CN103614346B - 一种采用高渗透压收获液收获病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种采用高渗透压收获液收获病毒的方法。本发明提供的高渗透压收获液渗透压为1500～2500mOsmol/kg，包含细胞缓冲液PBS和蔗糖，其能够高效的裂解细胞，使胞内病毒释放并得到有效收集，是一种新的病毒收获方式，打破了在大规模平面培养病毒工艺中由于收获工艺的限制带来的壁垒。通过改变细胞渗透压的方式收获病毒的工艺方法操作简单，便于规模化生产，可有效提高产业化能力，适用于企业的大规模生产，具有很强的实用性。本发明提供的高渗收获液仅含蔗糖，可有效保证产品的安全性。

Description

一种采用高渗透压收获液收获病毒的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种采用高渗透压收获液裂解细胞使病毒释放并使其得到有效收获的工艺方法。

背景技术

水痘—带状疱疹病毒（Varicella-Zoster virus，VZV）属α疱疹病毒亚科，为双链DNA病毒，其原发感染为水痘，潜伏感染再激活时可引发带状疱疹。接种疫苗是预防由VZV引起的水痘与带状疱疹的最有效措施。迄今为止，水痘减毒活疫苗（Oka株）是唯一获准用于预防由VZV引起的疾病的疫苗。接种疫苗是公认的预防由VZV引起的水痘的最有效措施。

轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起婴幼儿严重腹泻和脱水的主要病因，在发展中国家和发达国家都是一个重要的公共卫生问题，全世界<5岁的儿童每年大约有600,000左右的死亡病例，85%的死亡儿童在发展中国家。轮状病毒腹泻不但造成社会的疾病负担，而且带来了巨大的经济损失。疫苗免疫是唯一可行的预防轮状病毒腹泻较高发病率和死亡率的方法。有鉴于此，世界卫生组织在1997年将轮状病毒疫苗的开发列为全球新疫苗研制开发的第一项目，世界各国的有关机构都在积极进行轮状病毒疫苗的研制工作。

EV71病毒和CA16病毒均为引起婴幼儿手足口病的主要病原体。人肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科,基因组为单股正链RNA,长度约为7400个核苷酸,仅含有一个开放读码框,编码的多聚蛋白约含2 190个氨基酸。该病毒最早于1969～1970年间在美国加利福尼亚州发生中枢神经系统症状的婴儿粪便中分离得到。电镜观察发现该病毒的形态及理化特性都与当时已知的其他肠道病毒类似,但中和抗体试验和免疫扩散试验却未发现交互作用,因此认为是一种新型肠道病毒,命名为人肠道病毒71型。

柯萨奇病毒A组16型（简称：CA16）于1958年被分离出，CA16是单正链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，为二十面体立体对称，无包膜。基因组长约7400bp,包括5′及3′端的非编码区和中间一个大的开放读码框(ORF),依次由VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 11个基因组成,主要编码产生病毒结构蛋白。在历次手足口病的流行中,EV71与CA16交替或共同出现,成为HFMD的主要病原体。

甲型病毒性肝炎简称甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒(甲肝病毒)引起的一种急性传染病，粪-口传播是其主要传播途径。甲型肝炎病毒属于微小核糖核酸病毒科，肝病毒属。病毒颗粒呈球形，直径约为27nm，无囊膜，衣壳由32个壳粒组成，呈20面体立体对称，每个壳粒具有四个多肽分别为病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，基因组为单股正链RNA，其长度相当于7500个核苷酸左右。在RNA的3′末端有多聚的腺苷序列，在5′末端以共价形式与病毒基因组蛋白。根据病毒核苷酸序列分析，人甲肝病毒可以分为四个基因型，但其抗原性相似，所以甲型肝炎病毒只有一个血清型。

病毒疫苗的制备一般是先将毒种接种于未感染的适宜代次的细胞上进行传代，当达到一定程度细胞病变时收获感染细胞，加适量疫苗液制成原液。原液经冻融，超声破碎，离心，过滤澄清，得到上清液，加入疫苗稳定剂即半成品；半成品冻干或直接分装后即成为冻干疫苗或液体剂型疫苗。

