毫克/升，
硬脂酸0.0085毫克/升，
吐温80 2.4毫克/升，
嵌段式聚醚F68 1599.8毫克/升。
所述的微量元素的含量为：
硫酸铜15.5毫克/升，
硝酸铁84.2毫克/升，
硫酸亚铁0.29毫克/升，
亚硒酸钠131.2毫克/升。
所述的缓冲剂的含量为：
碳酸氢钠2680.0毫克/升，
羟乙基哌嗪乙磺酸3000毫克/升。
所述的蛋白水解物的含量为：
大豆水解物3600毫克/升。
小麦水解物2400毫克/升。
所述的酸碱指示剂的含量为：
酚红6.5毫克/升。
所述的其他添加物的含量为：
葡萄糖3000毫克/升，
次黄嘌呤6毫克/升，
胸苷0.65毫克/升。
上述用于培养DF-1细胞的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：无血清培养基中的各组分根据自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于30℃混合，调节所得混合液的pH值至6.95，定容后即得用于培养DF-1细胞的无血清培养基。
实施例5
本具体实施例提供了一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基的应用，实施例1-4提供的用于培养DF-1细胞的无血清培养基应用于DF-1细胞的全悬浮驯化中，DF-1细胞的全悬浮驯化方法包括如下步骤：将在含血清培养基中贴壁培养的DF-1贴壁培养型细胞直接转到无血清培养基中悬浮培养，培养几代后再次用含血清培养基进行贴壁培养，如此反复多次培养后即可获得DF-1全悬浮培养型细胞。在DF-1细胞驯化过程中使用的无血清培养基中添加有适当含量的肝素钠，优选为10μg/ml，添加肝素钠用于降低细胞结团率，阻碍DF-1细胞的纤维蛋白形成而导致的细胞连接现象，驯化成功后不再添加，驯化成功后的DF-1细胞为单细胞悬浮生长，结团率为0。
DF-1细胞全悬浮驯化方法的具体驯化步骤如下：
(1)选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性的贴壁培养型DF-1细胞进行培养，培养至形成致密单层后用含10％胎牛血清的DMEM培养液分瓶传代培养，在48-72h内细胞形成致密单层，选用生长正常且边缘清晰的细胞用于驯化。
(2)将步骤(1)中培养的DF-1细胞用胰酶消化后用无血清培养基悬浮培养，用无血清培养基悬浮培养时，用无血清培养基调整细胞密度，培养48h-72h取样计细胞密度与细胞活率，根据细胞密度与细胞活率决定是否需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，若不需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，则用新鲜无血清培养基稀释调整细胞密度继续培养，重复上述培养方式若干次即无血清培养基悬浮培养若干次后，将悬浮细胞离心弃上清，将离心后获得的DF-1细胞用含胎牛血清的DMEM培养基重悬至贴壁状态并培养传代若干次。
(3)将步骤(2)最终获得的DF-1细胞重复采用步骤(2)的方法培养多次。
(4)将步骤(3)最终获得的DF-1细胞用胰酶消化后用无血清培养基悬浮培养，用无血清培养基悬浮培养时，用无血清培养基调整细胞密度，培养48h-72h取样计细胞密度与细胞活率，根据细胞密度与细胞活率决定是否需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，若不需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，则用新鲜无血清培养基稀释调整细胞密度继续培养，重复上述培养方式若干次即用无血清培养基悬浮培养若干次后，将获得的DF-1细胞用无血清培养基重新调整细胞密度，培养48h-72h取样计细胞密度与细胞活率，根据细胞密度与细胞活率决定是否需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，若不需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，则用新鲜无血清培养基稀释调整细胞密度继续培养，若连续培养多代，每代细胞在48h-72h检测细胞密度时，均达到设定数值以上，则无血清培养基中不再添加肝素钠，此时驯化得到的细胞即为全悬浮培养型DF-1细胞系。
在驯化过程中，由于细胞不能适应培养状态的改变，细胞在驯化过程中逐渐死亡，当细胞的存活率低于60％时，将细胞重新用贴壁方式进行培养增殖，一方面，增加存活细胞的数量，另一方面，由于只有存活细胞能贴壁增殖，死细胞不能贴壁，可以将死细胞去除，以避免死细胞释放的信号导致存活细胞凋亡。
