JP2022539511A - ウイルスの生産方法及び採取用溶液組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ウイルスの生産方法及び採取用溶液組成物を提供する。当該方法は以下の工程を含む：細胞を培養する工程であって、該細胞がウイルスを接種されているか、又はウイルスパッケージング要素をトランスフェクトされている工程；及び、培養細胞を採取用溶液組成物と接触させて、ウイルスをワンステップで採取する工程であって、該採取用溶液組成物が、トリプシン、ｐＨ緩衝液、及び任意にヌクレアーゼを含み、且つ、該採取用溶液組成物のｐＨが７．５超１０．５以下の範囲である工程。本発明のウイルスの生産方法は、操作が簡単、スケールアップが容易、収量が安定している等の利点を有し、従来技術に比べ、収量が予想外に著しく改善される。またウイルスの生物活性を損なわずに、ウイルス粒子の完全性を担保することができる。そのため、ウイルスの大量生産に非常に適している。

Description

本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、特に、ウイルスの生産方法及び採取用溶液組成物に関する。より具体的には、本発明は、細胞を培養してウイルスを生産する方法、及び細胞培養に供されたウイルスを採取するための採取用溶液組成物に関する。

腫瘍溶解性ウイルス薬、ウイルスワクチン又は組換えウイルスベクターなどのウイルス生物学的製剤の調製は、通常、以下を含む：適切な世代の非感染細胞にウイルスを接種すること；感染細胞がある程度の細胞障害を示した時点で感染細胞を採取すること；細胞を様々な方法で溶解してウイルスを採取すること；次いで、密度勾配遠心分離又はクロマトグラフィーによってウイルスを精製してウイルス原液を得ること；一定量の緩衝液を加えて半製品を得ること；及び、半製品を凍結乾燥又は分注して完成品を得ること。

現在、ウイルス生物学的製剤を生産するための細胞の大量培養には、主にセルファクトリー又は培養槽が導入されている。増幅したウイルスの多くは細胞内に存在する。そのため、ウイルスの採取工程では、細胞を効果的に破砕及び溶解してウイルスを放出させ、ウイルス粒子の完全性を担保する必要がある。しかし、採取工程の違いにより、細胞の溶解及びウイルス粒子の完全性に与える影響が異なる。採取方法はウイルス力価に直接影響し、採取したウイルス原液の効果的な高い力価は、最終製品の品質に影響を与える重要な要素である。

ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、及びアデノウイルスは細胞内ウイルスに属し、細胞への結合活性が強いため、ウイルスの採取時には細胞を収集して溶解し、遊離ウイルス粒子を得る必要がある。現在、レンチウイルス、レトロウイルス、及びアデノウイルス関連ウイルスをベースにした組換えウイルスベクターについては、実際のパッケージングや生産工程において細胞外の遊離ウイルスのみが採取され、大量の細胞内のウイルスが十分に利用されていない。

現在、これらのウイルスの大量生産では、細胞を溶解して細胞内のウイルスを採取する凍結融解法が用いられている。しかし、凍結融解法は、消費エネルギーが大きい、過程が長い、工程が多い、スケールアップが難しい、収量が不安定などの欠点があり、ウイルス生物学的製剤の生産規模を制限する。また、細胞内のウイルスを採取する方法として、低張法又は化学溶解法があるが、細胞膜に結合したウイルスの多くが十分に放出されず、多くの化学溶解剤がエンベロープウイルス（ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルスなど）のエンベロープを破壊し、ウイルスの生物活性を喪失させる。

したがって、細胞培養によりウイルスを効率的に生産できる方法、及び細胞培養に供されたウイルスを効率的に採取できる採取用溶液が依然として必要とされている。これは、高品質のウイルスワクチン及び組換えウイルスベクターなどの製品を得るために必要不可欠である。

従来技術における上記課題の１つ以上を解決するために、本発明は、ウイルスの生産方法及び採取用溶液組成物を提供する。

具体的には、本発明は以下を提供する：
（１）ウイルスの生産方法であって、以下を含む方法：
細胞を培養する工程であって、該細胞がウイルスを接種されているか、又はウイルスパッケージング要素をトランスフェクトされている工程；及び
培養細胞を採取用溶液組成物と接触させて、ウイルスをワンステップで採取する工程であって、該採取用溶液組成物が、トリプシン、ｐＨ緩衝液、及び任意にヌクレアーゼを含み、該採取用溶液組成物のｐＨが７．５超１０．５以下の範囲である工程。

（２）採取用溶液組成物中のトリプシンの濃度が、０．０１～０．１２％（ｗ／ｖ）の範囲、好ましくは０．０３～０．０６％（ｗ／ｖ）の範囲である、（１）に記載の方法。

（３）採取用溶液組成物中のヌクレアーゼの濃度が、１～１００ＩＵ／ｍｌの範囲、好ましくは１～５０ＩＵ／ｍｌの範囲、より好ましくは１～５ＩＵ／ｍｌの範囲である、（１）又は（２）に記載の方法。

（４）採取用溶液組成物の浸透圧が、０～５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ又は８００～２５００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲、好ましくは０～２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ又は１７８５～２０００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲、より好ましくは１～２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲である、（１）～（３）のいずれか一つに記載の方法。

（５）採取用溶液組成物のｐＨが、８．５～９．５の範囲である、（１）～（４）のいずれか一つに記載の方法。

（６）ｐＨ緩衝液が、Ｔｒｉｓ緩衝液及び重炭酸ナトリウム緩衝液から選択される、（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法。

（７）培養が、セルフラスコ、セルファクトリー又は培養槽で行われ、培養が、付着培養及び懸濁培養を含む、（１）～（６）のいずれか一つに記載の方法。

（８）培養が付着培養である場合、採取用溶液組成物の量が、３５μｌ以上の採取用溶液組成物／ｃｍ^２の細胞、好ましくは７０μｌ以上の採取用溶液組成物／ｃｍ^２の細胞の範囲であり、培養が懸濁培養である場合、採取用溶液組成物の量が、３５μｌ以上の採取用溶液組成物／１０^５細胞、好ましくは７０μｌ以上の採取用溶液組成物／１０^５細胞の範囲である、（１）～（７）のいずれか一つに記載の方法。

（９）培養細胞を採取用溶液組成物に５～６０分の時間範囲で接触させる、（１）～（８）のいずれか一つに記載の方法。

（１０）細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、２９３細胞、ＣＥＦ細胞、及びＨｅＬａ細胞から選択される、（１）～（９）のいずれか一つに記載の方法。

（１１）ウイルスが、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ロタウイルス、ＥＶ７１ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、麻疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、セネカバレーウイルス、エコーエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、及びマラバウイルスを含み、好ましくはエンベロープウイルスである、（１）～（１０）のいずれか一つに記載の方法。

（１２）細胞が２９３細胞であり、ウイルスがワクシニアウイルスである、（１）～（１１）のいずれか一つに記載の方法。

（１３）採取用溶液組成物が、Ｔｒｉｓ緩衝液、トリプシン及びヌクレアーゼを含み、Ｔｒｉｓ緩衝液の濃度が１～５０ｍＭの範囲、好ましくは１～１０ｍＭの範囲である、（１）～（５）及び（７）～（１２）のいずれか一つに記載の方法。

（１４）細胞培養に供されたウイルスを採取するための採取用溶液組成物であって、該採取用溶液組成物が、トリプシン、ｐＨ緩衝液、及び任意にヌクレアーゼを含み、該採取用溶液組成物のｐＨが、７．５超１０．５以下の範囲である採取用溶液組成物。

（１５）採取用溶液組成物中のトリプシンの濃度が、０．０１～０．１２％（ｗ／ｖ）の範囲、好ましくは０．０３～０．０６％（ｗ／ｖ）の範囲である、（１４）に記載の採取用溶液組成物。

（１６）採取用溶液組成物中のヌクレアーゼの濃度が、１～１００ＩＵ／ｍｌの範囲、好ましくは１～５０ＩＵ／ｍｌの範囲、より好ましくは１～５ＩＵ／ｍｌの範囲である、（１４）又は（１５）に記載の採取用溶液組成物。

（１７）採取用溶液組成物の浸透圧が、０～５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ又は８００～２５００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であり、好ましくは０～２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ又は１７８５～２０００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であり、より好ましくは１～２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲である、（１４）～（１６）のいずれか一つに記載の採取用溶液組成物。

（１８）採取用溶液組成物のｐＨが、８．５～９．５の範囲である、（１４）～（１７）のいずれか一つに記載の採取用溶液組成物。

（１９）ｐＨ緩衝液が、Ｔｒｉｓ緩衝液及び重炭酸ナトリウム緩衝液から選択される、（１４）～（１８）のいずれか一つに記載の採取用溶液組成物。

（２０）培養が、セルフラスコ、セルファクトリー又は培養槽で行われ、培養が付着培養及び懸濁培養を含む、（１４）～（１９）のいずれか一つに記載の採取用溶液組成物。

（２１）細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、２９３細胞、ＣＥＦ細胞、及びＨｅＬａ細胞から選択される、（１４）～（２０）のいずれか一つに記載の採取用溶液組成物。

（２２）ウイルスが、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ロタウイルス、ＥＶ７１ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、麻疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、セネカバレーウイルス、エコーエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、及びマラバウイルスを含み、好ましくはエンベロープウイルスである、（１４）～（２１）のいずれか一つに記載の採液用組成物。

（２３）細胞が２９３細胞であり、ウイルスがワクシニアウイルスである、（１４）～（２２）のいずれか一つに記載の採取用溶液組成物。

（２４）採取用溶液組成物が、Ｔｒｉｓ緩衝液、トリプシン、及びヌクレアーゼを含み、Ｔｒｉｓ緩衝液の濃度が１～５０ｍＭの範囲であり、好ましくは１～１０ｍＭの範囲である、（１４）～（１８）及び（２０）～（２３）のいずれか一つに記載の採取用溶液組成物。

