CN116144610A - 一种流感病毒裂解疫苗的制备方法 - Google Patents

一种流感病毒裂解疫苗的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116144610A
CN116144610A CN202211588804.9A CN202211588804A CN116144610A CN 116144610 A CN116144610 A CN 116144610A CN 202211588804 A CN202211588804 A CN 202211588804A CN 116144610 A CN116144610 A CN 116144610A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
influenza virus
influenza
culture
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211588804.9A
Other languages
English (en)
Inventor
靳冬武
徐水林
马桂兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou Bailing Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Lanzhou Bailing Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou Bailing Biotechnology Co ltd filed Critical Lanzhou Bailing Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211588804.9A priority Critical patent/CN116144610A/zh
Publication of CN116144610A publication Critical patent/CN116144610A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括以下步骤：无血清全悬浮扩大培养犬肾细胞MDCK‑XF04，保藏编号为CCTCC NO：C2018192；利用MDCK细胞维持培养基稀释犬肾细胞MDCK‑XF04，接种流感病毒进行培养增殖，收获流感病毒液；将流感病毒液制备成流感病毒的单价原液；将单价原液配制成流感病毒裂解疫苗。本发明的生产效率高；生产规模易放大，产品均一性好、批间差小；细胞培养的密度高，流感病毒增殖的滴度高，而且传代细胞增殖病毒不易变异，疫苗更有效；内毒素低，降低了宿主细胞蛋白和DNA的残留；最终产品可以是单价或多价的流感病毒裂解疫苗，具有更广泛的保护性；无抗生素、防腐剂和卵清蛋白。

Description

一种流感病毒裂解疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，是使用MDCK细胞基质来制备流感病毒裂解疫苗，再具体地涉及利用生物反应器无血清全悬浮培养MDCK细胞制备流感病毒裂解疫苗的方法。
背景技术
流感(influenza)，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，流感病毒不仅引起地区性流行，同时也引起世界性大流行，据世界卫生组织(WHO)统计，全球每年感染流感病毒的人数可以达10亿人次。此外根据流感爆发的规律，每隔几十年还会引发一次全球流感大流行，这种现象严重威胁公共卫生安全，以及对人类生命健康产生巨大伤害。近几年流感病毒仍然处于大流行前的变异活跃期，发生流感流行和大爆发的威胁一直存在。对于流感这种古老的疾病，到目前为止疫苗接种仍是防止流感发生和流行最有效的手段。
传统的流感疫苗生产采用鸡胚生产工艺，鸡胚生产工艺存在生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染等诸多缺陷，如遇流感大规模爆发，鸡胚的供应也将存在很大问题。鉴于此，WHO从1995年起开始推动用传代细胞生产流感疫苗。采用传代细胞生产疫苗的工艺将不受鸡胚等天然因素的限制，生产周期短，工艺简单，如遇流感暴发会快速反应，短时间内可提供大量疫苗产品。传代细胞可以用转瓶、细胞工厂和生物反应器等多种方式培养，其中，生物反应器自动化程度高，可将细胞生长和病毒增殖控制在最适条件范围内，提高细胞密度和病毒滴度，实现大批次量、小批间差，产品具有更好的稳定性和安全性，节省了劳动力、生产场地和能源消耗，降低生产成本。生物反应器培养细胞有片状载体、微载体和全悬浮等多种方式，细胞培养至数量达到一定规模时向细胞接种病毒进行病毒增殖培养，从而收获病毒培养液制备疫苗。因细胞全悬浮培养工艺的细胞培养规模可以线性放大，并使用无血清培养基等优势而成为疫苗生产的首选工艺。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种使用生物反应器制备流感病毒裂解疫苗的方法，具体是一种利用生物反应器无血清全悬浮培养MDCK细胞制备流感病毒裂解疫苗的方法，尤其是利用本发明的方法可以制备多价流感病毒裂解疫苗，比如二价、三价、四价、五价流感病毒裂解疫苗。本发明用传代细胞代替鸡胚生产流感疫苗的同时，开发了保护性更广泛的流感疫苗工艺，而且工艺中不使用抗生素、防腐剂，实现流感疫苗的安全、高效及规模化生产(本项目受国家“重大新药创制”科技重大专项《MDCK细胞生物反应器悬浮培养技术平台的建立及四价流感病毒裂解疫苗临床前研究》资助，课题编号：2015ZX09102016，课题承担单位为兰州百灵生物技术有限公司)。
本申请提供一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1，无血清全悬浮扩大培养犬肾细胞MDCK-XF04细胞，所述犬肾细胞MDCK-XF04细胞的保藏编号为CCTCCNO：C2018192；
