CN100420936C

CN100420936C - 用外源性绿色荧光蛋白进行脂肪成体干细胞标记的方法

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Publication number: CN100420936C
Application number: CNB2005100215803A
Authority: CN
Inventors: 田卫东; 林云锋; 刘磊; 汤炜; 郑晓辉; 陈希哲; 刘家武; 肖金刚
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2005-08-31
Filing date: 2005-08-31
Publication date: 2008-09-24
Anticipated expiration: 2025-08-31
Also published as: CN1731151A

Abstract

本发明是一种利用外源性绿色荧光蛋白进行脂肪成体干细胞标记的方法。该方法的实现是通过腺病毒载体转染外源性绿色荧光蛋白到Balb/c小鼠脂肪成体干细胞中，替代内源性绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞进行细胞标记。从形态学、免疫细胞化学，mRNA和蛋白表达水平等方面证明腺病毒载体转染外源性绿色荧光蛋白的Balb/c小鼠脂肪成体干细胞与内源性绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞具有几乎一样的生长、增值、分化特性；且成本低，内源性绿色荧光蛋白转基因小鼠国外约2千美元/只，国内Balb/c小鼠2元人民币/只。该方法建立了一种高效、廉价的脂肪成体干细胞标记的新方法，从而推动脂肪成体干细胞体内外的深入研究。

Description

用外源性绿色荧光蛋白进行脂肪成体干细胞标记的方法

一、技术领域：

本发明涉及一种利用外源性绿色荧光蛋白(GFP)进行脂肪成体干细胞标记的新方法，更具体地说，是涉及一种利用外源性绿色荧光蛋白通过腺病毒载体将其转染到Balb/c小鼠脂肪成体干细胞中，来替代内源性绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞进行细胞标记的新方法。

二、背景技术：

干细胞根据其来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞，胚胎干细胞的研究由于受伦理道德、种族观念的约束和潜在异体排斥反应的影响，其应用前景不是十分乐观。

成体干细胞是存在于人和哺乳动物的成熟组织器官中，具有自我更新和一定的多能分化潜能，处于全能细胞和成熟细胞之间的中间体。在自然条件下，成体干细胞倾向于分化成所在组织的各种细胞，以利于维持机体的正常新陈代谢；在特定的外界条件诱导下，一种组织的成体干细胞可以“横向分化”成其他组织的功能细胞，参与组织的损伤修复；“横向分化”潜能的发现从理论上改写了“组织特异性干细胞只能定向分化”的经典概念，为许多疾病的细胞学治疗提供了新的思路和前景。成体干细胞的研究是继转基因动物、克隆动物、人类胚胎干细胞系建立等重大技术突破之后，生命科学研究中又一取得较大进展的领域。由于成体干细胞具有可在体外操作等诸多优点，可用于体外研究与细胞发育分化相关基因的调控；探索细胞分化，组织或器官形成的分子机制等，因而对于在细胞水平研究生命的发生、发育，在分子水平探讨生命活动的基本机制具有重要意义。

近来研究证明，脂肪基质中的确存在一些具有多向分化潜能的脂肪成体干细胞，该脂肪成体干细胞具有向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞和神经细胞等多个方向分化的能力。而且脂肪成体干细胞具有稳定的群体倍增率，同时具有细胞再生和自我更新潜能以及免疫相容性，在基因操作中易于感染腺病毒、慢病毒、逆转录病毒，可成为这类病毒载体的理想靶细胞。

最新研究还表明，脂肪成体干细胞具有来源广泛、取材方便、干细胞量大、易于分离纯化等优点，是人体潜在的最大干细胞库。现在关于脂肪成体干细胞的研究主要包括细胞分离鉴定、不同条件下的分化结果和分化机制的研究。如何从信号传导与基因调控角度揭示脂肪成体干细胞多向诱导分化的分子机制是干细胞研究中的一个重要课题，而在对于脂肪成体干细胞的多向分化能力的机理研究中，寻找到一个高效的、廉价、便于活细胞体内外观察的示踪标记就显得尤为重要。现在得到公认的是采用绿色荧光蛋白转基因小鼠的脂肪成体干细胞进行细胞标记的方法。该细胞带有内源性绿色荧光蛋白，可以在荧光显微镜下直观的观察细胞的生长、增殖、分化等生命活动，是目前最理想的脂肪成体干细胞标记方法。