従来技術と比較して、本発明は、以下の利点と好ましい効果を有する：

最初に、本発明は、本発明のウイルスの生産方法において、培養細胞を本発明の採取液組成物に接触させることにより、ウイルスをワンステップで採取することができる、ウイルスの生産のためのワンステップ採取方法を提案する。本発明者らは、広範な研究により本発明の採取用溶液組成物を得た。この採取用溶液組成物は、凍結融解、超音波、機械的破砕等の他の細胞溶解方法又は工程を必要とせず、細胞を完全に溶解してウイルスを採取することができる。

本発明のウイルスの生産方法は、操作が簡単、スケールアップが容易、収量が安定している等の利点を有し、従来技術に比べ、収量が予想外に著しく改善される。さらに、ウイルスの生物活性を損なわずに、ウイルス粒子の完全性を担保することができる。そのため、ウイルスの大量生産に非常に適している。

大量生産において、本発明の方法及び採取用溶液組成物を用いることにより、生産工程を大幅に簡略化することができ、生産コストを低減することができ、高活性のウイルス製品を高濃度かつ高純度で得ることができる。

図１は、本発明の一実施形態において、様々な処理液を用いたウイルスの採取の結果を示す図である。横軸は様々な群を表し、縦軸は単位面積当たりの平均収量（ｐｆｕ／ｃｍ^２）を表す。

［好ましい実施形態の詳細な説明］
以下に、添付図面を参照しながら具体的な実施形態の詳細な説明により本発明をさらに説明するが、これらは本発明を限定するものではない。当業者は、本発明の基本的な思想に基づき、様々な変更又は改良を行うことができる。これらは、本発明の基本的な思想から逸脱しない限り、本発明の範囲に含まれることが意図される。

本発明のウイルスの生産方法は、以下を含む：細胞を培養する工程であって、該細胞が、ウイルスを接種されているか、又はウイルスパッケージング要素をトランスフェクトされている細胞である工程；及び、培養細胞を本発明の採取用溶液組成物と接触させて、ウイルスをワンステップで採取する工程。本発明の採取用溶液組成物は、トリプシン、ｐＨ緩衝液、及び任意にヌクレアーゼを含み、該採取用溶液組成物のｐＨが７．５超１０．５以下の範囲である。

本明細書で使用する「ウイルスパッケージング要素」は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス関連ウイルスなどをパッケージングするために組換えウイルスベクターが必要とするシス作用要素及びトランス作用要素を意味する。

本明細書で用いる「ワンステップでウイルスを採取する」は、培養細胞を本発明の採取用溶液組成物に接触させた場合、凍結融解、超音波、機械的破砕等の他の細胞溶解方法又は工程を行う必要なく、採取用溶液組成物が細胞を完全に溶解してウイルスを採取できることを意味する。

本発明者らは、先行技術の低張緩衝液を単に使用しただけでは、ワンステップでウイルスを採取する目的を達成できず、依然としてウイルス収量が低いことを見出した。本発明の発明者らは、予期せぬことに、本発明の採取用溶液組成物を用いた場合、ウイルスをワンステップで採取することができ、ウイルス収量が著しく向上することを見出した。先行技術の方法と比較して、本発明によって得られるウイルス収量は、５倍以上増加させることができる。

採取用溶液組成物において、トリプシンの濃度は、０．０１～０．１２％（％は質量体積比（ｗ／ｖ）、すなわち、採取用溶液組成物１００ｍｌに含まれるトリプシンのグラム数は０．０１～０．１２ｇ）の範囲とすることができ、例えば、０．０３、０．０５、０．０７、０．０９、０．１１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０３～０．０６％（ｗ／ｖ）の範囲である。トリプシンは市販のものでもよく、動物に由来する従来のトリプシンであってもよいし、組換えトリプシンであってもよい。

採取用溶液組成物において、ヌクレアーゼを含む場合、ヌクレアーゼの濃度は、１～１００ＩＵ／ｍｌの範囲とすることができ、例えば、１、３、５、１０、２０、４０、６０、８０ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１～５０ＩＵ／ｍｌの範囲、より好ましくは１～５ＩＵ／ｍｌの範囲である。ヌクレアーゼを作用させるために、一定濃度のＭｇ^２＋（例えば、１～１０ｍＭ Ｍｇ^２＋、好ましくは１～２ｍＭ Ｍｇ^２＋；例えば、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）を添加することができる。

採取用溶液組成物の浸透圧は、０～５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ（例えば、１、５、１０、１５、３０、４５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）又は８００～２５００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ（例えば、１０００、１２５０、１５００、１７００、１９００、２１００、２３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）の範囲とすることができる。好ましくは、採取用溶液組成物の浸透圧は、０～２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ又は１７８５～２０００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であり、より好ましくは１～２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であり、さらに好ましくは１～１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲である。

採取用溶液組成物のｐＨはアルカリ性であり、より具体的には７．５超１０．５以下であり、例えば、７．６、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５であり、好ましくは８．５～９．５である。採取用溶液組成物のｐＨが７．５以下の場合、細胞を完全に溶解することができず、ウイルス収量が少なくなる。採取用溶液組成物のｐＨが１０．５超の場合、ウイルス活性に影響が出る。

採取用溶液組成物のｐＨ緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液及び重炭酸ナトリウム緩衝液から選択することができ、好ましくはＴｒｉｓ緩衝液である。

一実施形態において、本発明の採取用溶液組成物は、Ｔｒｉｓ緩衝液、トリプシン、及びヌクレアーゼを含む。Ｔｒｉｓ緩衝液の濃度は、１～５０ｍＭとすることができ、例えば、１、３、５、８、１０、２０、３０、４０ｍＭであり、好ましくは１～１０ｍＭである。

本発明の方法において、細胞を付着培養する場合、採取用溶液組成物の量は、３５μｌ以上の採取用溶液組成物／ｃｍ^２の細胞、好ましくは、７０μｌ以上の採取用溶液組成物／ｃｍ^２の細胞、例えば、７５、１００、１２５、１５０、２００μｌの採取用溶液組成物／ｃｍ^２の細胞であってもよい。ここで、「平方センチメートルの細胞（ｃｍ^２の細胞）」なる用語は、１平方センチメートルに増殖した全ての接着細胞の総和を意味する。細胞を懸濁培養する場合、採取用溶液組成物の量は、３５μｌ以上の採取用溶液組成物／１０^５細胞、好ましくは、７０μｌ以上の採取用溶液組成物／１０^５細胞、例えば、７５、１００、１２５、１５０、２００μｌの採取用溶液組成物／１０^５細胞とすることができる。

本発明において、培養細胞と採取用溶液組成物との接触時間は、通常６０分以下であり、通常５～６０分（例えば、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分）の接触時間内で細胞を完全に溶解させることができる。細胞の溶解は、顕微鏡で観察することができる。顕微鏡で無傷の細胞が観察されない場合、細胞は完全に溶解したと判断される。

本発明において、ウイルス又はウイルスのパッケージの接種、及び細胞培養は、当技術分野における通常の方法で実施することができる。ウイルスの接種量は、０．００１～０．２ＭＯＩ、例えば、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０８、０．１、０．１５ＭＯＩとすることができる。本明細書で使用する場合、用語「ＭＯＩ」又は「感染多重度」は、ウイルスの数と細胞の数の間の比率であり、ウイルス感染を起こす各細胞によって感染したウイルスの数を意味する。ＭＯＩ＝ｐｆｕ／細胞、すなわち、細胞数×ＭＯＩ＝全ＰＦＵである。

本発明において、細胞培養は、例えば、セルフラスコ（規模は２５～２２５ｃｍ^２の細胞／フラスコ）、セルファクトリー（規模は５００～８００ｃｍ^２の細胞／段、例えば６３２ｃｍ^２の細胞／段とすることができる）、又は培養槽（規模は０．５～５００ｃｍ^２の細胞／培養槽）で行うことができ、培養には付着培養と浮遊培養が含まれる。培地は、ＤＭＥＭ培地やＭＥＭ培地など、当技術分野で一般的に使用されているものとすることができる。本発明の方法は、培養細胞を採取用溶液組成物と接触させる前に、培養細胞を培地から分離する工程をさらに含むことができる。さらに、採取したウイルスは、タンジェンシャルフロー遠心分離及び／又はカラムクロマトグラフィーによってさらに精製することができる。

本発明で使用できる細胞としては、以下が挙げられる（ただし、これらに限定されない）：Ｖｅｒｏ細胞、２９３細胞、ＣＥＦ細胞（すなわち、ニワトリ胚線維芽細胞）及びＨｅＬａ細胞。

Ｖｅｒｏ細胞株は、千葉大学（日本）のＹ.ヤスムラとＹ.カワキタによって、正常なアフリカミドリザル成体の腎臓から樹立された。この細胞はアンカレッジ依存性の繊維芽細胞であり、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、日本脳炎ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルスなど、さまざまなウイルスの増殖をサポートすることができる。ＷＨＯは、Ｖｅｒｏ細胞は１５０世代以内の使用は安全であると考えており、それは非腫瘍形成性で、ヒト用のウイルスワクチン製造に承認されている。

２９３細胞株は、アデノウイルス５型（Ａｄ５）の７５株で形質転換し、Ａｄ５のＥ１領域を含むヒト胚性腎臓低三倍体細胞株であり、Ｅ１領域の欠損に相補的な細胞株である。１９７６年にカナダのマクマスター大学のＦ．Ｌ．ＧｒａｈａｍとＪ．Ｓ．ＭｉｌｅｙによってＤＮＡトランスフェクション技術を利用して構築された。２９３細胞には、ＨＥＫ２９３、Ａｄ２９３、２９３Ｔ／１７、ＡＡＶ－２９３など多くの誘導株が存在する。２９３細胞株は、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルスの生産、遺伝子発現、タンパク質発現に広く利用されている。

