CN102660511B - 一种降低血清中胰酶抑制物的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种降低血清中胰酶抑制物的方法。其包括以下步骤：血清解冻、离心处理、一次初步过滤、二次初步过滤、深度过滤等步骤得到减少了胰酶抑制物的血清。本发明所得到的减少了胰酶抑制物的血清用于禽流感病毒的接种繁殖。本发明所述的减少血清中胰酶抑制物的方法通过离心、横向切流、超滤等系列方法减少血清中胰酶抑制物的浓度。经过本发明的方法处理之后的血清用于禽流感病毒的繁殖，在同等条件对于没有处理过的血清用于禽流感病毒繁殖，禽流感病毒的HA价提高8-16倍；相对于完全没有加血清用于禽流感病毒繁殖，禽流感病毒的HA价提高2-4倍。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种降低血清中胰酶抑制物的方法及其应用。
背景技术
生物制品生产过程中广泛用到血清。血清是细胞培养过程中必不少的营养物质。其含有氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质，并且提供胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等激素和各种生长因子。血清中的结合蛋白能给携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁，结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用，对培养中的细胞起到某些保护作用，例如有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3，硒等。
哺乳动物细胞培养已经发展到能够自由扩大培养并且用于工业化生产的地步了。目前许多生物活性物质和疫苗，例如单克隆抗体、药用蛋白质、禽流感疫苗等，都可以通过动物细胞大规模培养获得。在生产过程中，不论是在细胞繁殖阶段还是生物活性物质生产阶段，血清均是必不可少的营养物质。但是在禽流感病毒繁殖过程中，出现了例外的情况。由于禽流感病毒入侵细胞时需要胰酶协助禽流感病毒入侵细胞，整个繁殖的过程中仍然需要加入胰酶促进禽流感病毒再次入侵细胞和繁殖。因此，禽流感病毒繁殖过程中，不能添加血清，否则病毒产量很低。但是血清中含有大量的氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物、胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素等激素和各种生长因子，这些因子绝大多数均为小分子物质，其不但对细胞生长维持细胞的活力还对病毒的合成繁殖起着重要作用。如果能够有效的去除或减少血清中胰酶抑制物的浓度，那么对禽流感病毒的繁殖和禽流感细胞苗的产业化将起着重要的作用。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明的目的在于提供一种降低血清中胰酶抑制物的方法，降低血清中胰酶抑制物，用于禽流感病毒的繁殖。
本发明的另一目的在于应用降低胰酶抑制物的血清进行禽流感病毒的接种繁殖。
本发明的有一目的在于提供一种用降低胰酶抑制物的血清进行禽流感病毒的接种繁殖方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种降低血清中胰酶抑制物的方法，其包括以下步骤：
1）血清解冻：将保存的血清解冻；
2）离心处理：血清解冻后，离心处理，去除血清中的大块沉淀物；
3）一次初步过滤：使用孔径为50-100K横向切流浓缩仪，对上述血清进行一次初步过滤，去处血清中的大分子物质，收集一次滤液；
4）二次初步过滤：使用孔径为20-40K横向切流浓缩仪，对上述滤液进行二次初步过滤，去处滤液中的大分子物质，收集二次滤液；
5）深度过滤：使用孔径为5-10K超滤系统，对上述二次滤液进行超滤，收集血清滤液，得到减少了胰酶抑制物的血清。
所述血清解冻步骤是将-20℃保存的血清放在2-8℃冰箱中过夜解冻。
所述离心处理步骤中是使用5000-8000转/分的离心机，将解冻后的血清离心20-30分钟。
本发明所得到的减少了胰酶抑制物的血清用于禽流感病毒的接种繁殖。
一种禽流感病毒的接种繁殖方法，其步骤如下：首先用含有胎牛血清的MEM培养基培养细胞，待细胞致密后倒掉培养液；然后使用PBS洗涤细胞，直到把细胞瓶培养瓶中的血清洗净，再加入少量禽流感病毒-胰酶溶液细胞进行接种，接种后倒掉禽流感病毒-胰酶溶液，加入减少胰酶抑制物的血清和胰酶进行禽流感病毒的繁殖。
上述接种繁殖方法中，所述MEM培养基中，胎牛血清的含量占培养基重量的1-2%。
上述接种繁殖方法中，所述的细胞培养瓶为T25细胞瓶。
上述接种繁殖方法中，所述细胞为MDCK或Vero细胞。
