CN101407788B - 一种促进狂犬病病毒增殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进狂犬病病毒增殖的方法。在狂犬病病毒培养的细胞维持液中单一添加精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸分别可提高狂犬病病毒滴度0.68 log LD 50/0.03ml~0.24 log LD 50/0.03ml。精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的氨基酸组合也可提高狂犬病病毒滴度。经多克隆荧光抗体染色结果表明,与对照组比较,精氨酸和亮氨酸组病毒吸附由60min缩短为30min,病毒穿膜由90min缩短为60min;经核蛋白单克隆荧光抗体染色结果表明,病毒核蛋白合成由21h缩短为18h;经狂犬病病毒抗原检测试剂盒检测培养液,病毒阳性检出由54h提前到42h。该方法简便有效,在狂犬病疫苗生产中有其实用性。
Description
【技术领域】 本发明涉及一种促进狂犬病病毒增殖的方法,属于微生物应用领域病毒培养技术。
【背景技术】 细胞大规模培养已成为生物制药领域关键技术之一,并在基础研究和生产实践方面越来越受到重视,如通过动物细胞培养生产出各种疗效很好的药物、灵敏度很高的诊断试剂以及其它生物制品,尤其是在病毒疫苗的生产中发挥越来越大的作用。病毒疫苗的生产,其主要的途径是通过细胞的大规模培养。而培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液,是组织细胞培养最重要的条件,培养基中的某些成分对于提高病毒表达量也有较大影响(司徒镇强,吴正军.细胞培养.西安:世界图书出版公司,2004)。
合成培养基中一般含有必需氨基酸(包括缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、半胱氨酸)和谷氨酰胺,这些都对细胞生长、病毒增殖有影响。氨基酸作为一类能够提高病毒滴度的物质,在相同的培养条件下,添加少量氨基酸便可获得更高病毒滴度的抗原液,提高了培养基的利用率。但是各种氨基酸对不同的细胞生长和各类病毒增殖起不同的作用,即起促进或抑制作用,发挥不同作用的浓度、时间和显著性也各不相同。
狂犬病是由弹状病毒科狂犬病病毒属的嗜神经病毒引起,可在所有哺乳动物中传播,通过接种或吸入传染性病毒而传染人。用来源于Pasteur氏1885株及其衍生株(Pasteur virus—PV株,CVS株、Pitman-Moore—PM株)和近期分离到的毒株(Flury株、SAD株、Vnukovo株和Kelev株)制成的疫苗可对抗迄今为止已分离的所有基因I型毒株。不论是用于人或动物的疫苗,狂犬病灭活疫苗制备的原理都一样。动物狂犬病疫苗既包括用于目标种类的弱毒活疫苗(如Flury鸡胚低代毒疫苗、Flury高代毒疫苗、SAD疫苗和Kelev疫苗等),又包括经化学或物理方法灭活疫苗及其基因重组疫苗。这些疫苗生产种子病毒可在新生动物的中枢神经组织、鸡胚或细胞培养物中繁殖。为获得安全有效的疫苗,特别是减少疫苗接种过程的副反应,获得高滴度的病毒液对于疫苗制备过程中后期精制纯化就显得非常重要。
【发明内容】
[发明目的] 本发明涉及在用于狂犬病疫苗生产的病毒培养过程中一种促进狂犬病病毒增殖的方法。氨基酸有很多种类,但不是所有种类的氨基酸对不同病毒的增殖都有促进作用,本发明的目的就是众多的氨基酸中筛选到对狂犬病病毒的增殖有促进作用的单一氨基酸、或其组合及其合适的浓度,在狂犬病疫苗制备中的病毒培养过程中利用此方法以获得高滴度病毒着手,为制备出安全有效又对接种动物无副作用的狂犬病疫苗提供保障。
[技术方案] 在狂犬病病毒细胞培养的过程中,通过将不同浓度的各种氨基酸分别添加到细胞培养的维持液中,培养结束,测定各自的狂犬病病毒的含量;在此过程中采用单一添加和正交组合法对不同浓度的多种氨基酸进行了筛选,筛选出可有效提高狂犬病病毒滴度的适当浓度的氨基酸及其组合,并在疫苗生产过程中进行验证。
【具体实施方式】
本发明是通过以下具体方法来实施的。