ニワトリ胚細胞は、組織培養で使用される最も初期の対象である。組織培養の研究者は、ニワトリ胚を使って多くの研究を行ってきた。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）は簡便に得ることができ、簡単に調製することができ、良好な耐性を有し、多くのウイルスの増殖と繁殖に適している。

そのため、ワクチンの製造、ウイルスの培養、及び細胞と分子生物学の研究などに広く利用されている（例えば、下記参考文献参照：Ｍｅｉｓｅｒ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＷＲ，ＩＨＤ－Ｊ ａｎｄ ＭＶＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ（ワクシニアウイルスのＷＲ株、ＩＨＤ－Ｊ株、ＭＶＡ株を感染させたニワトリ胚線維芽細胞におけるウイルス生産の比較）：ＩＨＤ－Ｊ ｉｓ ｍｏｓｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｔｒａｎｓ－Ｇｏｌｇｉ ｎｅｔｗｏｒｋ ｗｒａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ．（ＩＨＤ－Ｊは、トランスゴルジ網のラッピングと細胞外エンベロープウイルス放出において最も効率的である。）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，２００３，８４（Ｐｔ ６）：ｐ．１３８３－９２）

ＨｅＬａ細胞は、ヒトの組織から継代培養によって得られた最初の異数性上皮様細胞株である。１９５１年に、Ｇ．Ｏ．Ｇｅｙらによって、３１歳の黒人女性の子宮頸がん組織から樹立された。他の癌細胞株と比較して、この細胞株は増殖が極めて速く、ポリオウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスなどに感受性が高く、明らかな細胞変性を示し、ウイルス研究と生産において大きな価値がある。また、腫瘍研究、生物学的実験、細胞培養などにも広く利用されている。

本発明により生産可能なウイルスとしては、以下のものが挙げられる（ただし、これらに限定されない）：ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ロタウイルス、ＥＶ７１ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、麻疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス。水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、セネカバレーウイルス、エコーエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マラバウイルス。また、エンベロープウイルスが好ましい。例えば、エンベロープウイルスとしては、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ロタウイルス、ＥＶ７１ウイルス、コクサッキーウイルス（ＣＡ１６ウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルスが挙げられる。

本発明により生産可能なウイルスには、腫瘍細胞に選択的に複製することができる腫瘍溶解性ウイルスが含まれる。本発明の腫瘍溶解性ウイルスには、腫瘍溶解効果を有する遺伝子変異ウイルスと腫瘍溶解効果を有する野生型ウイルスが含まれる。腫瘍溶解効果を有する遺伝子変異ウイルスとしては、以下のものが挙げられる（ただし、これらに限定されない）：アデノウイルス、ポックス・ウイルス（ワクシニアウイルスとしても公知）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス及びレトロウイルス。腫瘍溶解効果を有する野生型ウイルスとしては、以下のものが挙げられる（ただし、これらに限定されない）：レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、セネカバレーウイルス、エコーエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス及びマラバウイルス。

前記腫瘍溶解性ウイルスのゲノムには外来遺伝子を組み込むことができる。外来遺伝子としては、外来免疫制御遺伝子、外来スクリーニング遺伝子、外来レポーター遺伝子等が挙げられる。前記腫瘍溶解性ウイルスのゲノムは、任意の外来遺伝子を組み込まない場合がある。

ワクシニアウイルス（ＶＶと略される；ポックス・ウイルスとしても公知）は、ポックス・ウイルス科に属し、人類の感染症や病気との戦いの歴史において重要な役割を担っている。１９８０年よりも前は、ワクシニアウイルスが主に天然痘ワクチンとして広く使用され、そして最終的に世界中で天然痘ウイルスを完全に駆逐した。ワクシニアウイルスにおいて外来遺伝子の発現に成功したことと、集団におけるワクチン接種の安全性の高さが相まって、徐々にワクシニアウイルスは、遺伝子発現ベクター、予防と治療用ワクチンベクター、免疫療法用ベクターなどとして開発されるようになった。

その感染段階の違いにより、ワクシニアウイルスの生涯には４つの異なる感染形態がある：細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープウイルス（ＩＥＶ）、細胞質エンベロープウイルス（ＣＥＶ）、及び細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）。大部分のワクシニアウイルス株（ＷＲ株、コペンハーゲン株、アンカラ株、天壇株など）では、ＩＭＶが全子孫ウイルスの９０％超を占めている。これらのウイルスは、ウイルス工場で組み立てられた後、細胞内に留まり、細胞が溶解されるまで細胞外に放出されない。

腫瘍溶解性ワクシニアウイルスには、以下が含まれる（ただし、これらに限定されない）：Ｐｅｘａ－ｖａｃ（Ｊｅｎｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、ＪＸ－９６３（Ｊｅｎｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、ＪＸ－９２９（Ｊｅｎｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、ＶＳＣ２０（調製方法は科学文献に見出すことができる：「ＭｃＣａｒｔ，ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａ ｔｕｍｏｒ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｍｕｔａｎｔ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００１）６１：８７５１－８７５７」）、ＧＬ－ＯＮＣ１（Ｇｅｎｅｌｕｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）、ＴＧ６００２（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）、ＤＤｖｖ－ＩＬ２１（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／０６２２３４Ａ１参照）等。

水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は、αヘルペスウイルス亜科に属する、二本鎖ＤＮＡウイルスである。その一次感染は水痘である。潜伏感染したものが再活性化すると、帯状疱疹を引き起こす。ＶＺＶによる水痘及び帯状疱疹の予防には、ワクチン接種が最も有効な方法である。現在までに、ＶＺＶによる疾患の予防が承認されているワクチンは、弱毒性水痘生ワクチン（Ｏｋａ株）のみである。このワクチンの予防接種が、ＶＺＶによる水痘の予防に最も効果的な方法であると認められている。

単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ヘルペスウイルス科のαウイルス亜科に属する。現在、抗原性の違いにより、このウイルスは１型と２型に分類されている。単純ヘルペスウイルスは、ヒトの細胞を宿主細胞として使用することができ、幅広い種類のヒト細胞に感染できること、抗ヘルペス薬で偶発的な増殖を阻止できること、増殖期及び潜伏期に宿主細胞ゲノムに組み込まれず、挿入変異のリスクが低いという利点を有する。それは、腫瘍又は神経系の変性疾患などの遺伝子治療に広く用いられている。ＨＳＶは溶解経路を有し、主に細胞内に存在する。

腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスとしては、以下が挙げられる（ただし、これらに限定されない）：ＨＳＶ－１単純ヘルペスウイルス、ＨＳＶ－２単純ヘルペスウイルス；具体的には（例えば）、以下が挙げられる：Ｉｍｌｙｇｉｃ（商標）（Ａｍｇｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、Ｇ２０７（Ｍｅｄｉｇｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、ＨＦ１０（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、Ｓｅｐｒｅｈｖｉｒ（Ｖｉｒｔｔｕ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、Ｏｒｉｅｎ Ｘ０１０（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｏｒｉｅｎｇｅｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、ＮＶ１０２０（Ｃａｔｈｅｒａｘ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）等。

レンチウイルス（ＬＶ）はレトロウイルス科に属し、ＲＮＡウイルスである。レンチウイルスの全体の大きさは約１００ナノメートルである。それは、例えば下記の利点を有する：遺伝子断片の運搬能力が大きい、トランスフェクション効率が高い、宿主の範囲が広い、及び、発現が長期間安定である。現在では、それは標的遺伝子を導入するための理想的なベクターとなり、臨床治療に利用されており、ＣＡＲ－Ｔ細胞の構築に用いられる一般的なウイルスの一つである。合衆国で販売されているＣＤ１９を標的とした２つのＣＡＲ－Ｔ薬剤、すなわちＫｙｍｒｉａｈ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社から入手可能）とＹｅｓｃａｒｔａ（Ｋａｔｅ社から入手可能）は、ベクターとしてレンチウイルスを使用している。

１回の遺伝子治療には１．０Ｅ＋１２ＴＵのウイルスの総量が必要なので、レンチウイルスのパッケージングと生産レベルの向上は、レンチウイルスを介した遺伝子治療の発展を効果的に促進することができる。

現在、レンチウイルスの生産は、プラスミドを細胞マトリックスに一時的にトランスフェクションし、限られた数のパッケージングされたウイルスを生産する方法で行われている。一般的な構築方法は、以下を含む：ウイルスのパッケージングに必要な３つのタンパク質Ｇａｇ／Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、ＶＳＶ－Ｇ（ＨＩＶ－１のＥｎｖの代替）をそれぞれ３つのプラスミドに別々に載せ、プラスミドｐＬｅｎｔｉ－ｇｅｎｅ上に標的遺伝子のベクターを構築すること；及び、次に、４つのプラスミドを比例させて宿主細胞に共導入すること；及び、培養後の上清を回収し、ウイルスを精製すること。

レトロウイルスは一本鎖のＲＮＡウイルスである。レトロウイルスのゲノムは約１０Ｋｂであり、５’から３’にＧａｇ（ウイルスのコアタンパク質をコードしている）、Ｐｏｌ（逆転写酵素）、及びＥｎｖ（ウイルス粒子表面のエンベロープ糖タンパク質）の３つの重要な遺伝子を含む。さらに、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）とパッケージングシグナル（ψ）シス作用要素を含む。