由于按血清逐级降低的方式进行驯化DF-1细胞，将导致DF-1细胞数量降低，当培养基由含有血清降低到无血清时，DF-1细胞数量很少，无法进行悬浮驯化，所以本驯化方法选用了DF-1细胞由含血清培养基贴壁培养直接转化为无血清悬浮培养，没有进行培养基中血清含量逐渐降低的过程。
本具体实施例中的DF-1细胞全悬浮驯化方法应用于禽源病毒疫苗的研发和生产中能够保证病毒的效价的同时极大地降低了疫苗生产过程中的污染风险和疫苗的生产成本。
实施例6
本具体实施例提供了一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基的应用，实施例1-4提供的用于培养DF-1细胞的无血清培养基应用于DF-1细胞的全悬浮驯化中，DF-1细胞的全悬浮驯化方法包括如下步骤：将在含血清培养基中贴壁培养的DF-1贴壁培养型细胞直接转到无血清培养基中悬浮培养，培养几代后再次用含血清培养基进行贴壁培养，如此反复多次培养后即可获得DF-1全悬浮培养型细胞。在DF-1细胞驯化过程中使用的无血清培养基中添加有适当含量的肝素钠，优选为10μg/ml，添加肝素钠用于降低细胞结团率，阻碍DF-1细胞的纤维蛋白形成而导致的细胞连接现象，驯化成功后不再添加，驯化成功后的DF-1细胞为单细胞悬浮生长，结团率为0。
DF-1细胞全悬浮驯化方法的具体驯化步骤如下：
(1)选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性的贴壁培养型DF-1细胞进行培养，培养至形成致密单层后用含10％胎牛血清的DMEM培养液按1：5比例分瓶传代，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养，在48-72h内细胞形成致密单层，选用生长正常且边缘清晰的细胞用于驯化。
(2)将步骤(1)中培养的DF-1细胞用0.25％的胰酶消化后用无血清培养基悬浮培养，用无血清培养基悬浮培养时，用无血清培养基将细胞密度调整至5-8×105/ml，在130r/min、37℃5％CO2的摇床中培养，培养48h-72h取样计细胞密度与细胞活率，若细胞密度未达到1.5×106/ml，细胞活率高于80％，则800-1000r离心后换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，若细胞密度达到1.5×106/ml以上，细胞活率高于80％，则用新鲜无血清培养基稀释调整细胞密度为8×105/ml继续培养，重复上述培养方式3次即无血清培养基悬浮培养3代后，将悬浮细胞800-1000r离心弃上清，将离心后获得的DF-1细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬至贴壁状态并培养传代2-3次，此方法用于去除死细胞，提高细胞活性。
(3)将步骤(2)最终获得的DF-1细胞即用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬至贴壁状态并培养传代2-3次后获得的细胞重复采用步骤(2)的方法培养3次。
(4)将步骤(3)最终获得的DF-1细胞用胰酶消化后用0.25％的无血清培养基悬浮培养，用无血清培养基悬浮培养时，用无血清培养基将细胞密度调整至5-8×105/ml，在130r/min、37℃5％CO2的摇床中培养，培养48h-72h取样计细胞密度与细胞活率，若细胞密度未达到1.5×106/ml，细胞活率高于80％，则离心后换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，若细胞密度达到1.5×106/ml以上，细胞活率高于80％，则用新鲜无血清培养基稀释调整细胞密度为8×105/ml继续培养，重复上述培养方式3次即无血清培养基悬浮培养3代后，将获得的DF-1细胞用无血清培养基将细胞密度调整为1.5×106/ml，培养48h-72h取样计细胞密度与细胞活率，若细胞密度未达到4.5×106/ml，细胞活率高于80％，则离心后换用新鲜无血清培养基重新悬浮，若细胞密度达到4.5×106/ml以上，则将细胞悬液稀释至1.5×106/ml接种培养，若连续培养三代，每代细胞在48h-72h检测细胞密度时，均达到4.5×106/ml以上时，则无血清培养基中不再添加肝素钠，此时驯化得到的细胞即为全悬浮培养型DF-1细胞系，细胞为单细胞悬浮，结团率为0。
本具体实施例中的DF-1细胞全悬浮驯化方法应用于禽源病毒疫苗的研发和生产中能够保证病毒的效价的同时极大地降低了疫苗生产过程中的污染风险和疫苗的生产成本。
实施例7
