CN108504718A - 一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其包括以下步骤：a、病毒株的培养与扩增：RV‑Wa株与SA‑11病毒株的培养与扩增均在猴胚胎肾细胞上进行；b、制备GST‑NSP4T融合蛋白；c、构建RV腹泻模型以及NSP4腹泻模型；d、体重、体征、腹泻程度观察及粪便RV含量测定；e、动物取材；f、相关指标检测：在RV感染后每时间点取各肠段石蜡切片HE染色，光镜观察形态学改变、TUNEL荧光显色法原位检测肠上皮细胞凋亡。本发明能够有效地揭示钙敏感受体CaSR在RV、NSP4感染中的表达状态，以明确RV感染与CaSR表达变化的相关性。

Description

一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法
技术领域
本发明涉及轮状病毒感染性腹泻研究技术领域，尤其涉及一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法。
背景技术
轮状病毒感染性腹泻呈高发病率、高死亡率、且无特效药物。轮状病毒（Rotavirus，RV）是轮状病毒感染性腹泻的主要病原体，全球每年约有1.1亿左右的新生儿因感染RV而出现严重的分泌性腹泻，约0.5亿5岁以下的儿童因RV感染而脱水死亡。对于防止RV感染，接种疫苗似乎仍然是最有效的手段，然而由于RV毒株的变异性，疫苗的疗效性和安全性等相关的问题限制了其推广。目前临床治疗急性轮状病毒腹泻仍多采用WHO推荐的口服补液以缓解症状。因此加强对轮状病毒感染及致泻机制的研究，开发新药一直是亟待解决的社会问题。
RV感染性腹泻的致泻机制尚不清楚。前期研究表明RV感染腹泻的致泻机制与多种因素有关，如体液电解质失调、RV非结构蛋白4（Non-structural protein， NSP4）、宿主的肠道神经系统以及细胞因子等，尤其NSP4最为关键。NSP4被认为是目前发现的与RV致泻能力密切相关的一种肠毒素，其致泻机制尚不清楚，其中主要的理论假设有：可特异性诱发肠上皮细胞Ca2+升高导致CI-分泌，或者抑制小肠刷状缘膜的Na+-葡糖共转运载体介导的Na+耦合的葡萄糖同向转运，或者激活钙激活氯离子通道（calcium-activated chloridechannel， CaCCs）或直接升高细胞质中钙离子，或者通过ENS和上皮促生长激素神经肽受体等。因此研究RV感染的致泄机制，寻找RV感染水液代谢紊乱的调控靶点至关重要。
钙敏感受体（calcium-sensing receptor， CaSR）属于G蛋白偶联受体C家族的成员，为Ca2+选择性受体。CaSR在哺乳动物胃肠道上皮细胞高表达，并参与细胞内外液的吸收与分泌、肠道的蠕动与渗透压的平衡、肠上皮细胞的分化、生长、炎症调节等。研究表明在大肠杆菌（Escherichia coli）热稳定内毒素及霍乱（cholera toxin）毒素引起的多种腹泻过程中CaSR的表达及活性异常，表明CaSR的表达变化与多种病原体引起的腹泻相关。这些发现为认识CaSR在分泌性腹泻与炎症性腹泻的病理发生过程中的作用奠定一定的基础，但在RV感染及其诱导的感染性腹泻方面，CaSR的表达变化、主要的生物学功能及其作用机制等方面尚未见报道。
细胞内Ca2+离子稳定性的剧烈变化可作为RV感染的重要标记物，RV感染机体全过程，包括细胞入侵、转录激活、形态发生、细胞裂解、毒颗粒释放及后续蛋白行为都依赖Ca2+完成[16]，但是Ca2+离子的内流机制仍然知之甚少。鉴于Ca2+在RV感染中的重要作用，同时CaSR作为Ca2+的选择性受体，开展基于Ca2+依赖的相关信号途径研究RV/NSP4感染与CaSR的表达变化的相关性研究，对于揭示CaSR参与RV/NSP4在宿主细胞内的复制及致泻过程具有一定的可行性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，该CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法能够有效地揭示钙敏感受体CaSR在RV、NSP4感染中的表达状态，以明确RV感染与CaSR表达变化的相关性。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现。
一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，包括有以下步骤，具体的：
