CN107550943A - 人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法，其中所述建立步骤为：随机选择体重为3.5g‑5.0之间的SPF级别4‑5日龄NIH乳鼠为实验动物，采集粪便，采用胶体金法进行轮状病毒抗原检测；选取结果为阴性乳鼠10只为模型组，每只乳鼠经口腔灌入0.2ml人源轮状病毒离心收获液；选取结果为阴性乳鼠10只为对照组，每只乳鼠经口腔灌入0.2ml Vero细胞冻融后离心上清液；模型组8h后测粪便中轮状病毒抗原，结果呈阳性定义为乳鼠感染轮状病毒，实验模型建模成功；对照组的乳鼠，用金标法检测粪便中轮状病毒抗原，结果呈阴性；优点为：本模型能够模拟婴幼儿轮状病毒感染急性胃肠炎的腹泻等特征，快速构建轮状病毒感染乳鼠实验模型。

Description

人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法

技术领域

本发明涉及一种病毒毒株毒力分析的动物模型建立方法，尤其是人轮状病毒研究毒株毒力分析的动物模型建立方法。

背景技术

目前，关于轮状病毒动物模型，有以大鼠、兔子、悉生小猪、无菌牛、灵长类动物作为实验动物构建的，存在或建模成功率不高，或实验动物价格昂贵、饲养条件高。因此有必要建立一种稳定、操作简便、经济高效、符合婴幼儿轮状病毒性急性胃肠炎特征的实验动物模型。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术中存在的问题，提供一种可以模拟婴幼儿轮状病毒感染过程并诱发急性胃肠炎症状、操作简便、无需特殊孕产和饲养条件、经济高效的轮状病毒感染乳鼠实验模型。

本发明的技术方案包括：人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法，其建立步骤为：

1）随机选择体重为3.5g-5.0之间的SPF级别4-5日龄NIH乳鼠为实验动物，实验前，采集粪便，采用胶体金法进行轮状病毒抗原检测；

2）选取结果为阴性4-5日龄NIH乳鼠10只设定为模型组，每只乳鼠分别采用高压灭菌的自制小鼠灌胃针一次性经口腔灌入0.2ml 人源轮状病毒离心收获液；

3）选取结果为阴性4-5日龄NIH乳鼠10只设定为对照组，每只乳鼠分别采用高压灭菌的自制小鼠灌胃针一次性经口腔灌入0.2ml Vero细胞冻融后离心上清液；

4）模型组的10只乳鼠在灌入轮状病毒8h后，出现黄色软便，肛门口有稀便痕迹，用无菌棉签收集粪便于无菌试管中，用金标法检测粪便中轮状病毒抗原，结果均呈阳性，定义为乳鼠感染轮状病毒，实验模型建模成功；

5）之后1～4天，连续采集乳鼠粪便进行轮状病毒抗原检测；对照组的乳鼠，用金标法检测粪便中轮状病毒抗原，结果均呈阴性。

乳鼠选用产仔率和存活率也较高的NIH小鼠。

乳鼠饲养方式为饲喂辐照灭菌的饲料和高压灭菌的饮用水。

乳鼠在灌胃前后分别禁奶至少2小时。

所述轮状病毒为G1P[8]型人源轮状病毒WA株。

所述Vero细胞在含10%类胎牛血清，IMDM培养液中生长成单层。

轮状病毒扩增方法为：

1）Vero细胞在培养瓶中生长至单层时接种人轮状病毒：将人源轮状病毒WA株从-60℃冰箱中取出，室温溶解；将长成单层的Vero细胞用pH为7.2的无菌PBS润洗2次，接种病毒液，并加入含有胰蛋白酶的病毒维持液，36.5℃ 5%二氧化碳孵育2h后，弃去病毒液，PBS润洗两次，加入含胰蛋白酶的、无血清的IMDM培养液；

2）然后放入36.5℃、5%二氧化碳中培养并观察，至病毒感染Vero细胞病变达到+++～++++时，将培养瓶放入-60℃冻存，再4℃融解，如此反复冻融5次，室温4000rpm离心15min，取上清液；

3）再采用以上方法扩大培养一次，收获足量离心后病毒收获液，混匀后分装至15ml离心管，-60℃保存。

病毒滴度测定方法为：

1）用不含血清的IMDM培养液将其病毒按照1：10系列稀释成10^-1、10^-2、10^-3.…10^-8等8个浓度梯度，将培养成单层Vero细胞的96孔板用PBS润洗2次，再将不同稀释度的病毒加入到96孔细胞培养板中；