本具体实施例提供了一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基的应用，实施例1-4提供的用于培养DF-1细胞的无血清培养基应用于DF-1细胞的全悬浮驯化中，DF-1细胞的全悬浮驯化方法包括如下步骤：将在含血清培养基中贴壁培养的DF-1贴壁培养型细胞直接转到无血清培养基中悬浮培养，培养几代后再次用含血清培养基进行贴壁培养，如此反复多次培养后即可获得DF-1全悬浮培养型细胞。在DF-1细胞驯化过程中使用的无血清培养基中添加有适当含量的肝素钠，优选为10μg/ml，添加肝素钠用于降低细胞结团率，阻碍DF-1细胞的纤维蛋白形成而导致的细胞连接现象，驯化成功后不再添加，驯化成功后的DF-1细胞为单细胞悬浮生长，结团率为0。
DF-1细胞全悬浮驯化方法的具体驯化步骤如下：
(1)选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性的贴壁培养型DF-1细胞进行培养，培养至形成致密单层后用含10％胎牛血清的DMEM培养液按1：5比例分瓶传代，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养72h，细胞形成致密单层，选用生长正常且边缘清晰的细胞用于驯化；
(2)将生长正常的贴壁培养型DF-1细胞用0.25％的胰酶消化后用含10μg/ml肝素钠的无血清培养基重悬并用含10μg/ml肝素钠的无血清培养基将细胞密度调整至8×105/ml，在130r/min、37℃5％CO2的摇床中培养；
(3)培养48h后取样计细胞密度与细胞活率，若细胞密度未达到1.5×106/ml，细胞活率高于80％，则800r离心后换用新鲜含10μg/ml肝素钠的无血清培养基重新悬浮培养，若细胞密度达到1.5×106/ml以上，细胞活率高于80％，则用新鲜含10μg/ml肝素钠的无血清培养基稀释调整细胞密度为8×105/ml继续培养；
(4)连续传代三次后，将悬浮细胞800r离心，弃上清后，用含10％胎牛血清的无血清培养基重悬至贴壁状态，用含10％胎牛血清的DMEM培养基贴壁传2代；
(5)将步骤(4)重新贴壁培养的DF-1细胞用0.25％的胰酶消化后用含10ug/ml肝素钠的无血清培养基重悬，用含10ug/ml肝素钠的无血清培养基将细胞密度调整至8×105/ml，在130r/min、37℃、5％CO2的摇床中培养；
(6)培养48h后取样计细胞密度与细胞活率，若细胞密度未达到1.5×106/ml，细胞活率高于80％，则800r离心后换用新鲜含10μg/ml肝素钠的无血清培养基重新悬浮培养，若细胞密度达到1.5×106/ml以上，细胞活率高于80％，则用新鲜含10μg/ml肝素钠的无血清培养基稀释调整细胞密度为8×105/ml继续培养；
(7)连续传代三次后，将悬浮细胞800r离心，弃上清后，再次用含10％胎牛血清的无血清培养基重悬至贴壁状态，用10％胎牛血清的DMEM贴壁传2代；
(8)再将步骤(7)重新贴壁培养的DF-1细胞用0.25％的胰酶消化后用含10μg/ml肝素钠的无血清培养基重悬，用培养液将细胞密度调整至8×105/ml，在130r/min、37℃、5％CO2的摇床中培养；
(9)培养48h后取样计细胞密度与细胞活率，若细胞密度未达到1.5×106/ml，细胞活率高于80％，则800r离心后换用新鲜含10μg/ml肝素钠的无血清培养基重新悬浮培养，若细胞密度达到1.5×106/ml以上，细胞活率高于80％，则用新鲜含10μg/ml肝素钠的无血清培养基稀释调整细胞密度为8×105/ml继续培养；
(10)再次连续传代三次后，将悬浮细胞800r离心，弃上清后，再次用含10％胎牛血清的无血清培养基重悬至贴壁状态，用10％胎牛血清的DMEM贴壁传2代；
(11)第三次将步骤(10)重新贴壁培养的DF-1细胞用0.25％的胰酶消化后用含10μg/ml肝素钠的无血清培养基重悬，用培养液将细胞密度调整至8×105/ml，在130r/min、37℃、5％CO2的摇床中培养；
(12)培养48h后取样计细胞密度与细胞活率，若细胞密度未达到1.5×106/ml，细胞活率高于80％，则800r离心后换用新鲜含10μg/ml肝素钠的无血清培养基重新悬浮培养，若细胞密度达到1.5×106/ml以上，细胞活率高于80％，则用新鲜含10μg/ml肝素钠的无血清培养基稀释调整细胞密度为8×105/ml继续培养；
(13)连续传代三次后，将细胞全悬浮接种密度调整为1.5×106/ml，培养48h取样计细胞密度与细胞活率，细胞密度未达到4.5×106/ml时，若细胞密度未达到4.5×106/ml，细胞活率高于80％，则800r/min离心后换用新鲜含10μg/ml肝素钠的无血清培养基重新悬浮，若细胞密度达到4.5×106/ml以上，则将细胞悬液直接稀释至1.5×106/ml继续培养；
