CN113975412A - 一种评价轮状病毒疫苗有效性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种评价轮状病毒疫苗有效性的方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种评价轮状病毒疫苗有效性的方法，所述方法先使用待评价的轮状病毒疫苗对乳鼠进行免疫，再使用抗酸保护剂和轮状病毒对乳鼠进行灌胃，最后通过观察动物的腹泻情况对轮状病毒疫苗的有效性进行评价；研究发现，在使用轮状病毒进行攻毒前，或者，在使用轮状病毒进行攻毒时，给大日龄乳鼠灌胃抗酸保护剂，可有效提高大日龄乳鼠的轮状病毒发病率以及模型稳定性，因此，使用此方法评价轮状病毒疫苗有效性，可突破乳鼠的日龄限制，完成疫苗的完整免疫流程，在轮状病毒疫苗有效性的评价中也极具应用前景。

Description

一种评价轮状病毒疫苗有效性的方法
技术领域
本发明涉及一种评价轮状病毒疫苗有效性的方法，属于生物技术领域。
背景技术
轮状病毒（Rotavirus，RV）是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科，是引起五岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体之一，全球每年感染人数上亿，造成死亡人数数十万。在我国，每年大约有1000万婴幼儿患轮状病毒感染性胃肠炎，占婴幼儿人数的1/4，是引起婴幼儿严重腹泻的最主要病原。轮状病毒在1973年首次被发现，但至今仍无特效药，并且，现有的轮状病毒疫苗在不同地区的保护效果差异巨大且存在安全问题，因此，轮状病毒致病机制的研究和安全、高效疫苗的开发成为了当务之急，而有效的动物模型是致病机制研究和疫苗开发的重要环节和工具。
目前，轮状病毒动物模型的研究主要集中在乳鼠动物模型。在日龄选择上均以7日龄乳鼠为研究对象（具体可见文献“陈军华. 轮状病毒感染动物模型建立及其发病机制研究 [D]; 重庆医科大学, 2007.”、“林海军. 轮状病毒乳鼠动物模型的建立与初步应用[D]; 厦门大学.”和“乔洪图. 轮状病毒动物模型的构建及ZTR--68株灭活轮状病毒疫苗的体内保护性实验 [D]; 北京协和医学院(清华大学医学部)&中国医学科学院.”）。但是，由于疫苗免疫至少经过一针、两针或以上的免疫流程，而7日龄乳鼠日龄太小无法完成免疫流程，使得7日龄乳鼠的动物模型无法用来评估轮状疫苗的免疫效果，因此，需要大日龄乳鼠的攻毒模型来评估疫苗的免疫效果。
然而，乳鼠日龄对轮状病毒的发病率有明显的影响，日龄越大的乳鼠轮状病毒发病率越低，这严重阻碍了轮状病毒大日龄乳鼠攻毒模型的构建，因此，亟需找到提高大日龄乳鼠轮状病毒发病率以及模型稳定性的方法，以用于评估轮状病毒疫苗的有效性。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种评价轮状病毒疫苗有效性的方法，所述方法包括如下步骤：
免疫步骤：使用轮状病毒疫苗对动物进行免疫；
攻毒步骤：免疫结束后，先给动物灌胃抗酸保护剂，再给动物灌胃轮状病毒；或者，给动物灌胃抗酸保护剂和轮状病毒的混合物；
评价步骤：攻毒结束后，观察动物的腹泻情况。