但由于绿色荧光蛋白转基因小鼠的培育、繁殖条件非常困难，在国内还未见有此类小鼠繁育，在国外也仅有少数实验室具有生产繁育的条件，但价格极其昂贵，绿色荧光蛋白转基因小鼠的市价每只约2000美元，而且供货量及其有限。因此，无法大规模的应用于研究，极大的阻碍了脂肪成体干细胞体内外的广泛深入研究。所以关于脂肪成体干细胞的细胞标记问题一直没有得到理想的解决，也是当前制约脂肪成体干细胞深入研究的主要瓶颈之一。

绿色荧光蛋白是一种用于检测细胞基因表达和蛋白定位的新型报告分子，不需要反应底物即可产生荧光，且性质稳定，无毒性作用，作为细胞标记时可以进行活细胞的实时定位观察(R.Y.Tsien，.Annu Rev Biochem，1998.67：509-544.)，因此优于DAPI、DIL等染料及Lac-Z等标记方法(D.A.Persons，Nat Med，1998.4(10)：1201-1205.)。在基因转染技术中，最常用的报告基因主要有Lac-Z基因和绿色荧光蛋白基因。Couffinhal(T.Couffinhal，Hum Gene Ther，1997.8(8)：929-934)等发现应用Lac-Z作为报告基因、X-gal作为显色底物的方法测定基因转移效率会导致结果严重偏低，其原因为相关酶蛋白活性受到了空间结构和反应条件等因素的限制。绿色荧光蛋白在激发光照射下可以直接发射出绿色荧光，因此避开了酶与催化活性的问题，从而减少了实验误差，增强了实验的敏感性，且可使被标记细胞的分离和测定过程自动化。

在众多基因转移载体工具中，腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种高效基因转移载体，被广泛用于向哺乳动物细胞导入外源基因。腺病毒本身分子稳定，基因组不发生分子重排，对靶细胞的病理损害较小，不与宿主基因组整合，没有基因毒性，插入的外源基因也较稳定，既可以感染分裂期的细胞，又可以感染静止期的细胞，优于逆转录病毒和其它非病毒载体转移方法，因此，本发明采用腺病毒作外源性绿色荧光蛋白基因的转移载体。

三、发明内容：

针对现有脂肪成体干细胞的细胞标记方法中所存在的缺陷，本发明的目的是构建一种利用外源性绿色荧光蛋白(GFP)通过腺病毒载体将其转染到Balb/c小鼠脂肪成体干细胞中，来替代内源性绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞的、且成本低廉、操作简便、外源性绿色荧光蛋白转移效率高的脂肪成体干细胞标记的新方法，该方法可以大规模的应用于脂肪成体干细胞标记技术，从而推动和促进脂肪成体干细胞的广泛深入研究。

本发明的目的由以下措施构成的技术方案来实现的：

本发明利用外源性绿色荧光蛋白进行脂肪成体干细胞标记的方法，包括Balb/c小鼠和绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞的分离、培养；携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)的制备；通过腺病毒载体转染绿色荧光蛋白基因到Balb/c小鼠脂肪成体干细胞中，来替代内源性绿色荧光蛋白转基因小鼠的脂肪成体干细胞；并从形态学、免疫细胞化学，mRNA和蛋白表达水平等方面鉴定和分析两种脂肪成体干细胞的生长、增值、分化的相似性。