(14)若连续培养三代，每代细胞在48h检测细胞密度时，均达到4.5×106/ml以上，则无血清培养基中不再添加肝素钠，此时驯化得到的细胞即为全悬浮培养型DF-1细胞系，细胞为单细胞悬浮，结团率为0。
实施例8
本具体实施例为DF-1细胞的全悬浮驯化实验，该实验采用的细胞为贴壁培养型DF-1细胞，所采用的培养基为含10％胎牛血清的DMEM，添加有10μg/ml肝素钠的无血清培养基和无血清培养基，无血清培养基为实施例3中的无血清培养基，该实验采用实施例7中的驯化方法。
在DF-1细胞驯化过程中，DF-1细胞驯化各代次的初始细胞密度、培养48h后的细胞密度以及细胞活率的结果如表1所示，由表1的数据可以明显的看出，该DF-1细胞的全悬浮培养的驯化方法能够成功的驯化出全悬浮培养型DF-1细胞系。
表1 DF-1细胞驯化各代次细胞密度以及细胞活率的结果表
Figure BDA0002725410320000251
实施例9
本具体实施例为用于培养DF-1细胞的无血清培养基的培养验证实验，该实验的实验方法为：将三组全悬浮培养型DF-1细胞以细胞密度为5.0×105个/ml分别接种到生物反应器中，三个生物反应器中添加的无血清培养基分别为实施例2-4中的无血清培养基，对每个生物反应器每24h取样计数和检查细胞密度和细胞活力，结果如表2和图1所示，由表2可以看出，该无血清培养基培养全悬浮培养型DF-1细胞，培养48小时后，细胞密度可由5×105个/ml生长至5×106个/ml以上，细胞生长增殖10倍以上，细胞活率达到97％以上，结合图1可以明显的看出，实施例2-4中的无血清培养基均能够很好的培养全悬浮培养型DF-1细胞。
表2用于培养DF-1细胞的无血清培养基的培养验证实验结果
Figure BDA0002725410320000261
实施例10
本具体实施例为采用不同无血清培养基培养全悬浮培养型DF-1细胞的对比验证实验，该实验采用的培养基为实施例2中的无血清培养基和GIBICO无血清培养基，采用的实验方法为将两组全悬浮培养型DF-1细胞以细胞密度为5.0×105个/ml分别接种到实施例2中的无血清培养基和GIBICO无血清培养基中，培养48h，统计细胞密度，继续传3代，比较细胞在两种培养基的生长情况。
实验结果如表3和表4所示，由表3和表4可以得出，实施例2中的无血清培养基能够培养DF-1细胞连续传代3次，并且每代48小时细胞密度翻倍数超过10倍，该培养基适合DF-1细胞生长。GIBICO无血清培养基培养的DF-1细胞在第一代可以维持细胞活率93％以上，但是细胞没有明显的繁殖，第二代细胞活率下降至72.1％，细胞密度降低，到第三代细胞活率仅为43.6％，细胞密度较低，表4的数据表明GIBICO无血清培养基不适合DF-1细胞的生长，GIBICO无血清培养基不支持DF-1细胞的生长传代，目前没有专门针对DF-1细胞培养的商品化的培养基。
其它培养基并不能支持DF-1细胞的生长繁殖，其原因是其它培养基的成分不能为DF-1细胞的繁殖提供所需的物质，其不能提供适合DF-1细胞生长的环境，本发明无血清培养基的各种组分及其各组分的含量适合DF-1细胞的生长繁殖。
表3实施例2中的无血清培养基培养DF-1细胞的结果
Figure BDA0002725410320000271
表4 GIBICO无血清培养基培养DF-1细胞的结果
Figure BDA0002725410320000272
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化均囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物、酸碱指示剂和其他添加组分，其中，
所述氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
所述维生素为生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、硫胺素和硫辛酸；
所述盐类为氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和丙酮酸钠；
所述脂类为胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温和嵌段式聚醚F68；
所述微量元素为硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁和亚硒酸钠；