S2，利用MDCK细胞维持培养基稀释步骤S1的犬肾细胞MDCK-XF04细胞，然后接种流感病毒进行培养增殖，收获流感病毒液；
S3，将步骤S2的流感病毒液制备成流感病毒的单价原液；
S4，将步骤S3制备的单价原液按照流感病毒株血凝素最终含量为24-36μg/ml配制成流感病毒裂解疫苗。
MDCK细胞(Madin-Daby Canine Kidney Cells,MDCK)由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬肾脏组织分离培育建立，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异的特点，MDCK细胞系被公认为是最适于流感病毒复制的细胞系之一。本发明使用的犬肾细胞MDCK-XF04全悬浮培养型细胞于2018年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018192，以此基础上开发了生物反应器无血清全悬浮培养MDCK细胞制造流感裂解灭活疫苗的工艺。
作为优选，步骤S1中，使用5L-6000L生物反应器无血清全悬浮扩大培养犬肾细胞MDCK-XF04细胞。
作为优选，步骤S1中，全悬浮无血清培养MDCK细胞通过以下培养放大条件制得：常规方法复苏犬肾细胞MDCK悬浮培养型细胞，用无血清培养基在摇瓶中扩大培养后，以0.5～5.0×106个/ml的密度接种生物反应器，培养温度为36～37℃、pH值为7.00～7.30、溶氧为20～80％、转速为50～150rpm，培养3～5天，细胞密度达1.0～1.5×107个/ml；再以体积比1:5～1:20的比例转至其他生物反应器中放大培养细胞。
作为优选，步骤S2中，用MDCK细胞维持培养基将细胞密度稀释至2.0～8.0×106个/ml，然后将流感病毒按MOI为0.0001～0.01进行接种。
作为优选，步骤S2中，接种流感病毒后，甲型流感病毒的培养温度32℃～34℃，乙型流感病毒培养温度33℃～35℃；两种病毒培养的pH值为7.10±0.20，溶氧为30％～60％，搅拌转速为80～120rpm；和/或
步骤S2中，待甲型流感病毒培养液红细胞血凝价达(log2HA/25ul)7以上，且细胞活力≤30％时停止培养、收获病毒液；乙型流感病毒培养液红细胞血凝价(log2HA/25ul)8以上，且细胞活力≤30％时停止培养、收获病毒液。
作为优选，步骤S3中，将步骤S2的流感病毒液依次经离心除细胞碎片、微滤澄清、超滤浓缩、层析纯化、灭活剂灭活、裂解剂裂解、超滤除裂解剂和过滤除菌，制备成流感病毒的单价原液。
作为优选，所述微滤澄清是将经除细胞碎片的病毒液，用孔径0.45μm+0.2μm的滤膜过滤澄清；和/或
所述超滤浓缩是将经微滤澄清的病毒液，用300KD膜包超滤浓缩20～50倍。
作为优选，所述层析纯化是将经超滤浓缩的病毒浓缩液，依次用Capto core 700凝胶过滤层析和Capto Q ImpRes离子交换层析两步进行纯化；
作为优选，所述用Capto core 700凝胶过滤层析的具体方法为：采用层析介质为Capto Core 700，上样量不超过柱体积的3倍，平衡液和洗脱液均为pH7.2-7.5的0.1M NaClPB溶液，线性流速为100-200cm/h，在280nm波长监测下洗脱峰为病毒峰；收集范围：当UV280nm起峰时开始收集目标病毒液，实时观察UV280nm的值，UV280nm值下降至100mAU时结束收样；
所述用Capto Q ImpRes离子交换层析的具体方法为：采用层析介质为CaptoQImpRes，上样量不超过柱体积的5倍，上样缓冲液为pH7.2-7.5的0.1M NaCl PB溶液，线性流速为70-160cm/h，pH7.2-7.5的0.5M NaCl PB溶液为洗脱液，在280nm波长监测下洗脱峰为病毒峰；收集范围：0.5M NaCl PB缓冲液洗脱UV280nm开始起峰时，收集目标病毒峰，实时观察UV280nm吸光值，UV280nm值下降至100mAU时结束收样。
采用上述两步层析纯化法有效降低了宿主细胞蛋白和DNA的残留，较单独使用其中任意一种层析纯化方法更能有效降低宿主细胞蛋白和DNA的残留。
作为优选，所述灭活剂灭活是将经层析纯化后的病毒纯化液用灭活剂β-丙内酯在2～8℃振荡灭活20～24h，灭活剂与料液体积比1:1000～1:4000，灭活结束后置37℃水浴振荡2～3h分解β-丙内酯；和/或
所述裂解剂裂解是将经灭活的病毒灭活液用裂解剂Triton X-100在室温震荡裂解2～5h，裂解剂与料液体积比1:100～1:150；和/或
所述超滤除裂解剂是将经裂解剂裂解后的病毒液，用50～100倍体积的PBS通过50KD膜包洗滤除裂解剂，并浓缩至体积接近超滤浓缩后体积；和/或
所述过滤除菌是将经超滤除裂解剂的病毒液用滤膜孔径0.2μm过滤除菌。
作为优选，所述流感病毒裂解疫苗为多价流感病毒裂解疫苗；当为多价时，将步骤S3制备的各单价原液按照各型流感病毒株血凝素最终含量为24-36μg/ml配制成多价流感病毒裂解疫苗；所述多价至少为二价；
作为进一步优选，所述多价至少为三价；
作为进一步优选，所述多价至少为四价。
作为优选，所述多价为四价；
作为进一步优选，所述流感病毒为甲型流感病毒A型H1N1、H3N2和乙型流感病毒B型BY、BV。
与现有技术相比，本发明的优点：1)用传代细胞培养生产工艺替代现有鸡胚生产工艺制造流感疫苗，生产效率高，避免了鸡胚工艺受制于鸡蛋供应限制；2)生物反应器全悬浮培养工艺，生产规模易放大，产品均一性好、批间差小；3)细胞培养的密度高，流感病毒增殖的滴度高，而且传代细胞增殖病毒不易变异，疫苗更有效；4)生产中使用无血清培养基，避免了常规细胞培养基中添加动物血清而潜在生物安全风险；5)因制造过程不易造成污染，内毒素低，采用分子筛和离子交换法两步纯化法降低了宿主细胞蛋白和DNA的残留，有效成份的回收率高于现有超速离心纯化法(鸡胚工艺因不易控制污染，内毒素含量高，采用超速离心法降低了内毒素，有效成份的回收率低)；6)最终产品可以是单价的流感病毒裂解疫苗，也可以是多价的流感病毒裂解疫苗，比如可以是含有两个甲型和两个乙型流感病毒抗原的四价流感病毒裂解疫苗，具有更广泛的保护性；7)工艺中不使用抗生素和防腐剂；8)生产过程不使用鸡胚，无卵清蛋白。