本发明的有益效果在于：本发明所述的减少血清中胰酶抑制物的方法通过离心、横向切流、超滤等系列方法减少血清中胰酶抑制物的浓度。经过本发明的方法处理之后的血清用于禽流感病毒的繁殖，在同等条件对于没有处理过的血清用于禽流感病毒繁殖，禽流感病毒的HA价提高8-16倍；相对于完全没有加血清用于禽流感病毒繁殖，禽流感病毒的HA价提高2-4倍。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
以下是本发明优选的实施例。
实施例1：
一种降低血清中胰酶抑制物的方法，其包括以下步骤：
将保存的血清放在5℃冰箱中过夜解冻；血清解冻后，用5000转/分的离心机，将解冻后的血清离心20分钟，去除血清中的大块沉淀物；使用孔径为50-100K横向切流浓缩仪，对上述血清进行一次初步过滤，去处血清中的大分子物质，收集一次滤液，再使用孔径为20-40K横向切流浓缩仪，对上述滤液进行二次初步过滤，去处滤液中的大分子物质，收集二次滤液，接着使用孔径为5-10K超滤系统，对上述二次滤液进行超滤，收集滤液，得到减少胰酶抑制物的血清。
MDCK细胞按照1：4的比例进行传代，MDCK细胞使用含有10%的胎牛血清的MEM培养基进行培养，等细胞致密后，接种H5亚型禽流感病毒，接种方法为：首先用倒掉T25细胞瓶中培养液；然后使用PBS洗涤MDCK细胞，直到把细胞瓶中的血清洗净；再加入少量禽流感病毒-胰酶溶液对MDCK细胞进行接种，接种后倒掉禽流感病毒-胰酶溶液，加入血清和胰酶进行禽流感病毒的繁殖。其中用减少胰酶抑制物的血清置两组对比：即将分别用质量浓度为1%和2%的减少胰酶抑制物的血清繁殖禽流感病毒；没有处理的血清设置两组对比：分别用质量浓度为1%和2%没有处理的血清繁殖禽流感病毒；同时设置不添加血清的对照组。
按照上述处理的H5亚型禽流感病毒接种后24小时和48小时检测繁殖禽流感的滴度（HA价），其结见表1：
表1:H5亚型禽流感病毒接种对比
实施例2：
将保存的血清放在2℃冰箱中过夜解冻；血清解冻后，用8000转/分的离心机，将解冻后的血清离心30分钟，减少血清中的大块沉淀物；使用孔径为50-100K横向切流浓缩仪，对上述血清进行一次初步过滤，去处血清中的大分子物质，收集一次滤液，再使用孔径为20-40K横向切流浓缩仪，对上述滤液进行二次初步过滤，去处滤液中的大分子物质，收集二次滤液，接着使用孔径为5-10K超滤系统，对上述二次滤液进行超滤，收集滤液，得到减少胰酶抑制物的血清。
MDCK细胞按照1：4的比例进行传代，MDCK细胞使用含有10%的胎牛血清的MEM培养基进行培养，等细胞致密后，接种H9亚型禽流感病毒，接种方法为：首先用倒掉T25细胞瓶中培养液；然后使用PBS洗涤MDCK细胞，直到把细胞瓶中的血清洗净；再加入少量禽流感病毒-胰酶溶液对MDCK细胞进行接种，接种后倒掉禽流感病毒-胰酶溶液，加入血清和胰酶进行禽流感病毒的繁殖。其中用减少胰酶抑制物的血清置两组对比：即将分别用浓度为1%和2%的减少胰酶抑制物的血清繁殖禽流感病毒；没有处理的血清设置两组对比：分别用浓度为1%和2%没有处理的血清繁殖禽流感病毒；同时设置不添加血清的对照组。
按照上述处理的H9亚型禽流感病毒接种后24小时和48小时检测繁殖禽流感的滴度（HA价），其结果见表2：
表2：H9亚型禽流感病毒接种对比
从实施例1和实施例2可知：血清处理后在同等条件下繁殖禽流感病毒相对于没有处理过的血清其禽流感病毒繁殖后病毒的HA价提高8-16倍，相对于完全没有加血清其禽流感病毒繁殖后病毒的HA价提高2-4倍。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种禽流感病毒的接种繁殖方法，其包括以下步骤：
1）血清解冻：将-20℃保存的血清放在2-8℃冰箱中过夜解冻；
2）离心处理：血清解冻后，用5000-8000转/分的离心机离心处理20-30分钟，去除血清中的大块沉淀物；
3）一次初步过滤：使用孔径为50-100K横向切流浓缩仪，对上述血清进行一次初步过滤，去除血清中的大分子物质，收集一次滤液；
4）二次初步过滤：使用孔径为20-40K横向切流浓缩仪，对上述滤液进行二次初步过滤，去除滤液中的大分子物质，收集二次滤液；
5）深度过滤：使用孔径为5-10K超滤系统，对上述二次滤液进行超滤，收集血清滤液，得到减少了胰酶抑制物的血清；
6）用含有胎牛血清的MEM培养基培养细胞，待细胞致密后倒掉培养液；然后使用PBS洗涤细胞，直到把细胞培养瓶中的血清洗净，再加入少量禽流感病毒-胰酶溶液进行接种，接种后倒掉禽流感病毒-胰酶溶液，加入含减少胰酶抑制物的血清的MEM培养基和胰酶进行禽流感病毒的繁殖，其中减少胰酶抑制物的血清占培养基重量的1-2%。
2.根据权利要求1所述的禽流感病毒的接种繁殖方法，其特征在于：所述禽流感病毒繁殖过程中，MEM培养基中胎牛血清的含量占培养基重量的1-2%。
3.根据权利要求1所述的禽流感病毒的接种繁殖方法，其特征在于：所述细胞为MDCK或Vero细胞。
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