レトロウイルスの生産には、大抵、プラスミドを用いた細胞基質へのトランスフェクション、安定な毒素産生細胞株の構築とスクリーニングが含まれる。レトロウイルスベクターの組み込み部位は、通常、染色体のオープン領域と転写活性領域に位置し、外来性の標的遺伝子を効率的に発現する細胞株を得る可能性が非常に高くなる。さらに、レトロウイルスはＣＡＲ－Ｔ細胞構築のための一般的なウイルスベクターの一つでもある。

アデノウイルス（ＡｄＶ）はエンベロープを持たない球状の粒子で、そのＤＮＡは線状の二本鎖の形状で存在している。アデノウイルスはエンベロープを有さず、ヌクレオカプシドの直径は７０～８０ナノメートルであり、正二十面体で、３次元的な対称性を有する。アデノウイルスは比較的安全なベクターである。人口の５０％超がＡｄ５に対する抗体を持っている。

その利点（例えば、遺伝子導入効率が高い、幅広い種類の細胞への導入、調製と精製が容易、及び、宿主細胞ゲノムに組み込まれず宿主細胞に入った後に一過性に発現するのみ）から、アデノウイルスは、遺伝子治療、遺伝子免疫、ワクチン調製の分野でますます重要となり、ワクチン開発、免疫療法、遺伝子治療などの様々な分野で広く利用されている。

腫瘍溶解性アデノウイルスとしては、以下が挙げられる（ただし、これらに限定されない）：ヒトアデノウイルス５型又はヒトキメラアデノウイルス；具体的には（例えば）以下が挙げられる：Ｏｎｙｘ－０１５（Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、Ｈ１０１（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｕｎｗａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、Ａｄ５－ｙＣＤ／ｍｕｔＴＫＳＲ３９ｒｅｐ－ｈＩＬ１２（Ｈｅｎｒｙ Ｆｏｒｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、ＣＧ００７０（Ｃｏｌｄ Ｇｅｎｅｓｙｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、ＤＮＸ－２４０１（ＤＮＡｔｒｉｘ Ｃｏ．から入手可能）、ＯＢＰ－３０１（Ｏｎｃｏｌｙｓ ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、ＯＮＣＯＳ－１０２（Ｔａｒｇｏｖａｘ Ｏｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．／Ｏｎｃｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、ＣｏｌｏＡｄ１（ＰｓｉＯｘｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、ＶＣＮ－０１（ＶＣＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）、ＰｒｏｓｔＡｔａｋ（商標）（Ａｄｖａｎｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能）等。

アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科に属し、５Ｋｂ未満のゲノムＤＮＡを有する非エンベロープ型一本鎖線状ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、高い安全性、低い免疫原性、広い宿主範囲、安定した発現、及び、開裂細胞と非開裂細胞に同時に感染する能力などの利点を有している。それは、バイオメディカル産業、特に遺伝子治療の分野で非常に魅力的な可能性を有する。組換えＡＡＶの大部分は、産生細胞内に残る。

一実施形態において、本発明は、２９３細胞を用いてワクシニアウイルス（腫瘍溶解性ポックス・ウイルスを含む）を生産する。生産方法は以下を含む：

ワクシニアウイルスのワーキングシードを２９３細胞に接種する工程。接種量は０．００１～０．２ＭＯＩ（例えば、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０８、０．１、０．１５ＭＯＩ）とすることができる；

接種された細胞を培養して細胞を変性する、好ましくは細胞が完全に細胞変性するまで（通常４８～９６時間）培養する工程。例えば、培養にはセルフラスコを使用することができ、培養は、例えば、付着培養である；及び、

培養した細胞を本発明の採取用溶液組成物と接触させ、ワンステップでウイルスを採取する工程。

採取用溶液組成物は、トリプシン、ｐＨ緩衝液、及び任意にヌクレアーゼを含む。採取用溶液組成物のｐＨは、７．５超１０．５以下、好ましくは８．５～９．５であり、好ましくは、採取用溶液組成物は、Ｔｒｉｓ緩衝液、トリプシン及びヌクレアーゼを含む。

Ｔｒｉｓ緩衝液の濃度は、１～５０ｍＭ（例えば、１、３、５、８、１０、２０、３０、４０ｍＭ）とすることができ、好ましくは１～１０ｍＭとすることができる。トリプシンの濃度は、０．０１～０．１２％（ｗ／ｖ）（例えば、０．０３、０．０５、０．０７、０．０９、０．１１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０３～０．０６％（ｗ／ｖ）である。ヌクレアーゼの濃度は、１～１００ＩＵ／ｍｌ、例えば、１、３、５、１０、２０、４０、６０、８０ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１～５０ＩＵ／ｍｌ、より好ましくは１～５ＩＵ／ｍｌとすることができる；採取用溶液組成物の浸透圧は好ましくは低張であり、ｐＨは好ましくは８．５～９．５である。

採取用溶液組成物の量は、３５μｌ以上の採取用溶液組成物／ｃｍ^２の細胞の範囲、好ましくは７０μｌ以上の採取用溶液組成物／ｃｍ^２の細胞の範囲、例えば、７５、１００、１２５、１５０、２００μｌの採取用溶液組成物／ｃｍ^２の細胞とすることができる。

培養細胞の採取用溶液組成物との接触時間は、通常６０分以下であり、通常５～６０分（例えば、１０、２０、３０、４０、５０分）の接触時間内に細胞を完全に溶解させることができる。

本発明のウイルスの生産方法は、培養細胞中のウイルスを得るために、穏やかな手段を採用している。この方法は、細胞溶解法や、凍結融解、超音波、機械的破砕等の工程を伴わない。本工程は、簡便で操作性に優れ、スケールアップも容易であり、大量細胞培養によるウイルス生産に非常に適している。

さらに、先行技術で一般的に用いられている従来の方法（凍結融解法など）と比較して、収量が従来の方法の５～１０倍と大幅に向上し、同時にウイルスの生物活性を損なうことなくウイルス粒子の完全性を担保できるため、ウイルスの大量生産が可能になる。

以下の実施例は、本発明の内容をさらに説明するものであるが、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の精神及び本質から逸脱することなく、本発明の方法、工程又は条件に対して行われる全ての修正又は置換は、本発明の範囲内に入る。

本明細書における全ての数値は、「約」という単語で修正されたものとして理解されるべきである。終値で表される数値範囲は、その範囲内のすべての値及び部分を含む（例えば、１～１００は、１、１０、３０、５０、１００などを含む）。紙面の都合上、わずかな例しか具体的に挙げられないが、本願では、可能性があるすべての値の組み合わせ（既定の最低値、最高値を含む）を明示的に挙げるものと見なされる。

以下の実施例で使用した技術的手段は、特に指定がない限り、当業者によく知られた従来の手段であり、使用した試薬は市販品である。特に指定がない限り、各試薬の濃度（％）は、試薬の体積百分率濃度（％（ｖ／ｖ））を意味する。

使用したＤＭＥＭ、ＭＥＭ培地、血清、試薬は、すべて一般に用いられる市販品である。調製例１の指示に従い、採取用溶液組成物（処理液又は採取用溶液ともいう）を調製した。

以下の実施例で使用した材料について、以下に説明する：
１．Ｔｒｉｓ塩基（Ｂｉｏｓｈａｒｐ社より入手；カタログ番号：７７－８６－１）
４００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ塩基母液の調製：Ｔｒｉｓ塩基１．９３８ｇを秤量し、少量の注入用水に溶解し、注入用水で４０ｍｌに定容した。４００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ塩基母液を注入用水で希釈し、１ｍＭ Ｔｒｉｓを調製した。

２．ＮａＨＣＯ_３（Ｇｉｂｃｏ社より入手；カタログ番号：２５０８０－０９４）
超純水を用いて、７．５％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ_３溶液を調製した。

３．ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社；カタログ番号：Ｃ１１９６５５００ＣＰ）
メチルセルロース（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社；製品番号：Ａ６００６１５－０２５０）
４％メチルセルロース：メチルセルロース８．０ｇを秤量し、そこに超純水１６０ｍｌを加えて振盪し、次いでメスシリンダーで２００ｍｌに定容し、１２１℃で２０分間滅菌し、室温まで冷却し、４℃で保存し、毎日メチルセルロースが完全に溶解するまで振盪した。

半固形培地：ＤＭＥＭ培地３６０ｍｌ、ＦＢＳ１５ｍｌ、４％メチルセルロース１２５ｍｌを取り、均一になるように振盪し、４℃で保存した。

４．トリプシン（Ｇｉｂｃｏ社より入手；カタログ番号Ａ１２１７７－０１）
トリプシンは、使用時に、最終濃度が０．０１～０．１２％（ｗ／ｖ）になるように処理液で希釈した。

５．ヌクレアーゼ（Ｍｅｒｃｋ社より入手；カタログ番号：７０７４６－１０ＫＵＮ）
ヌクレアーゼは、使用時に、最終濃度１～１００ＩＵ／ｍｌになるように処理液で希釈した。ヌクレアーゼを作用させるために（例えば）１ｍＭのＭｇＣｌ_２を添加することができる。

６．ＰＢＳ緩衝液の組成：ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ２．７ｍＭ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １０ｍＭ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ２ｍＭ、ｐＨ７．２

緩衝液「リン酸二水素カリウム、及びリン酸水素二ナトリウム」の組成は、リン酸二水素カリウム０．２９％（ｇ／ｍｌ）、リン酸水素二ナトリウム０．０２６％（ｇ／ｍｌ）、ｐＨ７．２～７．４である。

リン酸二水素カリウムは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（カタログ番号：７７７８－７７－０）から入手；リン酸水素二ナトリウムは、Ｈｕｓｈｉ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（カタログ番号：１００２０３１８）から入手；すべて分析用純度である。

７．ワクシニアウイルスのワーキングシード：ワクシニアウイルスは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０１９／０６２２３４ Ａ１に開示された組み換え型腫瘍溶解性ポックス・ウイルスＤＤｖｖ－ｈＩＬ２１であり、その調製方法はこのＰＣＴ出願の調製例１及び２に記載されている。

