CN109554351A

CN109554351A - Rspo1诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的应用

Info

Publication number: CN109554351A
Application number: CN201811519862.XA
Authority: CN
Inventors: 杨丽红; 解军; 杨巧艳; 程肖霞; 宋慧芳; 何生; 张娟; 于保锋; 刘丹
Original assignee: Shanxi Medical University
Current assignee: Shanxi Medical University
Priority date: 2018-12-12
Filing date: 2018-12-12
Publication date: 2019-04-02

Abstract

本发明提供了Rspo1诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的应用。以腺病毒为载体，将Rspo1转染大鼠骨髓间充质干细胞，经5‑氮杂胞嘧啶核苷诱导分化，可以检测到心肌样细胞的心肌细胞特异性蛋白表达，且表达量显著增加，表明Rspo1促进了骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，其心肌样细胞转化率高达53%。

Description

Rspo1诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的应用

技术领域

本发明属于再生医学技术领域，涉及一种心肌样细胞的诱导分化方法，特别是涉及一种利用Rspo1将骨髓间充质干细胞定向诱导分化为心肌样细胞的方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是存在于骨髓中的非造血干细胞，具有很强的自我更新能力和多向分化潜能。BMSCs在特定的生理环境或体外诱导条件下，可以向多个胚层的细胞分化，例如心肌细胞、骨及软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和肝细胞等。

BMSCs来源丰富，对供者相对无损，免疫原性低，易于外源基因导入，不存在胚胎干细胞的伦理问题，也不存在诱导多能干细胞的基因稳定性争议。因此，目前已经成为细胞再生医学中应用最为广泛的种子细胞，临床应用于心血管和神经等系统疾病的治疗。动物实验研究显示，将BMSCs移植到特定组织和器官中，其可以向该组织和器官的功能细胞分化。

心肌细胞为永久性细胞，一旦遭到破坏，再生能力极弱。心肌细胞死亡可以引起邻近结缔组织中的成纤维细胞增生并取代坏死的心肌细胞。成纤维细胞能够分泌大量的胶原纤维，进而造成心肌纤维化，严重时引起心脏功能下降甚至心力衰竭。已有研究表明，移植到梗死心肌部位的BMSCs能够向心肌细胞分化以补充部分坏死的原有心肌细胞，缩小了心肌梗死面积，减轻了心肌纤维化，不同程度地改善了心脏功能。

鉴于BMSCs的优势，目前应用BMSCs治疗心肌梗死具有广阔的应用前景，为干细胞在心血管疾病治疗研究中的热点。但是，目前应用干细胞移植治疗心肌梗死仍存在诸多问题，其中最主要的问题是向心肌细胞的转化效率较低。相关研究显示，移植到梗死心肌部位的干细胞，如脐带源性干细胞、脐带血源性干细胞和BMSCs，均不能产生有效治疗数量的心肌细胞。

基因治疗是一种通过载体将目的基因导入靶细胞，继而通过基因修饰、置换、修复等方式达到治疗疾病目的的方法。以干细胞作为基因治疗的载体，将基因治疗与干细胞治疗相结合，具有以下优点：（1）体外将外源基因转染到干细胞易于操作和调控，有利于保证转染的成功率。（2）通过病毒转染外源基因到干细胞，再输注入移植对象体内，可以避免直接将病毒暴露于移植对象的免疫系统，减少免疫反应引起的副作用。（3）干细胞在移植对象体内分化、存活，有利于外源基因的高效、长久表达。（4）干细胞具有向损伤部位定向迁移的特性，有助于外源基因的靶向表达。（5）基因导入干细胞能够提高干细胞定向分化而来的成体细胞的转化率、存活率和功能整合。

以BMSCs作为基因治疗载体的思路是在体外以BMSCs作为靶细胞，通过载体以目的基因转染BMSCs，再将BMSCs移植到移植对象体内的靶器官，通过BMSCs对目的基因的翻译、表达相应目的蛋白以达到基因治疗的目的。