a、病毒株的培养与扩增：RV-Wa株与SA-11病毒株的培养与扩增均在猴胚胎肾细胞上进行；
b、制备GST-NSP4T融合蛋白；
c、构建RV腹泻模型以及NSP4腹泻模型：动物接种病毒及给药，空白组灌胃DMEM培养液，200µl/只；RV组灌胃SA-11株200µl/只，NSP4T组腹腔注射重组融合蛋白GST-NSP4T，200µl/只，乳鼠灌胃后与母鼠同笼，母乳喂养；1dpi后，腹泻乳鼠分别灌胃给药，RV组、NSP4T病毒对照组及空白组灌胃DMEM培养液200µl/只，每天三次，连续5天；
d、体重、体征、腹泻程度观察及粪便RV含量测定；
e、动物取材：在给药后第1、2、3、4、5天相同时间点处死乳鼠，且每组3只，取每只乳鼠小肠、大肠组织，经PBS冲洗后放入含RNAlater溶液中浸泡24h，装入灭活RNA酶的冻存管内，于液氮冷冻并于-80℃保存，以用于分子生物学检测；一份10%甲醛固定，供免疫组织化学及常规HE染色；
f、相关指标检测：在RV感染后每时间点取各肠段石蜡切片HE染色，光镜观察形态学改变、TUNEL荧光显色法原位检测肠上皮细胞凋亡。
其中，于所述步骤a中，接种RV-Wa株的猴胚胎肾细胞在接种前需经胰酶活化，当细胞出现严重的细胞病变后，保存细胞瓶于-20℃冰箱过夜，次日4℃溶解，反复冻融三次后，收集细胞冻融液，离心，分装，冰箱保存备用。
其中，所述步骤f中还包括有：各肠段组织，用4mL TEN溶液充分吹悬沉淀后，常规方法滴膜，2%磷钨酸负染后电镜观察细胞形态。
其中，所述步骤f中还包括有：免疫组织化学方法和荧光检测9种NHEs表达和定位。
其中，所述步骤f中还包括有：qRT-PCR检测各肠断组织中CaSR mRNA的表达。
其中，所述步骤f中还包括有：Western blot 检测各肠断组织中CaSR蛋白表达。
其中，所述步骤f中还包括有：Fura-2/AM检测细胞内[Ca2+]i变化。
本发明的有益效果为：本发明的所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其包括有以下步骤：a、病毒株的培养与扩增：RV-Wa株与SA-11病毒株的培养与扩增均在猴胚胎肾细胞上进行；b、制备GST-NSP4T融合蛋白；c、构建RV腹泻模型以及NSP4腹泻模型：动物接种病毒及给药，空白组灌胃DMEM培养液，200µl/只；RV组灌胃SA-11株200µl/只，NSP4T组腹腔注射重组融合蛋白GST-NSP4T，200µl/只，乳鼠灌胃后与母鼠同笼，母乳喂养；1dpi后，腹泻乳鼠分别灌胃给药，RV组、NSP4T病毒对照组及空白组灌胃DMEM培养液200µl/只，每天三次，连续5天；d、体重、体征、腹泻程度观察及粪便RV含量测定；e、动物取材：在给药后第1、2、3、4、5天相同时间点处死乳鼠，且每组3只，取每只乳鼠小肠、大肠组织，经PBS冲洗后放入含RNAlater溶液中浸泡24h，装入灭活RNA酶的冻存管内，于液氮冷冻并于-80℃保存，以用于分子生物学检测；一份10%甲醛固定，供免疫组织化学及常规HE染色；f、相关指标检测：在RV感染后每时间点取各肠段石蜡切片HE染色，光镜观察形态学改变、TUNEL荧光显色法原位检测肠上皮细胞凋亡。通过上述步骤设计，本发明的CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法能够有效地揭示钙敏感受体CaSR在RV、NSP4感染中的表达状态，以明确RV感染与CaSR表达变化的相关性。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明进行说明。
一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，包括有以下步骤，具体的：
a、病毒株的培养与扩增：RV-Wa株与SA-11病毒株的培养与扩增均在猴胚胎肾细胞上进行；其中，接种RV-Wa株的猴胚胎肾细胞在接种前需经胰酶活化，当细胞出现严重的细胞病变后，保存细胞瓶于-20℃冰箱过夜，次日4℃溶解，反复冻融三次后，收集细胞冻融液，离心，分装，冰箱保存备用；
b、制备GST-NSP4T融合蛋白；
c、构建RV腹泻模型以及NSP4腹泻模型：动物接种病毒及给药，空白组灌胃DMEM培养液，200µl/只；RV组灌胃SA-11株200µl/只，NSP4T组腹腔注射重组融合蛋白GST-NSP4T，200µl/只，乳鼠灌胃后与母鼠同笼，母乳喂养；1dpi后，腹泻乳鼠分别灌胃给药，RV组、NSP4T病毒对照组及空白组灌胃DMEM培养液200µl/只，每天三次，连续5天；