在本发明的一种实施方式中，所述动物为乳鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述乳鼠为昆明小鼠乳鼠、BALB/c小鼠乳鼠、Swiss小鼠乳鼠或ICR小鼠乳鼠中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述乳鼠为3~16日龄的乳鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述乳鼠为7~16日龄的乳鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述抗酸保护剂为己二酸二钠、碳酸氢钠、琥珀酸钠、枸橼酸钠、苹果酸钠或乙酸钠中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述攻毒步骤中，先以50~500μL/只的剂量给动物灌胃浓度为0.1~2M的抗酸保护剂溶液，1~30min后，再以3.0~10.0 lgCCID50/只的剂量给动物灌胃轮状病毒；或者，所述攻毒步骤中，以50~500μL/只的剂量给动物灌胃含有3.0~10.0lgCCID50轮状病毒的0.1~2M抗酸保护剂溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述攻毒步骤中，先以50~200μL/只的剂量给动物灌胃浓度为0.3~1.5M的抗酸保护剂溶液，5~20min后，再以3.0~10.0 lgCCID50/只的剂量给动物灌胃轮状病毒；或者，所述攻毒步骤中，以50~200μL/只的剂量给动物灌胃含有3.0~10.0lgCCID50/只轮状病毒的0.3~1.5M抗酸保护剂溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述腹泻情况包括动物的腹泻率或腹泻严重程中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述腹泻率的计算公式为：腹泻率=发生腹泻的乳鼠数量/乳鼠总数量×100%。
在本发明的一种实施方式中，所述腹泻严重程度的评价方法为：观察乳鼠粪便形态进行打分，共分4档，分别对应1~4分，打分标注如下：1分：黄色软便；2分：黄色稀便，量少，成分以固体为主，含有少量液体；3分：黄色稀便，量中等，成分以液体为主，含有部分固体；4分：大量水样腹泻，肛周有大量粪便污染，身体其他部位也会被粪便污染，比如腹部、腿部。
在本发明的一种实施方式中，所述轮状病毒疫苗为轮状病毒减毒活疫苗或轮状病毒灭活疫苗。
本发明还提供了上述方法在评价轮状病毒疫苗有效性中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述轮状病毒疫苗为轮状病毒减毒活疫苗或轮状病毒灭活疫苗。
本发明还提供了一种评价轮状病毒毒株毒力的方法，所述方法包括如下步骤：
攻毒步骤：先给动物灌胃抗酸保护剂，再给动物灌胃轮状病毒；或者，给动物灌胃抗酸保护剂和轮状病毒的混合物；
评价步骤：攻毒结束后，观察动物的腹泻情况。
在本发明的一种实施方式中，所述动物为乳鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述乳鼠为昆明小鼠乳鼠、BALB/c小鼠乳鼠、Swiss小鼠乳鼠或ICR小鼠乳鼠中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述乳鼠为3~16日龄的乳鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述乳鼠为7~16日龄的乳鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述抗酸保护剂为己二酸二钠、碳酸氢钠、琥珀酸钠、枸橼酸钠、苹果酸钠或乙酸钠中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述攻毒步骤中，先以50~500μL/只的剂量给动物灌胃浓度为0.1~2M的抗酸保护剂溶液，1~30min后，再以3.0~10.0 