脊椎顶板特异性蛋白1(Roof plate-specific spondin 1，R-spondin 1，Rspo1)属于Rspo分泌蛋白家族成员之一。Rspo1作为Wnt信号通路的激活剂，可以激活经典/非经典Wnt信号通路。已有关于Rspo1的生物学效应研究显示，Rspo1通过促进干细胞的干性维持参与组织正常形态的发生，比如Rspo1促进肠道干细胞增殖、抑制细胞凋亡在小肠的代谢更新中发挥重要作用；Rspo1通过提高胚胎血管内皮细胞的增生参与血管发生和塑型；Rspo1通过促进成体干细胞的增殖和分化、抑制细胞凋亡而促进损伤组织的修复，如肝损伤、骨和软骨损伤、肌肉损伤、胃肠黏膜和口腔黏膜损伤。但是Rspo1在BMSCs分化中的作用目前未见报导。

发明内容

本发明的目的是提供Rspo1诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的应用。

基于背景技术的现状，有必要探寻一种外源基因，将其导入骨髓间充质干细胞中，以提高体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的转化率。

本发明研究发现，提取培养大鼠骨髓间充质干细胞，将Rspo1通过腺病毒载体转染进入骨髓间充质干细胞中，在诱导剂作用下，能够促进大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。Rspo1蛋白有促进大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化、使心肌再生和修复的潜在作用，并且分化为心肌样细胞的心机细胞指标显著升高。

基于此，本发明提出了Rspo1诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的应用。

进而，本发明所述Rspo1诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的应用是在诱导剂5-氮杂胞嘧啶核苷(5-AZA)的存在下实现的。

因此，本发明所述应用中，诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的物质为Rspo1基因DNA和5-氮杂胞嘧啶核苷(5-AZA)。

本发明上述应用中，所述用于诱导分化的骨髓间充质干细胞为离体骨髓间充质干细胞。

更进一步地，所述骨髓间充质干细胞为离体大鼠骨髓间充质干细胞。

进而，本发明还提供了一种诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的方法，所述方法是以携带Rspo1基因的腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞，将Rspo1转染进入骨髓间充质干细胞中，在诱导剂5-氮杂胞嘧啶核苷(5-AZA)作用下，诱导培养所述转染Rspo1的大鼠骨髓间充质干细胞，使其分化得到心肌样细胞。

上述方法中，是将所述携带Rspo1基因的腺病毒载体配制成浓度2×10⁸ PFU/ml的腺病毒液以转染大鼠骨髓间充质干细胞。

以下提供了使用诱导剂5-氮杂胞嘧啶核苷(5-AZA)诱导转染Rspo1的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的具体方法。

1）、将转染腺病毒的骨髓间充质干细胞置于25cm²培养瓶中，弃掉培养基，加入浓度为10μmol/l的5-AZA工作液2ml，继续培养24h。

2）、弃掉5-AZA工作液，PBS清洗2遍，以4ml含10% FBS的L-DMEM培养基培养2～3天，至细胞融合度90%，加入1ml含EDTA的0.25%胰酶溶液，37℃消化3min，至细胞变圆漂浮，加入含10% FBS的L-DMEM培养基终止消化。将细胞移入离心管，1000rpm离心5min，弃掉上清，加入含10% FBS的L-DMEM培养液4ml重悬细胞，以比例1∶2传代。

3）、传代细胞在37℃、5% CO₂培养箱中继续培养，至细胞融合度达到90%，再次进行传代，共传代3次。

本发明上述诱导分化培养的时间为4周。

实验结果显示，高表达Rspo1的骨髓间充质干细胞经诱导分化培养后，能够检测到心肌细胞的特异性蛋白—心肌肌钙蛋白I(cardiac troponinI，cTnI)、连接蛋白43(connexin43，Cx43)、α-心肌肌动蛋白(α-cardiac actin，α-actin)的表达，而且与对照组和阴性对照组相比较，在mRNA和蛋白水平上表达显著增高。证明Rspo1能够提高体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的转化率。

本发明将基因Rspo1转染骨髓间充质干细胞，以提高体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的转化率，实验证明，心肌样细胞的转化率高达53%，为体外干细胞来源的心肌细胞的获取提供了新的细胞来源方法，并使得通过再生对传统认知的永久性细胞损伤进行修复成为可能。

本发明发现Rspo1蛋白具有促进大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用，在诱导剂作用下，过表达Rspo1的骨髓间充质干细胞分化而来的心肌样细胞的心肌细胞表面标记物的表达量显著高于对照组和阴性对照组，证明本发明发现的Rspo1蛋白的促分化作用较显著，为心肌细胞再生以及修复心脏功能的基础科学研究和临床治疗心肌梗死等心血管疾病提供了重要的依据。