在上述方案中，Balb/c小鼠和绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞的分离、培养过程：取Balb/c小鼠和绿色荧光蛋白转基因小鼠，在常规无菌条件下切取鼠蹊部皮下脂肪，经剪碎、除血液、过滤等处理后，在脂肪组织中加入与脂肪等体积的质量百分数为0.075％的I型胶原酶，经过消化分离后获得的脂肪成体干细胞用α-MEM培养基培养至2～10周，即得两种脂肪成体干细胞。

在上述方案中，携带绿色荧光蛋白基因腺病毒载体的制备：将穿梭质粒限制性内切酶I酶切线性化，与病毒骨架质粒用常规电穿孔共同转化同源重组菌BJ5183细胞；转化菌接种于含卡那霉素的LB培养板中筛选，挑选菌落提取重组腺病毒绿色荧光蛋白基因腺病毒载体；利用293细胞进行绿色荧光蛋白基因腺病毒载体的扩增。

在上述方案中，通过腺病毒载体转染绿色荧光蛋白基因到Balb/c小鼠脂肪成体干细胞中：将含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体的病毒液与第三代脂肪成体干细胞混合培养过夜，筛选阳性克隆细胞纯化，即获得转染外源性绿色荧光蛋白基因的Balb/c小鼠的脂肪成体干细胞。

本发明具有以下优点及积极效果：

1、本发明将外源性绿色荧光蛋白通过腺病毒载体转染到Balb/c小鼠脂肪成体干细胞中，其结果从形态学、免疫细胞化学，mRNA和蛋白表达水平等充分证明了Balb/c小鼠脂肪成体干细胞与绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞具有几乎一样的生长、增殖、分化特性。

2、本发明之所以采用成软骨诱导，是为了证明在细胞分化过程中转染绿色荧光蛋白的Balb/c小鼠脂肪成体干细胞和绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞之间的相似性，从而说明完全可以用廉价的转染了绿色荧光蛋白的Balb/c小鼠脂肪成体干细胞来替代价格昂贵的绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞，来进行脂肪成体干细胞体内外的研究；Balb/c小鼠非常廉价，2元人民币/只；而转基因小鼠约2000美元/只；绿色荧光蛋白基因腺病毒载体的首次构建大约需要3000人民币，而每次转染所消耗的试剂平均价格在100元人民币左右；可使脂肪成体干细胞的研究成本大大下降。

3、本发明构建的绿色荧光蛋白基因腺病毒载体可以无限扩增与使用，成本低廉，且国内普通的实验室均可以完成。

4、本发明找到了一种高效的、廉价的脂肪成体干细胞标记方法，为深入研究其分化机制奠定实验学基础；在国内外首次从mRNA及蛋白表达水平成功的比较了脂肪成体干细胞在分化过程中，内外源性绿色荧光蛋白表达的相似性；该方法还为脂肪成体干细胞的体内外研究提供有力的细胞追踪技术，将会极大的推动脂肪成体干细胞的深入研究。

四、附图说明

图1为绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)，用Pac I酶切电泳鉴定的示意图。

图1中，M为入DNA/Hind III marker；1为Ad-GFP(Pac I)；2为Ad-GFP；结果证实成功构建携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体。

图2为Ad-GFP转染Balb/c小鼠脂肪成体干细胞与GFP转基因小鼠脂肪成体干细胞在2周和10周时的形态学HE染色比较的示意图。

图2中，(A)Ad-GFP转染Balb/c小鼠脂肪成体干细胞2周时HE染色，(B)Ad-GFP转染Balb/c小鼠脂肪成体干细胞10周时HE染色，(C)转基因小鼠脂肪成体干细胞在2周时HE染色，(D)GFP转基因小鼠脂肪成体干细胞在10周时HE染色；HE染色提示在诱导后2周(A)、(C)与诱导后10周(B)、(D)时的两种脂肪成体干细胞的形态学表现几乎完全相同。