lgCCID50/只的剂量给动物灌胃轮状病毒；或者，所述攻毒步骤中，以50~500μL/只的剂量给动物灌胃含有3.0~10.0lgCCID50轮状病毒的0.1~2M抗酸保护剂溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述攻毒步骤中，先以50~200μL/只的剂量给动物灌胃浓度为0.3~1.5M的抗酸保护剂溶液，5~20min后，再以3.0~10.0 lgCCID50/只的剂量给动物灌胃轮状病毒；或者，所述攻毒步骤中，以50~200μL/只的剂量给动物灌胃含有3.0~10.0lgCCID50/只轮状病毒的0.3~1.5M抗酸保护剂溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述腹泻情况包括动物的腹泻率或腹泻严重程中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述腹泻率的计算公式为：腹泻率=发生腹泻的乳鼠数量/乳鼠总数量×100%。
在本发明的一种实施方式中，所述腹泻严重程度的评价方法为：观察乳鼠粪便形态进行打分，共分4档，分别对应1~4分，打分标注如下：1分：黄色软便；2分：黄色稀便，量少，成分以固体为主，含有少量液体；3分：黄色稀便，量中等，成分以液体为主，含有部分固体；4分：大量水样腹泻，肛周有大量粪便污染，身体其他部位也会被粪便污染，比如腹部、腿部。
本发明还提供了上述方法在评价轮状病毒毒株毒力中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种评价轮状病毒疫苗有效性的方法，所述方法先使用待评价的轮状病毒疫苗对乳鼠进行免疫，再使用抗酸保护剂（如己二酸二钠、碳酸氢钠、琥珀酸钠、枸橼酸钠、苹果酸钠以及乙酸钠等）和轮状病毒对乳鼠进行灌胃，最后通过观察动物的腹泻情况对轮状病毒疫苗的有效性进行评价；研究发现，在使用轮状病毒进行攻毒前，或者，在使用轮状病毒进行攻毒时，给大日龄乳鼠灌胃抗酸保护剂，可有效提高大日龄乳鼠的轮状病毒发病率以及模型稳定性，因此，使用此方法评价轮状病毒疫苗有效性，可突破乳鼠的日龄限制，完成疫苗的完整免疫流程，在轮状病毒疫苗有效性的评价中极具应用前景。
本发明提供了一种评价轮状病毒毒株毒力的方法，所述方法先使用抗酸保护剂（如己二酸二钠、碳酸氢钠、琥珀酸钠、枸橼酸钠、苹果酸钠以及乙酸钠等）和轮状病毒对乳鼠进行灌胃，然后通过观察动物的腹泻情况对轮状病毒毒株的毒力进行评价；研究发现，在使用轮状病毒进行攻毒前，或者，在使用轮状病毒进行攻毒时，给大日龄乳鼠灌胃抗酸保护剂，可有效提高大日龄乳鼠的轮状病毒发病率以及模型稳定性，因此，使用此方法评价轮状病毒毒株毒力，可突破乳鼠的日龄限制，简化乳鼠的日龄管控，在轮状病毒毒株毒力的评价中极具应用前景。
附图说明
图1：不同日龄乳鼠的腹泻率变化曲线。
图2：不同日龄乳鼠的腹泻打分变化曲线。
图3：不同攻毒剂量下乳鼠的腹泻率变化曲线。
图4：不同攻毒剂量下乳鼠的腹泻打分变化曲线。
图5：己二酸二钠对乳鼠腹泻率的影响。
图6：己二酸二钠对乳鼠腹泻打分的影响。
图7：碳酸氢钠对乳鼠腹泻率的影响。
图8：碳酸氢钠对乳鼠腹泻打分的影响。
图9：不同轮状病毒毒株对乳鼠腹泻率的影响。
图10：不同轮状病毒毒株对乳鼠腹泻打分的影响。
图11：不同免疫剂量下乳鼠的腹泻率变化曲线（轮状病毒减毒活疫苗）。
图12：不同免疫剂量下乳鼠的腹泻打分变化曲线（轮状病毒减毒活疫苗）。
图13：不同免疫剂量下乳鼠的腹泻率变化曲线（轮状病毒灭活疫苗）。
图14：不同免疫剂量下乳鼠的腹泻打分变化曲线（轮状病毒灭活疫苗）。
图15：正常乳鼠的粪便情况。
图16：腹泻严重程度为1分的乳鼠的粪便情况。
图17：腹泻严重程度为2分的乳鼠的粪便情况。
图18：腹泻严重程度为3分的乳鼠的粪便情况。
图19：腹泻严重程度为4分的乳鼠的粪便情况。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中轮状病毒液的制备方法如下：
