CN102120986B - 轮状病毒的细胞培养方法 - Google Patents
轮状病毒的细胞培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102120986B CN102120986B CN 201010563967 CN201010563967A CN102120986B CN 102120986 B CN102120986 B CN 102120986B CN 201010563967 CN201010563967 CN 201010563967 CN 201010563967 A CN201010563967 A CN 201010563967A CN 102120986 B CN102120986 B CN 102120986B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cell culture
- rotavirus
- dmem
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种轮状病毒的细胞培养方法，包括以下步骤：以10％小牛血清加高糖DMEM作为细胞生长液，将轮状病毒腹泻病人或动物粪便标本用0.1M的1×PBS制成10％悬液，经50μg/mL胰酶在37℃下作用1小时后接种于MA-104罗猴肾细胞，在37℃下吸附1h；以及加含5μg/mL胰酶的无血清DMEM细胞培养液，37℃下5％CO2转鼓培养3～4天，CPE达到90％时收获细胞培养液，冻融2次，作为下一代培养的接种物培养传代。其中，所述细胞生长液按照如下方式配制：在100mL细胞培养瓶中加入87mL DMEM培养基溶液及10mL小牛血清，并加入有3％的谷氨酰胺、PBS及7.5％NaHCO3溶液各1mL。其中，所述细胞培养液由含5μg/mL胰酶的DMEM中加入青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL制成。本发明的轮状病毒的细胞培养方法可适用于人或动物，通过对粪便标本的多次培养，效果可靠，重复性良好。
Description
【技术领域】
本发明涉及轮状病毒，特别涉及一种轮状病毒的细胞培养方法。
【背景技术】
轮状病毒(RotaVirus，RV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是各种幼龄动物非细菌性腹泻的主要病原之一。RV基因由11个不连续的dsRNA节段组成，其平均长度约为660～3300bp，分别编码6个结构蛋白(VP1，VP2，VP3，VP4，VP6，VP7)和5个非结构蛋白(NSP1，NSP2，NSP3，NSP4，NSP5)。RV在电镜下呈球形，无囊膜，由内向外拥有核衣壳、内衣壳、外衣壳三层蛋白质衣壳。根据RV群抗原的不同及病毒RNA末端指纹图谱的分析，可将该病毒共分为A～G七个群；根据其中和抗原VP7的差异可将A组RV分为14个G型(G1～G14)及21个P型(P1～P24)。
轮状病毒腹泻是由RV引起的胃肠道感染性腹泻，是流行广泛的人兽共患病，也是多种幼龄动物与婴幼儿的一种急性肠道传染病。临床上以呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱为特征，主要发生于5岁以内的儿童，是秋冬季引起小儿死亡的主要原因之一。几乎所有儿童在5岁以前都受到过RV感染。据统计，全球每年约有1.11亿-1.35亿例RV腹泻病例，导致65万名婴儿死亡。在我国，每年也约有1800万名婴幼儿患RV感染性胃肠炎，死亡3-4万例。
自从1968年在美国阿拉斯加州一农场犊牛腹泻病例中分离到牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)后，随后许多国家都有BRV感染的报道，我国亦有牛感染轮状病毒的报道。RV主要感染1～7日龄的犊牛，可引起犊牛消化道机能紊乱，感染牛、犬和猪往往发生死亡，病死率可达50％。据报道英国犊牛RV腹泻的发病率为60～80％，死亡率为0～50％。该病发生于世界各地，主要造成犊牛腹泻，给犊牛的生长和生产带来很大的经济损失。
目前尚无治疗牛RV感染的特效药物，常规治疗效果不佳，因此仍以疫苗预防为主。而细胞分离培养的成功与否是疫苗研制的关键之一。
RV分离培养比较困难，应用易感细胞并适当处理是细胞培养RV的关键环节。RV的分离培养在最初多采用原代细胞，后来使用易感细胞系恒河猴肾传代细胞(MA-104)。20世纪80年代我国应用MA-104细胞系分离到BRV，开始了BRV的研究。国外已获批准的人用轮状病毒疫苗多采用非洲绿猴肾传代细胞
(Vero)或胎猴一倍体细胞(FRhL-2)培养，一些尚在研发中的疫苗也有采用原代猴肾细胞或鸡胚细胞培养制备的疫苗。《中国药典》规定原代细胞可使用原始培养的细胞或传了少数几代的细胞，《中国生物制品规程》中规定轮状病毒疫苗生产用细胞基质为原代或一代新生小牛肾细胞。
由此可见，对于RV的细胞培养要求各不相同，而且培养的方法亦有差异，尤其是人和动物轮状病毒对细胞的适应性也不相同，BRV和猪轮状病毒(Porcine RotaVirus，PRV)对细胞的适应性也不同。
【发明内容】
有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明提供一种同时适用于人和动物的轮状病毒的细胞培养方法。