自1974年Oka株水痘减毒活疫苗问世以来，欧美等国家陆续开始了水痘疫苗的生产，其生产工艺均采用克氏瓶静止培养，生产规模和病毒产量受到一定的限制。轮状病毒的大规模培养主要采用转瓶或细胞工厂，EV71、CA16病毒和甲肝病毒的大规模培养主要采用细胞工厂，上述病毒均属于胞内病毒，在病毒的收获工艺中需要有效的破碎裂解细胞使病毒释放，并保证病毒颗粒的完整性。而不同的收获工艺对细胞的裂解程度和病毒颗粒的完整性的影响不同。收获方式直接影响病毒滴度值，而病毒收获液的有效高滴度值是影响疫苗品质的重要因素。因此，选择一种合适、有效的病毒收获方式至关重要。

水痘病毒、轮状病毒、EV71病毒、CA16病毒和甲肝病毒均属于细胞内病毒，具有很强的细胞结合活性，病毒收获时必须收集并破碎细胞才能得到游离的病毒颗粒。目前针对上述病毒的上市产品中，各厂家多采用冻融法收集和破碎细胞，该方法适合于转瓶和克式瓶等培养方式，但不适用于细胞工厂培养系统；也有厂家采用含EDTA或胰蛋白酶的消化液经消化收集细胞，并采用冻融法破碎细胞，该方法适用于细胞工厂培养系统，但存在引入消化液成份并难以去除的弊端，对疫苗的安全性存在风险。

现有的技术中，EV71病毒、CA16病毒和甲肝病毒采用10层或40层细胞工厂的大规模培养中，采用冻融方式收获病毒的可行性差；另一种方式则为收集病毒培养上清液，由于病毒为胞内病毒，上清液中病毒滴度值较冻融破碎细胞后收集的病毒液滴度值低，造成不必要的损失，对成品的质量也具有一定的影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效的破碎细胞收获病毒的方法。

渗透压法是通过渗透压的改变达到破碎细胞、收获病毒的目的。正常的渗透压为285～310mOsmol/kg，当细胞置于高渗透压溶液中时，由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，易于脱落，通过震摇可达到收获细胞的目的。当达到平衡后，将介质快速稀释，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂，从而达到收获病毒的目的。

本发明首先提供一种用于破碎细胞收获病毒的高渗透压收获液，其渗透压值为1500～2500mOsmol/kg，其配方含有细胞缓冲液PBS和蔗糖；其中PBS为行业内常用组分，组分为0.876%氯化钠、0.031%二水合磷酸二氢盐和0.287%十二水合磷酸氢二盐，其中所述盐为钠盐或钾盐；蔗糖的浓度为40%-60%。前述%均为质量体积比,单位为克/毫升

本发明的高渗透压收获液通过以下方法配制得到，将蔗糖按照40%-60%的质量体积比加入缓冲液PBS中，至完全溶解，过滤除菌。

上述高渗透压收获液在制备病毒类疫苗或药物中的应用应属于本发明的保护范围。

所述的病毒为水痘病毒、轮状病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲型肝炎病毒。

本发明还提供了采用高渗收获液破碎细胞收获病毒的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）采用细胞瓶或细胞工厂培养病毒；

（2）配制高渗收获液；

（3）弃细胞培养液后加入高渗收获液，室温静置；

（4）显微镜下观察细胞状态，待细胞发生明显收缩时震摇细胞瓶或细胞工厂，收集病毒液；

（5）加入无菌注射水，使细胞渗透压恢复至等渗；使细胞破裂，释放病毒。

上述方法还包括步骤（6）显微镜下观察细胞破碎情况。

本发明所述的高渗透压收获病毒的方法适用于胞内病毒，包括水痘-带状疱疹病毒、轮状病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲肝病毒。

步骤（1）为病毒的培养，主要为胞内病毒，病毒的释放需要裂解细胞方可完成，如水痘-带状疱疹病毒、轮状病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲肝病毒。病毒培养采用的细胞为疫苗行业常用的如Vero细胞、二倍体细胞等。采用细胞瓶或细胞工厂等平面培养的模式培养细胞。