单层MA104细胞的制备：将MA104细胞（购自中国典型培养物保藏中心）复苏至装满DMEM培养基（购自Gibco公司）的T25细胞瓶内，于37℃培养24h后，弃去旧培养基，更换新的DMEM培养基，继续于37℃培养3d，得到长满单层的MA104细胞；用DMEM培养基按照1:3的比例将长满单层的MA104细胞于T75细胞瓶内进行传代培养，传代培养3d后T75细胞瓶内长满单层MA104细胞，用于轮状病毒接种；
轮状病毒的活化：取轮状病毒的病毒液1mL（轮状病毒分别为购自ATCC的SA11毒株和购自美国CDC的CDC-9毒株），在病毒液中加入终浓度15μg/mL的胰酶（购自Gibco公司）和终浓度为600μg/mL的氯化钙（购自Sigma公司）后，于37℃水浴锅活化1h；
单层MA104细胞的吸附：弃去T75细胞瓶内的细胞上清液，加入10mL DMEM培养基清洗单层MA104细胞2遍以去除血清，清洗第2遍时不弃去培养基；清洗结束后，在T75细胞瓶内加入1.2μL活化后的轮状病毒病毒液，于37℃吸附2h，吸附期间，隔30min晃动T75细胞瓶；吸附结束后，弃去T75细胞瓶中的细胞上清液，加入30mL病毒维持液（病毒维持液为含有20μg/mL胰酶的DMEM培养基），于37℃培养3d；培养结束后，冻融T75细胞瓶中的单层MA104细胞3次，得到轮状病毒液，该轮状病毒液用于动物模型的攻毒。
下述实施例中轮状病毒减毒活疫苗的制备方法如下：
单层Vero细胞的制备：将Vero细胞（购自ATCC）复苏至装满DMEM培养基（购自Gibco公司）的T25细胞瓶内，于37℃培养24h后，弃去旧培养基，更换新的DMEM培养基，继续于37℃培养6d，得到长满单层的Vero细胞；用DMEM培养基按照1:6的比例将长满单层的Vero细胞于T75细胞瓶内进行传代培养，7d传代1次，按照上述方法，扩大培养至10层细胞工厂，传代至10层细胞工厂4d后用于轮状病毒接种；
轮状病毒的活化：取轮状病毒CDC-9株1mL，在病毒液中加入终浓度15μg/mL的胰酶（购自Gibco公司）和终浓度为600μg/mL的氯化钙（购自Sigma公司）后，于37℃水浴锅活化1h；
病毒接种：弃去细胞工厂的细胞上清液，加入1.0L DMEM培养基清洗Vero细胞2遍以去除血清；清洗结束后，取无血清的DMEM培养基2.0L，加入100μL活化后的轮状病毒液和终浓度20μg/mL的胰酶（购自Gibco公司），混合均匀后接种Vero细胞，接种后3d收获得到轮状病毒液；
轮状减毒活疫苗制备：将CDC-9毒株接种Vero细胞制备得到的轮状病毒液于-20℃冰箱反复冻融3次，于8000g、4℃下离心15min，得到经离心的轮状病毒液；将经澄清的轮状病毒液用孔径为1.2μm的滤膜的过滤，得到经过滤的轮状病毒液；将经过滤的轮状病毒液用100 kD超滤膜包浓缩到原体积的1/10，得到轮状病毒减毒活疫苗浓缩液；浓缩液、蔗糖（购自默克公司）和乙酸钠（购自西安晋湘药用辅料有限公司）配制成轮状减毒活疫苗，轮状减毒活疫苗中，蔗糖、乙酸钠终浓度分别为50%（w/w）、1.0M，根据病毒含量不同共配制四种规格，病毒含量分别为6.5 lgCCID50/mL、5.5 lgCCID50/mL、4.5 lgCCID50/mL和3.5 lgCCID50/mL，以上轮状病毒减毒活疫苗用于有效性评价。
下述实施例中轮状病毒灭活疫苗的制备方法如下：
单层Vero细胞的制备：将Vero细胞（购自ATCC）复苏至装满DMEM培养基（购自Gibco公司）的T25细胞瓶内，于37℃培养24h后，弃去旧培养基，更换新的DMEM培养基，继续于37℃培养6d，得到长满单层的Vero细胞；用DMEM培养基按照1:6的比例将长满单层的Vero细胞于T75细胞瓶内进行传代培养，7d传代1次，按照上述方法，扩大培养至10层细胞工厂，传代至10层细胞工厂4d后用于轮状病毒接种；