2）放入36.5℃、5%二氧化碳中孵育2h后吸出病毒液，加入不含血清的细胞培养液，200uL/孔；放入36.5℃、5%二氧化碳中孵育，连续观察；

3）当能够出现细胞病变CPE的最低稀释度的病毒孔中不再继续出现CPE时，计数每个稀释度出现CPE的细胞孔数，按照Reed-Munch方法计算病毒的TCID₅₀。

本发明的有益效果为：本模型能够模拟婴幼儿轮状病毒感染急性胃肠炎的腹泻等特征，快速构建轮状病毒感染乳鼠实验模型。本发明采用NIH小鼠，该小鼠产仔率高，一般一胎13-16只，一方面可获得足够数量的感染轮状病毒的乳鼠，另一方面降低不同窝乳鼠带来的系统误差。本发明的技术方案建模时间短，12h即可得到感染轮状病毒的乳鼠，且乳鼠感染病毒的时间可持续至少5天，且症状稳定，能稳定观察到腹泻症状，检测到粪便排毒。采用本发明的技术方案建立的感染轮状病毒的乳鼠实验模型稳定性好，可重复，建模成功性高几乎为100%。细胞和病毒培养过程中均不添加抗生素，减少了抗生素对诱导腹泻症状的干扰。

附图说明

图1为实施例1中正常组乳鼠在48-72小时后的小肠病理切片。

图2为实施例1中模型组乳鼠在48-72小时后的小肠病理切片。

具体实施方式

（一）轮状病毒培养

1、细胞培养：

Vero细胞在含10%类胎牛血清，IMDM培养液中生长和传代。

2、病毒扩增：

Vero细胞在培养瓶中生长至单层时接种人轮状病毒（WA株）。将人源轮状病毒WA株从-60℃冰箱中取出，室温溶解。将长成单层的Vero细胞用pH为7.2的无菌PBS润洗2次，接种病毒液，并加入含有胰蛋白酶的病毒维持液， 36.5℃ 5%二氧化碳孵育2h后，弃去病毒液，PBS润洗两次，加入含胰蛋白酶的、无血清的IMDM培养液。然后放36.5℃、5%二氧化碳中培养并观察，至病毒感染Vero细胞病变达到+++～++++时，将培养瓶放入-60℃冻存，再4℃融解，如此反复冻融5次，室温4000rpm离心15min，取上清；再采用以上方法扩大培养一次，收获足量离心后病毒收获液。混匀后分装至15ml离心管，-60℃保存。

3、病毒滴度测定：

用不含血清的IMDM培养液将其病毒按照1：10系列稀释成10-1、10-2、10-3.…10-8等8个浓度梯度，将培养成单层Vero细胞的96孔板用PBS润洗2次，再将不同稀释度的病毒加入到96孔细胞培养板中。放入36.5℃、5%二氧化碳中孵育2h后吸出病毒液，加入不含血清的细胞培养液，200uL/孔。放入36.5℃、5%二氧化碳中孵育，连续观察。当能够出现细胞病变CPE的最低稀释度的病毒孔中不再继续出现CPE时，计数每个稀释度出现CPE的细胞孔数，按照Reed-Munch方法计算病毒的TCID50。

（二）动物实验模型构建

1、随机选择体重为3.5g-5.0之间的SPF级别 4-5日龄NIH乳鼠为实验动物，实验前，采集粪便，采用胶体金法进行轮状病毒抗原检测。饲喂辐照灭菌的饲料和高压灭菌的饮用水。

2、选取结果为阴性4-5日龄NIH乳鼠10只设定为模型组，每只乳鼠分别用Iml一次性注射器，采用高压灭菌的自制小鼠灌胃针一次性经口腔灌入0.2ml Wa株病毒离心收获液。所有乳鼠在灌胃前后均禁奶至少2小时。

3、同时，选取结果为阴性4-5日龄NIH乳鼠10只设定为对照组，每只乳鼠分别采用高压灭菌的自制小鼠灌胃针一次性经口腔灌入0.2ml Vero细胞冻融后离心上清。所有乳鼠在灌胃前后均禁奶至少2小时。

4、各组动物隔离饲养观察。

（三）效果测定：

1、抗原检测

模型组的10只乳鼠在灌入轮状病毒8h后，均出现黄色软便，肛门口有稀便痕迹，用无菌棉签收集粪便于无菌试管中，用金标法检测粪便中轮状病毒抗原，结果均呈阳性，定义为乳鼠感染轮状病毒，实验模型建模成功，成功率为100%。之后1～4天，连续采集乳鼠粪便进行轮状病毒抗原检测，10只乳鼠粪便均能检测到轮状病毒抗原，可稳定持续四天。乳鼠腹泻和抗原检出情况如表1。而对照组的乳鼠，用金标法检测粪便中轮状病毒抗原，结果均呈阴性。