所述缓冲剂为碳酸氢钠和羟乙基哌嗪乙磺酸；
所述蛋白水解物为大豆水解物和小麦水解物；
所述酸碱指示剂为酚红；
所述其他添加组分为葡萄糖、次黄嘌呤和胸苷。
2.根据权利要求1所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，所述氨基酸中各成分的终浓度分别为丙氨酸4～8毫克/升、精氨酸100～200毫克/升、天冬酰胺6～20毫克/升、天冬氨酸9～16毫克/升、胱氨酸15～25毫克/升、半胱氨酸20～35毫克/升、谷氨酸7～15毫克/升、谷氨酰胺200～800毫克/升、甘氨酸10～25毫克/升、组氨酸20～50毫克/升、异亮氨酸30～60毫克/升、亮氨酸50～70毫克/升、赖氨酸100～150毫克/升、甲硫氨酸15～30毫克/升、苯丙氨酸30～50毫克/升、脯氨酸15～30毫克/升、丝氨酸20～40毫克/升、苏氨酸30～60毫克/升、色氨酸15～30毫克/升、酪氨酸40～70毫克/升、缬氨酸40～70毫克/升；
所述维生素中各成分的终浓度分别为生物素0.003～0.01毫克/升、叶酸2～5毫克/升、烟酰胺5～10毫克/升、吡哆醇2～5毫克/升、硫胺素2～5毫克/升、硫辛酸0.2～0.5毫克/升；
所述盐类中各成分的终浓度分别为氯化镁30～100毫克/升、硫酸镁30～100毫克/升、氯化钙150～200毫克/升、氯化钾300～500毫克/升、氯化钠1000～6000毫克/升、磷酸氢二钠50～100毫克/升、磷酸二氢钠50～100毫克/升、丙酮酸钠60～150毫克/升；
所述脂类中各成分的终浓度分别为胆固醇2～5毫克/升、生育酚醋酸酯0.005～0.01毫克/升、豆蔻酸0.005～0.01毫克/升、棕榈酸0.005～0.01毫克/升、棕榈油酸0.005～0.01毫克/升、硬脂酸0.005～0.01毫克/升、吐温80 1～3.0毫克/升、嵌段式聚醚F6810～2000毫克/升；
所述微量元素中各成分的终浓度分别为硫酸铜10～20毫克/升、硝酸铁50～100毫克/升、硫酸亚铁0.1～0.6毫克/升、亚硒酸钠80～150毫克/升；
所述缓冲剂中各成分的终浓度分别为碳酸氢钠1000～3700毫克/升、羟乙基哌嗪乙磺酸1000～5000毫克/升；
所述酚红的终浓度为5～10毫克/升；
所述蛋白水解物中各成分的终浓度分别为大豆水解物2000～4000毫克/升、小麦水解物2000～4000毫克/升；
所述其他添加组分中各成分的终浓度分别为葡萄糖2000～6000毫克/升、次黄嘌呤5～10毫克/升、胸苷0.1～0.8毫克/升。
3.根据权利要求2所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，所述氨基酸中各成分的终浓度分别为丙氨酸5.2毫克/升、精氨酸168.1毫克/升、天冬酰胺7.92毫克/升、天冬氨酸9.34毫克/升、胱氨酸20.0毫克/升、半胱氨酸31.1毫克/升、谷氨酸12.5毫克/升、谷氨酰胺699.5毫克/升、甘氨酸19毫克/升、组氨酸36.9毫克/升、异亮氨酸53.7毫克/升、亮氨酸61.5毫克/升、赖氨酸134.4毫克/升、甲硫氨酸23.6毫克/升、苯丙氨酸40.2毫克/升、脯氨酸28.8毫克/升、丝氨酸28.0毫克/升、苏氨酸43.3毫克/升、色氨酸25.5毫克/升、酪氨酸51.7毫克/升、缬氨酸60.1毫克/升；
所述维生素中各成分的终浓度分别为生物素0.0039毫克/升、叶酸2.95毫克/升、烟酰胺7.98毫克/升、吡哆醇3.33毫克/升、硫胺素4.08毫克/升、硫辛酸0.37毫克/升；
所述盐类中各成分的终浓度分别为氯化镁70.4毫克/升、硫酸镁57.9毫克/升、氯化钙158.9毫克/升、氯化钾423.0毫克/升、氯化钠4908.7毫克/升、磷酸氢二钠69.21毫克/升、磷酸二氢钠90.75毫克/升、丙酮酸钠129.90毫克/升；
所述脂类中各成分的终浓度分别为胆固醇2.91毫克/升、生育酚醋酸酯0.0072毫克/升、豆蔻酸0.0058毫克/升、棕榈酸0.0065毫克/升、棕榈油酸0.0092毫克/升、硬脂酸0.0085毫克/升、吐温80 2.4毫克/升、嵌段式聚醚F68 1599.8毫克/升；
所述微量元素中各成分的终浓度分别为硫酸铜15.5毫克/升、硝酸铁84.2毫克/升、硫酸亚铁0.29毫克/升、亚硒酸钠131.2毫克/升。
4.根据权利要求3所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，所述缓冲剂中各成分的终浓度分别为碳酸氢钠2680.0毫克/升、羟乙基哌嗪乙磺酸3毫克/升；
所述酚红的终浓度为6.5毫克/升；