附图说明

图1是培养所得各代BMSCs的细胞形态图。

图2是BMSCs特异性表面分子的流式鉴定结果图。

图3是BMSCs细胞周期的流式鉴定结果图。

图4是BMSCs成骨诱导分化的鉴定结果图。

图5是BMSCs成脂诱导分化的鉴定结果图。

图6是以腺病毒为载体Rspo1转染BMSCs的荧光显微镜观察图。

图7是流式细胞仪检测以腺病毒为载体Rspo1转染BMSCs的转染效率图。

图8是RT-PCR检测Rspo1 mRNA在BMSCs的表达量。

图9是Western-blotting检测Rspo1蛋白在BMSCs的表达量。

图10是心肌样细胞的细胞形态图。

图11是免疫荧光检测心肌细胞特异性蛋白α-actin的表达量。

图12是免疫荧光检测心肌细胞特异性蛋白cTnI的表达量。

图13是免疫荧光检测心肌细胞特异性蛋白Cx43的表达量。

图14是BMSCs向心肌样细胞分化的转化率。

图15是RT-PCR检测心肌细胞特异性蛋白α-actin、Cx43和cTnI的mRNA表达量。

图16是Western-blotting检测心肌细胞特异性蛋白α-actin的表达量。

图17是Western-blotting检测心肌细胞特异性蛋白Cx43的表达量。

图18是Western-blotting检测心肌细胞特异性蛋白cTnI的表达量。

图19是流式细胞仪检测心肌细胞特异性蛋白α-actin的表达量。

图20是流式细胞仪检测心肌细胞特异性蛋白Cx43的表达量。

图21是流式细胞仪检测心肌细胞特异性蛋白cTnI的表达量。

具体实施方式

下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1：大鼠BMSCs的分离和培养。

无菌条件下，暴露Sprague-Dawley大鼠后肢股骨和胫骨骨髓腔，培养基(L-DMEM+10%胎牛血清+1%双抗，以下相同)冲洗骨髓腔，直到骨髓腔由红色变为白色。

将骨髓混悬液移入25cm²培养瓶，置于湿度≥95%、37℃、5%CO₂培养箱中培养。

3天后，BMSCs融合度达到90%左右时，进行第1次传代。弃掉培养基，PBS清洗2遍，加入0.25%胰酶(含EDTA)溶液1.5ml，37℃消化3min，显微镜下见细胞变圆漂浮，加入培养基终止消化。

用吸管将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min。弃掉上清，加入培养基，吹打细胞进行重悬，按照传代比例1∶2将原代细胞传到第1代细胞(P0-P1)，湿度≥95%、37℃、5% CO₂培养箱中培养。

BMSCs融合度达到90%左右时，进行第2次传代，即第1代细胞传到第2代细胞(P1-P2)，传代方法同第1次传代。

直到传到第3代细胞(P3)，将P3 BMSCs用于进行后续实验。

所培养各代BMSCs的细胞形态如图1。全骨髓贴壁法提取的P0细胞呈多角形、长梭形，边缘有树突状突起，混杂有少许透亮圆形的造血细胞。P1和P2细胞呈纺锤形或长梭形，排列有序。P3细胞的细胞大小和形状趋于一致，呈长梭形，整体成同心圆状，造血细胞数量减少。细胞形态学上显示，所培养细胞具有与BMSCs相似的形态。

实施例2：大鼠BMSCs的鉴定。

取实施例1培养的P3细胞，加入无EDTA的0.25%胰蛋白酶，37℃消化，以PBS清洗。所得细胞用于流式细胞仪检测BMSCs的特异性表面分子和细胞周期。

以1ml PBS制备细胞混悬液并细胞计数，使细胞密度为1×10⁵个/ml，1000rpm离心5min，弃上清。200μl PBS制备细胞混悬液，加入CD29-APC、CD90-FITC、CD45-PE抗体(Abcam公司)，常温避光孵育30min。PBS清洗，200μl缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测BMSCs的特异性表面分子CD29、CD90和造血细胞的特异性表面分子CD45，结果如图2所示。