９．２９３［ＨＥＫ－２９３］細胞は、ＡＴＣＣ社（カタログ番号：ＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ－１５７３）から得た。Ｖｅｒｏ細胞は、ＡＴＣＣ社（カタログ番号：ＡＴＣＣ（商標）ＣＣＬ－８１）から得た。ＨｅＬａ細胞は、ＡＴＣＣ社（カタログ番号：ＡＴＣＣ（商標）ＣＣＬ－２）から得た。ＳＬＦ－１細胞株は、中国科学院微生物研究所（ＣＧＭＣＣ）（寄託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．４８７５）から得た。

以下の実施例で用いた試験方法について以下に説明する：
１．トリパンブルー染色法による計数
ＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、トリプシンで消化し、ＰＢＳに懸濁した。次いで、終濃度０．０４％（ｗ／ｖ）でトリパンブルー染色液を添加した。その後、顕微鏡下で細胞を計数した。死細胞は青く染色され、生細胞は無色透明であった。生細胞の数を最終データとした。

2.ウイルス力価の測定
（１）プラーク形成単位（ｐｆｕ）法によるウイルス力価の測定
６ウェルプレートにＶｅｒｏ細胞を植え付けた。細胞が６ウェルプレートの８０％超に広がった時点で、細胞培養液を静かに吸引した。細胞維持液で希釈した試験対象のウイルス試料５００μｌを加えた。各希釈物について５ウェルを平行にセットし、細胞維持液の入った１ウェルを陰性対照とした。

プレートを静かに振盪し、３７℃で２時間置いた後、３０～６０分毎に１回静かに振盪した。ウェル内の液体を吸引し、未吸着の遊離ウイルスを除去するために２ｍｌのＤＭＥＭ培地を加えて一度洗い流し、３～４ｍｌの半固形培地を加え、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内で２～３日間静置培養した。培養期間中、ウイルスプラークの形成が確認された。（以下の工程では、無菌状態の必要はない）。

６ウェルプレートを取り出し、半固形培地を廃棄し、１％クリスタルバイオレット染色液１ｍｌを加え、室温で３０分～３時間静置した。染色液を流水で静かに洗い流し、１ウェルあたりのプラーク数を数えた（又は乾燥後に数えた）。ウイルス力価は、以下の式に従って算出した。

ウイルス力価（ｐｆｕ／ｍｌ）＝ウイルスプラークの平均数×希釈倍数／添加ウイルス量（ｍｌ）

（２）組織培養半感染量（ＴＣＩＤ５０）法による力価の測定
２９３細胞をＤＭＥＭ培養液で約１×１０^５／ｍｌの濃度の懸濁液に調製し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで植え付けた。（同時に、上記細胞に感染させるためのウイルス希釈液を１０倍希釈でそれぞれ調製した）。各列の最初の１０ウェルに同濃度のウイルス希釈液１００μｌを添加し、１１番目と１２番目のウェルには陰性対照として２％ＢＣＳ ＤＭＥＭを等量添加した。

このプレートを３７℃のＣＯ_２インキュベーターに１０日間置いた後、蛍光倒立顕微鏡で観察し、各列の細胞変性効果（ＣＰＥ）を判定して記録した。評価基準では、少数の細胞がＣＰＥを示す限り陽性とみなす。ＣＰＥ又は細胞死の判定が困難な場合は、ウエルを陰性対照と比較する。

力価は以下の式に従って算出した：Ｔ＝１０^{１＋ｄ（Ｓ－０．５）}ＩＵ／ｍｌ
式中、ｄ＝Ｌｏｇ１０希釈倍数、Ｓ＝最初の希釈からの陽性比率の合計である。２回の並行実験から得られた力価の差は≦１０^０．７であろう。

３．ウイルス粒子数の測定
ウイルスをウイルス溶解液で十分に溶解し、ウイルス保存液をブランクとして、試料のＯＤ２６０を測定した。

ウイルス試料をＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で処理した後、Ａ２６０ｎｍの値を測定してウイルス粒子数を決定した（ＵＶ－ＳＤＳ法）：ウイルス２５０μｌを採取し、等量の０．２％ＳＤＳ溶液を加え、均一に混合するように振盪し、５６℃のウォーターバスに１０分間置いた。温度を室温まで冷却した後、一時的に遠心分離を行った。ウイルス安定化溶液と０．２％ＳＤＳ溶液を等量で混合し、得られた溶液をブランクコントロールとして使用した。２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定した。並行して２回の実験を行った。

計算式：ウイルス粒子数＝Ａ２６０ｎｍ×希釈倍率×１．１×１０^１２

調製例１
１．採取用処理液（採取用溶液ともいう）の調製
採取用溶液は無菌環境で調製した。その手順は以下の通りである：

（１）表１に従って、対応する量の試薬を注入用水に加え、十分に溶解させた。
（２）（１）工程で十分に溶解した溶液を注入用水で目標量まで定容した。
（３）ｐＨを対応する値に調整した。
（４）濾過により滅菌し、後の使用のために室温で保存した。
（５）各溶液の浸透圧を自動凝固点浸透圧計法で測定した。結果は以下の通りである：
１ｍＭ Ｔｒｉｓの浸透圧：１ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ
７．５％ ＮａＨＣＯ_３の浸透圧：１７８５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ

２．細胞培養
ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の調製：
７～９日齢のＳＰＦニワトリ胚を採取した。卵の表面を、ヨウ素と７５％アルコールの綿球で拭いた。ニワトリ胚を採取した後、その頭部、四肢及び内臓を除去した。

残りの組織片を切断し、トリプシンにより室温で１５～２０分間静置消化した。ＤＭＥＭ完全培地を加え、自動ピペットでパージを繰り返し、５分間静置して沈降させた。組織をＤＭＥＭで希釈し、処理した組織を４層の滅菌ガーゼで３回濾過した。最後に、単細胞のカウントを行った。

処理したＣＥＦ細胞を３７℃で一晩培養した。顕微鏡で細胞の形態と質を観察した。トリパンブルー染色で細胞をカウントし、生細胞カウンターで確認した。調製したＣＥＦ細胞の生存率を算出した。顕微鏡観察は、形態が無傷であり、良好な状態であることを示した。

２９３、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞を常法により培養した。工程は以下の通りである：コンフルエンス率８０％～９０％の接着細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターから取り出した。細胞培養フラスコの表面に７５％アルコールを噴霧した。

次いで、細胞培養フラスコを回転させ、生物学的に安全なキャビネットに入れ、滅菌ピペットで培地を吸引した。一定量の予熱したＰＢＳを加えて一度洗浄し、ＰＢＳを吸引した。０．２５％（ｗ／ｖ）のトリプシンを細胞培養フラスコに加え、これを振盪してトリプシンを細胞表面に十分に広げた。ボトルキャップを閉め、細胞培養フラスコを３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターに置き、消化を行った。

顕微鏡で細胞を観察し、丸くなったかどうかを確認した。完全に丸くなっていない場合は、細胞が完全に丸くなるまで消化を続ける。１０％ＦＢＳを含む一定量の培地を加えて反応を停止させた。

フラスコ上の細胞をピペットで静かに吹き飛ばし、ピペッティングを繰り返すことで再懸濁させた。再懸濁後、細胞を新しい細胞培養フラスコに取り、１０％ＦＢＳ培地を加え、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養し、コンフルエンス率が８０％～９０％に達するまで毎日観察した。その後、再度、細胞を継代した。

実施例２：処理液の細胞溶解効果の試験
Ｔ７５細胞培養フラスコ（各フラスコの細胞培養面積が７５ｃｍ^２）を用いて、２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞を培養した。細胞が単層に増殖した後、採取用溶液の細胞溶解効果の試験に使用した。

（１）処理液の調製：調製例１に記載した処理液の処方に従って調製を行った。

（２）細胞破砕効果の試験（トリプシン消化後の細胞溶解状態）
２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、及びＨｅＬａ細胞が単層に増殖した時点で、最初の増殖培地を廃棄した。１ｍｌの０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンにより３７℃、２分間で細胞を完全に消化した。５～１０ｍｌの１０％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ培地を加えて消化を停止させた。均一に混合した後、３００ｇで１０分間遠心分離を行った。

上清を廃棄した。この細胞ペレットに調製例１のＡ～Ｅ群の処理液８ｍｌを均一に混合し、室温で静置した（最大１２０分）。時間を記録し、顕微鏡で細胞形態の変化を観察した。細胞懸濁液を少量採取し、顕微鏡下で細胞の破砕を観察した。

顕微鏡で無傷の細胞が観察できなくなったら（完全に溶解したとみなす）、懸濁液を３００ｇで１０分間遠心分離し、遠心分離後に沈殿物があるかどうかを確認した。各群の実験を３回を超えて繰り返した。

（３）細胞破砕効果の試験（ｉｎ ｓｉｔｕでの細胞溶解）
２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、及びＨｅＬａ細胞が単層に増殖した時点で、最初の増殖培地を廃棄した。接着細胞の細胞表面を、調製例１のＡ～Ｅ群の処理液２～５ｍｌで１～２回洗浄した。次いで、同じ新鮮な処理液８ｍｌを添加した。

細胞は室温で静置した。時間を記録し、顕微鏡で細胞の形態の変化を観察した。顕微鏡下で無傷の細胞が観察されなくなったら（完全に溶解したとみなす）、懸濁液を３００ｇで１０分間遠心分離し、遠心分離後に沈殿物があるかどうかを確認した。各群の実験を３回を超えて繰り返した。