在狂犬病病毒细胞培养的过程中,通过将不同浓度的各种氨基酸分别添加到细胞培养的维持液中,培养结束,测定各自的狂犬病病毒的含量;再通过比较,筛选出可有效提高狂犬病病毒滴度的适当浓度的氨基酸及其组合,并在疫苗生产过程中进行验证;通过狂犬病病毒多克隆抗体免疫荧光染法、在病毒蛋白合成阶段对狂犬病病毒N蛋白免疫荧光染色及对不同组别细胞接种病毒后不同时间病毒培养液上清病毒释放的检测,探讨添加有效提高狂犬病病毒滴度的氨基酸的作用机理。
1.氨基酸的筛选
(1)狂犬病病毒的培养
1)病毒培养细胞的制备待玻璃扁瓶中BHK-21细胞(由中国兽医药品监察所提供)长成致密单层后,倒掉细胞维持液,先用5ml 0.25%的胰蛋白酶溶液清洗细胞表面,然后再加入5ml 0.25%的胰蛋白酶溶液消化细胞,待细胞聚集成团开始脱落时倒掉胰蛋白酶溶液,加入10ml细胞生长液终止消化,将消化液混合,按常规方法进行活细胞计数(朱良全.猪瘟兔化弱毒(C株)和鸡马立克火鸡疱疹病毒(HVT)氨基酸的研究[硕士学位论文].中国兽医药品监察所.2004年),加适量的细胞生长液作为细胞分散液,调节细胞密度至1×105个/ml,每个25cm2塑料细胞培养瓶中接入10ml细胞分散液并放入37℃细胞培养箱静置培养。
2)病毒培养待细胞生长至覆盖75%~80%细胞培养瓶培养平面时,倒掉细胞生长液,每瓶接种10μl生产用狂犬病病毒固定弱毒株Flury-LEP株(由中国兽医药品监察所提供)种毒(病毒的半数致死量:5.0 log LD50/0.03ml;计算方法参见:中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典,二○○五年版,三部,附录21)和0.5ml添加氨基酸的细胞维持液(简称氨基酸细胞维持液),病毒对照组加入0.5ml细胞维持液,37℃吸附1h,期间每隔15min轻轻摇动1次,吸附完毕后,加入9.5ml氨基酸细胞维持液(病毒对照组加入细胞维持液),33.5℃培养96h后收获。每一组别至少3瓶细胞。
(2)不同组别氨基酸细胞维持液的配制
取各种氨基酸配制而成的储存溶液(配制方法见以下附录1),按表1向细胞维持液中添加入不同量的氨基酸储存液,配制成不同终浓度及组别的氨基酸细胞维持液,4℃避光保存。接种病毒前,将由不同种类氨基酸配制而成的氨基酸细胞维持液用37℃水浴预热,按以上狂犬病病毒的培养方法进行病毒培养。病毒对照组以不另外添加氨基酸类物质的常规细胞维持液作为维持液(称细胞维持液)。
表1不同组别氨基酸细胞维持液的配制
(2)病毒液的收获
将培养至96h的病毒液收获,于—20℃冻存。
(3)病毒滴度的测定
病毒收获液经2次冻融后,将各组别中的3瓶病毒收获液合并为1瓶,采用小鼠脑内接种法(MIT)测定病毒滴度(实验小鼠,选用昆明系清洁级,9~11g雌性,购自北京实验动物中心)。根据检测结果确定所添加氨基酸对病毒增殖的影响。每组试验至少重复3次。并在筛选试验过程中,进行了小鼠脑内接种法(Fu ZF,Jackson AC.Neuronaldysfunction and death in rabies virus infection.J Neuro Virol,2005,11:101-106)与狂犬病病毒核蛋白快速酶联免疫法(核蛋白ELISA)和狂犬病病毒糖蛋白快速酶联免疫(糖蛋白ELISA)法(附录2)的平行关系研究,探索快速测定狂犬病病毒滴度的方法。结果表明在检测病毒收获液病毒滴度时狂犬病病毒核蛋白快速酶联免疫检测法和狂犬病病毒糖蛋白快速酶联免疫检测法都不能代替小鼠脑内接种法。本发明在检测病毒收获液病毒滴度时均用小鼠脑内接种法。
(4)对提高病毒滴度有效的氨基酸及其组合
1)添加单一氨基酸筛选试验
不同种类的氨基酸配制成不同浓度的病毒维持液进行病毒培养,收获病毒液,采用MIT检测病毒滴度,筛选出可提高狂犬病病毒滴度的氨基酸。病毒收获液病毒滴度检测结果见表2。
表2氨基酸对狂犬病病毒增殖影响试验结果
注:**表示差异极显著(P<0.01);*表示差异显著(P<0.05)
表2结果显示,病毒维持液中添加氨基酸对病毒滴度有影响,但对病毒滴度的影响作用与添加氨基酸种类及浓度有关,上述所添加氨基酸对狂犬病病毒增殖的影响依次为:R>L>P>C>E>K、S>H、D>G>N。其中以1.2mmol/L的精氨酸和0.8mmol/L的亮氨酸对病毒滴度提高的影响显著(P<0.05)。
2)氨基酸组合筛选试验