轮状病毒的活化：取轮状病毒CDC-9株1mL，在病毒液中加入终浓度15μg/mL的胰酶（购自Gibco公司）和终浓度为600μg/mL的氯化钙（购自Sigma公司）后，于37℃水浴锅活化1h；
病毒接种：弃去细胞工厂的细胞上清液，加入1.0L DMEM培养基清洗Vero细胞2遍以去除血清；清洗结束后，取无血清的DMEM培养基2.0L，加入100μL活化后的轮状病毒液和终浓度20μg/mL的胰酶（购自Gibco公司），混合均匀后接种Vero细胞，接种后3d收获得到轮状病毒液；
轮状灭活疫苗制备：将CDC-9毒株接种Vero细胞制备得到的轮状病毒液于-20℃冰箱反复冻融3次，于8000g、4℃下离心15min，得到经离心的轮状病毒液；将经澄清的轮状病毒液用孔径为1.2μm的滤膜的过滤，得到经过滤的轮状病毒液；在经过滤的轮状病毒液中按1:2000（BPL:经过滤的轮状病毒液=1:2000，v/v）加入BPL（β-丙内酯，购自SERVA公司）4℃灭活24 h，37℃水解2 h，得到经灭活的轮状病毒液；将经灭活的轮状病毒液用100 kD超滤膜包浓缩到原体积的1/10后，再用蔗糖密度梯度离心得到纯化的灭活液，纯化的灭活液、氢氧化铝佐剂（购自SERVA公司）配制灭活疫苗，铝含量为0.8mg/mL，根据总蛋白含量不同共配制25μg/mL、5μg/mL两种规格，以上轮状病毒灭活疫苗用于有效性评价。
下述实施例中涉及的缓冲液如下：
PBS缓冲液：先称取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，然后用HCl调节pH至7.35，最后加蒸馏水定容至1L，即得0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液。
实施例1：日龄对昆明小鼠乳鼠发病情况的影响
实验动物为昆明小鼠乳鼠（购自北京维通利华公司），实验组共设置5组，5组实验组的乳鼠日龄分别为7、9、12、14、16 d，乳鼠饥饿1h后进行灌胃攻毒，攻毒剂量为SA11 6.75lgCCID50/只，采用6号灌胃针。攻毒后每天统计腹泻情况并根据腹泻程度打分。
根据采集到的数据，绘制腹泻率变化曲线和腹泻打分变化曲线，具体可见图1~2；其中，腹泻率的计算公式为：腹泻率（%）=发生腹泻的乳鼠数量/乳鼠总数量×100%；腹泻程度的评价方法为：观察乳鼠粪便形态进行打分，共分4档，分别对应1~4分，打分标注如下：1分：黄色软便；2分：黄色稀便，量少，成分以固体为主，含有少量液体；3分：黄色稀便，量中等，成分以液体为主，含有部分固体；4分：大量水样腹泻，肛周有大量粪便污染，身体其他部位也会被粪便污染，比如腹部、腿部。
由图1~2可知，轮状病毒攻毒后乳鼠的腹泻率和腹泻严重程度与日龄相关，日龄越大，乳鼠腹泻率逐渐降低，腹泻严重程度逐渐下降，14日龄和16日龄乳鼠已不再发生腹泻。
实施例2：不同攻毒剂量对乳鼠发病情况的影响
实验动物为7日龄的昆明小鼠乳鼠（购自北京维通利华公司），实验组共设置4组，其中3组乳鼠饥饿1h后进行灌胃攻毒，攻毒剂量分别为CDC-9 5.50 lgCCID50/只、6.50lgCCID50/只、7.25 lgCCID50/只，剩余1组乳鼠饥饿1h后灌胃同体积PBS缓冲液作为阴性对照（Mock）。攻毒后每天统计腹泻情况并根据腹泻程度打分。
根据采集到的数据，腹泻率变化曲线和腹泻打分变化曲线，具体可见图3~4；其中，腹泻率的计算公式为：腹泻率（%）=发生腹泻的乳鼠数量/乳鼠总数量×100%；腹泻程度的评价方法为：观察乳鼠粪便形态进行打分，共分4档，分别对应1~4分，打分标注如下：1分：黄色软便；2分：黄色稀便，量少，成分以固体为主，含有少量液体；3分：黄色稀便，量中等，成分以液体为主，含有部分固体；4分：大量水样腹泻，肛周有大量粪便污染，身体其他部位也会被粪便污染，比如腹部、腿部。