所述蛋白水解物中各成分的终浓度分别为大豆水解物3600毫克/升、小麦水解物2400毫克/升；
所述其他添加组分中各成分的终浓度分别为葡萄糖3000毫克/升、次黄嘌呤6毫克/升、胸苷0.65毫克/升。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基应用于DF-1细胞的培养和鸡法氏囊疫苗的规模化生产。
6.根据权利要求1-4任意一项所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基应用于DF-1细胞的全悬浮驯化，所述DF-1细胞的全悬浮驯化方法为：
(1)对贴壁培养型DF-1细胞用含有血清的培养基进行培养至形成致密单层，选用生长正常且边缘清晰的细胞用于驯化；
(2)将步骤(1)中培养的DF-1细胞用胰酶消化后用无血清培养基悬浮培养若干次后，将悬浮细胞离心弃上清，将离心后获得的DF-1细胞用含有血清的培养基中重悬至贴壁状态并培养若干次；
(3)将步骤(2)最终获得的DF-1细胞重复采用步骤(2)的方法培养多次；
(4)将步骤(3)最终获得的DF-1细胞用胰酶消化后用无血清培养基悬浮培养，用无血清培养基悬浮培养若干次后获得的DF-1细胞即为驯化得到的全悬浮培养型DF-1细胞系。
7.根据权利要求6所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，步骤(1)中选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性的贴壁培养型DF-1细胞进行培养，具体的培养方法为：将贴壁培养型DF-1细胞培养至形成致密单层后用含10％胎牛血清的DMEM培养液按1：5比例分瓶传代，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养，在48-72h内细胞形成致密单层，选用生长正常且边缘清晰的细胞用于驯化。
8.根据权利要求6所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)中的无血清培养基中添加有用于降低细胞团结率的肝素钠，步骤(2)中DF-1细胞用胰酶消化后用无血清培养基悬浮培养时，用无血清培养基调整细胞密度，培养48h-72h取样计细胞密度与细胞活率，根据细胞密度与细胞活率决定是否需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，若不需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，则用新鲜无血清培养基稀释调整细胞密度继续培养，重复上述培养方式若干次即无血清培养基悬浮培养若干次后，将悬浮细胞离心弃上清，将离心后获得的DF-1细胞用含胎牛血清的培养基重悬至贴壁状态并培养传代若干次。
9.根据权利要求8所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，步骤(4)中DF-1细胞用胰酶消化后用无血清培养基悬浮培养时，用无血清培养基调整细胞密度，培养48h-72h取样计细胞密度与细胞活率，根据细胞密度与细胞活率决定是否需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，若不需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，则用新鲜无血清培养基稀释调整细胞密度继续培养，重复上述培养方式若干次即用无血清培养基悬浮培养若干次后，将获得的DF-1细胞用无血清培养基重新调整细胞密度，培养48h-72h取样计细胞密度与细胞活率，根据细胞密度与细胞活率决定是否需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，若不需要离心换用新鲜无血清培养基重新悬浮培养，则用新鲜无血清培养基稀释调整细胞密度继续培养，若连续培养多代，每代细胞在48h-72h检测细胞密度时，均达到设定数值以上，则无血清培养基中不再添加肝素钠，此时驯化得到的细胞即为全悬浮培养型DF-1细胞系。
10.权利要求1-4任意一项所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：无血清培养基中的各组分根据自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于30℃混合，调节所得混合液的pH值至6.95，定容后即得用于培养DF-1细胞的无血清培养基。