d、体重、体征、腹泻程度观察及粪便RV含量测定；
e、动物取材：在给药后第1、2、3、4、5天相同时间点处死乳鼠，且每组3只，取每只乳鼠小肠、大肠组织，经PBS冲洗后放入含RNAlater溶液中浸泡24h，装入灭活RNA酶的冻存管内，于液氮冷冻并于-80℃保存，以用于分子生物学检测；一份10%甲醛固定，供免疫组织化学及常规HE染色；
f、相关指标检测：在RV感染后每时间点取各肠段石蜡切片HE染色，光镜观察形态学改变、TUNEL荧光显色法原位检测肠上皮细胞凋亡；各肠段组织，用4mL TEN溶液充分吹悬沉淀后，常规方法滴膜，2%磷钨酸负染后电镜观察细胞形态；免疫组织化学方法和荧光检测9种NHEs表达和定位；qRT-PCR检测各肠断组织中CaSR mRNA的表达；Western blot 检测各肠断组织中CaSR蛋白表达；Fura-2/AM检测细胞内[Ca2+]i变化。
通过上述步骤设计，本发明的CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法能够有效地揭示钙敏感受体CaSR在RV、NSP4感染中的表达状态，以明确RV感染与CaSR表达变化的相关性。
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (7)

1.一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，包括有以下步骤，具体的：
a、病毒株的培养与扩增：RV-Wa株与SA-11病毒株的培养与扩增均在猴胚胎肾细胞上进行；
b、制备GST-NSP4T融合蛋白；
c、构建RV腹泻模型以及NSP4腹泻模型：动物接种病毒及给药，空白组灌胃DMEM培养液，200µl/只；RV组灌胃SA-11株200µl/只，NSP4T组腹腔注射重组融合蛋白GST-NSP4T，200µl/只，乳鼠灌胃后与母鼠同笼，母乳喂养；1dpi后，腹泻乳鼠分别灌胃给药，RV组、NSP4T病毒对照组及空白组灌胃DMEM培养液200µl/只，每天三次，连续5天；
d、体重、体征、腹泻程度观察及粪便RV含量测定；
e、动物取材：在给药后第1、2、3、4、5天相同时间点处死乳鼠，且每组3只，取每只乳鼠小肠、大肠组织，经PBS冲洗后放入含RNAlater溶液中浸泡24h，装入灭活RNA酶的冻存管内，于液氮冷冻并于-80℃保存，以用于分子生物学检测；一份10%甲醛固定，供免疫组织化学及常规HE染色；
f、相关指标检测：在RV感染后每时间点取各肠段石蜡切片HE染色，光镜观察形态学改变、TUNEL荧光显色法原位检测肠上皮细胞凋亡。
2.根据权利要求1所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于：于所述步骤a中，接种RV-Wa株的猴胚胎肾细胞在接种前需经胰酶活化，当细胞出现严重的细胞病变后，保存细胞瓶于-20℃冰箱过夜，次日4℃溶解，反复冻融三次后，收集细胞冻融液，离心，分装，冰箱保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，所述步骤f中还包括有：各肠段组织，用4mL TEN溶液充分吹悬沉淀后，常规方法滴膜，2%磷钨酸负染后电镜观察细胞形态。
4.根据权利要求1所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，所述步骤f中还包括有：免疫组织化学方法和荧光检测9种NHEs表达和定位。
5.根据权利要求1所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，所述步骤f中还包括有：qRT-PCR检测各肠断组织中CaSR mRNA的表达。
6.根据权利要求1所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，所述步骤f中还包括有：Western blot 检测各肠断组织中CaSR蛋白表达。
7.根据权利要求1所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，所述步骤f中还包括有：Fura-2/AM检测细胞内[Ca2+]i变化。
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