图3为Ad-GFP转染Balb/c小鼠脂肪成体干细胞与GFP转基因小鼠脂肪成体干细胞在成软骨诱导2周和10周时Aggrecan免疫细胞化学染色和荧光显微镜下GFP表达的结果。

图3中，腺病毒载体转染GFP基因到Balb/c小鼠脂肪成体干细胞中，在经过成软骨诱导后，不仅Aggrecan高度表达(A)，GFP同样高度表达(B)；而且随着诱导时间的延长，Aggrecan和GFP的表达(C)和(D)逐渐减弱；

GFP转基因小鼠的脂肪成体干细胞经过成软骨诱导后同样表达出Aggrecan(E)，GFP同样高度表达(F)；而且随着时间的延长，上述指标也出现逐渐降低(G)、(H)，这与Ad-GFP转染的Balb/c小鼠脂肪成体干细胞在诱导增殖分化过程中的表现完全一样。

图4为Ad-GFP转染Balb/c小鼠脂肪成体干细胞与GFP转基因小鼠脂肪成体干细胞在成软骨诱导2周、6周和10周时，成软骨相关指标的Rt-PCR检测。

图4中，两种脂肪成体干细胞向软骨细胞分化后相关鉴定基因Aggecan、SOX9、Col-I、Col-II、Col-X的Rt-PCR检测结果。Ad-GFP转染Balb/c小鼠脂肪成体干细胞(A)与GFP转基因小鼠(B)，在经过成软骨诱导前后的表达时间、强度完全吻合；从mRNA水平充分说明了AD-GFP转染的Balb/c小鼠脂肪成体干细胞完全可以成为GFP转基因小鼠脂肪成体干细胞的替代细胞进行细胞追踪研究。

图5为Ad-GFP转染Balb/c小鼠脂肪成体干细胞与GFP转基因小鼠脂肪成体干细胞在成软骨诱导2周、6周和10周时，成软骨相关指标的Western blot检测。

图5中，Western blot检测了Ad-GFP转染的Balb/c小鼠脂肪成体干细胞(A)与GFP转基因小鼠脂肪成体干细胞(B)在经过成软骨诱导后，Col-I和Col-II胶原的定量表达，结果证实二者蛋白表达完全吻合；从而从蛋白水平说明了Ad-GFP转染的Balb/c小鼠脂肪成体干细胞可以成为GFP转基因小鼠的脂肪成体干细胞的替代细胞，以进行脂肪成体干细胞相关的细胞追踪与体内外研究。

五、具体实施方式

下面用实施例对本发明作进一步的说明。

实施例

本发明实施例中所用主要材料与试剂：

所用材料：

4-6周Balb/c雄性小鼠(四川大学实验动物中心提供)；绿色荧光蛋白转基因小鼠(四川大学华西医院眼科与遗传病实验室提供)

所用试剂：

α-MEM培养基、胰酶-EDTA，HEPES(美国Gibco公司)；

胎牛血清(FBS)(美国Hyclone公司)；

I型胶原酶、牛血清白蛋白(BSA)、克雷布斯-林格氏碳酸氢盐液(KRB)抗坏血酸、胰岛素、TGF-β 1(美国Sigma公司)；

穿梭质粒pAdTrack-CMV、病毒骨架质粒pAdEasy-1、大肠杆菌BJ5183和DH5 α、人胚肾293细胞株(四川大学华西医院眼科与遗传病实验室提供)；

胰蛋白酶(美国Promeaga公司)；

兔抗鼠Aggrecan相关抗体(武汉博士德公司)；

Trizol RNA提取试剂盒(美国Gibco公司)；

DNA分子量、Taq酶、dNTP、PCR试剂盒(立陶宛MBI公司)。

所用仪器和设备：

CO₂培养箱(美国Forma Scientific公司)；

细胞培养瓶(美国Corning公司)；

超静工作台(苏州净化仪器设备厂)；

IX70型倒置相差荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；

体视解剖显微镜(重庆光学仪器厂)；

流式细胞仪(美国Coulter公司)；

高速离心机(日本Sanyo公司)；

电泳仪(美国BIO-RAD公司)。

1、Balb/c小鼠脂肪成体干细胞与绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞的分离、培养过程：