步骤（2）中高渗收获液的配制为采用PBS为溶剂，将蔗糖按照40￥-60%的质量体积比加入PBS缓冲液中，至完全溶解，过滤除菌，备用。

步骤（3）和（4）中待病毒接种一定时间或细胞病变到CPE程度大于50%时弃培养上清液，加入步骤（2）中配制的高渗收获液，室温静置并显微镜下观察细胞状态，待细胞发生明显收缩时震摇细胞瓶或细胞工厂，收集病毒液。

步骤（5）中在收集的病毒液中加入无菌注射水，使细胞的渗透压瞬间变化，胞外水瞬间渗入细胞，引起细胞快速膨胀裂解。

步骤（6）中取样观察细胞破碎程度，收获的病毒液用于后续的生产工艺。

本发明提供的高渗透压收获液裂解细胞能在50分钟内使细胞发生明显收缩，震摇后细胞裂解比例为100%，且收获的病毒液滴度与现有技术相仿，无降低。本发明方法克服了以往工艺中上述各种病毒由于收获工艺的限制而不能大规模的采用平面培养的壁垒，为一种全新的病毒收获工艺，不仅适用于实验室小规模的研究，更适用于生产企业的大规模生产，具有很强的实用性、创新性和新颖性。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。

实施例1 高渗收获液的配制

于无菌环境中配制高渗收获液，步骤如下：

（1）按照表1内容，分别向PBS缓冲液中加入蔗糖，使蔗糖与PBS缓冲溶液的质量体积比（g/ml）满足表1的内容，充分溶解;共5组，其中A、E两组为对照组。

（2）维持pH值为7.0-7.5；

（3）过滤除菌，室温保存，备用。

（4）采用全自动冰点渗透压计法测定渗透压。

表1 高渗收获液成分表

实施例2 高渗收获液裂解细胞效力试验

采用T25细胞培养瓶培养Vero细胞和SLF-1细胞（保藏编号为CGMCC No.4875），带细胞长至单层后，用于高渗收获液裂解细胞效力试验。

（1）收获液配制

高渗收获液按照实施例1所述的配方进行配制。

（2）破碎细胞效力试验

将长至单层的Vero细胞和SLF-1细胞弃原生长液，用高渗收获液2-5ml清洗细胞表面1-2次，再加入1-3ml相同的高渗收获液，室温静置，计时并显微镜下观察细胞形态改变情况。待细胞发生明显收缩时，震摇细胞培养瓶，收集病毒液；向病毒液中加入5-10ml无菌注射水，使细胞瞬间裂解，取细胞悬液于显微镜下观察细胞破碎情况。

（3）试验结果见表2.

表2 高渗收获液破碎Vero和SLF-1细胞效力试验结果

本实施例试验结果显示：高渗透压收获液B、C、D和E组均可以在50分钟内使细胞发生明显收缩；A组的收获液由于渗透压低于1500mOsmol/kg，使细胞发生明显收缩的时间为120min；细胞发生明显收缩后，震摇A-E组的培养瓶后，细胞自培养瓶瓶壁脱落完全，加入注射水后，镜下观察无完整细胞，细胞全部裂解，且细胞碎片粒径较小。本实施例试验用的Vero和二倍体细胞（SLF-1、MRC-5）细胞实验结果无差异。

实施例3 病毒的培养、收获和病毒滴度测定

1、水痘病毒的培养和收获。将人胚肺成纤维二倍体细胞SLF-1接种至T25细胞培养瓶，待细胞长至单层，将Oka株水痘带状疱疹病毒（来自ATCC，编号为VR-795）工作种子按照MOI为0.001～0.1接种至SLF-1细胞，将接种病毒的细胞瓶置35.0±1.0℃吸附0.5-2小时；吸附结束后补加病毒MEM维持液，置35.0±1.0℃培养箱中继续培养48-96h，弃去培养液，分别加入实施例1所述的高渗透压收获液A-E组，室温静置15min；显微镜下观察细胞状态，待细胞发生明显收缩时震摇细胞瓶或细胞工厂，收集病毒液；加入无菌注射水，使细胞渗透压恢复至等渗；并进行细胞收缩时间、细胞脱落比例、细胞破碎情况和病毒滴度等各项检测；同时，设置冻融收获对照组。