选取以上病毒滴度测定试验中所筛选出的可提高狂犬病病毒滴度的几种氨基酸,进行正交试验设计,组成多种组合。按上述方法进行细胞制备、病毒培养、添加组合物质、收获和病毒滴度测定,采用正交试验法筛选出对提高病毒滴度较为有效的一种或几组氨基酸组合。
单一氨基酸筛选试验证实,病毒维持液中添加单一氨基酸对病毒滴度有影响,其中狂犬病病毒滴度提高值大于0.2 log LD50/0.03ml的氨基酸有R、L、P和C。为对多个变量进行有效的筛选,并按因素和位级要求选择正交表L9(34),各组顺序对各因素和位级进行组合。筛选试验结果见表3。
表3氨基酸组合筛选试验结果
2.添加氨基酸的作用
在病毒吸附和脱壳阶段,通过狂犬病病毒多克隆抗体免疫荧光染色发现:添加1.2mmol/L精氨酸组和0.8mmol/L亮氨酸组接种病毒后30min即可吸附,而未添加以上氨基酸的病毒对照组和添加氨基酸组合的均在60min才可观察到荧光;添加1.2mmol/L精氨酸组和0.8mmol/L亮氨酸组接种病毒后90min时便可在细胞内观察到大量荧光,而病毒对照组、抑制剂组和氨基酸组合90min时只能观察到少量微弱荧光;添加1.2mmol/L精氨酸组和0.8mmol/L亮氨酸组接种病毒后180min时荧光变暗或消失,而病毒对照组、抑制剂组和氨基酸组合在210min时荧光才开始变暗。氨基酸组合在病毒吸附和脱壳阶段与病毒对照组相比并无明显差异。以上结果可以看出,单添加精氨酸或亮氨酸有助于病毒吸附、脱壳和转录的启动,从而加快了病毒的复制。
在病毒蛋白合成阶段,通过狂犬病病毒N蛋白免疫荧光染色发现:添加1.2mmol/L精氨酸组和0.8mmol/L亮氨酸组接种病毒后18h细胞内即可观察到荧光,21h荧光强度达到最大,而病毒对照组、抑制剂组和氨基酸组合21h细胞内开始出现荧光颗粒,24h荧光强度达到最高,并且添加1.2mmol/L精氨酸组和0.8mmol/L亮氨酸组荧光颗粒数明显多于病毒对照组、抑制剂组和氨基酸组合。说明精氨酸和亮氨酸均促进狂犬病病毒N蛋白的合成速度和合成数量,保护病毒mRNA免遭核酸酶的降解,加快了病毒的复制,为病毒合成数量的增加提供了基础。
不同组别细胞接种病毒后36h、48h、56h和60h检测病毒培养液上清中是否有病毒释放,发现添加1.2mmol/L精氨酸组和添加0.8mmol/L亮氨酸组均在接种病毒后42h培养液中即可检测到病毒,而对照组54h才能在细胞培养上清中检测到病毒。说明单添加1.2mmol/L精氨酸或添加0.8mmol/L亮氨酸促进了病毒的成熟。
【本发明的积极效果】
在狂犬病病毒培养的细胞维持液中单一添加精氨酸、亮氨酸、脯氨酸、半胱氨和酸精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的氨基酸组合可提高狂犬病病毒滴度。经多克隆荧光抗体染色结果表明,与对照组比较,精氨酸和亮氨酸组病毒吸附由60min缩短为30min,病毒穿膜由90min缩短为60min;经核蛋白单克隆荧光抗体染色结果表明,病毒核蛋白合成由21h缩短为18h;经狂犬病病毒抗原检测试剂盒检测培养液,病毒阳性检出由54h提前到42h。该方法简便有效,将对狂犬病疫苗生产产生积极效果。
实施例1
待125cm2玻璃扁瓶中BHK-21细胞长成致密单层后,倒掉细胞维持液,每瓶先用5ml0.25%的胰蛋白酶溶液清洗细胞表面,然后加入5ml 0.25%的胰蛋白酶溶液消化细胞,待细胞聚集成团开始脱落时倒掉胰蛋白酶溶液,加入10ml细胞生长液终止消化,将5瓶玻璃扁瓶消化液混合,吹打混匀,接入转瓶,补充950ml细胞生长液,置于37℃细胞培养室,8r/h旋转培养。
待3个转瓶的细胞生长至覆盖75%~80%转瓶培养面时,倒掉细胞生长液,每瓶接种5ml生产用种毒(5.0 log LD50/0.03ml)和50ml添加了精氨酸的细胞维持液(精氨酸的最终浓度为1.2mmol/L),37℃ 8r/h吸附1h,吸附完毕后,加入950ml添加了精氨酸的细胞维持液,33.5℃ 8r/h培养96h后收获并混合,按小鼠脑内接种法进行病毒滴度为6.11±0.23log LD50/0.03ml,而维持液不另外添加精氨酸的对照组病毒滴度为5.45±0.28 log LD50/0.03ml,与对照组相比病毒滴度提高值为0.66 log LD50/0.03ml。
实施例2