取4-6周Balb/c雄性小鼠32只，1％戊巴比妥钠(30mg/Kg)腹腔注射麻醉，常规无菌条件下切取鼠蹊部皮下脂肪约1mL，浸于生理盐水中；机械分割及组织消化，在超净工作台中将脂肪剪碎，用脂肪的两倍体积的KRB冲洗去除血液；100目滤网过滤后，脂肪组织中加入与脂肪等体积的质量百分数为0.075％的I型胶原酶，37℃恒温搅拌60min，200目滤网滤去未消化完全的组织块；低速离心(300g×5min)，收集细胞团，细胞团用α-MEM重新悬浮，再300g离心3×5 min，以充分去除胶原酶；脂肪成体干细胞用α-MEM培养基(内含10％胎牛血清)悬浮，接种于25cm²培养瓶中，置入温度为37℃、体积分数为5％的CO₂孵箱中培养，间日换液。当细胞培养7～10d，细胞可达80％融合，倾去培养瓶中的培养基，加入D-Hanks缓冲液5ml清洗后倾去，重复清洗3次。之后加入0.25％胰蛋白酶1ml消化2～3min，显微镜下观察看到细胞开始出现胞体收缩即可加入含血清培养基2ml终止消化，用吸管吸取培养瓶内培养基反复吹打贴壁细胞，至80％以上细胞脱落，然后反复吹打制备成单细胞悬液。进行细胞计数后按照1×10⁴/ml的密度接种于塑料培养瓶中，培养瓶上标记为第一代，传代后2h即换液一次，以后每三天换液一次，待贴壁细胞彼此融合至80％汇合时重复上述操作，反复传代扩增，标记为第二、第三、第四代等。细胞培养2～10周，即获得Balb/c小鼠和绿色荧光蛋白转基因小鼠的脂肪成体干细胞。

2、携带绿色荧光蛋白基因腺病毒载体的制备：

将穿梭质粒(pAdTrack-CMV)限制性内切酶Pme I酶切线性化，与病毒骨架质粒(pAdEasy-1)在2.5kv、2000hms、25μF条件下常规电穿孔共同转化同源重组菌BJ5183细胞；转化菌接种于含卡那霉素的LB培养板中过夜筛选，挑选菌落提取重组腺病毒绿色荧光蛋白基因腺病毒载体，用Pac I酶切鉴定特征性片断，鉴定后电穿孔转化DH5α细菌大量扩增。将293细胞以2×10⁸/L的密度接种于25cm²培养瓶中，24h后细胞生长至80％融合时，将4μg经Pac I酶切线性化的绿色荧光蛋白基因腺病毒载体接种于293细胞培养基中，6h后去除培养液，添加α-MEM培养基，待细胞出现圆缩、脱落等细胞病变时收集细胞及培养基，然后反复冻融3次，离心取上清收获病毒，经常规氯化铯密度梯度离心法纯化，胎牛血清稀释后-70℃温度保存备用。

3、通过腺病毒载体转染绿色荧光蛋白基因到Balb/c小鼠脂肪成体干细胞中：

将含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体的病毒液与Balb/c小鼠第三代脂肪成体干细胞混合培养过夜，筛选阳性克隆细胞进行纯化，即获得转染外源性绿色荧光蛋白基因的Balb/c小鼠的脂肪成体干细胞。

4、诱导腺病毒转染绿色荧光蛋白的Balb/c小鼠脂肪成体干细胞与绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞向成软骨细胞分化及鉴定：