申请号201611207062.5公开的“悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养工艺技术”中，使用培养基对细胞进行稀释，促进了细胞的二次生长，与本发明使用MDCK细胞维持培养基对细胞稀释有不同之处。1)前者培养的目的是促进细胞增殖，本发明的目的是维持细胞生存，促进病毒增殖。2)前者使用培养基稀释成本高，本发明使用成本低的MDCK细胞维持培养基稀释，更具有适用性。
申请号201410212197.5公开的“全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺及产品”中，看似有细胞基质的禽流感疫苗工艺，与本发明有不同之处：1)前者仅为单一抗原的禽用的流感疫苗，本发明可以是多种抗原的人用的流感疫苗，产品品种不一致。2)前者禽流感疫苗纯化进行离心和750KD超滤两个步骤，只进行了简单的除细胞碎片，因动物疫苗对质量的要求低，最终配苗是按照定性实验HA结果，本发明用流感疫苗纯化要进行离心、微滤、300KD超滤、两步层析等多步骤细致纯化，最终配苗是根据定量实验血凝素蛋白(即有效抗原)含量，技术路线和产品质量不一样。3)前者工艺细胞培养密度低，需要借旋转过滤器浓缩细胞并换液，需加0.5～2.0％新生牛血清的营养液增殖病毒，本发明批培养细胞密度达1.5×107个/ml，细胞密度高需要稀释后接毒，而且工艺全程是无血清培养，技术水平不一样。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为生物反应器无血清全悬浮培养MDCK细胞制造四价流感病毒裂解疫苗工艺路线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。
本发明的使用生物反应器制备流感病毒裂解疫苗的方法的主要技术流程主要分为4个阶段：1、生物反应器MDCK细胞放大培养；2、流感病毒的增殖培养；3、单价原液制备及检定；4、成品的制备与检定。以下将分别详细说明。
本发明的方法适用于单价流感病毒裂解疫苗的制备，也适用于多价流感病毒裂解疫苗的制备，比如二价、三价、四价、五价流感病毒裂解疫苗的制备。单价疫苗在制备时，只需要将按照本发明方法制备得到的流感病毒单价原液按照流感病毒株血凝素最终含量为24-36μg/ml进行配制即可。而多价疫苗在制备时，只需要将按照本发明方法制备得到的各流感病毒单价原液按照各型流感病毒株血凝素最终含量为24-36μg/ml进行配制即可。采用本发明的方法制备的四价流感病毒裂解疫苗的总蛋白含量最高仅在血凝素含量的2.78倍(见本申请表10)，远低于标准中规定的4.5倍，故按照本发明的方法完全可以制备二价、三价、四价流感病毒裂解疫苗，推测可以制备五价流感病毒裂解疫苗。
应用本发明的方法，对于流感病毒毒株没有具体要求，可以使用近期较流行的流感病毒毒株来制备疫苗。
以下以四价流感病毒裂解疫苗为例进一步介绍本发明的方法。
实施例1生物反应器MDCK细胞放大培养
1.材料与方法
1.1主要材料和设备
1.1.1MDCK悬浮培养型细胞(犬肾细胞MDCK-XF04)，为专利申请201910237638.X中所述细胞，该细胞在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：C2018192。
1.1.2无血清培养基：SFM-MDCK培养基，兰州百灵生物技术有限公司，货号：CFM414，按说明书配制。
1.1.3摇床，ZCZY-AS8，上海知楚仪器有限公司(CO2可控制)。
1.1.4生物反应器
1)5L生物反应器，CELLIGEN310(培养体积5L)，NBS公司。
2)50L生物反应器，YB-QXF(培养体积50L)，江苏扬中绿扬公司。
3)50L生物反应器，cellipowE09(培养体积50L)，上海日泰公司。
1.1.5细胞计数仪，IC1000，美国Countstar公司。
1.1.6其它材料、容器和设备为常规市售产品。
1.2方法
1.2.1种子细胞的复苏培养
从液氮罐中取出冻存的MDCK悬浮培养型细胞CCTCC NO：C2018192，用止血钳夹住冻存管，在38-40℃的水浴中快速搅动，使其尽快融化，然后置125ml摇瓶在120rpm、37℃、5％CO2摇床培养，根据冻存细胞的数量，无血清培养基体积为40mL，此时细胞密度约0.2～0.5×106个/ml，每24h取样计数，培养3～5天。
1.2.2种子细胞传代培养
待复苏培养的细胞生长至4.0×106～1.0×107个/ml时，将细胞按照0.5～5.0×106个/ml的细胞密度扩增至1L摇瓶中培养，无血清培养基体积为300ml，培养条件同1.2.1，每24h取样计数，为生物反应器提供种子细胞。
1.2.35L生物反应器培养
待1L摇瓶的细胞生长至1.0×106～1.5×107个/ml时，将细胞按照0.5～5.0×106个/ml的细胞密度扩增至5L生物反应器中培养，无血清培养基体积为5L，温度为36～37℃、pH值为7.00～7.30、溶氧为20～80％、转速为50～150rpm，每24h取样计数，培养3～5天。1.2.450L生物反应器放大培养
待5L生物反应器的密度生长至1.0×106～1.5×107个/ml时，将细胞按照0.5～5.0×106个/ml的细胞密度扩增至50L生物反应器中培养，无血清培养基体积为50L，温度为36～37℃、pH值为7.00～7.30、溶氧为20～80％、转速为50～150rpm，每24h取样计数，培养3～5天，细胞密度达1.0×107～1.5×107个/ml。在显微镜下观察，细胞为悬浮状态。
之后可按设计产能，根据生物反应器体积1：5～1：20放大连续扩大培养至所需体积的生物反应器中。目前可以放大到6000L生物反应器中，细胞生长正常，为悬浮状态。
实施例2流感病毒的增殖培养
1.材料与方法
1.1主要材料和设备