CN202011101169.8A 2020-10-15 2020-10-15 一种用于培养df-1细胞的无血清培养基及其制备方法 Pending CN112210542A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011101169.8A CN112210542A (zh) 2020-10-15 2020-10-15 一种用于培养df-1细胞的无血清培养基及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011101169.8A CN112210542A (zh) 2020-10-15 2020-10-15 一种用于培养df-1细胞的无血清培养基及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112210542A true CN112210542A (zh) 2021-01-12

Family

ID=74052787

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011101169.8A Pending CN112210542A (zh) 2020-10-15 2020-10-15 一种用于培养df-1细胞的无血清培养基及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112210542A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113943694A (zh) * 2021-10-13 2022-01-18 无锡多宁生物科技有限公司 一种支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基及其制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101760442A (zh) * 2010-01-15 2010-06-30 华东理工大学 适于mdck细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基
CN102268403A (zh) * 2011-08-01 2011-12-07 上海米迪生物技术有限公司 适于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基
CN103555659A (zh) * 2013-11-11 2014-02-05 乔自林 一种mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基
CN103555658A (zh) * 2013-11-07 2014-02-05 令世鑫 一种bhk-21细胞全悬浮培养的无血清培养基
CN107435037A (zh) * 2016-05-27 2017-12-05 上海倍谙基生物科技有限公司 一种用于bhk细胞的无血清培养基
CN108265024A (zh) * 2018-03-30 2018-07-10 吉林冠界生物技术有限公司 适应mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101760442A (zh) * 2010-01-15 2010-06-30 华东理工大学 适于mdck细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基
CN102268403A (zh) * 2011-08-01 2011-12-07 上海米迪生物技术有限公司 适于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基
CN103555658A (zh) * 2013-11-07 2014-02-05 令世鑫 一种bhk-21细胞全悬浮培养的无血清培养基
CN103555659A (zh) * 2013-11-11 2014-02-05 乔自林 一种mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基
CN107435037A (zh) * 2016-05-27 2017-12-05 上海倍谙基生物科技有限公司 一种用于bhk细胞的无血清培养基
CN108265024A (zh) * 2018-03-30 2018-07-10 吉林冠界生物技术有限公司 适应mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AUDSLEY J等: "The growth of attenuated influenza vaccine donor strains in continuous cell lines", 《J VIROL METHODS》 *