用Ad-GFP病毒液与Balb/c小鼠第3代脂肪成体干细胞混合培养过夜，用无菌细胞刮刀刮取阳性克隆细胞进行纯化扩增后作为实验组，取绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞第3代细胞作为对照组，均以2×10⁷个/L的密度接种于24孔板，加入成软骨诱导液(含6.25mg/L胰岛素、0.05mmol/L的抗坏血酸、10μg/LTGF-β₁及含10％的胎牛血清的α-MEM培养基)培养；24孔板内的细胞在2、6、10w收集细胞进行HE染色、Aggrecan免疫细胞化学染色、Rt-PCR和Western Blot检测。

1)两种小鼠脂肪成体干细胞诱导后形态学及免疫细胞化学鉴定：

两种小鼠脂肪成体干细胞分化后的形态学通过倒置显微镜观察。待细胞达80％融合时，取出细胞爬片，PBS洗涤，4％多聚甲醛固定，简单清洗后浸入体积分数为0.3％的TritonX-100中15 min，蒸馏水冲洗，体积分数为0.03的H₂O₂室温孵育10min，PBS浸泡5 min，再用体积分数为10％的山羊血清室温下封闭30min，倾去血清，分别滴加用小牛血清白蛋白(BSA)稀释为1∶1000的兔抗小鼠Aggrecan抗体(一抗)温度4℃过夜；37℃复温1h，PBS冲洗3次×5min，再滴加1∶100生物素标记的羊抗兔(二抗)，37℃孵育30min，再PBS冲洗3次×5min，滴加1∶100ABC复合物37℃孵育30 min，还用PBS冲洗3次×5 min，DAB显色，自来水充分冲洗，封片，置于光学显微镜下观察。

2)RT-PCR检测软骨相关指标：

①总RNA提取：

总RNA的提取，按照Gibco公司的TRIZOL RNA提取试剂盒说明书提取步骤提取两组脂肪成体干细胞总RNA，同时取空白对照组脂肪成体干细胞的总RNA，实验方法和条件与实验组相同。步骤如下：

a)D-Hanks液离心洗涤细胞2次后离心，倾去上清液。

b)加入1ml Trizol Reagent，吸管反复冲洗离心管，将细胞完全溶解。

c)将溶解有细胞的Trizol Reagent转移到1.5mlDEPC处理的EP管中，4℃，12000×离心10min，将上清移至DEPC处理的EP管，室温下孵育5min。

d)上清液中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡，充分混匀后，室温下孵育3min，4℃，12000×g离心15min。EP管中液体分为三层，上层水相，中间相和下层酚～氯仿相。下层酚～氯仿相置于4℃冰箱留待提取总蛋白。

e)小心吸取含有RNA的水相转移至另一DEPC处理的EP管中，加入0.5ml异丙醇，混匀后静置，室温孵育10min，4℃，12000×g离心10min。将上清弃去，管底沉淀即为RNA。

f)加入DEPC处理过的75％乙醇1ml，轻轻颠倒洗涤EP管管壁，小心弃去乙醇，清洗RNA两次，4℃，7500×g离心5min，去上清，在超净工作台中自然干燥RNA沉淀。50μlDEPC处理水溶解，5μl作1％琼脂糖凝胶电泳和紫外光分光光度计测定260nm、280nm的光密度及其比值。测出RNA浓度及其纯度，上样于1.2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭显色，紫外灯观察有无RNA及RNA是否降解。将RNA样品保存于-80 OC。若提取的总RNA纯度不够，则需进一步纯化。

②逆转录：

将成软骨诱导后不同时间即2周、6周和10周提取的两种脂肪成体干细胞总RNA进行逆转录，该逆转录产物作为PCR扩增模板，采用MBI公司已有的One-Step RT-PCR kit，在PTC-2000PCR仪上按照说明书进行逆转录

③引物设计：

β-actin 5’-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’

5’-ACTCGTCATACTCCTGCTTGC-3’

SOX9 5’-GAACGCACATCAAGACGGAG-3’

5’-TCTCGTTGATTTCGCTGCTC-3’

Aggrecan 5’-GCAGAGACGCATCTAGAAATTG-3’