同实施例1一样转瓶培养的的BHK-21细胞,待3个转瓶的细胞生长至覆盖75%~80%转瓶培养面时,倒掉细胞生长液,每瓶接种5ml生产用种毒(5.0 log LD50/0.03ml)和50ml添加了亮氨酸的细胞维持液(亮氨酸的最终浓度为0.8mmol/L),37℃ 8r/h吸附1h,吸附完毕后,加入950ml添加了精氨酸的细胞维持液,33.5℃ 8r/h培养96h后收获并混合,按小鼠脑内接种法进行病毒滴度为5.98±0.19 log LD50/0.03ml,而维持液不另外添加精氨酸的对照组病毒滴度为5.45±0.28 log LD50/0.03ml,与对照组相比病毒滴度提高值为0.53 logLD50/0.03ml。
实施例3
同实施例1一样转瓶培养的的BHK-21细胞,待3个转瓶的细胞生长至覆盖75%~80%转瓶培养面时,倒掉细胞生长液,每瓶接种5ml生产用种毒(5.0 log LD50/0.03ml)和50ml添加了脯氨酸的细胞维持液(脯氨酸的最终浓度为0.16mmol/L),37℃ 8r/h吸附1h,吸附完毕后,加入950ml添加了精氨酸的细胞维持液,33.5℃ 8r/h培养96h后收获并混合,按小鼠脑内接种法进行病毒滴度为5.71±0.20 log LD50/0.03ml,而维持液不另外添加精氨酸的对照组病毒滴度为5.36±0.13 log LD50/0.03ml,与对照组相比病毒滴度提高值为0.35 logLD50/0.03ml。
实施例4
同实施例1一样转瓶培养的的BHK-21细胞,待3个转瓶的细胞生长至覆盖75%~80%转瓶培养面时,倒掉细胞生长液,每瓶接种5ml生产用种毒(5.0 log LD50/0.03ml)和50ml添加了半胱氨酸的细胞维持液(半胱氨酸的最终浓度为0.1mmol/L),37℃ 8r/h吸附1h,吸附完毕后,加入950ml添加了精氨酸的细胞维持液,33.5℃ 8r/h培养96h后收获并混合,按小鼠脑内接种法进行病毒滴度为5.98±0.23 log LD50/0.03ml,而维持液不另外添加精氨酸的对照组病毒滴度为5.45±0.28 log LD50/0.03ml,与对照组相比病毒滴度提高值为0.24 logLD50/0.03ml。
实施例5
同实施例1一样转瓶培养的的BHK-21细胞,待3个转瓶的细胞生长至覆盖75%~80%转瓶培养面时,倒掉细胞生长液,每瓶接种5ml生产用种毒(5.0 log LD50/0.03ml)和50ml添加了氨基酸组合的细胞维持液(精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的最终浓度分别为0.6mmol/L、0.8mmol/L、0.16mmol/L和0.1mmol/L),37℃ 8r/h吸附1h,吸附完毕后,加入950ml添加了氨基酸组合的细胞维持液,33.5℃ 8r/h培养96h后收获并混合,按小鼠脑内接种法进行病毒滴度为5.80±0.20 log LD50/0.03ml,而维持液不另外添加氨基酸的对照组病毒滴度为5.45±0.28 log LD50/0.03ml,与对照组相比病毒滴度提高值为0.33 logLD50/0.03ml。
实施例6
同实施例1一样转瓶培养的的BHK-21细胞,待3个转瓶的细胞生长至覆盖75%~80%转瓶培养面时,倒掉细胞生长液,每瓶接种5ml生产用种毒(5.0 log LD50/0.03ml)和50ml添加了氨基酸组合的细胞维持液(精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的最终浓度分别为0.6mmol/L、1.6mmol/L、0.32mmol/L和0.2mmol/L),37℃ 8r/h吸附1h,吸附完毕后,加入950ml添加了氨基酸组合的细胞维持液,33.5℃ 8r/h培养96h后收获并混合,按小鼠脑内接种法进行病毒滴度为5.69±0.23 log LD50/0.03ml,而维持液不另外添加氨基酸的对照组病毒滴度为5.45±0.28 log LD50/0.03ml,与对照组相比病毒滴度提高值为0.24 logLD50/0.03ml。
实施例7