試験結果をそれぞれ表２、表３に示す。

この実施例では、トリプシン消化後の細胞溶解試験とｉｎ ｓｉｔｕでの細胞溶解試験の両方で、以下の結果が得られた：

Ａ群及びＢ群の処理液は１５分以内に細胞を完全に溶解することができ、Ｂ群の細胞の完全溶解時間はＡ群の細胞よりも短かった。細胞の破片は小さく、明らかな沈殿物はなく、細胞懸濁液を遠心分離した後の上清は粘性ではなかった。核酸を除去する効果は明らかであった。溶解した細胞の比率は１００％であった。２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞の間で有意差はなかった。

Ｃ群（対照群）の処理液は、細胞溶解の効果が低かった。１２０分後の溶解で、まだ多くの細胞形態が顕微鏡で確認できた。細胞懸濁液を遠心分離した後、明らかな沈殿物が確認できた。上清は粘性があり、いくらかの細胞が溶解して核酸などの細胞内物質が放出されたことを示す。

Ｄ群及びＥ群（対照群）の処理液は、基本的に溶解時間を延長して細胞を溶解することができる。顕微鏡での観察は、細胞の破片が大きいことを示した。細胞懸濁液を遠心分離した後、明らかな沈殿物は見られず、上清は粘性がなかった。核酸除去の効果は明らかであった。溶解した細胞の比率は１００％未満であった。２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞の間で有意差はなかった。

表２及び表３に示すように、トリプシン消化後の細胞溶解とｉｎ ｓｉｔｕの細胞溶解を比較することにより、各群の採取用溶液の溶解効果は基本的に同じであることがわかる。最初にトリプシンで細胞を消化した場合、ｉｎ ｓｉｔｕでの溶解よりも時間がかからなかった。したがって、トリプシンで消化した後の採取用溶液での処理の効果は、ｉｎ ｓｉｔｕでの溶解の効果よりも若干優れている。

Ａ群、Ｂ群の処理液は、細胞がトリプシンで消化されたか、ｉｎ ｓｉｔｕで溶解されたかに関わらず、３０分以内に２９３、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞を効果的に溶解でき、本発明の採取用溶液が２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞に適用可能であることを示す。

実施例３：ウイルス培養と処理液がウイルス力価に与える影響
ワクシニアウイルスの培養と採取：２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＥＦ細胞をそれぞれＴ７５細胞培養フラスコに植え付けた。細胞が８０％超のコンフルエンスまで接着して増殖した時点で、ワクシニアウイルスのワーキングシードを各細胞に０．０２のＭＯＩで接種した。細胞培養フラスコ内のウイルスを接種した細胞を３７．０±１．０℃に置いて２時間吸着させた。吸着が完了した後、２％ＦＢＳを含むウイルス維持液を補充し、３７．０±１．０℃インキュベーターに入れて細胞が完全に細胞変性するまで（通常４８～９６時間）培養を続けた。次いで、培養液を廃棄し、調製例１記載のＡ～Ｅ群の処理液を添加し、１０～６０分間それぞれ処理した。細胞の状態は、顕微鏡で観察した。

細胞が完全に溶解した後（最大溶解時間は６０分）、ウイルス液を回収し、溶解した時間と細胞の破砕状態を試験した。ウイルス液を３００ｇで１０分間遠心分離し、次いで上清を採取してウイルス力価を測定した。遠心分離後の沈殿物の有無、及び上清の粘度を記録した。

同時に凍結融解対照群（略して凍結融解群）を以下の通りに設定した：完全に細胞変性した細胞をピペッティングし、細胞と感染培地を１５ｍｌの滅菌遠心管に移し、－８０℃の冷蔵庫に入れて１２０分間急速凍結した。次いで、３７℃水浴に入れて１０分間急速解凍し、これを３回繰り返した。ウイルス液を７５０ｇで１０分間遠心分離し、上清を採取してウイルス力価を検出した。各群の実験は３回を超えて繰り返し、統計解析のために平均値をとった。

ウイルス力価はプラークアッセイ（すなわち、プラーク形成単位法）により測定した。試験結果に応じて、各群の処理液の採取効果及びウイルス力価に与える影響を評価した。結果を下記表４に示す。

この実験の結果は以下を示す：
Ａ群及びＢ群の処理液はいずれも１０分以内に細胞を完全に溶解することができる。細胞の破片は小さく、明らかな沈殿物はなく、細胞懸濁液を遠心分離した後の上清は粘性ではない。核酸を除去する効果は明らかであった。溶解した細胞の比率は１００％であった。２９３細胞とＨｅＬａ細胞との間に有意差はなかった。

Ｃ群（対照群）の処理液は、細胞溶解効果が低い。６０分間の溶解後、まだ多くの細胞形態を顕微鏡で見ることができ、また細胞懸濁液を遠心分離した後、明らかな沈殿物を見ることができる。上清は比較的粘性が高く、いくらかの細胞が溶解されて核酸などの細胞内物質が放出されたことを示す。

Ｄ群及びＥ群（対照群）の処理液は、基本的に溶解時間を延長して細胞を溶解することができる。顕微鏡での観察は、細胞の破片が大きいことを示した。細胞懸濁液を遠心分離した後、明らかな沈殿物は見られず、上清は粘性がなかった。核酸除去の効果は明らかであった。溶解した細胞の比率は１００％未満であった。２９３細胞とＨｅＬａ細胞の間で有意差はなかった。

Ｆ群（凍結融解対照群）では、３回の凍結融解後、まだ顕微鏡下で細胞の形態が確認でき、細胞の破片は大きかった。明らかな沈殿物はなく、細胞懸濁液を遠心分離した後の上清は凝集性の浮遊物を伴う粘性であった。これは、３回の凍結融解後に細胞が溶解して核酸などの細胞内物質が放出されたことを示す。溶解した細胞の比率は１００％未満であった。２９３細胞とＨｅＬａ細胞の間に有意差はなかった。

Ａ群及びＢ群の処理液は、１０分以内に２９３細胞及びＨｅＬａ細胞をｉｎ ｓｉｔｕで効果的に溶解でき、本発明の採取用溶液が２９３細胞及びＨｅＬａ細胞のいずれにも適用可能であることを示す。（ウイルス力価偏差≦３０％ｐｆｕ／ｍｌは、許容される検出誤差範囲とみなされる。以下同様）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を試験することにより、調製した腫瘍溶解性ウイルスの生物活性は損なわれなかったと考えられている。

実施例４：処理方法の違いがウィルスの採取に与える影響
２９３細胞を培養した。細胞が８０％超のコンフルエンスまで接着して増殖した時点で、ワクシニアウイルスのワーキングシードを細胞に０．０２のＭＯＩで接種した。Ｔ７５セルフラスコ内のウイルス接種された細胞を、吸着のために３７．０±１．０℃で２時間静置した。吸着の完了後、２％ＦＢＳを含むウイルス維持液を補充し、３７．０±１．０℃のインキュベーターに入れ、４８時間培養を継続した。

細胞が完全に細胞変性した後、細胞内ウイルスと上清（細胞外ウイルス）を採取した。８ｍｌの採取用処理液Ｇと採取用処理液Ｈをそれぞれ細胞内のウイルスに加え、１０分間処理した。細胞の状態を顕微鏡で観察した。

細胞が完全に溶解した後、ウイルス溶液を回収した。ウイルス液を３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を採取してウイルス力価を検出した。同時に凍結融解対照群を以下の通り設定した：完全に細胞変性した細胞をピペッティングし、細胞と感染培地を１５ｍｌの滅菌遠心管に移し、－８０℃の冷蔵庫に入れて１２０分間で急速に凍結し、３７℃の水浴に入れて１０分間解凍した。これを３回繰り返した。

このウイルス液を７５０ｇで１０分間遠心分離し、次いで上清を採取し、ウイルス力価を検出した。処理液で処理した後に採取したウイルスの力価を評価した。各群の実験は３回を超えて繰り返し、統計解析のために平均値をとった。

この実験の結果を図１に示す。この図は、細胞を完全に溶解してウイルスを放出させた場合の採取物については、細胞内ウイルスの処理の違いにより、得られる結果が大きく異なることを示す。細胞内ウイルスの処理が異なるため、得られる結果に大きなばらつきがある。ここで、凍結融解群の収量は低い；処理液Ｇ群（１ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．０６％（ｗ／ｖ）トリプシン＋５ＩＵ／ｍｌ ヌクレアーゼ）の収量は、凍結融解群の約６倍であった；処理液Ｈ群（７．５％ＮａＨＣＯ_３＋０．０６％（ｗ／ｖ）トリプシン＋５ＩＵ／ｍｌヌクレアーゼ）の収量は、凍結融解群の約５倍であった。

実施例５：処理液の投与量の違いがウイルスの採取に与える影響
２９３細胞をＴ７５細胞培養フラスコに植え付けた。細胞が８０％超のコンフルエンスまで接着して増殖した時点で、ワクシニアウイルスのワーキングシードを細胞に０．０２のＭＯＩで接種した。細胞培養フラスコ内のウイルスを接種された細胞を、吸着のために３７．０±１．０℃で０～２時間置いた。

吸着の完了後、２％ＦＢＳを含むウイルス維持液を補充し、３７．０±１．０℃のインキュベーターに入れ、培養を継続した。細胞が完全に細胞変性した後、ウイルスを採取した。培養液を廃棄し、調製例１に記載の群Ａの処理液を培養細胞の面積（すなわち、３５μｌ／ｃｍ^２、７０μｌ／ｃｍ^２、１５０μｌ／ｃｍ^２）に応じて、それぞれ添加した。

それぞれ１０分と３０分間、処理を行った。細胞の状態を顕微鏡で観察した。ウイルス液を回収し、細胞の破砕状態を記録した。ウイルス液を７５０ｇで１０分間遠心分離し、次いで上清を採取してウイルス力価を試験した。遠心分離後の沈殿物の有無、及び上清の粘度を記録した。