5’-GGTAATTGCAGGGAACATCATT-3’

Col-I 5’-CATCTCCCCTTCGTTTTTGA-3’

5’-CTGTGGAGGAGGGTTTCAGA-3’

Col-II 5’-TTCAGCTATGGAGATGACAATC-3’

5’-AGAGTCCTAGAGTGACTGAG-3’

Col-X 5’-CACCAGGCATTCCAGGATTCC-3’

5’-AGGTTTGTTGGTCTGATAGCTC-3’

④PCR反应：

将上述逆转录产物进行PCR扩增，反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳观察并照相，PCR扩增操作步骤如下：0℃下预混下列溶液于PCR反应管中：

每个不同时间点即0周、2周、6周和10周的两组细胞的共计8个反应管加矿物油30μl封闭后放PCR扩增仪中进行扩增反应。PCR扩增条件：

a)94℃ 2min

b)94℃ 10sec，55℃30sec，72℃ 1min，35个循环

c)72℃ 5min

d)4℃ 保温

将反应产物取8μl作1.5％常规琼脂糖凝胶电泳，观察并照相。

3)提取蛋白(Western Blot)

取上述提取总RNA步骤中留置的酚-氯仿相溶液，加入1.5ml异丙醇，混匀后至室温静置10min，12000转/min离心，吸取上清液用盐酸胍乙醇溶液洗涤3次，弃去上清液后干燥沉淀，用1％SDS溶解沉淀，取上清经10％SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，经电转膜，5％脱脂奶粉封闭后，用羊抗Col II与Col I多抗(1∶400)于37℃下孵育45min，1×TBST清洗后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，于37℃下反应45min，洗膜后用DAB显色，拍照并灰度扫描，借助Western Blot法半定量检测共同培养不同时间组中细胞ColII与Col I的表达情况。

本发明的结果：

(1)重组腺病毒载体Ad-GFP的鉴定：

Ad-GFP用Pac I酶切后获得30kb的腺病毒基因组片断和3.0kb的复制起始点(ori)及卡那霉素抗性编码基因片断，证实获得了重组腺病毒(图1)。

(2)Ad-GFP转染Balb/c小鼠脂肪成体干细胞与GFP转基因小鼠的脂肪成体干细胞形态学观察：

两种脂肪成体干细胞原代培养情况相似：原代培养消化获取的细胞悬液中可见大量的圆形细胞，并含有少量的细胞碎片；接种后6～24h，可见细胞开始贴壁，细胞呈梭形，胞体较小，单个核；接种后24～48h，贴壁细胞数量增加，少数细胞呈集落样生长，细胞呈梭形、不规则形等，细胞体积逐渐增大；接种后72h，贴壁细胞数量众多，部分聚集成团，细胞呈典型成纤维细胞样生长；培养7～10d，细胞可达80％融合，细胞成片生长，细胞成条形、梭形以及少量多角性细胞。

Ad-GFP感染小鼠脂肪干细胞后16h即可见到有绿色荧光蛋白表达，以后逐渐增加，一周后表达趋于稳定。

(3)成软骨定向诱导后两种脂肪成体干细胞细胞成软骨表型鉴定：

经连续成软骨诱导培养14d，两种脂肪干细胞由原代的长梭形变成了多角形，细胞体积明显增大并伸展出伪足，HE染色显示细胞周围有类似软骨组织中的细胞外多糖的分泌(图2)。免疫细胞化学染色可以观察到细胞密集的地方有aggrecan的形成(图3)。