由图3~4可知，乳鼠的腹泻率和腹泻严重程度与轮状病毒CDC-9株攻毒剂量相关，攻毒剂量越大，腹泻率和腹泻程度越严重。
实施例3：己二酸二钠对乳鼠发病情况的影响
实验动物为14日龄、16日龄的昆明小鼠乳鼠（购自北京维通利华公司），每种日龄设置2组实验组，乳鼠饥饿1h后进行灌胃攻毒，其中1组直接灌胃攻毒，攻毒剂量为SA116.75 lgCCID50/只，剩余1组灌胃添加有己二酸二钠（购自上海阿拉丁公司）的轮状病毒液，轮状病毒液中，己二酸二钠的浓度为100 mg/mL，攻毒剂量为SA11 6.75 lgCCID50/只。攻毒后每天统计腹泻情况并根据腹泻程度打分。
根据采集到的数据，腹泻率变化曲线和腹泻打分变化曲线，具体可见图5~6；其中，腹泻率的计算公式为：腹泻率（%）=发生腹泻的乳鼠数量/乳鼠总数量×100%；腹泻程度的评价方法为：观察乳鼠粪便形态进行打分，共分4档，分别对应1~4分，打分标注如下：1分：黄色软便；2分：黄色稀便，量少，成分以固体为主，含有少量液体；3分：黄色稀便，量中等，成分以液体为主，含有部分固体；4分：大量水样腹泻，肛周有大量粪便污染，身体其他部位也会被粪便污染，比如腹部、腿部。
由图5~6可知，己二酸二钠可提高14日龄乳鼠的腹泻率和腹泻严重程度。
实施例4：碳酸氢钠溶液对乳鼠发病情况的影响
实验动物为14日龄、16日龄的昆明小鼠乳鼠（购自北京维通利华公司），每种日龄设置3组实验组，第一组乳鼠饥饿1h后直接灌胃攻毒，攻毒剂量为SA11 6.75 lgCCID50/只，第二组乳鼠饥饿1h后先灌胃100μL 100mM的碳酸氢钠（购自上海阿拉丁公司）水溶液，10min后，再灌胃攻毒，攻毒剂量为SA11 6.75 lgCCID50/只，第三组乳鼠饥饿1h后先灌胃100μL890mM的碳酸氢钠水溶液，10 min后，再灌胃攻毒，攻毒剂量为SA11 6.75 lgCCID50/只。攻毒后每天统计腹泻情况并根据腹泻程度打分。
根据采集到的数据，腹泻率变化曲线和腹泻打分变化曲线，具体可见图7~8；其中，腹泻率的计算公式为：腹泻率（%）=发生腹泻的乳鼠数量/乳鼠总数量×100%；腹泻程度的评价方法为：观察乳鼠粪便形态进行打分，共分4档，分别对应1~4分，打分标注如下：1分：黄色软便；2分：黄色稀便，量少，成分以固体为主，含有少量液体；3分：黄色稀便，量中等，成分以液体为主，含有部分固体；4分：大量水样腹泻，肛周有大量粪便污染，身体其他部位也会被粪便污染，比如腹部、腿部。
由图7~8可知，碳酸氢钠水溶液有助于提高14日龄乳鼠的腹泻率和腹泻严重程度，且碳酸氢钠用量越大，腹泻率和腹泻程度越严重。
实施例5：轮状病毒攻毒动物模型用于毒株毒力的评价
评价对象为轮状病毒SA11毒株和轮状病毒CDC-9毒株，实验动物为12日龄的昆明小鼠乳鼠（购自北京维通利华公司），实验组共设置3组，其中2组乳鼠饥饿1h后先灌胃100μL890mM的碳酸氢钠（购自上海阿拉丁公司）水溶液，10 min后，再灌胃攻毒，2组乳鼠的攻毒剂量分别为SA11 6.75 lgCCID50/只和CDC-9 6.75 lgCCID50/只，剩余1组乳鼠饥饿1h后灌胃同体积PBS缓冲液作为阴性对照（PBS）。攻毒后每天统计腹泻情况并根据腹泻程度打分。
根据采集到的数据，腹泻率变化曲线和腹泻打分变化曲线，具体可见图9~10；其中，腹泻率的计算公式为：腹泻率（%）=发生腹泻的乳鼠数量/乳鼠总数量×100%；腹泻程度的评价方法为：观察乳鼠粪便形态进行打分，共分4档，分别对应1~4分，打分标注如下：1分：黄色软便；2分：黄色稀便，量少，成分以固体为主，含有少量液体；3分：黄色稀便，量中等，成分以液体为主，含有部分固体；4分：大量水样腹泻，肛周有大量粪便污染，身体其他部位也会被粪便污染，比如腹部、腿部。