1.1.1MDCK悬浮培养型细胞(犬肾细胞MDCK-XF04，保藏编号为CCTCC NO：C2018192)，采用实施例1中50L生物反应器培养的细胞。
1.1.2无血清培养基：SFM-MDCK培养基，兰州百灵生物技术有限公司，货号：CFM414，按说明书配制。
1.1.3MDCK细胞维持培养基：兰州百灵生物技术有限公司，货号：CMM412，按说明书配制。
1.1.4流感病毒毒株，均为WHO提供的流感疫苗生产用毒种，由武汉生物制品研究所有限责任公司提供。
1)甲型：H1N1，IVR-180reassortant derived fromA/Singapore/GP1908/2015，实验用种毒毒价为9.15logCCID50/mL。
2)甲型：H3N2，IVR-186reassortant derived fromA/Singapore/INFIMH-16-0019/2016，实验用种毒毒价为8.5logCCID50/mL。
3)乙型：B(Yamagata lineage，简称：BY)，B/Phuket/3073/2013wild type virus，实验用种毒毒价为10.42logCCID50/mL。
4)乙型：B(Victoria lineage，简称：BV)，NYMCBX-69A reassortant derivedfrom B/Maryland/15/2016，实验用种毒毒价为10.26logCCID50/mL。
1.1.5生物反应器
1)50L生物反应器，YB-QXF(培养体积50L)，江苏扬中绿扬公司。
2)50L生物反应器，cellipowE09(培养体积50L)，上海日泰公司。
1.1.6细胞计数仪，IC1000，美国Countstar公司。
1.1.7其它材料、容器和设备为常规市售产品。
1.2方法
1.2.1接毒培养
采用实施例1中50L生物反应器培养的MDCK细胞接种流感病毒进行增殖培养，将实施例1的50升生物反应器全悬浮培养的MDCK细胞，当密度达到1.0～1.5×107个/ml时，用MDCK细胞维持培养基将细胞密度稀释至2.0～8.0×106个/ml，将流感病毒按MOI为0.0001～0.01分别接种后分别培养增殖。接种流感病毒后，甲型流感病毒的培养温度32℃～34℃，乙型流感病毒培养温度33℃～35℃。两种病毒培养的pH值为7.10±0.20，溶氧为30％～60％，搅拌转速为80～120rpm。
MOI是指：感染复数，即每个细胞感染几个病毒。
1.2.2培养检测
自接种24h起，每12h取样检测细胞密度和活力，检测血凝滴度。
待甲型流感病毒培养液红细胞血凝价达(log2HA/25ul)7以上，且细胞活力≤30％时停止培养、收获病毒液；乙型流感病毒培养液红细胞血凝价(log2HA/25ul)8以上，且细胞活力≤30％时停止培养、收获病毒液。
实施例3流感病毒单价原液制备及检定
1.材料与方法
1.1主要材料和设备
1.1.1标准抗原和标准抗体，均为WHO的国际标准品供应中心实验室提供。
1)A/Singapore/GP1908/2015(H1N1 IVR-180),NIBSC code:16/292；
2)Anti-A/Michigan/45/2015-like HA serum,NIBSC code:17/106；
3)A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(H3N2 IVR-186),NIBSC code:18/110；
4)A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016antiserum，NIBSC code:17/220(18/108)；
5)B/Phuket/3073/2013，NIBSC code:16/158，(简称：BY)；
6)B/Phuket/3073/2013antiserum，NIBSC code:15/150；
7)B/Maeyland/15/2016(NYMC BX-69A)，NIBSC code:18/104，(简称：BV)；
8)B/Maeyland/15/2016antiserum，NIBSC code:18/102(18/170)。
1.1.2超速离心机，Pico17(连续流转头)，美国Thermo Fisher。
1.1.3超滤仪，WUF-10和WUF-1，均为武汉华海公司。
1.1.4蛋白纯化系统，AKTAPURE，美国GE公司。
1.1.5介质Capto Core 700和Capto Q ImpRes，均为美国GE公司。
1.1.6MDCK细胞蛋白检测试剂盒(ELISA法)，美国Cygnus technologies公司。
1.1.7MDCK细胞DNA检测试剂盒(qPCR法)，湖州申科生物技术有限公司。
1.1.8孔径0.45μm+0.2μm的滤膜，赛多利斯公司，货号：5442507H1。
1.1.9其它材料、容器和设备为常规市售产品。
1.2方法
将实施例2收获的流感病毒液分别制成病毒单价原液，并检测。具体方法如下：
1.2.1除细胞碎片
将实施例2收获的不同流感病毒液，分别用5000-15000rpm连续流离心。
1.2.2微滤澄清
经除细胞碎片的病毒液，用滤膜孔径0.45μm+0.2μm(该滤膜为双层膜结构，即该滤膜的孔径逐级变小，液体先通过0.45μm的滤膜，再通过0.2μm的滤膜)过滤澄清。
1.2.3超滤浓缩
经微滤澄清的病毒液，用300KD膜包超滤浓缩20～50倍。
1.2.4层析纯化
经超滤浓缩的病毒浓缩液，依次用Capto core 700凝胶过滤层析和Capto QImpRes离子交换层析两步进行纯化。
1.2.4.1凝胶过滤层析
采用层析介质为Capto Core 700，上样量不超过柱体积的3倍，平衡液和洗脱液均为pH7.2-7.5的0.1M NaCl PB溶液，线性流速为100-200cm/h，在280nm波长监测下洗脱峰为病毒峰。
其中，每升0.1M NaCl PB溶液配方为：2.83g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、0.33g二水合磷酸二氢纳(NaH2PO4·2H2O)、5.84g氯化钠(NaCl)、0.2ml Tween-80，其余为水。