图2显示BMSCs特异性表面分子CD29、CD90的表达率分别为(99.54±0.13)%和(95.74±1.39)%，造血细胞特异性表面分子CD45的表达率为(0.87±0.26)%，证明所培养细胞阳性表达BMSCs特异性表面分子，阴性表达造血细胞特异性表面分子。

用4℃预冷的70%乙醇固定液2ml制备细胞悬液，4℃过夜。PBS清洗，用200μl PBS制备细胞混悬液，加RNase 150μl和PI 50μl，室温避光孵育30min。流式细胞仪检测细胞周期。

结果如图3所示，显示G1期、G2期、S期细胞分别为(95.20±0.72)%、(3.21±0.25)%、(1.58±0.49)%，表明所培养细胞群基本处于G1期(即DNA合成前期)，提示所培养细胞具有BMSCs的增殖、分化潜能特性。

取实施例1的P3细胞，加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶，37℃消化，细胞变圆漂浮终止消化。PBS清洗，加培养基制备细胞混悬液。将细胞以1×10⁵个/ml接种于6孔板，每孔加2ml培养基，湿度≥95%、37℃、5% CO₂培养箱中培养。细胞融合度达到60～70%时，分别进行成骨和成脂诱导分化。

每孔加2ml成骨诱导分化培养基，继续培养，每2天换液1次，诱导分化3周。PBS清洗，每孔加2ml 4%中性甲醛溶液，固定30min，PBS清洗。茜素红染色3～5min，光学显微镜观察并且拍照。

光学显微镜观察结果见图4。成骨诱导分化细胞表面可见钙盐沉积并形成类圆形钙结节，茜素红染色为红褐色，对照组无钙结节形成。提示所培养细胞具有BMSCs的成骨分化潜能。

每孔加2ml成脂诱导A液，3天后弃A液换2ml成脂诱导B液，1天后，弃B液换A液。A液、B液交替作用3～5次。PBS清洗，加入4%中性甲醛溶液，固定30min。PBS清洗，油红O染色30min，光学显微镜观察并且拍照。

光学显微镜观察结果见图5。成脂诱导分化的细胞胞浆可见圆形脂滴形成，油红O染色为橘红色，对照组无脂滴形成。提示所培养细胞具有BMSCs的成脂分化潜能。

上述鉴定结果表明，实施例1培养的大鼠P3细胞具有BMSCs的生物学特性。

实施例3：以腺病毒为载体Rspo1转染大鼠BMSCs。

取实施例1的P3细胞，PBS清洗，加入含EDTA的0.25%胰酶，37℃消化3min。细胞以8×10⁴个/孔的密度种植于6孔板中，湿度≥95%、37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。

将BMSCs分为3组：对照组，只加无双抗培养基2ml；阴性对照组，加入阴性对照病毒液1ml+无双抗培养基1ml； Rspo1过表达组，加入浓度为2×10⁸PFU/ml的带有基因Rspo1的病毒液1ml+无双抗培养基1ml。

3组BMSCs孵育24h后换液，继续孵育2天，荧光显微镜观察并拍照。

根据图6的荧光显微镜观察结果，对照组(图6A)未见绿色荧光，阴性对照组(图6C)和Rspo1过表达组(图6E)均可见绿色荧光，表明腺病毒转染进入细胞中，阴性对照组和Rspo1过表达组的转染效率进一步采用流式细胞仪检测。其中图6B、6D和6F分别为图6A、6C和6E相对应的细胞结构图。

PBS清洗3组BMSCs，加入无EDTA的0.25%胰酶，37℃消化，PBS清洗。1ml PBS制备细胞悬液并细胞计数(细胞至少为1×10⁵个/ml)。流式细胞仪检测腺病毒转染BMSCs的转染效率，结果如图7所示，对照组转染效率为(0.05±0.03)%(图7A)，阴性对照组转染效率为(98.47±1.25)%(图7B)，Rspo1过表达组转染效率为(63.52±1.18)%(图7C)。

实施例4：反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Rspo1的mRNA表达水平。

以RNA提取试剂盒分别提取实施例3中3组BMSCs的总RNA，DnaseI(脱氧核糖核酸酶)处理RNA样品以去除DNA污染。

将3组RNA样品分别稀释为100μg/ml，各取10μl样品，用反转录试剂盒合成第一链cDNA。以第一链cDNA为模板，持家基因β-actin作为内参对照，采用表1所示引物，在表2所述RT-PCR反应体系中按照表3的反应条件进行PCR反应。