一种轮状病毒的细胞培养方法，包括以下步骤：以10％小牛血清加高糖DMEM作为细胞生长液，将轮状病毒腹泻病人或动物粪便标本用0.1M的1×PBS制成10％悬液，经50μg/mL胰酶在37℃下作用1小时后接种于MA-104罗猴肾细胞，在37℃下吸附1h；以及加含5μm/mL胰酶的无血清DMEM细胞培养液，37℃下5％CO2转鼓培养3～4天，CPE达到90％时收获细胞培养液，冻融2次，作为下一代培养的接种物培养传代。其中，所述细胞生长液按照如下方式配制：在100mL细胞培养瓶中加入87mL DMEM培养基溶液及10mL小牛血清，并加入有3％的谷氨酰胺、PBS及7.5％NaHCO3溶液各1mL。其中，所述细胞培养液由含5μg/mL胰酶的DMEM中加入青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL制成。
本发明的轮状病毒的细胞培养方法可适用于人或动物，通过对粪便标本的多次培养，效果可靠，重复性良好。
【具体实施方式】
为更好地理解本发明，以下将结合具体实例对发明进行详细的说明。
如前文所述，通过对患病幼儿、犊牛、仔猪和仔犬等轮状病毒阳性粪便样品的处理与培养，以期为研发快速准确的诊断试剂盒和有效疫苗奠定基础，本发明提供一种轮状病毒的细胞培养方法。
1.粪便样本的采集与检测
采集动物医学临床和养殖场疑似轮状病毒性腹泻的犊牛、仔猪和幼犬粪便样本68、58和35份，用轮状病毒酶标诊断试剂盒检测，检测出阳性样本17、5和20例。同时使用ELISA检测的幼儿阳性粪样10份作为样本。
2.细胞株和标准病毒株
采用罗猴肾细胞株(MA-104)、猪轮状病毒参考株(AV-55)及牛轮状病毒参考株(AV52，G6血清型)。
3.主要试剂与设备仪器
采用的试剂包括：小牛血清(Calf serum)、DMEM细胞培养基(Dulbecco′sModified Eagle Medium，DMEM)、胰蛋白酶(trypsin)、磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline，PBS)、谷氨酰胺(Glutamine)、0.01mol/L PBS(pH 7.2)，D-Hanks液，聚乙二醇(Polyethylene glycol)。
采用的仪器有：美国Rayto RT-6000全自动酶标仪、电热恒温培养箱、C2O2培养箱及德国Leica显微镜。
4.溶液及其培养基的制备
4.1胰蛋白酶溶液
用1×PBS配制成0.25％溶液，过滤除菌。
4.2DMEM(高糖)培养基
将DMEM配制成9.4g/L的培养基溶液或按照产品说明书。
4.3细胞生长液
A液为10％胎牛血清+高糖DMEM培养液；B液为5％小牛血清+高糖DMEM培养液；C液为10％小牛血清+高糖DMEM培养液。
在100mL细胞培养瓶中加入87mL DMEM培养基溶液及10mL血清，加入3％的谷氨酰胺、PBS及7.5％NaHCO3溶液各1mL，再加入青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL。
4.5细胞培养液
甲液：2μg/mL胰酶，DMEM；乙液：3μg/mL胰酶，DMEM；丙液：5μg/mL胰酶DMEM。甲、乙、丙液中均加入青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL。
5.实验方法
5.1样本处理与检测
5.1.1制备10％的粪便样本悬液
取粪便样本0.2g或200μL移至EP管中，加入1×PBS(0.1M)标本处理液，振荡3次，每次20s。然后静置10min，8000r/min离心5min，吸取上清，用0.22nm的膜过滤除菌，制备10％成样本悬液，或分装后-20℃保存。
5.1.2样本检测
取适量粪便样本悬液，移入EP管中，在包被板的每个孔加入粪便样本悬液50μL，并设阴性、阳性对照各两孔及空白，每孔50μL。每孔再加入50μL酶结合物，空白除外。
封口后37℃水浴30min，甩去板中液体，拍干。如此反复5次。
每孔加入50μL底物A和50μL底物B，37℃水浴10min，再加入50μL终止液，震荡混匀。用酶标仪测定OD450值。
5.1.3阳性样本处理
经ELISA检测呈阳性的样本，用0.1M的1×PBS制成10％悬液，4℃下3000r/min，离心20min，取上清，4℃下再10000r/min，离心30min，再取上清， 加入青霉素、链霉素和庆大霉素，混合后置4℃冰箱过夜。病毒悬液滤过除菌后，缓慢滴加浓度为400g/L的PEG6000，至终浓度70g/L，调节至PH7.5，4℃冰箱过夜，即得到阳性处理样品(+)。另取ELISA检测呈阴性的样品，经上述步骤进行处理，制成阴性处理样品(-)，作为对照。
5.2MA-104细胞的复苏与培养
取出细胞冻存管，于37℃温水融化，放入10mL细胞生长液的培养瓶中，并用细胞生长液冲洗冻存管数次，5％C2O2培养箱培养2～3h取出细胞瓶，倒去细胞生长液，移入13～15mL新细胞生长液，再放入5％C2O2培养箱培养。
将MA-104细胞分为三组，分别接种于含有10mLA液、B液和C液的细胞生长液中，5％C2O2 37℃培养箱培养，每3～5d传代1次；如此重复，直至细胞长到90％以上进行传代。传代时取长满单层的细胞，用少量PBS溶液清洗细胞表面，加入胰酶消化液(2mL/75cm2)37℃消化，观察到大部分细胞肿胀、变圆时，轻拍并翻转细胞瓶，使细胞自瓶壁脱落，补充适量含10％小牛血清的DMEM细胞生长液，用吸管上下吹打数次以打散细胞团块，混合均匀后，按1：2比例移至新的细胞瓶中，5％C2O2，37℃继续培养。
用倒置显微镜观察细胞生长情况，比较MA-104细胞在三种细胞生长液中的生长情况，以选择最佳细胞生长液。