2、轮状病毒的培养和收获。将Vero细胞接种至T25细胞培养瓶，待细胞长至单层，将采用胰蛋白酶激活后的G1型人牛（UK）重配轮状病毒（来自美国国立卫生院NIH）工作种子按照MOI为0.001～0.1接种至Vero细胞，将接种病毒的细胞瓶置37.0±1.0℃吸附0.5-2小时；吸附结束后补加病毒MEM维持液，置37.0±1.0℃培养箱中继续培养48-96h，弃去培养液，分别加入实施例1所述的高渗透压收获液A-E组，室温静置；显微镜下观察细胞状态，待细胞发生明显收缩时震摇细胞瓶或细胞工厂，收集病毒液；加入无菌注射水，使细胞渗透压恢复至等渗；并进行细胞收缩时间、细胞脱落比例、细胞破碎情况和病毒滴度等各项检测；同时，设置冻融收获对照组。

3、EV71病毒培养和收获。将人胚肺成纤维二倍体细胞SLF-1（保藏编号为CGMCC No.4875）接种至T25细胞培养瓶，待细胞长至单层，将EV71病毒（北京科兴中维有限公司）工作种子按照MOI为0.01-0.1接种至SLF-1细胞，添加2%牛血清病毒维持液，置36±1℃培养7天，弃去培养液，分别加入实施例1所述的高渗透压收获液A-E组，室温静置；显微镜下观察细胞状态，待细胞发生明显收缩时震摇细胞瓶或细胞工厂，收集病毒液；加入无菌注射水，使细胞渗透压恢复至等渗；并进行细胞收缩时间、细胞脱落比例、细胞破碎情况和病毒滴度等各项检测；同时，设置冻融收获对照组。

4、CA16病毒培养和收获。将人胚肺成纤维二倍体细胞SLF-1（保藏编号为CGMCC No.4875）接种至T25细胞培养瓶，待细胞长至单层，将CA16病毒（CGMCC No.5371）工作种子按照MOI为0.001-0.01接种至细胞，添加2%牛血清病毒维持液，置36±1℃培养3-5天，弃去培养液，分别加入实施例1所述的高渗透压收获液A-E组，室温静置；显微镜下观察细胞状态，待细胞发生明显收缩时震摇细胞瓶或细胞工厂，收集病毒液；加入无菌注射水，使细胞渗透压恢复至等渗；并进行细胞收缩时间、细胞脱落比例、细胞破碎情况和病毒滴度等各项检测；同时，设置冻融收获对照组。

5、甲肝病毒培养和收获。将Vero细胞接种至T25细胞培养瓶，待细胞长至单层，将甲肝病毒工作种子TZ84株（北京科兴生物制品有限公司）按照MOI为0.01-0.1接种至Vero细胞，添加病毒维持液，置33±1℃培养25-30天，弃去培养液，分别加入实施例1所述的高渗透压收获液A-E组，室温静置；显微镜下观察细胞状态，待细胞发生明显收缩时震摇细胞瓶或细胞工厂，收集病毒液；加入无菌注射水，使细胞渗透压恢复至等渗；并进行细胞收缩时间、细胞脱落比例、细胞破碎情况和病毒滴度等各项检测；同时，设置冻融收获对照组。

6、高渗透压收获液对病毒滴度的影响

试验结果如表3所示。

表3 采用高渗收获液收获病毒试验结果

本实施例结果显示：（1）高渗收获液B-E组均可以在50分钟内使细胞皱缩并全部脱落，加入注射水后使细胞100%裂解，病毒释放；裂解后的病毒收获液显微镜下观察无完整细胞，且细胞碎片粒径较小，便于后续工艺的纯化；E组由于渗透压较高要恢复等渗加入注射水量较多，病毒较大程度被稀释，使得滴度值较低；A组细胞收缩时间较长，震摇力量较大，对病毒有一定程度的损伤，病毒滴度值较低。（2）高渗收获液B-D组收获的病毒液与冻融组相比病毒滴度均无明显差异，结果说明B-D组高渗收获液可以高效的收获水痘-带状疱疹病毒、轮状病毒、EV71、CA16和甲肝病毒。（注：病毒滴度值偏差≤0.3lgCCID₅₀/ml视为可接受的检测误差范围，下同。）