对PCR反应条带进行灰度扫描，分别与β-actin的灰度值比较，分别计算出3组BMSCs的Rspo1表达量，结果如图8所示。

结果显示，Rspo1过表达组的Rspo1表达量显著高于对照组（p<0.01）和阴性对照组（p<0.01），表明通过腺病毒转染，在基因水平上Rspo1在BMSCs成功高表达，结果提示Rspo1转染进入BMSCs。

实施例5：Western-blotting检测Rspo1蛋白在BMSCs的表达量。

以总蛋白提取试剂盒分别提取实施例3的3组BMSCs的总蛋白。

用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将其转至PVDF膜上，设定电流200mA，转膜时间1.5h。室温下用5%BSA封闭PVDF膜1h。分别在3组BMSCs中加入兔抗大鼠Rspo1 抗体(Abcam公司，浓度1∶1000)，GAPDH一抗(浓度1∶1000)，4℃摇床过夜。用含有0.1% Tween20的PBS(PBST)洗膜3次，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗IgG-HR(浓度1∶5000)，室温摇床孵育1h。PBST洗膜3次，用ECL超敏发光液(美国Thermo Fisher Scientific Inc.)发光并曝光底物。

以持家基因GAPDH为内参对照，经灰度扫描后分别与GAPDH的灰度值比较，计算3组BMSCs的Rspo1蛋白表达量，结果如图9所示。

检测结果显示，Rspo1过表达组的Rspo1蛋白表达量显著高于对照组（p<0.01）和阴性对照组（p<0.01），表明通过腺病毒转染，在蛋白水平Rspo1在BMSCs成功高表达，提示Rspo1成功转染进入BMSCs。

实施例6：转染Rspo1的BMSCs向心肌样细胞的诱导分化。

取实施例3的3组BMSCs，置于25cm²培养瓶中，弃掉培养基，加入浓度为10μmol/l的5-AZA工作液(J&K Scientific公司)2ml，继续培养24h。

弃掉5-AZA工作液，PBS清洗2遍，加入4ml含10% FBS的L-DMEM培养基(以下培养基相同)培养2～3天。5-AZA对细胞毒性较大，细胞漂浮死亡较多属于正常现象。

当细胞融合度达到90%左右时，加入0.25%胰酶(含EDTA)溶液1ml，37℃消化3min，细胞变圆漂浮，加入培养基终止消化。

用吸管移入离心管，1000rpm离心5min。弃掉上清，加入培养基，重悬细胞，传代比例为1∶2，湿度≥95%、37℃、5% CO₂培养箱中继续培养。

观察细胞状态并常规细胞培养，细胞融合度达到90%左右进行传代，传代共3次。

上述诱导分化和培养共计4周，光镜观察细胞形态如图10，细胞成团聚集，说明诱导分化后的BMSCs呈团簇状生长，与对照组和阴性对照组相比，Rspo1过表达组细胞的成团聚集现象更为明显。

将所得细胞进行后续心肌样细胞表达心肌细胞特异性蛋白的验证实验。

实施例7：细胞免疫荧光检测心肌细胞特异性蛋白cTnI、Cx43和α-actin的表达。

取实施例6的BMSCs，弃掉培养基，PBST清洗。

4%中性多聚甲醛溶液(每孔500μl)室温下固定30min，PBST清洗。每孔加入500μl0.5% Triton X-100，室温破膜30min，PBST清洗。10%山羊封闭血清(每孔1ml)室温封闭1h，PBST清洗。

分别加入一抗溶液(α-actin浓度1∶200，Cx43浓度1∶50，cTnI浓度1∶400)，4℃摇床过夜。PBST清洗，加入与一抗对应的荧光二抗溶液(浓度均为1∶100)，37℃避光孵育1h。PBST清洗，滴加DAPI溶液(Solarbio公司)，室温避光孵育10min。去离子水清洗，荧光显微镜观察并拍照。

图11～13分别给出了心肌细胞特异性蛋白α-actin、Cx43和cTnI的免疫荧光检测结果，其中A为对照组，B为阴性对照组，C为Rspo1过表达组。3组BMSCs均有心肌细胞特异性蛋白表达，但Rspo1过表达组分别与对照组和阴性对照组比较，cTnI（p<0.01）、Cx43（p<0.01）和α-actin（p<0.01）的荧光强度均显著增高，从细胞蛋白水平上表明Rspo1促进了BMSCs向心肌样细胞的分化。