表1.MA-104细胞在不同细胞生长液的生长情况
注：方差检验得出三组间细胞贴壁的时间差异显著(p＞0.05)。
结果表明用C细胞生长液培养时MA-104细胞贴壁较快，生长良好，成本较低；细胞接毒后18h出现明显的细胞病变(CPE)，当CPE达到90％的时候开始收毒。培养的最佳条件为5％C2O2和37℃。
5.3病毒的制备与细胞接毒
吸取上述粪样悬液1mL，加入含50μg/mL胰酶的DMEM营养液中激活1.5h，期间摇匀3～5次，以备接毒。
取生长至90％的MA-104细胞，加入5mL胰酶消化液，消化吹打细胞，成细胞悬液，将细胞加至96孔微量培养板中，5％C2O2培养2d。
5.4病毒的培养
将胰酶处理过的RV接种于生长良好MA-104细胞中，37℃吸附1h，期间摇匀2～3次，取上清，分为四组，分别加5～8mL甲液、乙液和丙液(分别含胰蛋白酶2μg/mL、3μg/mL和5μg/mL的细胞培养液)，对照组不做任何处理。37℃ 5％ C2O2培养箱培养3～4d。CPE达到90％时收获，收获的病毒液4℃下12000r/min，离心20min，取上清冻融2次，分装，-80℃冻存，作下一代培养物的接种物。
结果表明RV在丙液中分离培养最好，CPE为100％(表2)。将分离培养的病毒经聚丙烯酰胺凝胶电泳后结果显示病毒核酸呈4∶2∶3∶2排列，与参考株NCDV相似。
表2.不同细胞培养液中RV引起的CPE
综上实验得出RV的MA-104细胞培养的最佳方法是：将轮状病毒腹泻病人或动物粪便标本经50μg/mL胰酶在37℃下作用1小时后接种于罗猴肾细胞，在37℃下吸附1h；加含5μg/mL胰酶(无血清)的DMEM细胞培养液，37℃下5％C2O2转鼓培养3天，CPE达到90％时收获细胞培养液，冻融2次，作为下一代培养的接种物培养传代。
本技术经过对犊牛、仔猪、仔犬及幼儿粪便标本的多次培养，效果可靠，重复性良好。与传统的轮状病毒MA-104细胞培养方法相比，本技术具有操作简便、条件稳定、重复性强、时间短、成本低廉、接种病毒后易出现CEP等优点，并可用于RV的大规模传代培养，适用于后续诊断试剂盒和疫苗的研发与生产。
以上所述实施示例仅表达了本发明的部分实施方式，其描述较为具体和详 细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (1)
1.一种轮状病毒的细胞培养方法，包括以下步骤：
以10％小牛血清加高糖DMEM作为细胞生长液，将轮状病毒腹泻病人或动物粪便标本用0.1M的1×PBS制成10％悬液，经50μg/mL胰酶在37℃下作用1小时后接种于MA-104罗猴肾细胞，在37℃下吸附1h；以及
加含5μg/mL胰酶的无血清DMEM细胞培养液，37℃下5％CO2转鼓培养3～4天，CPE达到90％时收获细胞培养液，冻融2次，作为下一代培养的接种物培养传代；
其中，所述细胞生长液按照如下方式配制：在100mL细胞培养瓶中加入87mL DMEM培养基溶液及10mL小牛血清，并加入有3％的谷氨酰胺、PBS及7.5％NaHCO3溶液各1mL；
其中，所述细胞培养液由含5μg/mL胰酶的DMEM中加入青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL制成。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010563967 CN102120986B (zh) | 2010-11-24 | 2010-11-24 | 轮状病毒的细胞培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010563967 CN102120986B (zh) | 2010-11-24 | 2010-11-24 | 轮状病毒的细胞培养方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102120986A CN102120986A (zh) | 2011-07-13 |
| CN102120986B true CN102120986B (zh) | 2013-07-17 |
Family
ID=44249654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010563967 Expired - Fee Related CN102120986B (zh) | 2010-11-24 | 2010-11-24 | 轮状病毒的细胞培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102120986B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109988811A (zh) * | 2019-05-30 | 2019-07-09 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种微生物快速检测培养基及其制备方法和应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117070475B (zh) * | 2023-10-13 | 2023-12-29 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 牛轮状病毒无血清悬浮培养方法及其产品和应用 |
-
2010