实施例4 高渗透压法收获病毒工艺的放大试验

分别采用T175细胞培养瓶、二层细胞工厂（CF-2）、10层细胞工厂（CF-10）和40层细胞工厂（CF-40）制备单层细胞，按照实施例1所述的方法接种病毒和进行病毒培养，同时设置冻融对照组（通过冻融方式使细胞裂解，病毒释放）和上清对照组（待病变至一定程度或培养一定时间后直接收集培养上清液）。采用实施例6中配制的高渗透压收获液收获病毒，记录病毒完全脱落耗时和检测病毒滴度值。试验结果如表4-6所示。

表4 A组高渗透压收获液收获病毒工艺放大试验结果

表5 B组高渗透压收获液收获病毒工艺放大试验结果

表6 C组高渗透压收获液收获病毒工艺放大试验结果

本实施例结果表明，采用本发明所述的B-D组高渗透压收获液收获病毒的工艺能够放大至2层细胞工厂、10层细胞工厂和40层细胞工厂，病毒滴度与T25、T175细胞培养瓶收获的病毒滴度无差异；在进行10层和40层细胞工厂培养模式中，采用传统的冻融方式收获病毒由于时间过长影响病毒稳定性导致滴度下降；通过直接收集培养上清液的方式收获的病毒由于胞内病毒在培养过程中不能完全的释放而导致病毒滴度值较低；采用本发明所述的高渗透压法收获病毒对病毒的滴度无任何影响，其滴度值明显高于冻融对照组和上清对照组，在大规模的生产过程中能够提高病毒产量，具有明显的优势。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种高渗透压收获液在破碎细胞收获病毒中的应用，其特征在于，该高渗透压收获液的渗透压为1500～2500mOsmol/kg；

所述高渗透压收获液含有缓冲液PBS和蔗糖；所述蔗糖含量为40％-60％，所述％为蔗糖与缓冲液PBS的质量体积比，单位为g/ml；

所述的细胞为Vero细胞或SLF-1细胞；

所述的病毒为水痘病毒、轮状病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲型肝炎病毒。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓冲液PBS的配方为：0.876％氯化钠，0.031％二水合磷酸二氢盐和0.287％十二水合磷酸氢二盐，所述％为质量体积比，单位为g/ml。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高渗透压收获液通过以下方法配制得到，将蔗糖按照40％-60％的质量体积比加入PBS缓冲液中，至完全溶解，过滤除菌。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述应用为在制备病毒类疫苗或药物中的应用。

5.一种采用高渗透压收获液收获病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)培养病毒；所述的病毒为水痘病毒、轮状病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲型肝炎病毒；

(2)配制高渗透压收获液；所述高渗透压收获液的渗透压为1500～2500mOsmol/kg；其含有缓冲液PBS和蔗糖；该高渗透压收获液通过以下方法配制得到，将蔗糖按照40％-60％的质量体积比加入PBS缓冲液中，至完全溶解，过滤除菌即得；所述％为蔗糖与缓冲液PBS的质量体积比，单位为g/ml；

(3)当细胞出现病变并且CPE程度大于50％时，弃细胞培养液后加入高渗透压收获液，室温静置5-30分钟；所述的细胞为Vero细胞或SLF-1细胞；

(4)显微镜下观察细胞状态，待细胞发生明显收缩时震摇，使细胞脱壁，收集病毒液；

(5)向收获的病毒液中加注射水，使细胞渗透压恢复至等渗。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)采用细胞瓶或细胞工厂培养病毒。

7.权利要求5-6任一项所述的方法在制备用于预防或治疗水痘病毒、轮状病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲肝病毒所致疾病的疫苗或药物中的应用。