同時に凍結融解対照群を以下の通り設定した：完全に細胞変性した細胞をピペッティングし、細胞と感染培地を１５ｍｌの滅菌遠心管に移し、－８０℃の冷蔵庫に入れて１２０分間急速に凍結した。次いで、３７℃の水浴に入れて１０分間融解した。これを３回繰り返した。

ウイルス液を７５０ｇで１０分間遠心分離し、上清を採取してプラークアッセイによりウイルス力価を検出した。各試験の結果に応じて、処理液の投与量及び処理時間の違いが、採取効果及び力価に及ぼす影響を評価した。結果を以下の表５に示す。

この実験の結果は以下を示す：
処理量と処理時間は、細胞溶解量とウイルス収量に大きな影響を与える。群Ａの処理液３５、７０、１５０μｌ／ｃｍ^２を採取した細胞内ウイルスの処理に使用すると、３０分以内に効果的に細胞を溶解でき、細胞溶解率は１００％で、上清に粘性はなかった。また、細胞溶解効果は、処理液の投与量及び処理時間と正の相関があった。処理液の添加量が１５０μｌ／ｃｍ^２、且つ、処理時間が１０分の場合、ウイルス感染価は最も高く、凍結融解群のウイルス感染価の６倍超であった。

実施例６：様々な例示的なウイルスの培養と採取
水痘ウイルスの培養と採取：Ｔ２５細胞培養フラスコにＳＬＦ－１細胞を植え付けて、細胞が単層に増殖した時点で、水痘帯状疱疹ウイルスのＯｋａ株（ＡＴＣＣ社より入手、番号はＶＲ－７９５）のワーキングシードをＳＬＦ－１細胞に０．００１～０．１のＭＯＩで接種した。セルフラスコ内のウイルスを接種された細胞を３５．０±１．０℃に置いて２時間吸着させた。

吸着が完了した後、ウイルスＭＥＭ維持液を補充し、次いで、細胞を３５．０±１．０℃のインキュベーターに置き、４８～９６ｈ培養を継続した。培養液を廃棄し、調製例１に記載したＡ～Ｅの採取用溶液群を添加した。細胞を室温で１０分間静置し、顕微鏡で細胞の状態を観察した。細胞が著しく膨潤した時点で細胞を振って落下させ、次にウイルス液を回収した。細胞の膨潤時間、細胞剥離率、細胞破砕、ウイルス力価を検出した。同時に、凍結融解採取対照群も設定した。結果に従って、各群の採取用溶液の採取効果及びウイルス力価に及ぼすそれらの影響を評価した。

ＨＳＶの培養と採取：Ｖｅｒｏ細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターに置き、増殖と培養を行った。細胞が単層に増殖した後、それぞれＭＯＩ＝０．００１～０．１でウイルスを感染させた。細胞が丸くなり、まだ落ちていない時点で、感染した細胞と上清を採取した。１０～６０分間の処理のために、調製例１に記載したＡ～Ｅ群の処理液をそれぞれ添加した。細胞の状態は、顕微鏡で観察した。

細胞が完全に溶解した後（最大溶解時間は６０分）、ウイルス液を回収し、細胞が溶解するまでの時間と細胞の破砕を記録した。ウイルス液を３００ｇで１０分間遠心分離し、次いで上清を採取し、ウイルス力価を測定した。遠心分離後の沈殿物の有無と上清の粘度を記録した。同時に凍結融解対照群と上清対照群を設定した。ウイルス力価をプラークアッセイで測定した。各群の処理液の様々な時点における採取効果及びウイルス力価に及ぼすそれらの影響を結果に従って評価した。

アデノウイルスの培養と採取：２９３細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターに置き、増殖と培養を行った。細胞が単層に増殖した後、それぞれＭＯＩ＝１～１００でウイルスを感染させた。細胞が丸くなり、まだ落ちていない時点で、感染した細胞と上清を採取した。１０～６０分間の処理のために、調製例１に記載したＡ～Ｅ群の処理液をそれぞれ添加した。細胞の状態は、顕微鏡で観察した。

細胞が完全に溶解した後（最大溶解時間は６０分）、ウイルス液を回収し、細胞が溶解するまでの時間と細胞の破砕を記録した。ウイルス液を３００ｇで１０分間遠心分離し、次いで上清を採取し、ウイルス力価を測定した。遠心分離後の沈殿物の有無と上清の粘度を記録した。同時に凍結融解対照群と上清対照群を設定した。ウイルス力価をＴＣＩＤ５０法に従って測定した。各群の処理液の様々な時点における採取効果及びウイルス力価に及ぼすそれらの影響を結果に従って評価した。

レンチウイルスの培養と採取：２９３細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターに置き、増殖と培養を行った。４種類のプラスミド（すなわち、ウイルスのパッケージングに必要な３種類のタンパク質Ｇａｇ／Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、ＶＳＶ－Ｇ（ＨＩＶ－１のＥｎｖの代替）をそれぞれ３つのプラスミドに独立に配置し、標的遺伝子のベクターをプラスミドｐＬｅｎｔｉ－Ｇｅｎｅ上に構築し、４種類のプラスミドを得た。）を加えて細胞に感染させた。細胞が丸くなり、まだ落ちていない時点で、感染した細胞と上清を採取した。１０～６０分間の処理のために、調製例１に記載したＡ～Ｅ群の処理液を添加した。細胞の状態は、顕微鏡で観察した。

細胞が完全に溶解した後（最大溶解時間は６０分）、ウイルス液を回収し、細胞が溶解するまでの時間と細胞の破砕を記録した。ウイルス液を３００ｇで１０分間遠心分離し、次いで上清を採取し、ウイルス力価を測定した。遠心分離後の沈殿物の有無と上清の粘度を記録した。同時に凍結融解対照群と上清対照群を設定した。各群の処理液の様々な時点における採取効果及びウイルス力価に及ぼすそれらの影響を結果に従って評価した。

実施例７：ウイルス生産工程のスケールアップ実験
２９３細胞を蘇生後、１０％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地で増殖と培養を行った。細胞コンフルエンスが８０％～９０％になった時点で、細胞をセルファクトリーに植え付け、ＣＯ_２インキュベーターで約４８時間培養した後、消化して細胞懸濁液を調製した。

細胞懸濁液を用いて、細胞培養槽（ＮＢＳ社より入手、ＣｅｌｌｉＧｅｎ Ｐｌｕｓ／３１０、表面積約２２平方メートル）に植え付けた。細胞の灌流培養を行い、６～８日後にＭＯＩ＝０．０２でワクシニアウイルスに感染させた。細胞にウイルスを約４８～７２時間感染させた後、ウイルスを採取した。調製例１に記載のＧ群の処理液を用いることにより、１．３×１０^１３ＰＦＵ／培養槽のウイルスが採取できた。

実施例８：セルファクトリーを用いたプロセスのスケールアップ実験
２９３細胞を蘇生後、１０％子牛血清を含むＤＭＥＭ培地で３つの１０段のセルファクトリー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ Ｃｈａｍｂｅｒ，１０ ＳＴＡＣＫ，ＰＯＬＹＳＴＹＲＥＮＥ，ＳＴＥＲＩＬＥ，１／６」；３つの１０段のセルファクトリーの合計面積：６３６０＊３＝１９０８０ｃｍ^２）まで増殖させた。細胞コンフルエンスが８０％～９０％になった時点で、２％血清を含むＤＭＥＭ培地の感染培地を用いて、ＭＯＩ＝０．０２でワクシニアウイルスを細胞に感染させた。

ウイルスの感染から約７２時間後、細胞を叩き落とし、培地と一緒に滅菌遠心分離ボトルに移した。バランス調整をしながら、４℃、２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。次いで、上清を廃棄し、細胞ペレットを溶解と採取のために室温に平衡化した処理液３Ｌ（約１５７μｌ／ｃｍ^２の細胞）で処理した。

処理液の組成は、１ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０３％ 組換えトリプシン、５Ｕ／ｍｌ ヌクレアーゼ、ｐＨ９．０に、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を加えたものである。７．８０×１０^１０ＰＦＵのウイルス（単位面積あたりの収量：４．０９×１０^６ＰＦＵ／ｃｍ^２）を採取することができる。

実施例９：培養槽（５Ｌ）を用いたプロセスのスケールアップ実験
３つのＴ２２５細胞培養用フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号：４３１０８２）内で、２９３細胞を蘇生させ、１０％子牛血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて増殖と培養を行った。細胞コンフルエンスが８０％～９０％になった時点で、細胞を１つの１０段のセルファクトリー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ Ｃｈａｍｂｅｒ，１０ ＳＴＡＣＫ，ＰＯＬＹＳＴＹＲＥＮＥ，ＳＴＥＲＩＬＥ，１／６」；総面積：６３６０ｃｍ^２）に植え付けた。ＣＯ_２インキュベーターで約７２時間培養した後、細胞を消化して細胞懸濁液を調製した。

細胞懸濁液を用いて、植え付け量４７０ｍｌ、総細胞数１．７８×１０^９で、細胞培養槽（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社より購入、ＢｉｏＦｌｏ ３２０、５Ｌの細胞培養槽の表面積は約１５０，０００ｃｍ^２）に植え付けた。細胞の灌流培養を行い、６～８日後に、ＭＯＩ＝０．０２５でワクシニアウイルスを感染させた。細胞にウイルスを感染させた約７２時間後、細胞を溶解し、処理液とともにウイルスをｉｎ ｓｉｔｕで採取した。

処理液の組成は、１ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０３％ 組換えトリプシン、５Ｕ／ｍｌ ヌクレアーゼ、ｐＨ９．３に、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を加えたものである。処理液の総量は約１３．５Ｌ（約９０μｌ／ｃｍ^２の細胞）であった。４．４１×１０^１１ＰＦＵ／培養槽のウイルス（単位面積あたりの収量：２．９４×１０^６ＰＦＵ／ｃｍ^２）を採取することができる。