同实施例1一样转瓶培养的的BHK-21细胞,待3个转瓶的细胞生长至覆盖75%~80%转瓶培养面时,倒掉细胞生长液,每瓶接种5ml生产用种毒(5.0 log LD50/0.03ml)和50ml添加了氨基酸组合的细胞维持液(精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的最终浓度分别为2.4mmol/L、1.6mmol/L、0.32mmol/L和0.05mmol/L),37℃ 8r/h吸附1h,吸附完毕后,加入950ml添加了氨基酸组合的细胞维持液,33.5℃ 8r/h培养96h后收获并混合,按小鼠脑内接种法进行病毒滴度为5.89 log LD50/0.03ml,而维持液不另外添加氨基酸的对照组病毒滴度为5.63 log LD50/0.03ml,与对照组相比病毒滴度提高值为0.26 log LD50/0.03ml。
附录1氨基酸储存溶液的配制方法
(1)40mmol/L亮氨酸储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和0.524g亮氨酸,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(2)60mmol/L精氨酸储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和1.046g精氨酸,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(3)36mmol/L丝氨酸储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和0.378g丝氨酸,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(4)24mmol/L谷氨酸储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和0.3528g谷氨酸,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(5)36mmol/L甘氨酸储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和0.524g甘氨酸,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(6)20mmol/L天冬氨酸储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和0.2672g天冬氨酸,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(7)40mmol/L苏氨酸储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和0.476g苏氨酸,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(8)40mmol/L赖氨酸储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和0.73g赖氨酸HCL,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(9)16mmol/L脯氨酸储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和0.184g脯氨酸,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(10)20mmol/L组氨酸储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和0.524g组氨酸,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(11)10mmol/L半胱氨酸储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和0.121g半胱氨酸,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(12)200mmol/L谷氨酰胺储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和2.92g谷氨酰胺,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(13)100mmol/L丙酮酸钠储存溶液:称取0.96g MEM粉剂和1.10g谷氨酰胺,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