根据图12的cTnI荧光检测结果，统计细胞总数(即DAPI染色细胞数量)和cTnI阳性细胞数量，计算心肌样细胞转化率，心肌样细胞转化率＝cTnI阳性细胞数量/DAPI染色细胞数量。

计算结果见图14，显示Rspo1过表达组的心肌样细胞转化率高达53%，明显高于对照组和阴性对照组，表明Rspo1提高了BMSCs向心肌样细胞转化的转化率。

实施例8：RT-PCR检测心肌细胞特异性蛋白α-actin、cTnI和Cx43的mRNA表达量。

取实施例6诱导分化的3组BMSCs，以RNA提取试剂盒分别提取总RNA，具体步骤、反应体系和反应条件同实施例4，采用表4所示引物进行PCR反应。

以持家基因β-actin作为内参对照，经灰度扫描分别与β-actin的灰度值比较，分别计算3组BMSCs的α-actin、cTnI和 Cx43的mRNA表达量，结果如图15所示。

检测结果显示，Rspo1过表达组的α-actin、cTnI和Cx43的mRNA表达量均显著高于对照组（α-actin，p<0.01；cTnI，p<0.05；Cx43，p<0.05）和阴性对照组（α-actin，p<0.01；cTnI，p<0.05；Cx43，p<0.05），表明Rspo1使心肌样细胞的心肌细胞特异性蛋白α-actin、Cx43和cTnI的mRNA表达升高，提示在基因水平上Rspo1促进了BMSCs向心肌样细胞的分化。

实施例9：Western-blotting检测心肌细胞特异性蛋白α-actin、Cx43和cTnI的表达。

取实施例6诱导分化的3组BMSCs，总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，具体步骤同实施例5，一抗α-actin、Cx43、cTnI和GAPDH的浓度均为1∶1000(Abcam公司)，辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗IgG-HR浓度为1∶5000。结果如图16～18所示。

检测结果显示，分别与对照组和阴性对照组比较，Rspo1过表达组的α-actin、Cx43和cTnI的表达量均显著高于对照组（α-actin，p<0.01；Cx43，p<0.01；cTnI，p<0.01）和阴性对照组（α-actin，p<0.01；Cx43，p<0.01；cTnI，p<0.01），表明Rspo1使心肌样细胞的心肌细胞特异性蛋白α-actin、Cx43和cTnI表达升高，提示在蛋白水平上Rspo1促进了BMSCs向心肌样细胞的分化。

实施例10：流式细胞仪检测心肌细胞特异性蛋白α-actin、Cx43和cTnI的表达。

取实施例6诱导分化的3组BMSCs进行流式细胞仪检测，具体步骤同实施例2，α-actin一抗浓度为1∶20， Cx43一抗浓度为1∶50，cTnI一抗浓度为1∶50，荧光二抗浓度均为1∶100。结果如图19～21所示。

检测结果显示，分别与对照组和阴性对照组比较，Rspo1过表达组的α-actin、Cx43和cTnI的表达率均显著高于对照组（α-actin，p<0.01；Cx43，p<0.01；cTnI，p<0.01）和阴性对照组（α-actin，p<0.01；Cx43，p<0.01；cTnI，p<0.01），结果表明在蛋白水平上Rspo1促进了BMSCs向心肌样细胞的分化。

Claims

1.Rspo1诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化是在诱导剂5-氮杂胞嘧啶核苷存在下实现。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的物质为Rspo1基因DNA和诱导剂5-氮杂胞嘧啶核苷。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述用于诱导分化的骨髓间充质干细胞为离体骨髓间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是所述离体骨髓间充质干细胞为离体大鼠骨髓间充质干细胞。

6.一种诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的方法，其特征是以携带Rspo1基因的腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞，将Rspo1转染进入骨髓间充质干细胞中，在诱导剂5-氮杂胞嘧啶核苷作用下，诱导培养所述转染大鼠骨髓间充质干细胞，使其分化得到心肌样细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是将所述携带Rspo1基因的腺病毒载体配制成浓度2×10⁸ PFU/ml的腺病毒液以转染大鼠骨髓间充质干细胞。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征是所述诱导分化培养时间为4周。