実施例１０：培養槽（５Ｌ）を用いたプロセスのスケールアップ実験
３つのＴ２２５細胞培養用フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号：４３１０８２）内で、２９３細胞を蘇生させ、１０％子牛血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて増殖と培養を行った。細胞コンフルエンスが８０％～９０％になった時点で、細胞を１つのセルファクトリー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ Ｃｈａｍｂｅｒ，１０ ＳＴＡＣＫ，ＰＯＬＹＳＴＹＲＥＮＥ，ＳＴＥＲＩＬＥ，１／６」；総面積：６３６０ｃｍ^２）に植え付けた。ＣＯ_２インキュベーターで約７２時間培養した後、細胞を消化して細胞懸濁液を調製した。

細胞懸濁液を用いて、植え付け量４３０ｍｌ、総細胞数１．９７×１０^９で、細胞培養槽（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社より購入、ＢｉｏＦｌｏ ３２０、５Ｌの細胞培養槽の表面積は約１５０，０００ｃｍ^２）に植え付けた。細胞の灌流培養を行い、６～８日後に、ＭＯＩ＝０．０６でワクシニアウイルスを感染させた。細胞にウイルスを感染させた約５日後、細胞を溶解し、処理液とともにウイルスをｉｎ ｓｉｔｕで採取した。

処理液の組成は、１ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０３％ 組換えトリプシン、５Ｕ／ｍｌ ヌクレアーゼ、ｐＨ９．３に、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を加えたものである。処理液の総量は約１５Ｌ（約１００μｌ／ｃｍ^２の細胞）であった。２．４１×１０^１１ＰＦＵ／培養槽のウイルス（単位面積あたりの収量：１．６１×１０^６ＰＦＵ／ｃｍ^２）を採取することができる。

実施例１１：培養槽（１４Ｌ）を用いたプロセスのスケールアップ実験
３つのＴ２２５細胞培養用フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号：４３１０８２）内で、２９３細胞を蘇生させ、１０％子牛血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて増殖と培養を行い、細胞コンフルエンスが８０％～９０％になった時点で、３つの１０段のセルファクトリー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ Ｃｈａｍｂｅｒ，１０ ＳＴＡＣＫ，ＰＯＬＹＳＴＹＲＥＮＥ，ＳＴＥＲＩＬＥ，１／６」；３つの１０段のセルファクトリーの合計面積：６３６０＊３＝１９０８０ｃｍ^２）に植え付けた。ＣＯ_２インキュベーターで約７２時間培養した後、細胞を消化して細胞懸濁液を調製した。

細胞懸濁液を用いて、植え付け量１４００ｍｌ、総細胞数３．１９×１０^９で、細胞培養槽（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社より購入、ＢｉｏＦｌｏ ３２０、１４Ｌの細胞培養槽の表面積は約４５０，０００ｃｍ^２）に植え付けた。細胞の灌流培養を行い、６～８日後に、ＭＯＩ＝０．０５でワクシニアウイルスを感染させた。細胞にウイルスを感染させた約７２時間後、細胞を溶解し、処理液とともにウイルスをｉｎ ｓｉｔｕで採取した。

処理液の組成は、１ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０３％ 組換えトリプシン、５Ｕ／ｍｌ ヌクレアーゼ、ｐＨ９．３に、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を加えたものである。処理液の総量は約５０Ｌ（約１１０μｌ／ｃｍ^２の細胞）であった。１．２４×１０^１２ＰＦＵ／培養槽のウイルス（単位面積あたりの収量：２．７６×１０^６ＰＦＵ／ｃｍ^２）を採取することができる。

上述した実施例から、本発明の採取方法及び採取用処理液が、生産工程を大幅に簡略化でき、特にウイルスの大量生産に適していることを知ることができる。本発明の採取方法及び採取用処理液を採用することにより、採取したウイルスの収量が高く、不純物が少なくなる。これにより、その後の精製工程がさらに実施しやすくなり、得られるウイルスの純度及び生物活性がより高くなる。

上記の実施形態は、本発明の原理を説明するために用いられる例示的な実施形態に過ぎず、本発明はこれらに限定されないことが理解できる。当業者にとっては、本発明の精神及び本質から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行うことができ、これらの変更及び修正もまた本発明の保護範囲内にある。

Claims (24)

1. ウイルスの生産方法であって、以下の工程を含む方法：
   細胞を培養する工程であって、該細胞がウイルスを接種されているか、又はウイルスパッケージング要素をトランスフェクトされている工程；及び、
   培養細胞を採取用溶液組成物と接触させて、ウイルスをワンステップで採取する工程であって、該採取用溶液組成物が、トリプシン、ｐＨ緩衝液、及び任意にヌクレアーゼを含み、且つ、該採取用溶液組成物のｐＨが７．５超１０．５以下の範囲である工程。
2. 採取用溶液組成物中のトリプシンの濃度が、０．０１～０．１２％（ｗ／ｖ）の範囲、好ましくは０．０３～０．０６％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項１に記載の方法。
3. 採取用溶液組成物中のヌクレアーゼの濃度が、１～１００ＩＵ／ｍｌの範囲、好ましくは１～５０ＩＵ／ｍｌの範囲、より好ましくは１～５ＩＵ／ｍｌの範囲である、請求項１に記載の方法。
4. 採取用溶液組成物の浸透圧が、０～５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ又は８００～２５００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲、好ましくは０～２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ又は１７８５～２０００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲、より好ましくは１～２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲である、請求項１に記載の方法。
5. 採取用溶液組成物のｐＨが、８．５～９．５の範囲である、請求項１に記載の方法。
6. ｐＨ緩衝液が、Ｔｒｉｓ緩衝液及び重炭酸ナトリウム緩衝液から選択される、請求項１に記載の方法。
7. 培養が、セルフラスコ、セルファクトリー又は培養槽で行われ、且つ、培養が、付着培養及び懸濁培養を含む、請求項１に記載の方法。
8. 培養が付着培養である場合、採取用溶液組成物の量が、３５μｌ以上の採取用溶液組成物／ｃｍ^２の細胞、好ましくは７０μｌ以上の採取用溶液組成物／ｃｍ^２の細胞の範囲であり、培養が懸濁培養である場合、採取用溶液組成物の量が、３５μｌ以上の採取用溶液組成物／１０^５細胞、好ましくは７０μｌ以上の採取用溶液組成物／１０^５細胞の範囲である、請求項１に記載の方法。
9. 培養細胞を採取用溶液組成物に５～６０分の時間範囲で接触させる、請求項１に記載の方法。
10. 細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、２９３細胞、ＣＥＦ細胞、及びＨｅＬａ細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
11. ウイルスが、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ロタウイルス、ＥＶ７１ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、麻疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、セネカバレーウイルス、エコーエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、及びマラバウイルスを含み、好ましくはエンベロープウイルスである、請求項１に記載の方法。
12. 細胞が２９３細胞であり、且つ、ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項１に記載の方法。
13. 採取用溶液組成物が、Ｔｒｉｓ緩衝液、トリプシン及びヌクレアーゼを含み、且つ、Ｔｒｉｓ緩衝液の濃度が１～５０ｍＭの範囲、好ましくは１～１０ｍＭの範囲である、請求項１～５及び請求項７～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 細胞培養に供されたウイルスを採取するための採取用溶液組成物であって、該採取用溶液組成物が、トリプシン、ｐＨ緩衝液、及び任意にヌクレアーゼを含み、且つ、該採取用溶液組成物のｐＨが、７．５超１０．５以下の範囲である採取用溶液組成物。
15. 採取用溶液組成物中のトリプシンの濃度が、０．０１～０．１２％（ｗ／ｖ）の範囲、好ましくは０．０３～０．０６％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項１４に記載の採取用溶液組成物。
16. 採取用溶液組成物中のヌクレアーゼの濃度が、１～１００ＩＵ／ｍｌの範囲、好ましくは１～５０ＩＵ／ｍｌの範囲、より好ましくは１～５ＩＵ／ｍｌの範囲である、請求項１４に記載の採取用溶液組成物。
17. 採取用溶液組成物の浸透圧が、０～５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ又は８００～２５００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であり、好ましくは０～２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ又は１７８５～２０００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であり、より好ましくは１～２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲である、請求項１４に記載の採取用溶液組成物。
18. 採取用溶液組成物のｐＨが、８．５～９．５の範囲である、請求項１４に記載の採取用溶液組成物。
19. ｐＨ緩衝液が、Ｔｒｉｓ緩衝液及び重炭酸ナトリウム緩衝液から選択される、請求項１４に記載の採取用溶液組成物。
20. 培養が、セルフラスコ、セルファクトリー又は培養槽で行われ、且つ、培養が付着培養及び懸濁培養を含む、請求項１４に記載の採取用溶液組成物。
21. 細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、２９３細胞、ＣＥＦ細胞、及びＨｅＬａ細胞から選択される、請求項１４に記載の採取用溶液組成物。
22. ウイルスが、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ロタウイルス、ＥＶ７１ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、麻疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、セネカバレーウイルス、エコーエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、及びマラバウイルスを含み、好ましくはエンベロープウイルスである、請求項１４に記載の採取用溶液組成物。
23. 細胞が２９３細胞であり、且つ、ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項１４に記載の採取用溶液組成物。
24. 採取用溶液組成物が、Ｔｒｉｓ緩衝液、トリプシン、及びヌクレアーゼを含み、且つ、Ｔｒｉｓ緩衝液の濃度が１～５０ｍＭの範囲であり、好ましくは１～１０ｍＭの範囲である、請求項１４～１８及び請求項２０～２３のいずれか一項に記載の採取用溶液組成物。

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