表1接种轮状病毒或细胞冻融后离心上清各组乳鼠腹泻和抗原检出情况

注：“+”腹泻或检出抗原；“-”未腹泻或未检出抗原。

2、乳鼠观察

模型组的10只乳鼠在灌入轮状病毒后，均出现精神反应差且活动减少、皮毛光泽差的情况。随后，10只乳鼠逐渐出现腹胀腹泻现象，肛门红肿，尾部有粪便粘附，皮肤干燥褶皱增多，肛周有大便污染痕迹。在接种后第24-72小时10只乳鼠腹泻达到高峰，此后症状逐渐减轻，至第120小时腹泻情况消失。

而对照组的乳鼠精神反应佳，活力充沛，皮肤红润有弹性，肛门无红肿，粪便性状正常。

4、乳鼠小肠病理检测

第48-72小时的病理切片显示，正常组乳鼠（见图1）的小肠粘膜层较厚，绒毛密集。模型组乳鼠（见图2）的小肠肌层变薄，粘膜肿胀、充血，大量淋巴细胞浸润，小肠绒毛发生萎缩，肠腔上皮细胞完整性破坏，胞内可观察到空泡化。

Claims (8)

1.人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法，其特征在于:所述建立步骤为：

1）随机选择体重为3.5g-5.0之间的SPF级别4-5日龄NIH乳鼠为实验动物，实验前，采集粪便，采用胶体金法进行轮状病毒抗原检测；

2）选取结果为阴性4-5日龄NIH乳鼠10只设定为模型组，每只乳鼠分别采用高压灭菌的自制小鼠灌胃针一次性经口腔灌入0.2ml 人源轮状病毒离心收获液；

3）选取结果为阴性4-5日龄NIH乳鼠10只设定为对照组，每只乳鼠分别采用高压灭菌的自制小鼠灌胃针一次性经口腔灌入0.2ml Vero细胞冻融后离心上清液；

4）模型组的10只乳鼠在灌入轮状病毒8h后，出现黄色软便，肛门口有稀便痕迹，用无菌棉签收集粪便于无菌试管中，用金标法检测粪便中轮状病毒抗原，结果均呈阳性，定义为乳鼠感染轮状病毒，实验模型建模成功；

5）之后1～4天，连续采集乳鼠粪便进行轮状病毒抗原检测；对照组的乳鼠，用金标法检测粪便中轮状病毒抗原，结果均呈阴性。

2.根据权利要求1所述的人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法，其特征在于:乳鼠选用产仔率和存活率也较高的NIH小鼠。

3.根据权利要求1所述的人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法，其特征在于:乳鼠饲养方式为饲喂辐照灭菌的饲料和高压灭菌的饮用水。

4.根据权利要求1所述的人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法，其特征在于:乳鼠在灌胃前后分别禁奶至少2小时。

5.根据权利要求1所述的人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法，其特征在于:轮状病毒为G1P[8]型人源轮状病毒WA株。

6.根据权利要求1所述的人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法，其特征在于:所述Vero细胞在含10%类胎牛血清，IMDM培养液中生长成单层。

7.根据权利要求1或5或6所述的人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法，其特征在于:

所述轮状病毒还包括扩增方法如下：

1）Vero细胞在培养瓶中生长至单层时接种人轮状病毒：将人源轮状病毒WA株从-60℃冰箱中取出，室温溶解；将长成单层的Vero细胞用pH为7.2的无菌PBS润洗2次，接种病毒液，并加入含有胰蛋白酶的病毒维持液，36.5℃ 5%二氧化碳孵育2h后，弃去病毒液，PBS润洗两次，加入含胰蛋白酶的、无血清的IMDM培养液；

2）然后放入36.5℃、5%二氧化碳中培养并观察，至病毒感染Vero细胞病变达到+++～++++时，将培养瓶放入-60℃冻存，再4℃融解，如此反复冻融5次，室温4000rpm离心15min，取上清液；

3）再采用以上方法扩大培养一次，收获足量离心后病毒收获液，混匀后分装至15ml离心管，-60℃保存。

8.根据权利要求1或5或6或7所述的人轮状病毒导致病理损伤和腹泻乳鼠动物模型的建立方法，其特征在于:

所述病毒滴度测定方法为：

1）用不含血清的IMDM培养液将其病毒按照1：10系列稀释成10^-1、10^-2、10^-3.…10^-8等8个浓度梯度，将培养成单层Vero细胞的96孔板用PBS润洗2次，再将不同稀释度的病毒加入到96孔细胞培养板中；

2）放入36.5℃、5%二氧化碳中孵育2h后吸出病毒液，加入不含血清的细胞培养液，200uL/孔；放入36.5℃、5%二氧化碳中孵育，连续观察；

3）当能够出现细胞病变CPE的最低稀释度的病毒孔中不再继续出现CPE时，计数每个稀释度出现CPE的细胞孔数，按照Reed-Munch方法计算病毒的TCID₅₀。