由图9~10可知，同样攻毒剂量，SA11株乳鼠腹泻率和腹泻严重程度高于CDC-9株，说明SA11株毒力强于CDC-9株，该动物模型可用于轮状病毒毒株的毒力评价。
实施例6：轮状病毒攻毒动物模型用于轮状病毒减毒活疫苗有效性的评价
评价对象为轮状病毒减毒活疫苗，实验动物为3日龄的昆明小鼠乳鼠（购自北京维通利华公司），实验组共设置5组，4组乳鼠先灌胃轮状减毒活疫苗进行第一次免疫，第一次免疫剂量分别为5.5 lgCCID50/100μL/只、4.5 lgCCID50/100μL/只、3.5 lgCCID50/100μL/只和2.5 lgCCID50/100μL/只，待乳鼠10日龄再进行第二次免疫，第二次免疫计量与第一次免疫一致，剩余1组乳鼠于3日龄、10日龄灌胃同体积PBS缓冲液作为阴性对照（Control），免疫结束后，5组乳鼠于12日龄饥饿1h后先灌胃100μL 890mM的碳酸氢钠（购自上海阿拉丁公司）水溶液，10 min后，再灌胃攻毒，攻毒剂量为SA11 6.75 lgCCID50/只。攻毒后每天统计腹泻情况并根据腹泻程度打分。
根据采集到的数据，腹泻率变化曲线和腹泻打分变化曲线，具体可见图11~12；其中，腹泻率的计算公式为：腹泻率（%）=发生腹泻的乳鼠数量/乳鼠总数量×100%；腹泻程度的评价方法为：观察乳鼠粪便形态进行打分，共分4档，分别对应1~4分，打分标注如下：1分：黄色软便；2分：黄色稀便，量少，成分以固体为主，含有少量液体；3分：黄色稀便，量中等，成分以液体为主，含有部分固体；4分：大量水样腹泻，肛周有大量粪便污染，身体其他部位也会被粪便污染，比如腹部、腿部。
由图11~12可知，轮状减毒活疫苗的保护效果与免疫剂量相关，该动物模型可准确评估轮状减毒活疫疫苗的有效性。
实施例7：轮状病毒攻毒动物模型用于轮状病毒灭活疫苗有效性的评价
评价对象为轮状病毒灭活疫苗，实验动物为3日龄的昆明小鼠乳鼠（购自北京维通利华公司），实验组共设置3组，2组乳鼠先腹腔注射轮状病毒灭活疫苗进行第一次免疫，第一次免疫剂量分别为2.5μg/100μL/只、0.5μg/100μL/只，待乳鼠10日龄再进行第二次免疫，第二次免疫计量与第一次免疫剂量一致，剩余1组乳鼠于3日龄、10日龄腹腔注射同体积PBS缓冲液作为阴性对照（Control），免疫结束后，3组乳鼠于12日龄饥饿1h后先灌胃100μL890mM的碳酸氢钠（购自上海阿拉丁公司）水溶液，10 min后，再进行灌胃攻毒，攻毒剂量为SA11 6.75 lgCCID50/只。攻毒后每天统计腹泻情况并根据腹泻程度打分。
根据采集到的数据，腹泻率变化曲线和腹泻打分变化曲线，具体可见图13~14；其中，腹泻率的计算公式为：腹泻率（%）=发生腹泻的乳鼠数量/乳鼠总数量×100%；腹泻程度的评价方法为：观察乳鼠粪便形态进行打分，共分4档，分别对应1~4分，打分标注如下：1分：黄色软便；2分：黄色稀便，量少，成分以固体为主，含有少量液体；3分：黄色稀便，量中等，成分以液体为主，含有部分固体；4分：大量水样腹泻，肛周有大量粪便污染，身体其他部位也会被粪便污染，比如腹部、腿部。
由图13~14可知，轮状病毒灭活疫苗的保护效果与免疫剂量相关，该动物模型可准确评估轮状病毒灭活疫苗的有效性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (17)

1.一种评价轮状病毒疫苗有效性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
免疫步骤：使用轮状病毒疫苗对动物进行免疫；
攻毒步骤：免疫结束后，先给动物灌胃抗酸保护剂，再给动物灌胃轮状病毒；或者，给动物灌胃抗酸保护剂和轮状病毒的混合物；