樊庆帅等: "无血清培养MDCK细胞生产狂犬病病毒条件的初步优化", 《中国生物制品学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113943694A (zh) * 2021-10-13 2022-01-18 无锡多宁生物科技有限公司 一种支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基及其制备方法
CN113943694B (zh) * 2021-10-13 2024-07-16 无锡多宁生物科技有限公司 一种支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101760442B (zh) 适于mdck细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基
CN109337861B (zh) 一种支持产物高表达的cho细胞无血清培养基
CN100362098C (zh) 适用于多种动物细胞大规模培养的无血清培养基
US20170369836A1 (en) Serum-free medium for full suspension culture of mdck cells and preparation method of serum-free medium
CN101864393B (zh) 一种用于Vero细胞微载体培养的无动物来源成分无血清培养基
CN112795531B (zh) 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途
CN112210530A (zh) 一种细胞全悬浮驯化方法、df-1细胞全悬浮驯化方法及应用
CN104928251B (zh) 一种诱导多能性干细胞的培养体系
CN102268403A (zh) 适于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基
CN107841482B (zh) Mdck细胞无血清悬浮培养技术生产h9亚型流感疫苗
EP3708658A1 (en) Method for acclimating and suspending vero and second-order production process for virus
CN111944741B (zh) Mdck细胞系的悬浮培养驯化方法
CN111440764A (zh) 间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方法
CN108359632A (zh) Mdck细胞系、复制病毒的方法及其应用
CN108753737A (zh) 一种在mdck全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法及其应用
CN112210542A (zh) 一种用于培养df-1细胞的无血清培养基及其制备方法
CN108103003B (zh) 一种适应pk-15全悬浮生长的无血清培养基及其制备方法和应用于pk-15细胞的全悬浮驯化方法
CN114480286A (zh) 无血清悬浮型lmh细胞系及其制备方法和应用
CN113913368A (zh) 适合cho细胞大规模悬浮扩增培养的无血清培养基及其制备和应用
CN113684175A (zh) 一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法
CN112063578A (zh) 适应全悬浮细胞培养的培养基及其制备方法和应用
CN111662882A (zh) 一种采用mdck细胞系增殖禽流感病毒的方法
CN113943694B (zh) 一种支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基及其制备方法
CN113755427A (zh) 一种优化后的bhk21细胞无血清悬浮培养基
CN107119017B (zh) 一种骨肉瘤细胞的无血清培养基及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210112

RJ01 Rejection of invention patent application after publication