收集范围：当UV(280nm)起峰时开始收集目标病毒液，实时观察UV(280nm)的值，UV(280nm)值下降至100mAU时结束收样。
1.2.4.2离子交换层析
采用层析介质为Capto Q ImpRes，上样量不超过柱体积的5倍，上样缓冲液为pH7.2-7.5的0.1M NaCl PB溶液，线性流速为70-160cm/h，pH7.2-7.5的0.5M NaCl PB溶液为洗脱液。在280nm波长监测下洗脱峰为病毒峰。
其中，每升0.1M NaCl PB溶液配方为：2.83g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、0.33g二水合磷酸二氢纳(NaH2PO4·2H2O)、5.84g氯化钠(NaCl)、0.2ml Tween-80，其余为水。
每升0.5M NaCl PB溶液配方为：2.83g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、0.33g二水合磷酸二氢纳(NaH2PO4·2H2O)、29.2g氯化钠(NaCl)、0.2ml Tween-80，其余为水。
收集范围：0.5M NaCl PB缓冲液洗脱UV(280nm)开始起峰时，收集目标病毒峰，实时观察UV(280nm)值吸光值，UV(280nm)值下降至100mAU时结束收样。
1.2.5病毒液灭活
经层析纯化后的病毒纯化液用灭活剂β-丙内酯在2～8℃振荡灭活20～24h，灭活剂与料液体积比1:1000～1:4000，灭活结束后置37℃水浴振荡2～3h分解β-丙内酯。
1.2.6病毒液裂解
经灭活的病毒灭活液用裂解剂Triton X-100在室温震荡裂解2～5h，裂解剂与料液体积比1:100～1:150。
1.2.7超滤除裂解剂
将经裂解剂裂解后的病毒液，用50～100倍体积的PBS通过50KD膜包洗滤除裂解剂，同时浓缩至体积接近超滤浓缩后体积。
1.2.8过滤除菌
经超滤除裂解剂的病毒液用滤膜孔径0.2μm过滤除菌，即为病毒单价原液，在2～8℃无菌保存。
1.2.9病毒单价原液检测及合格判定
1)鉴别试验，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗检定方法单向免疫扩散试验，合格标准为：抗原性与推荐病毒株相一致。
2)病毒灭活验证
①参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗检定方法鸡胚培养法，合格标准：盲传一代不出现血凝反应。
②MDCK细胞盲传法，合格标准：盲传三代细胞不出现病变。
两种方法均合格时才判定为此项指标合格。
3)血凝素含量，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗检定方法单向免疫扩散试验测定，合格标准：≥120μg/(株·ml)。
4)总蛋白含量，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗检定方法Lowry法，合格标准：应不高于血凝素含量的4.5倍。
5)无菌检查，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗检定方法直接接种法，合格标准：阴性。
6)细菌内毒素含量，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗检定方法凝胶限度试验，合格标准：＜20EU/ml。
实施例4成品的制备与检定
1.材料与方法
1.1主要材料和设备
1.1.1流感病毒单价原液，由实施例3制备。
1.1.2标准抗体，均为WHO的国际标准品供应中心实验室提供。
1)Anti-A/Michigan/45/2015-like HA serum,NIBSC code:17/106；
2)A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016antiserum，NIBSC code:17/220(18/108)；
3)B/Phuket/3073/2013antiserum，NIBSC code:15/150；
4)B/Maeyland/15/2016antiserum，NIBSC code:18/102(18/170)。
1.1.3MDCK细胞蛋白检测试剂盒(ELISA法)，美国Cygnustechnologies公司。
1.1.4MDCK细胞DNA检测试剂盒(qPCR法)，湖州申科生物技术有限公司。
1.1.5其它材料、容器和设备为常规市售产品。
1.2方法
1.2.1配苗
将实施例3制备并检测合格的流感病毒单价原液，用pH为7.2-7.5的PBS稀释，按各型(甲型H1N1、甲型H3N2、乙型BY、乙型BV)流感病毒株血凝素最终含量为24-36μg/株·ml进行混合，按每剂0.6ml进行分装。
1.2.2检测
1)鉴别试验，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗检定方法单向免疫扩散试验，合格标准为：抗原性与推荐病毒株相一致。
2)外观，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗外观检定方法，合格标准：微乳白色液体，无异物。
3)渗透压，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗渗透压检定方法，合格标准：270-320mSmol/kg。
3)pH，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗pH检定方法，合格标准：6.5-8.0。
4)血凝素含量，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗检定方法单向免疫扩散试验测定，合格标准为：24-36μg/ml。
5)总蛋白含量，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗检定方法之Lowry法，合格标准为：应不高于血凝素含量的4.5倍。