评价步骤：攻毒结束后，观察动物的腹泻情况。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物为乳鼠。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乳鼠为昆明小鼠乳鼠、BALB/c小鼠乳鼠、Swiss小鼠乳鼠或ICR小鼠乳鼠中的一种或一种以上。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乳鼠为3~16日龄的乳鼠。
5.如权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，所述抗酸保护剂为己二酸二钠、碳酸氢钠、琥珀酸钠、枸橼酸钠、苹果酸钠或乙酸钠中的一种或一种以上。
6.如权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，所述攻毒步骤中，先以50~500μL/只的剂量给动物灌胃浓度为0.1~2M的抗酸保护剂溶液，1~30min后，再以3.0~10.0 lgCCID50/只的剂量给动物灌胃轮状病毒；或者，所述攻毒步骤中，以50~500μL/只的剂量给动物灌胃含有3.0~10.0 lgCCID50轮状病毒的0.1~2M抗酸保护剂溶液。
7.如权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，所述攻毒步骤中，先以50~200μL/只的剂量给动物灌胃浓度为0.3~1.5M的抗酸保护剂溶液，5~20min后，再以3.0~10.0lgCCID50/只的剂量给动物灌胃轮状病毒；或者，所述攻毒步骤中，以50~200μL/只的剂量给动物灌胃含有3.0~10.0 lgCCID50/只轮状病毒的0.3~1.5M抗酸保护剂溶液。
8.如权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，所述腹泻情况包括动物的腹泻率或腹泻严重程中的一种或一种以上。
9.权利要求1~8任一项所述的方法在评价轮状病毒疫苗有效性中的应用。
10.一种评价轮状病毒毒株毒力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
攻毒步骤：先给动物灌胃抗酸保护剂，再给动物灌胃轮状病毒；或者，给动物灌胃抗酸保护剂和轮状病毒的混合物；
评价步骤：攻毒结束后，观察动物的腹泻情况。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述动物为乳鼠。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述乳鼠为昆明小鼠乳鼠、BALB/c小鼠乳鼠、Swiss小鼠乳鼠或ICR小鼠乳鼠中的一种或一种以上。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述乳鼠为3~16日龄的乳鼠。
14.如权利要求10~13任一项所述的方法，其特征在于，所述抗酸保护剂为己二酸二钠、碳酸氢钠、琥珀酸钠、枸橼酸钠、苹果酸钠或乙酸钠中的一种或一种以上。
15.如权利要求10~13任一项所述的方法，其特征在于，所述攻毒步骤中，先以50~500μL/只的剂量给动物灌胃浓度为0.1~2M的抗酸保护剂溶液，1~30min后，再以3.0~10.0lgCCID50/只的剂量给动物灌胃轮状病毒；或者，所述攻毒步骤中，以50~500μL/只的剂量给动物灌胃含有3.0~10.0 lgCCID50轮状病毒的0.1~2M抗酸保护剂溶液。
16.如权利要求10~13任一项所述的方法，其特征在于，所述腹泻情况包括动物的腹泻率或腹泻严重程中的一种或一种以上。
17.权利要求10~16任一项所述的方法在评价轮状病毒毒株毒力中的应用。
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