(4)两种脂肪干细胞经过诱导后表达的成软骨相关基因的RT-PCR检测：

SOX9、Aggrecan、Col-I、Col-II、Col-X都是软骨相关的特异性基因。在本发明中，无论携带内源性还是外源性绿色荧光蛋白的脂肪成体干细胞在诱导后都高度表达了这几种基因。而在阴性对照组中并没有上述基因表达(图4)；Western blot结果证实在诱导后的内源性和外源性脂肪成体干细胞分泌Col-I、Col-II(图5)；无论携带内源性和外源性绿色荧光蛋白的脂肪成体干细胞在诱导过程中，细胞的形态学、免疫细胞化学、mRNA水平、蛋白水平都表现出高度的一致性，充分说明了完全可以用腺病毒载体转染绿色荧光蛋白的Balb/c小鼠脂肪成体干细胞来替代绿色荧光蛋白转基因小鼠的脂肪成体干细胞进行细胞标记、追踪，从而进行脂肪成体干细胞体内外的深入研究。

Claims

1. 一种利用外源性绿色荧光蛋白GFP进行脂肪成体干细胞标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)Balb/c小鼠和绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞的分离、培养：取4-6周Balb/c小鼠和绿色荧光蛋白转基因小鼠，在无菌条件下切取鼠蹊部皮下脂肪，经剪碎、除血液、100目滤网过滤后，脂肪组织中加入与脂肪等体积的质量百分数为0.075％的I型胶原酶，于37℃恒温搅拌60min，200目滤网滤去末完全消化组织块，300g×5min低速离心，收集细胞团用α-MEM重新悬浮，再离心去除胶原酶，脂肪成体干细胞用内含10％胎牛血清的α-MEM培养基悬浮，接种于25cm²培养瓶中，置于温度37℃，体积分数为5％的CO₂孵箱中培养，经间日换液重复清洗，反复传代扩增，细胞培养2～10周，即可获得Balb/c小鼠和绿色荧光蛋白基因小鼠的脂肪成体干细胞；

(2)携带绿色荧光蛋白基因腺病毒载体的制备：

将穿梭质粒pAdTrack-CMV限制性内切酶Pme I酶切线性化，与病毒骨架质粒pAdEasy-1在2.5kv、2000hms、25μF条件下电穿孔共同转化同源重组菌BJ5183细胞，转化菌接种于含卡那霉素的LB培养板中过夜筛选，挑选菌落提取重组腺病毒绿色荧光蛋白基因腺病毒载体，用Pac I酶切鉴定特征性片断，鉴定后电穿孔转化DH5a细菌大量扩增，将293细胞以2×10⁸/L的密度接种于25cm²培养瓶中，24h后细胞生长至80％融合时，将4μg经Pac I酶切线性化的绿色荧光蛋白基因腺病毒载体接种于293细胞培养基中，6h后去除培养液，添加α-MEM培养基，待细胞出现圆缩、脱落等细胞病变时收集细胞及培养基后反复冻融3次，离心取上清收获病毒，经氯化铯密度梯度离心法纯化，胎牛血清稀释后于-70℃保存备用；

(3)通过腺病毒载体转染绿色荧光蛋白基因到Balb/c小鼠脂肪成体干细胞中：

将上述含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体的病毒液与Balb/c小鼠第三代脂肪成体干细胞混合培养过夜，筛选阳性克隆细胞进行纯化，即获得转染外源性绿色荧光蛋白基因的Balb/c小鼠的脂肪成体干细胞；

(4)诱导腺病毒转染绿色荧光蛋白的Balb/c小鼠脂肪成体干细胞与绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞向成软骨细胞分化及鉴定：

用Ad-GFP病毒液与Balb/c小鼠第3代脂肪成体干细胞混合培养过夜，用无菌细胞刮刀刮取阳性克隆细胞进行纯化扩增后作为实验组，取绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪成体干细胞第3代细胞作为对照组，均以2×10⁷个/L的密度接种于24孔板，加入成软骨诱导液于含6.25mg/L胰岛素、0.05mmol/L的抗坏血酸、10μg/LTGF-β₁及含10％的胎牛血清的α-MEM培养基中培养；24孔板内的细胞在2、6、10w收集细胞进行HE染色、Aggrecan免疫细胞化学染色、Rt-PCR和WesternBlot检测。