6)Triton X-100残留量，高效液相色谱法，合格标准：＜300μg/ml。
7)MDCK宿主细胞蛋白残留量，ELISA法，合格标准为：＜6μg/剂。
8)MDCK宿主细胞DNA残留量，qPCR法，合格标准为：＜10ng/剂。
9)无菌检查，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗检定方法薄膜过滤法，合格标准为：符合规定。
10)异常毒性检查，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗检定方法接种小鼠和豚鼠，合格标准为：动物全部健存，且无异常反应，体重应增加。
11)细菌内毒素含量，参照《中国药典》鸡胚工艺流感疫苗检定方法凝胶限度试验，合格标准为：＜20EU/ml。
检测结果为：本发明的四价流感病毒裂解疫苗，其成品指标除了符合《中国药典》现行版相应指标外，血凝素含量为24～36μg/(株·ml)，MDCK宿主细胞蛋白残余量＜4μg/ml，MDCK细胞DNA残留量＜10ng/ml，细菌内毒素含量＜10EU/ml，不含牛血清白蛋白、卵清蛋白和防腐剂。
应用实施例
一、生物反应器MDCK细胞放大培养
1方法
1.1种子细胞的复苏培养
从液氮罐中取出冻存的MDCK悬浮培养型细胞CCTCC NO：C2018192，用止血钳夹住冻存管，在39℃的水浴中快速搅动，使其尽快融化，然后置125ml摇瓶在120rpm、37℃、5％CO2摇床培养，根据冻存细胞的数量，无血清培养基体积为40mL，每24h取样计数，培养5天，具体复苏培养结果见表1。
1.2种子细胞传代培养
待1L摇瓶的细胞生长至表1所示细胞密度时，将细胞按照表2所示的细胞初始密度扩增至1L摇瓶中培养，无血清培养基体积为300ml，培养条件同1.1，每24h取样计数，为生物反应器提供种子细胞，具体传代培养结果见表2。
1.35L生物反应器培养
待1L摇瓶的细胞生长至表2所示细胞密度时，将细胞按照表3所示的细胞初始密度扩增至5L生物反应器中培养，无血清培养基体积为5L，温度为36.5℃、pH值为7.20、溶氧为50％、转速为120rpm，每24h取样计数，培养3～5天，具体5L生物反应器培养结果见表3。
1.450L生物反应器放大培养
待5L生物反应器的密度生长至表3所示细胞密度时，将细胞按照表4所示的细胞初始密度扩增至50L生物反应器中培养，无血清培养基体积为50L，温度为36.5℃、pH值为7.15、溶氧为60％、转速为100rpm，每24h取样计数，培养4天，具体50L生物反应器放大培养结果见表4。
2结果
2.1种子细胞的复苏培养
种子细胞的复苏培养在125ml摇瓶(无血清培养基体积40ml)培养的结果见表1。
表1种子细胞在125ml摇瓶(无血清培养基体积40ml)复苏培养结果
Figure BDA0003993115390000131
Figure BDA0003993115390000141
2.2种子细胞传代培养
种子细胞在1L摇瓶(无血清培养基体积300ml)传代培养的结果见表2。
表2种子细胞在1L摇瓶(无血清培养基体积300ml)传代培养结果
Figure BDA0003993115390000142
2.35L生物反应器培养
细胞在5L生物反应器(无血清培养基体积5L)培养的结果见表3。
表3细胞在5L生物反应器(无血清培养基体积5L)培养的结果
Figure BDA0003993115390000143
2.450L生物反应器放大培养
细胞在50L生物反应器(无血清培养基体积50L)放大培养的结果见表4。
表4细胞在50L生物反应器(无血清培养基体积50L)放大培养的结果
Figure BDA0003993115390000144
Figure BDA0003993115390000151
二、流感病毒的增殖培养
1方法
1.1接毒培养
采用本实施例步骤一中50L生物反应器培养的MDCK细胞接种流感病毒进行增殖培养，将50升生物反应器全悬浮培养的MDCK细胞，当密度达到1.2×107个/ml时，用MDCK细胞维持培养基将细胞密度稀释至表5中所述的密度(本实施例将一个50L生物反应器的细胞部分或全部分到两个50L生物反应器中，如有多余细胞被弃之)，将流感病毒按表5中所述MOI分别接种后分别培养增殖。接种流感病毒后，甲型流感病毒的培养温度33℃，乙型流感病毒培养温度34℃。两种病毒培养的pH值为7.10，溶氧为50％，搅拌转速为90rpm。
MOI是指：感染复数，即每个细胞感染几个病毒。
1.2培养检测
自接种24h起，每12h取样检测细胞密度和活力，检测血凝滴度。
待甲型流感病毒培养液红细胞血凝价达(log2HA/25ul)7以上，且细胞活力20％以下时停止培养、收获病毒液；乙型流感病毒培养液红细胞血凝价(log2HA/25ul)8以上，且细胞活力20％以下时停止培养、收获病毒液。
2结果
生物反应器中流感病毒在MDCK细胞上培养增殖结果见表5。从而得到不同的流感病毒原液。
表5生物反应器中流感病毒在MDCK细胞上培养增殖结果
Figure BDA0003993115390000152
Figure BDA0003993115390000161
三、流感病毒单价原液制备及检定
1方法
将本实施例步骤二收获的流感病毒原液分别制成病毒单价原液，并检测。具体方法如下：
1.1除细胞碎片
将步骤二收获的不同流感病毒原液，分别用10000rpm连续流离心。
1.2微滤澄清
经除细胞碎片的病毒液，用滤膜孔径0.45μm+0.2μm过滤澄清。
1.3超滤浓缩
经微滤澄清的病毒液，用300KD膜包超滤浓缩40倍。
1.4层析纯化
经超滤浓缩的病毒浓缩液，用Capto core 700凝胶过滤层析和Capto Q ImpRes离子交换层析两步纯化。
1.4.1凝胶过滤层析
采用层析介质为Capto Core 700，上样量不超过柱体积的3倍，平衡液和洗脱液均为pH7.26的0.1M NaCl PB溶液，线性流速为150cm/h，在280nm波长监测下洗脱峰为病毒峰。