以上各种氨基酸及丙酮酸钠等均为细胞培养级试剂,纯度≥99.99%,均购自Applichem公司。MEM培养基购自GIBCO公司。
附录2狂犬病病毒病毒滴度的测定方法
(1)小鼠脑内接种法(MIT):将合并后病毒收获液用pH 7.2的PBS作10倍系列稀释,取10-4、10-5和10-63个稀释度,每个稀释度接种6只小鼠,每只小鼠脑内接种0.03ml。接种所用各稀释度病毒液需冰浴放置。接种后连续观察14天,记录小鼠死亡数量,前3天死亡小鼠不计算在内。按Reed-Muench氏法计算半数致死量(LD50)。
(2)狂犬病病毒核蛋白快速酶联免疫法(核蛋白ELISA):将合并后病毒收获液用pH7.2PBS作10倍系列稀释,取10-2和10-32个稀释度,用狂犬病病毒抗原酶联免疫吸附检测试剂盒对病毒含量进行检测,各稀释度均设双孔测定。具体操作见狂犬病病毒核蛋白检测试剂盒(购自武汉生物制品研究所)说明书。
(3)狂犬病病毒糖蛋白快速酶联免疫法(糖蛋白ELISA):将合并后病毒收获液用pH7.2PBS作10倍稀释(即10-1),用狂犬病效力检测试剂盒对病毒含量进行检测,检测样品设双孔重复。具体操作见狂犬病疫苗效力检测试剂盒(购自武汉生物制品研究所)说明书。
附录3细胞培养液的配制
(1)10×MEM储存液:称取480gMEM粉剂,完全溶解于5000ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(2)7.5%碳酸氢钠溶液:称取7.5g碳酸氢钠,溶于100ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(3)双抗溶液:400万单位青霉素和400万单位链霉素溶于80ml去离子水中,过滤除菌,—20℃冷冻保存。
(4)细胞生长液的配制:分别量取578ml去离子水、75ml 10×MEM储存液、1.5ml双抗溶液、1ml 5.5%丙酮酸钠、20ml 7.5%碳酸氢钠溶液和75ml血清,装于1000ml灭菌玻璃瓶中,4℃避光保存。
(5)细胞维持液的配制:分别量取594.1ml去离子水、70ml 10×MEM储存液、1.4ml双抗溶液、1ml 5.5%丙酮酸钠、15ml 7.5%碳酸氢钠溶液和14ml血清,装于1000ml灭菌玻璃瓶中,4℃避光保存。
Claims (3)
1.一种促进狂犬病病毒增殖的方法,其特征在于在狂犬病病毒细胞培养的过程中,在细胞培养维持液中添加最终浓度分别为0.6mmol/L、0.8mmol/L、0.16mmol/L和0.1mmol/L的精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的氨基酸组合。
2.如权利要求1所述的一种促进狂犬病病毒增殖的方法,其特征在于在狂犬病病毒细胞培养的过程中,在细胞培养维持液中添加最终浓度分别为0.6mmol/L、1.6mmol/L、0.32mmol/L和0.2mmol/L的精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的氨基酸组合。
3.如权利要求1所述的一种促进狂犬病病毒增殖的方法,其特征在于在狂犬病病毒细胞培养的过程中,在细胞培养维持液中添加最终浓度分别为2.4mmol/L、1.6mmol/L、0.32mmol/L和0.05mmol/L的精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的氨基酸组合。
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2008
- 2008-11-26 CN CN 200810227225 patent/CN101407788B/zh active Active
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