- 2010-11-24 CN CN 201010563967 patent/CN102120986B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 宋昌军.猪轮状病毒实时定量荧光PCR检测方法的建立.《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》.2010,22页2.2.1-2.2.3.1以及23页2.3.2. * |
| 王鹏雁等.猪轮状病毒的细胞培养.《石河子大学学报(自然科学版)》.2002,第6卷(第4期),第283-284页. * |
| 裴银辉等.轮状病毒分离与培养方法的建立.《华北煤炭医学院学报》.2007,第9卷(第1期),全文. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109988811A (zh) * | 2019-05-30 | 2019-07-09 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种微生物快速检测培养基及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102120986A (zh) | 2011-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102949718B (zh) | 猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗 | |
| CN102120768B (zh) | 利用生物反应器生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的方法 | |
| CN111632137B (zh) | 猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN106591242A (zh) | 一株犬细小病毒毒株cpv‑yh及其应用 | |
| CN103436583B (zh) | 一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法、其制品及杂交瘤细胞 | |
| CN105821006A (zh) | 变异猪流行性腹泻病毒弱毒yn150株及其应用 | |
| CN111041002A (zh) | 猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN105866408B (zh) | 一种四种肠道病毒联合检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 | |
| CN102988972B (zh) | 一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法 | |
| CN103509761B (zh) | 表达猪圆环病毒ⅱ型orf2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株及其制备方法 | |
| CN106420842A (zh) | 一种轮状病毒感染乳鼠实验模型的构建方法 | |
| CN107550943A (zh) | 人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法 | |
| CN110841064B (zh) | 一种犬腺病毒ⅰ型灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN106591244A (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒、灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN105969737A (zh) | 一种规模化生产轮状病毒疫苗的方法 | |
| CN101928782A (zh) | 一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒及其检测方法 | |
| CN102120986B (zh) | 轮状病毒的细胞培养方法 | |
| CN114525261A (zh) | 一种猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN102727877A (zh) | 一种生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（jxa1-r株）的方法及其应用 | |
| CN108421037A (zh) | 一种猪伪狂犬病/猪细小病毒病二联灭活疫苗及其悬浮培养制备方法 | |
| CN101235363B (zh) | 猪传染性胃肠炎华毒弱毒疫苗株及其应用 | |
| CN103864931B (zh) | 一种伪狂犬病标准阳性血清的制备及其冻干保存方法 | |
| CN102965345B (zh) | 猪细小病毒、疫苗组合物及其应用 | |
| CN101380470B (zh) | 一种猪细小病毒活疫苗 | |
| CN103614346B (zh) | 一种采用高渗透压收获液收获病毒的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130717 Termination date: 20131124 |