收集范围：当UV(280nm)起峰时开始收集目标病毒液，实时观察UV(280nm)的值，UV(280nm)值下降至100mAU时结束收样。
1.4.2离子交换层析
采用层析介质为Capto Q ImpRes，上样量不超过柱体积的5倍，上样缓冲液为pH7.26的0.1M NaCl PB溶液，线性流速为100cm/h，pH7.34的0.5M NaCl PB溶液为洗脱液。在280nm波长监测下洗脱峰为病毒峰。
收集范围：0.5M NaCl PB缓冲液洗脱UV280开始起峰时，收集目标病毒峰，实时观察UV(280nm)值吸光值，UV(280nm)值下降至100mAU时结束收样。
1.5病毒液灭活
经纯化后的病毒纯化液用灭活剂β-丙内酯在4℃振荡灭活22h，灭活剂与料液体积比1：1500，灭活结束后置37℃水浴振荡2.5h分解β-丙内酯。
1.6病毒液裂解
经灭活的病毒灭活液用裂解剂Triton X-100在室温震荡裂解3h，裂解剂与料液体积比1:140。
1.7超滤除裂解剂
将经裂解病毒裂解液，用90倍体积的PBS通过50KD膜包洗滤除裂解剂，并浓缩至体积接近超滤浓缩后体积。
1.8过滤除菌
经超滤除裂解剂的病毒液用滤膜孔径0.2μm过滤除菌，即为病毒单价原液。
1.9病毒单价原液检测及合格判定
按照实施例3的方法进行检测。
2结果
表6甲型流感病毒(H1N1)单价原液检测结果
Figure BDA0003993115390000171
表7甲型流感病毒(H3N2)单价原液检测结果
Figure BDA0003993115390000172
Figure BDA0003993115390000181
表8乙型流感病毒(B/Phuket，BY)单价原液检测结果
Figure BDA0003993115390000182
表9乙型流感病毒(BX-69A，BV)单价原液检测结果
Figure BDA0003993115390000191
四、成品的制备与检定
1方法
1.1配苗
将本实施例步骤三制备并检测合格的流感病毒单价原液，用pH为7.30的PBS稀释，按流感病毒株血凝素最终含量进行混合，其中，甲型H1N1流感病毒株血凝素最终含量三批分别为32、29和32μg/ml，甲型H3N2流感病毒株血凝素最终含量三批分别为36、31和35μg/ml，乙型BY流感病毒株血凝素最终含量三批分别为34、36和34μg/ml，乙型BV流感病毒株血凝素最终含量三批分别为36、33和33μg/ml，最后按每剂0.6ml进行分装。
1.2检测
按照实施例4的方法进行检测。
2结果
表10四价流感病毒裂解疫苗(MDCK细胞)成品检测结果
Figure BDA0003993115390000192
Figure BDA0003993115390000201
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1，无血清全悬浮扩大培养犬肾细胞MDCK-XF04细胞，所述犬肾细胞MDCK-XF04细胞的保藏编号为CCTCC NO：C2018192；
S2，利用MDCK细胞维持培养基稀释步骤S1的犬肾细胞MDCK-XF04细胞，然后接种流感病毒进行培养增殖，收获流感病毒液；
S3，将步骤S2的流感病毒液制备成流感病毒的单价原液；
S4，将步骤S3制备的单价原液按照流感病毒株血凝素最终含量为24-36μg/ml配制成流感病毒裂解疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中，使用5L-6000L生物反应器无血清全悬浮扩大培养犬肾细胞MDCK-XF04细胞。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，用MDCK细胞维持培养基将细胞密度稀释至2.0～8.0×106个/ml，然后将流感病毒按MOI为0.0001～0.01进行接种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，接种流感病毒后，甲型流感病毒的培养温度32℃～34℃，乙型流感病毒培养温度33℃～35℃；两种病毒培养的pH值为7.10±0.20，溶氧为30％～60％，搅拌转速为80～120rpm；和/或
步骤S2中，待甲型流感病毒培养液红细胞血凝价达(log2HA/25ul)7以上，且细胞活力≤30％时停止培养、收获病毒液；乙型流感病毒培养液红细胞血凝价(log2HA/25ul)8以上，且细胞活力≤30％时停止培养、收获病毒液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S3中，将步骤S2的流感病毒液依次经离心除细胞碎片、微滤澄清、超滤浓缩、层析纯化、灭活剂灭活、裂解剂裂解、超滤除裂解剂和过滤除菌，制备成流感病毒的单价原液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述微滤澄清是将经除细胞碎片的病毒液，用孔径0.45μm+0.2μm的滤膜过滤澄清；和/或
所述超滤浓缩是将经微滤澄清的病毒液，用300KD膜包超滤浓缩20～50倍。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：所述层析纯化是将经超滤浓缩的病毒浓缩液，依次用Capto core 700凝胶过滤层析和Capto Q ImpRes离子交换层析两步进行纯化；
作为优选，所述用Capto core 700凝胶过滤层析的具体方法为：采用层析介质为CaptoCore 700，上样量不超过柱体积的3倍，平衡液和洗脱液均为pH7.2-7.5的0.1M NaCl PB溶液，线性流速为100-200cm/h，在280nm波长监测下洗脱峰为病毒峰；收集范围：当UV280nm起峰时开始收集目标病毒液，实时观察UV280nm的值，UV280nm值下降至100mAU时结束收样；
所述用Capto Q ImpRes离子交换层析的具体方法为：采用层析介质为Capto QImpRes，上样量不超过柱体积的5倍，上样缓冲液为pH7.2-7.5的0.1M NaCl PB溶液，线性流速为70-160cm/h，pH7.2-7.5的0.5M NaCl PB溶液为洗脱液，在280nm波长监测下洗脱峰为病毒峰；收集范围：0.5M NaCl PB缓冲液洗脱UV280nm开始起峰时，收集目标病毒峰，实时观察UV280nm吸光值，UV280nm值下降至100mAU时结束收样。
8.根据权利要求5-7任一项所述的制备方法，其特征在于：所述灭活剂灭活是将经层析纯化后的病毒纯化液用灭活剂β-丙内酯在2～8℃振荡灭活20～24h，灭活剂与料液体积比1:1000～1:4000，灭活结束后置37℃水浴振荡2～3h分解β-丙内酯；和/或
所述裂解剂裂解是将经灭活的病毒灭活液用裂解剂Triton X-100在室温震荡裂解2～5h，裂解剂与料液体积比1:100～1:150；和/或
所述超滤除裂解剂是将经裂解剂裂解后的病毒液，用50～100倍体积的PBS通过50KD膜包洗滤除裂解剂，并浓缩至体积接近超滤浓缩后体积；和/或
所述过滤除菌是将经超滤除裂解剂的病毒液用滤膜孔径0.2μm过滤除菌。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法，其特征在于：所述流感病毒裂解疫苗为多价流感病毒裂解疫苗；当为多价时，将步骤S3制备的各单价原液按照各型流感病毒株血凝素最终含量为24-36μg/ml配制成多价流感病毒裂解疫苗；所述多价至少为二价；
作为优选，所述多价至少为三价；
作为进一步优选，所述多价至少为四价。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述多价为四价；
作为优选，所述流感病毒为甲型流感病毒A型H1N1、H3N2和乙型流感病毒B型BY、BV。
CN202211588804.9A 2022-12-12 2022-12-12 一种流感病毒裂解疫苗的制备方法 Pending CN116144610A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211588804.9A CN116144610A (zh) 2022-12-12 2022-12-12 一种流感病毒裂解疫苗的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211588804.9A CN116144610A (zh) 2022-12-12 2022-12-12 一种流感病毒裂解疫苗的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116144610A true CN116144610A (zh) 2023-05-23

Family

ID=86339845

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211588804.9A Pending CN116144610A (zh) 2022-12-12 2022-12-12 一种流感病毒裂解疫苗的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116144610A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5264843B2 (ja) 細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製の方法、および本方法によって入手可能なインフルエンザウイルス
AU2002338666B2 (en) Multiplication of viruses in a cell culture
JP4243349B2 (ja) インフルエンザウイルスの複製のための動物細胞および方法
US10329536B2 (en) Methods for producing an active constituent of a pharmaceutical or a diagnostic agent in an MDCK cell suspension culture
CN107267466B (zh) 一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法
CA2197683C (en) Method for preparing an influenza virus, antigens obtained and applications thereof
CN108042798B (zh) 一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法
CN111920944B (zh) 一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法
US8753646B2 (en) IPV-DPT vaccine
CN110257344B (zh) 无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法
CN116162601A (zh) 一种流感病毒裂解疫苗的制备方法
CN105473712B (zh) 在细胞培养物中大规模生产病毒
EP3234113B1 (en) A method for a large scale virus purification
CN111714626A (zh) 一种采用mdck细胞系生产禽流感疫苗的方法及其制品
CN116144610A (zh) 一种流感病毒裂解疫苗的制备方法
CN102600468A (zh) 一种含mf59佐剂禽流感病毒裂解疫苗的制备工艺
CN113337475B (zh) 一种出血热疫苗生产及纯化工艺
CN107164334A (zh) 一种猪圆环病毒繁殖培养基及其应用
CN117603922A (zh) 一种流感病毒裂解液、流感病毒抗原及其制备方法与应用
CN117180415A (zh) 一种流感病毒裂解疫苗及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination