TWI445715B

TWI445715B - 新穎之鳥類星狀病毒

Info

Publication number: TWI445715B
Application number: TW098114034A
Authority: TW
Inventors: Wit Sjaak De; Carla Christina Schrier; De Laar Marcel Van; Iwan Verstegen
Original assignee: Intervet Int Bv
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2014-07-21
Also published as: CN102066407A; WO2009133054A1; RU2010148430A; ES2567712T3; TW201004972A; RU2547589C2; US8277814B2; MX2010011874A; EP2271663B1; US20110104178A1; EP2271663A1; JP2011520430A; AR071220A1

Description

新穎之鳥類星狀病毒

本發明關於獸醫病毒學及免疫學之領域。具體地說，本發明關於新穎之鳥類星狀病毒；對抗該新穎病毒之抗體或其片段；該新穎之鳥類星狀病毒之抗原製劑、蛋白質及DNA分子；該新穎病毒或其抗原製劑、蛋白質或DNA之疫苗；製造該等疫苗之方法及診斷套組。

星狀病毒係小型、圓形、不具有封套之病毒，該病毒具有正向單股之RNA基因組。大部份星狀病毒與造成某種腸炎有關，引起下痢、嘔吐、吸收不良、身體不適及生長遲緩。感染可使恢復力較差之人或動物致命，諸如年輕、年老或免疫不全之個體。參見：Matsui and Greenberg(in：Fields virology,3^rd ed.,1996,ed.：B.Fields etal.,ISBN：781702534,chapter 26)及Moser and Schultz-Cherry(2005,Viral Immunology,vol.18,p.4-10)。同時，星狀病毒誘發之病變的嚴重性可因星狀病毒種或毒株本身的毒力差異而有所不同。這使人們咸信有些星狀病毒係作為二次致病原，也就是他們本身僅造成次臨床之疾病，唯有當額外疾病原因之另一致病原存在時才會顯現疾病之完整臨床症狀。

免疫力藉以達成防備星狀病毒感染之機制也未完全明瞭；病毒中和抗體似乎確實在防禦及免疫記憶上有其功用，但是可能不是對抗星狀病毒感染之免疫反應的唯一效應物。此由M.Koci(2005,Viral Immunology,vol.18,p.11-16)回顧。

星狀病毒的分布遍及全世界，且從廣泛種類的動物身上分離。其次，在感染特定目標動物之星狀病毒種之中，有數種血清型被描述。就分類學上而言，星狀病毒科家族被分成二個主要的屬，哺乳動物星狀病毒屬(Mamastrovirus)及禽星狀病毒屬(Avastrovirus)。目前禽星狀病毒屬包含先前被識別之種：禽腎炎病毒1及2型(ANV1,2)(源自雞)及土雞星狀病毒1及2型(TAstV1,2)。

數種其他的禽星狀病毒係從鴨、雞、鴕鳥及土雞中分離。舉例來說，巴森戴爾(Baxendale)和孟巴斯辛(Mebatsion)曾經描述雞星狀病毒2型(CAstV2)(2004,Avian pathology,vol.33,p.364-370；及國際專利申請案WO 2004/027053)，陶德(Todd)等人描述與CAstV2密切相關之CAstV3(WO 2007/077464)。在科吉(Koci)和舒茲-雪利(Schulz-Cherry)之回顧文獻中，這些星狀病毒尚未經過正式分類(2002,Avian Pathology vol.31,p.213-227)。

星狀病毒在環境中相當穩定，例如它們能抵抗常見的脂肪溶劑和清潔劑，具有廣泛之pH容忍度且相當耐熱。此特徵以及它們的高感染力和易由糞口途徑傳播之特性，解釋了為什麼星狀病毒或對抗它們之抗體遍及全世界這麼多人和動物之原因。

這些小型RNA病毒之分類及命名經常在新的實驗資料出現時變動更新，以因應新的實驗資料所需之更新。舉例來說，鴨星狀病毒(DAstV)之前的分類是小核糖核酸病毒，原本被稱為鴨肝炎病毒第二型，因為它引起肝炎。同樣的，ANV1過去被歸類為小核糖核酸病毒，具體為腸病毒(Enterovirus)，但是現在被重新分類至禽星狀病毒屬(Imada et al.,2000,J.of Virology,vol.74,p.8487-8493)。ANV1亦被稱為雞星狀病毒1(CAstV1)，且引起腎炎。

當獲得有關其病毒基因組之序列及結構之新資訊時，需要重新分類這些病毒。特別以星狀病毒科而言，研究顯示該物理、電子顯微鏡及生化特徵通常不足以區別星狀病毒科與其他所謂的「小圓型病毒」或「類腸病毒病毒」，諸如小核糖核酸病毒科、杯狀病毒科、或肝炎病毒科(類肝炎E病毒)，或甚至封套RNA病毒諸如引起非常類似星狀病毒之疾病症狀之里奧病毒、輪狀病毒或冠狀病毒。這是因為該些特徵之結果將因所使用之方法及條件而異。因此這些特徵的一致性不足以做出正確決定。

另一方面，分子生物學特徵諸如基因型與免疫學特徵之組合被詳細描述且可重複發生，足以將微生物分配至適當之分類族群(Van Regenmortel et al.,2000,in：Virus Taxonomy,7^th report of the ICTV,Academic press,New York)。因此，理想上該決定係以核苷酸定序、聚合酶連鎖反應(PCR)試驗及血清學定型試驗為基礎。

星狀病毒科之RNA基因組的大小大約是7 kb，該基因組具有此病毒家族之典型基因組結構，參見Jiang et al.(1993,PNAS-USA,vol.90,p.10539-10543)及Koci et al.(2000,J.of Virology,vol.74,p.6173-6177)。根據目前的了解，該基因組含有三個明顯可辨之開放閱讀框(ORF)，從5’端至3’端為：

ORF1a：大小約3 kb，其編碼非結構性蛋白質，具有絲胺酸蛋白酶模體(motif)。

ORF1b：大小約1.5 kb，其部份與ORF1a重疊，且編碼非結構性RNA依賴性RNA聚合酶。

ORF2：由大約2 kb之次基因組RNA編碼結構病毒蛋白質。該表現之多蛋白可能在病毒組合前被裂解成較小部份，且包含質體或外膜蛋白質。

在這三個ORF中，ORF 1b之核苷酸序列相較於公開發表之星狀病毒核苷酸序列保留性最高，ORF 2係序列變異性最高之ORF。

從1987年至今，荷蘭、德國及阿拉伯聯合大公國的禽業發現一些特別的疾病問題，也就是雞和土雞出現下痢、飼料轉換率及生長下降，以及腿部關節及韌帶腫脹及疼痛的問題。這些問題出現在各種年齡之肉雞、種雞和蛋雞中，而且發生在無明顯互動聯繫之不同農場中。

跛腳見於一週齡至數月齡之禽類。動物後肢之跗(踝)關節和韌帶骨幹出現腫脹並充滿清澈微黏之液體，且呈現關節炎之症狀。這些禽類的飼料利用率及生長速率下降，這最可能是因為移動出現問題所致。最壞的情況下，禽類無法移動因此無法採食或飲水，最後導致死亡。這些腿部異常最常見於體重較重的肉種禽類，但是持續性經濟損失在所有種類之禽類均非常可觀。

甚至更嚴重的影響係下痢，此多見於幼禽但亦見於產蛋年齡之禽類。症狀從消化不良到明顯的腸炎不一，且導致飼料轉換率下降；生長緩慢甚或體重減輕；產蛋率下降(產蛋下降)；品質不良之蛋數增加；及死亡。

在一些農場中這個問題持續數年，導致長期生產績效不佳但找不出明確原因。

在進行死後剖檢時發現，有些病例除了小腸或腿關節以外，其他身體部份亦受到影響，諸如砂囊糜爛潰瘍或肝臟腫脹。

為了找出造成這些症狀之原因，就管理及飼料層面進行研究，但是它們與這些病例中觀察到的問題無關。同時探討可能致病之致病原，特別是里奧病毒感染，因為眾所周知此病毒造成吸收不良及關節問題。然而，雖然使用多種檢測仍無法在許多病例中偵測到里奧病毒。

也針對一些已知造成類似問題之其他病原體進行例行性或特別的檢測，諸如細菌：沙門氏桿菌、黴漿菌、嗜血桿菌及巴斯德桿菌；和病毒：腺病毒、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、新城雞瘟病毒(NDV)、感染性黏液囊疾病病毒(IBDV)、產蛋下降症候群(EDS)及禽流感病毒(AIV)。

直到目前為止，仍無法找出與所觀察到之腿及小腸問題相關之致病原，雖然其嚴重性、動物福利問題及在禽業所導致之經濟表現不佳。

因此有識別與所觀察到之疾病症狀有關之病原且提供疫苗及診斷試劑之需求，該疫苗及診斷試劑提供疾病預防及識別該致病原。

意外在出現小腸和移動運動疾病之雞和土雞中發現一種新穎的病毒。該病毒可自各種年齡、種類及來源之病禽的關節和韌帶以及不同的內部器官中分離。該分離病毒在經感染之健康受試動物中誘發類似之疾病症狀，且可自該發病受試動物中再次分離，因此符合柯霍氏假說。

該新穎病毒可被用來發展診斷試驗及疫苗，以偵測並防備該病毒及其在禽類所造成之疾病問題，特別是關節韌帶疾病及胃腸道疾病。

該新穎病毒經過多種方式分析，意外地被歸類為星狀病毒。由於其盛行於雞和土雞中，因此被暫時稱為鳥類星狀病毒。

在許多其他的特徵中，此處描述之新穎病毒係不具封套之事實得自以氯仿連續萃取二次之結果，在以氯仿萃取之後該萃取病毒樣本仍能在SPF雞胚胎蛋造成特定致病效果。

可用於進一步分析之核酸僅能從RNA萃取及RT-PCR得到，無法由DNA分離及一般PCR得到之事實得知，該新穎之病毒中存有RNA基因組。

意外的是，最相近(但仍可區別)之相關病毒被發現為ANV1病毒，因此此處描述之新穎之鳥類星狀病毒代表一種新穎的鳥類腎炎病毒族群，暫時被分類為ANV3病毒。

然而，發明人意外發現一些區別此處所描述之新穎之鳥類星狀病毒與ANV1及其他(星狀)病毒之特徵，並獨特地描述該新穎之鳥類星狀病毒之不同分離株屬於其本身之新穎且獨立之族群。

主要特徵係關於特定核苷酸序列之存在，其可由核苷酸序列分析及PCR檢測辨認。

感染胚胎時亦可觀察到特殊之病理症狀。利用VN或IFT檢驗進行血清型分析可偵測到特定免疫學差異。所有這些將於下列以實驗結果及細節描述。

本發明關於一種經分離之具有開放閱讀框(ORF)1a基因組區域之新穎之鳥類星狀病毒，其特徵為當與雞腎炎病毒1之ORF 1a比較時，該鳥類星狀病毒之ORF 1a含有12個核苷酸之插入序列，該插入序列係位於對應SEQ ID NO：1之第2485與2486個核苷酸之該等核苷酸之間。

較佳之「鳥類」有機體係指禽類；更佳之鳥類有機體係選自雞、土雞、鴨和鵝。最佳為雞。

「星狀病毒」一詞表示本發明之新穎病毒族群與目前被描述及/或分類為屬於星狀病毒科之分類家族之病毒之間的關係。然而，技藝人士將了解假以時日該系統分類可能會改變，因為新的發現將導致重新分類至新穎或其他分類族群。然而，由於這僅改變本發明之病毒之分類但不改變其特徵，因此重新分類之有機體仍屬於本發明之範圍內。

本發明特別包含所有從本發明之鳥類星狀病毒被次分類至亞種、株、分離株、基因型、血清型、變異型或亞型及該類似分類之病毒。

因此，就本發明而言，「星狀病毒」係指具有被分類為星狀病毒之病毒特徵之病毒。該特徵係關於例如分子學、生物化學及生物學特徵；舉例來說具有含有可識別為1a、1b及2之ORF之正向單股RNA基因組；為大小約28至30奈米之不具有封套之病毒體；且引起腸炎。

「基因組區域」一詞係用來表示本發明之新穎之鳥類星狀病毒之基因物質之一部份。該區域將由核酸組成；在本發明之新穎之鳥類星狀病毒之例中，該核酸係RNA。

本發明之新穎之鳥類星狀病毒之基因組和所有其他星狀病毒科相同，包含可識別為且對應ORF 1a、1b及2之區域。

然而意外發現，該新穎之鳥類星狀病毒在其ORF 1a基因組區域中具有一些不存在於ANV1或任何其他種(鳥類)星狀病毒之ORF 1a中之核苷酸。這些核苷酸係呈線形且連續12個核苷酸之片段形式，當與ANV1之ORF 1a序列比較時，代表在此區域中之插入序列。該12個核苷酸「插入序列」係存在於此處所描述之新穎之鳥類星狀病毒族群之所有測試分離株中。

該12個核苷酸插入序列存在此處所描述之新穎之鳥類星狀病毒分離株之ORF 1a中之位置係以如同描述參照ANV1病毒株之基因組序列之編號表示，此由Imada et al.(2000,J.of Virology,vol.74,p.8487-8493)描述。此ANV1病毒株之基因組序列之cDNA序列亦可在美國國家衛生院之網路核苷酸資料庫(GenBank)中找到，登錄號為AB033998，在此處以SEQ ID NO：1表示。

在本發明之新穎之鳥類星狀病毒的所有分離株中，該ORF 1a中之12個核苷酸插入序列係位於對應SEQ ID NO：1之第2485與2486個核苷酸之該等核苷酸之間。

目前還不知道本發明之新穎之鳥類星狀病毒之ORF 1a中的12個核苷酸插入序列(其不存在於ANV1之ORF 1a中)是否或如何影響此新穎之鳥類星狀病毒之行為。在不以任何理論為根據下，發明人假設該插入序列存在12個核苷酸，因此4個保持ORF 1a轉譯框完整之三聯體使得該額外編碼之4個胺基酸被納入從ORF 1a表現之非結構性蛋白質中。很有可能的是，此影響該病毒之病理生理學行為，例如其毒力及其引起小腸疾病和腿、關節及肌腱疾病之能力。

然而，這12個核苷酸存在於此處所描述之新穎之鳥類星狀病毒之ORF 1a基因組區域，但不存在ANV1或其他(鳥類)星狀病毒之ORF 1a中之事實，提供此新穎之病毒族群之陽性基因標記。

在該領域眾所周知的是，基因標記係位於特定基因組位置之有機體基因物質之特徵，其被用於鑑別或建立特定關聯，且可藉由技術方法偵測。當所欲鑑別之族群中含有特徵(如此例中)，此即為該族群之「陽性」基因標記。

作為本發明之新穎之鳥類星狀病毒之特徵的12個核苷酸插入序列之核苷酸序列在此處所描述之新穎之鳥類星狀病毒的所有分離株中並不完全相同，不過大小及位置完全相同。該12個核苷酸插入序列之核苷酸序列的共通序列係：5’-TCYGGDMARYYT-3’，在此處以SEQ ID NO：2表示。

因此，在一較佳之實施態樣中，本發明之特徵係該12個核苷酸插入序列含有如SEQ ID NO：2所示之核酸序列。

技藝人士將知道，SEQ ID NO：2之序列係所謂的「變性」引子序列，表示有的位置(此處為Y、D、M及R)可存在數種核苷酸之一。用來表示變性鹼基之慣用碼係IUPAC碼(發表於Biochem.J.,1985,vol.229,p.281-286)，其中R=G或A；Y=T或C；M=A或C；K=G或T；S=G或C；W=A或T；H=A、C或T；B=G、T或C；V=G、C或A；D=G、A或T；及N=G、A、T或C。

就本發明所描述之新穎之鳥類星狀病毒而言，含有這個可偵測之基因標記能夠讓該新穎病毒及其新穎族群經由例如DNA定序或PCR偵測予以辨識。

DNA定序係眾所周知之技術；例如用於高速自動定序之標準程序及設備可廣泛地取得。該等程序最常採用PCR基礎之「循環定序」，接著進行高清晰度電泳。

關於RNA病毒諸如星狀病毒科之核酸定序，所欲研究之核酸需呈複製DNA(cDNA)之形式，因為RNA定序還不可行。有許多標準程序及商用試劑套組可用於製備cDNA。該程序採用逆轉錄酶酵素。通常使用引子以啟動該複製過程。

適當之RT反應之引子實例在此處係由SEQ ID NO：3所表示之DNA寡核苷酸，其為：5’-TCG WTS CTA CYC-3’。發明人稱此引子為引子17。

此引子與許多鳥類星狀病毒之基因組的遠端3’區域雜交，該區域始於對應SEQ ID NO：1之第6731個核苷酸之該核苷酸，且以反向之方向進行。

圖1顯示數個經選擇之本發明之鳥類星狀病毒分離株之ORF1a片段之cDNA序列比對。這些序列係與ANV1參照病毒之基因組(如SEQ ID NO：1所示)的對應部份比對。如在方框區域顯而易見的，所有分離株具有12個核苷酸之區域，但此區域不存在ANV1 ORF1a中。本發明之鳥類星狀病毒之分離株的ORF 1a cDNA序列之SEQ ID NO係列於表1。

同樣的，圖2顯示圖1列示之cDNA序列經電腦轉譯所製備之假定胺基酸序列之多重比對。在方框區域中可見的是，由本發明之鳥類星狀病毒之ORF 1a編碼之蛋白質含有4個胺基酸，它們不存在於ANV1之ORF1a所編碼之蛋白質中。本發明之鳥類星狀病毒分離株之ORF 1a轉譯序列之SEQ ID NO係列於表1。

關於本發明之鳥類星狀病毒之分離株：在一段時間內從出現上述腿及/或小腸疾病之雞和土雞中收集大量田野分離株。許多這些分離株經過分析，導致此處所描述之本發明之新穎之鳥類星狀病毒族群。然而，所有分析之分離株中只有一部份呈現於此，以定義該新穎之鳥類星狀病毒在該族群中所發生之自然變異。

表1為此處描述之本發明之鳥類星狀病毒分離株之說明。表1亦列出選擇分離株之ORF1a、1b及2之cDNA和假定蛋白質序列之SEQ ID NO。

本發明之鳥類星狀病毒之分離株可從出現小腸或腿疾病之禽類中採集一或多種器官或腿之關節或肌腱之樣本獲得。該樣本視需要可被均質化，且例如與適當之緩衝溶液(較佳為含有抗生素)混合。

為了放大該分離株之病毒力價，可使用不同的基質，諸如鳥類細胞系或鳥類胚胎蛋。當使用蛋時，可將懸浮液接種且培養於鳥類胚胎蛋中。不同的接種途徑是可能的，諸如在絨毛膜尿囊膜(CAM)上、或卵黃囊中、或尿囊液腔中。較佳的是，最初幾次接種至卵黃囊中，之後幾次(若需要)可接種至尿囊液中。約5至7日齡之SPF雞胚胎蛋可被使用。該技術係為該領域之技術人士所熟知，適當品質及年齡之SPF雞蛋可自商業購得，例如Spafas或Lohmann。

在適當條件下培養2至7天後，可收集該胚胎、CAM或(較佳的)尿囊液。有需要的話可藉由接種至卵黃囊或尿囊液中，以在蛋上進行額外放大。最後可收集含有高量之本發明之鳥類星狀病毒之尿囊液。

要以PCR定序ORF 1a之代表性部份之雙股時，可方便地使用下列引子：

SEQ ID NO：28：5’-AAA GGK AAG ACD AAG ARR RAC MG-3’，和

SEQ ID NO：29：5’-TCG CCT TCT GGA AGG TCT TCA-3’。

發明人分別稱這些定序引子為引子F-II和R-II-3。SEQ ID NO：28從對應ANV1之nt 2171和以後(SEQ ID NO：1)之核苷酸開始雜交；SEQ ID NO：29與從SEQ ID NO：1之nt 2640開始之核苷酸雜交，並以相反方向前進(見表4)。如此含有不存在於ANV1中之12個核苷酸之本發明之鳥類星狀病毒之ORF 1a之基因組區域被經定序之ORF 1a之部份涵蓋。

在進行欲測定之DNA序列之電腦分析時，這些引子被移除以使它們不包含來自引子本身之變性序列。比較之序列也必須具有相同長度以達到代表性比對。另外，對該移除序列之全長進行比對。

這表示例如當使用引子SEQ ID NO：28和29時，欲被比較之序列長度約為400至425個核苷酸。

用於該操作及比對之便利電腦軟體係Clone Manager^TM (由Scientific and Educational software^TM )，或者可由網路獲得軟體：用於多重比對之“ClustaIW”，及用於轉譯之“Translate”，二者均可於www.expasy.org取得；或www.ncbi.nlm.nih.gov之“Blast”軟體。較佳的是採用內建計分參數。

使用引子SEQ ID NO：28和29之cDNA定序係用於本發明之鳥類星狀病毒之許多分離株。此處列出一些形成之經修剪之核苷酸序列，如表1中之SEQ ID NO：4、10、12、14、16、18、20、22、24和26。

這些序列彼此互相比對，使用編號161319之雞分離株之序列作為參照，發明人稱該分離株為分離株19。一些源自其他得自GenBank之星狀病毒ORF 1a之對應部份之DNA序列亦經比對，例如ANV1(AB033998,SEQ ID NO：1)、土雞星狀病毒1(TAstV1)(Y15936)、土雞星狀病毒2(AF206663)、綿羊星狀病毒(Y15937)、貂星狀病毒(AY179509)和人星狀病毒(Z25771)；連字符號之間為個別之GenBank登錄號。

在這些其他星狀病毒之ORF1a序列中，只有ANV1(特別是SEQ ID NO：1之nt 2213-2607之部份)具有顯著的序列同一性，表示核苷酸序列同一性百分比超過50%。至於其餘的星狀病毒，只有TAstV1(GenBank acc.nr：Y15936)在核苷酸編號2450-2856之部份具有可偵測、但幾乎不具顯著性之序列同一性。這顯示於表2。

這些核苷酸序列比對結果之樹狀圖顯示於圖3。

因此，我們意外發現本發明之新穎之鳥類星狀病毒之族群與所有其他鳥類或哺乳動物星狀病毒不同，也就是當與對應SEQ ID NO：4之ORF 1a DNA序列之區域比較時，它們分享88%或更高之核苷酸序列同一性。

因此，在一較佳之實施態樣中，本發明關於根據本發明之鳥類星狀病毒，其中該鳥類星狀病毒之ORF 1a包含一區域，該區域含有與SEQ ID NO：4至少88%同一性之核苷酸序列。

更佳的是，本發明關於根據本發明之鳥類星狀病毒，其中該鳥類星狀病毒之ORF 1a包含一區域，該區域含有與SEQ ID NO：4至少89%同一性之核苷酸序列，甚至更佳為90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性(依優先順序)。

除了SEQ ID NO：4之外，任何一個於SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24和26中所描述之部份ORF 1a核苷酸序列可在其他較佳之實施態樣中被用來作為本發明之鳥類星狀病毒之特徵。

和表2所示之ORF 1a核苷酸序列多重比對類似的是，可進行源自表2之修剪核酸序列(SEQ ID NO：4、10、12、14、16、18、20、22、24和26)之假定胺基酸序列之比對。該形成之胺基酸序列(由電腦轉譯)在此處以SEQ ID NO：5、11、13、15、17、19、21、23、25和27表示。該參照序列係SEQ ID NO：5(分離株19之ORF 1a之部份之假定胺基酸序列)。比對亦使用Align+軟體進行，與SEQ ID NO：5之全長比對。結果顯示於表3。

詳細之胺基酸比對顯示於圖2。

此胺基酸序列分析之結果顯示與表2之結果相同之結果：相較於其他鳥類星狀病毒，源自本發明之鳥類星狀病毒之分離株之胺基酸序列本身具有較高之相關性。本發明之鳥類星狀病毒之各分離株之胺基酸序列與SEQ ID NO：5之同一性百分比係介於93至99%，然而與ANV1之同一性較低為88%。

因此，在一較佳之實施態樣中，本發明關於根據本發明之鳥類星狀病毒，其中該鳥類星狀病毒之ORF 1a編碼包含一區域之胺基酸序列，該區域含有與SEQ ID NO：5至少93%同一性之胺基酸序列。

更佳的是，本發明關於根據本發明之鳥類星狀病毒，其中該鳥類星狀病毒之ORF 1a編碼包含一區域之胺基酸序列，該區域含有與SEQ ID NO：5至少94%同一性之胺基酸序列，甚至更佳為95、96、97、98、99或100%同一性(依優先順序)。

除了SEQ ID NO：5之外，任何一個於SEQ ID NO：11、13、15、17、19、21、23、25和27中所描述之部份ORF 1a假定轉譯核苷酸序列可在其他較佳之實施態樣中被用來作為本發明之鳥類星狀病毒之特徵。

除了核苷酸定序及比對之外，本發明之鳥類星狀病毒陽性基因標記可藉由使用PCR測定加以識別，以於例如出現小腸或移動運動疾病之鳥類樣本中偵測是否出現本發明之鳥類星狀病毒之ORF 1a區域中之12個核苷酸，這些核苷酸不存在於ANV1之ORF 1a中。

因此，在另一較佳之實施態樣中，本發明之鳥類星狀病毒之特徵在於，利用SEQ ID NO：30及31所示之引子組，可在PCR反應中從該鳥類星狀病毒之ORF 1a產製約260個核苷酸之PCR產物。

所利用之PCR引子為：

SEQ ID NO：30：5’-GTY CTY ACC GAR GAR GAR TAY C-3’

SEQ ID NO：31：5’-AAD GTT ATY CTC CTA RGB TKH C-3’

發明人分別稱這些引子為引子29和30。

這些引子與對應ANV1(SEQ ID NO：1)之第2252個核苷酸和以後之核苷酸雜交，與對應第2499個核苷酸之核苷酸雜交並以相反方向前進。

該產製之PCR產物可於凝膠上呈現約260個核苷酸之亮帶(此包含引子本身之長度)。只有當起始材料含有包含本發明之鳥類星狀病毒之ORF 1a區域之DNA時才能產製此亮帶，因為只有這些DNA包含不存在於ANV1 ORF 1a中之12個核苷酸。圖4說明引子SEQ ID NO：30和31之專一性結合及它們與該12個核苷酸區域之位置之相關性。

在該PCR反應中，專一性及敏感性係由所使用之特定PCR引子決定，特別是引子的序列及長度。接著藉由調整反應條件及循環條件可達成理想化之選擇性及敏感性，諸如反應步驟之溫度及時間，此為技藝人士所熟知。

這些技術以及其他分子生物學技術在標準教科書中有詳細說明，如Sambrook & Russell：“Molecular cloning：a laboratory manual”(2001,Cold Spring Harbour Laboratory Press；ISBN：0879695773)；Ausubel et al.,in：Current Protocols in Molecular Biology(J.Wiley and Sons Inc,NY,2003,ISBN：047150338X)；C.Dieffenbach & G.Dveksler；“PCR primers：a laboratory manual”(CSHL Press,ISBN 0879696540)；和“PCR protocols”,by：J.Bartlett and D.Stirling(Humana press,ISBN：0896036421)。

很方便的是，使用引子SEQ ID NO：30和31之PCR反應係與產製cDNA所需之RT反應組合且直接在其後發生；使該組合反應成為RT-PCR反應，如實施例中所述。

此處描述之RT-PCR反應被發明人應用於多種樣品上；陽性結果係得自本發明之新穎之鳥類星狀病毒之分離株之樣本；「陽性」PCR結果係指在電泳後看到參照適當之陽性及陰性對照樣本之約260個鹼基對之反應產物。然而，使用引子SEQ ID NO：30和31從相關之鳥類星狀病毒ANV1和雞星狀病毒2(CAstV2)所製備之RT-PCR樣本，被一致性地發現呈陰性之PCR結果。

該PCR測定結果之一例如圖5所示，該圖為經溴化乙錠染色、UV光照射之洋菜膠照片，該洋菜膠上為使用引子SEQ ID NO：30和31之PCR產物。只有分離株19之樣本呈陽性反應，含有ANV1或CAstV2之樣本如陰性對照組般呈陰性反應。

令人意外的是，用本發明之鳥類星狀病毒感染及培養鳥類胚胎蛋時觀察到高度顯著且驚人之病理影響：受感染之胚胎的腿及翅膀尖端顯示亮紅染色。這在以前從未被觀察到或描述。此外，該感染胚胎顯示其他較不顯著之特徵：腹部呈現普遍性淡紅染色、水腫，肝臟嚴重水腫且變成暗紅/紫色。

此特定病理學在SPF雞胚胎蛋感染後約2至7天出現，且幾乎完全導致胚胎死亡，視接種之病毒力價而定。

為了進行比較，在類似的測試條件下同時接種ANV1至胚胎蛋。ANV1亦誘發肝臟水腫，但是肝臟的顏色甚至更暗，且胚胎的整體顏色呈現暗紅色。然而，ANV1不會誘發如本發明之鳥類星狀病毒之分離株所觀察到之腿及翅膀尖端之特殊亮紅染色。

因此，在其他較佳之實施態樣中，本發明之鳥類星狀病毒之特徵在於，其在接種至約5至7日齡之SPF雞胚胎蛋、然後培養2至7天、或甚至適當之更長時間後能誘發雞胚胎之腿和翅膀尖端之變紅。

如述，SPF雞胚胎蛋及用於培養之設備可自商業購得。雞胚胎蛋之培養通常係於約35至39℃濕潤大氣壓之培養箱中進行。

接種可依任何方便之途徑進行，例如經CAM、卵黃囊或尿囊途徑。

如該領域之技術人士所了解的，在偶發狀況中腿及翅膀尖端之特定亮紅染色可能無法看見，例如當接種之病毒量極低(不允許「獲得」病毒)或極高(在變色可能發生之前即導致死亡)；或該胚胎之品質不足以使病毒複製。一般來說，該特定亮紅變色可於每顆蛋接種介於約10至約10^6 EID50時出現(EID50=蛋感染劑量50%)。

本發明之鳥類星狀病毒之一特定分離株被稱為分離株19，其經過進一步純化及放大以作為參照樣本並予以寄存。該分離株係以限制稀釋之方式在雞胚胎肝臟(CEL)細胞上純化。每次仍誘發CEL細胞cpe之最高稀釋濃度被繼代培養。接著藉由在SPF雞胚胎蛋之尿囊腔中進行三次病毒放大以放大此純化病毒。收集尿囊液並冷凍儲存。此純化病毒在SPF雞胚胎蛋上滴定，發現具有6.1 Log10 EID50/ml之力價。此材料在標準穩定緩衝液中冷凍乾燥並儲存於-20℃。確認無菌性。接著於2008年1月23日將此病毒材料之樣本以編號CNCM I-3895寄存於法國巴黎巴斯德研究中心之「國立微生物培養保存中心(CNCM)」。

因此，在其他較佳之實施態樣中，本發明之鳥類星狀病毒係以編號CNCM I-3895寄存於法國巴黎巴斯德研究中心之國立微生物培養保存中心(CNCM)之病毒。

雖然該經過純化、放大和寄存之樣本係稱為「分離株19」之分離株，本發明之鳥類星狀病毒之任一分離株(如表1所述)可用來作為本發明之鳥類星狀病毒之新穎族群之參照樣本。

一些培養系統可使用於活體外培養及測試本發明之鳥類星狀病毒：例如(鳥類)細胞系，諸如原始細胞如CEL或雞胚胎腎細胞(CEK)可有利地被使用。從SPF雞胚胎蛋製備CEL或CEK細胞培養係該領域之技術人士所周知。

CEK細胞特別適合用於監測病毒生長，及測量病毒量及存活性。雖然本發明之鳥類星狀病毒在這些細胞產生之細胞病變效應(cpe)是非典型的，但可清楚地看見感染細胞變成圓形細胞、從單層細胞捲起及發展至細胞溶解。

因此病毒滴定試驗可被設計成使用逐漸稀釋之病毒樣本，計算仍產生cpe之最高病毒稀釋分數。病毒力價接著可用斯皮爾曼-卡博法(Spearman-Karber method)計算之每毫升之組織培養感染劑量50%(TCID50)表示(描述於：D.Finney：Statistical method in biological assay,C.Griffin & Co.,Londen,ISBN 0195205677)。該技術為該領域之技術人士所熟知。

如此該病毒可於組織培養瓶或微滴定盤上培養以供各種測定及目的使用。通常在測試或滴定中使用病毒之前，先將從田野分離之病毒藉由在活體外培養之細胞中繼代幾次以適應該細胞是有利的。

或者，可在胚胎蛋中進行測試和滴定，較佳的是SPF雞蛋。舉例來說病毒滴定可藉由接種逐漸稀釋之病毒樣本至6日齡之SPF雞胚胎蛋之卵黃囊中進行。在紀錄感染或死亡胚胎之數目後，受測樣本所產生之力價可以每毫升之EID50表示，例如使用斯皮爾曼-卡博法(同上)。

寄存病毒造成孵化雞和土雞病理學之能力係於實驗室條件下之一些實驗測試雞中證實。接種係經多重途徑：肌肉內、經口及經眼。一些接受接種之雞出現嚴重的疾病症狀，但是模擬感染雞則未出現症狀。觀察到的症狀為死亡、全面低迷及輕微至嚴重下痢。在組織病理學方面，觀察到腎炎及腸炎。未觀察到腿或關節之疾病，然而本來就不認為會發生因為用於這些試驗之雞年紀太輕(3至6週齡)及/或體重不足(SPF產蛋雞)以表現出該問題。

寄存病毒之基因組之額外區域之核苷酸序列係列於此處以進一步特徵化：ORF 1b和ORF 2。個別核苷酸和假定胺基酸序列係列於此處為SEQ ID NO：5至8，見表1。

用於決定這些額外核苷酸序列之不同引子係列於此處為SEQ ID NO：32至34，且描述於表4；為了方便起見此表亦包括此處描述之其他PCR和定序引子。

另一個提供本發明之鳥類星狀病毒之額外特徵之方法，係以該寄存病毒樣本為參照，利用血清型定型來決定其免疫學特性，較佳為使用VN或IFT試驗。

在所有試驗中，該新穎之鳥類星狀病毒經證實與其他鳥類病毒為免疫學上可區別的，因為它不會被對抗下列其他鳥類病毒之抗體中和及專一性結合：里奧病毒、禽腺病毒(第1、2、4、5和8型)、傳染性支氣管炎病毒、新城雞瘟病毒、傳染性華氏囊病病毒、鳥類腸病毒(分離株1821/9及FP3)、產蛋下降症候群及鳥類流感病毒。同樣的，抗鳥類星狀病毒ANV1或CAstV2之抗體也不會中和或結合這些病毒，不過這些血清確實分別以高至1：640或1：10240之稀釋倍數有效地中和它們的捐贈病毒：ANV1和CAstV2。

然而，該寄存分離株19病毒之樣本被抗分離株19之雞抗血清有效且選擇性地中和，該抗血清係由分離株19實驗性感染SPF雞所產製。在給予補強接種之後，可得到專一性抗血清。在此試驗中用來讀取病毒中和之判斷標準係藉由中和以預防胚胎病變。

使用僅辨識且中和本發明之鳥類星狀病毒之專一性抗體之免疫試驗證實這些病毒屬於新穎且獨特之病毒血清型。

這可被實施於例如另一較佳之實施態樣中，其中本發明之鳥類星狀病毒之特徵在於該鳥類星狀病毒可在病毒中和試驗中被中和，該抗體對抗以標號CNCM I-3895寄存於法國巴黎巴斯德研究中心之國立微生物培養保存中心(CNCM)之星狀病毒之樣本。

另一個利用本發明之寄存病毒產製抗體之方法亦為可能。舉例來說，欲研究是否為(源自)本發明之鳥類星狀病毒之病毒樣本本身可被用來誘發抗體，接著測試該抗體與本發明之鳥類星狀病毒結合甚或中和之能力。該抗體可方便地以本發明之寄存病毒之樣本為測試對象。

就此目的而言，該測試病毒或其部份或製劑可被接種至動物。用於產製該抗體之動物原則上可為任何動物，但較佳為使用小鼠、大鼠、兔、倉鼠、山羊或雞。以此方式產製之抗體可被用於測試與本發明之鳥類星狀病毒結合或中和，例如方便地從CNCM訂購本發明之寄存病毒之樣本。這可於例如蛋、CEK或CEL細胞或其他基質上培養，最後與由該測試病毒樣本產生之抗體一起培養。抗體結合可由例如IFT或VN試驗偵測。

因此這構成一個供識別和特徵化具有生命或不活化之病毒或其部份或製劑係為或源自本發明之鳥類星狀病毒之方法。

因此，在其他較佳之實施態樣中，本發明提供根據本發明之鳥類星狀病毒，其中該病毒能誘發可於VN試驗中中和如本發明之寄存星狀病毒之樣本之抗體。

建立VN試驗之程序係為該領域所熟知，且為該領域之技術人士之例行能力之內。VN試驗之優先事項及細節係如上述。使用對本發明之鳥類星狀病毒具專一性之抗體之免疫試驗結果顯示，本發明亦提供一種可結合且可中和如本發明之鳥類星狀病毒之抗體。

因此，本發明之其他態樣係一種抗體或其片段，其可於病毒中和試驗中中和如本發明之鳥類星狀病毒。

本發明之該抗體可以多種方式獲得及產製，這些方法皆為該領域之技術人士所熟知及採用。舉例來說，該抗體可如上述於實驗動物中(重複)接種以產製。

或者抗體可由永生B淋巴細胞產製，如使用融合瘤技術。現代對典型融合瘤技術之改進使此技術更有效且更具生產力，例如增進融合前所欲脾細胞之量、正向選擇(篩選)接著在含有細胞激素混合物之培養中擴增。融合技術亦有所改善，從典型的聚乙二醇融合法變成電融合法。

在另一替代方法中，抗體可透過使用分子生物技術及在重組表現系統中表現獲得。分子生物技術能讓該抗體適應以更符合所欲治療之目標物種之抗體的特徵，或設計帶有二個不同專一性之結合區域之抗體。表現系統發展允許高容量表現系統之設計，諸如在植物中表現。

重組表現系統亦為該領域所熟知，例如使用細菌(例如大腸桿菌、沙門氏菌、芽胞桿菌、柄桿菌等)、酵母菌(例如酵母菌屬)、昆蟲(支翅夜蛾屬、粉紋夜蛾)、哺乳動物(例如中國倉鼠卵巢)或植物(菸草、馬鈴薯等)細胞。這些細胞可以轉化進帶有所欲表現之異源性序列之表現建構體。使用包含所欲表現之核酸之重組微生物之組合系統亦為已知，該微生物可在活體外之細胞培養以產製所欲規模之所欲蛋白質。一個實例為桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統。最後，所謂的無細胞表現系統可自商業購得以供適當重組DNA分子之無細胞表現。

用語「抗體或其片段」係用來表示完整的免疫球蛋白分子或其部份皆被認為在本發明之抗體之範圍內。本發明之抗體之片段係仍可與本發明之鳥類星狀病毒之表位結合之蛋白質分子。實例為FAB、scFv、Fv、dAb或Fd片段，所有均為該領域所熟知。

該片段可由完整的抗體以例如化學或酵素消化之方式獲得。或者該片段可由例如重組表現系統例如噬菌體展示系統獲得。

如該領域之技術人士所熟知，抗體或其片段與病毒之結合包含辨識在該病毒顆粒上之表位。這些表位最常由該病毒顆粒上展示之分子的線性或三維構型形成。結果，病毒或其部份之製劑可被本發明之抗體或其片段結合，只要這些製劑或部份仍包含且表現正確形式之正確表位。在本發明之鳥類星狀病毒之例中，表現至免疫系統之最重要之病毒蛋白質係從ORF 2編碼之衣殼蛋白質。

技術人士亦將了解到，當本發明之抗體係經由接種至動物產製時，所獲得之動物血清係多株抗血清，表示該抗血清包含可與廣泛種類之表位結合之抗體混合物。事實上這提供多重交互作用，且允許該病毒蛋白質之製劑或片段之有效結合，即使這些製劑或片段不具有或不適當表現完整具有生命之病毒顆粒上正常可得之所有表位。

或者，本發明之抗體可為單株抗體，例如以融合瘤技術產製者，或本發明之抗體可為抗體片段諸如Fab片段。在此例中，該抗體或片段辨識不同表位之能力較為低下，因為其通常只與單一表位專一性結合。因此，當此特定表位不存在或不表現在該病毒片段或製劑上時，該單株抗體或抗體片段可能完全不與該病毒片段或製劑結合。

本發明之抗體可用於多種用途；供特徵化本發明之鳥類星狀病毒、診斷、治療及/或品質保證之目的。

本發明提供以工業規模產製本發明之鳥類星狀病毒。這可由在活體內或活體外系統之宿主細胞中培養該病毒達成。活體外系統包含初代或永生細胞系。初代細胞之實例為CEK或CEL細胞。永生細胞系之實例為LMH細胞系(Kawaguchi et al.,Cancer Res.,vol.47,p.4460-4464)。活體內系統之實例為在鳥類胚胎蛋或在接種禽中培養。特別是在細胞或蛋中之培養可方便的按比例增加；例如細胞培養可保存在不同大小之容器中，諸如培養瓶、滾動細胞培養瓶或甚至醱酵罐。用於任何規模之細胞培養技術之技術和設備係廣為周知且可輕易地自供應商取得。

因此，本發明在另一態樣中提供一種被本發明之鳥類星狀病毒感染之宿主細胞。

同時，本發明提供一種產製如本發明之鳥類星狀病毒之方法，該法包含在適當系統中複製本發明之鳥類星狀病毒並收集該病毒材料。

此處所描述之本發明之鳥類星狀病毒之特徵不光是指呈完整、複製活性形式之鳥類星狀病毒。如技術人士所將瞭解的，本發明提供許多不同形式之此病毒之製劑。這些包含例如其中如本發明之鳥類星狀病毒已被不活化之製劑，或其中該病毒以一或多種(生物)化學或物理方式例如萃取、溶解、消化、均質化或音波化被分餾之製劑。

不活化病毒之方法係廣為周知，例如包括化學或物理不活化，諸如用福馬林、β-乙醇胺或β-丙內酯不活化；也包括加熱或用UV光、X光或放射活性放射線照射。

分餾之方法亦廣為周知，例如用清潔劑諸如TritonX-100萃取或溶解；用胰蛋白酶消化；以冷凍-解凍法或法式細胞破碎器均質化；或以超音波裂解細胞。

該製劑之起始材料可為純化(具有生命或不活化)之本發明之鳥類星狀病毒，但也可以是本發明之宿主細胞，或包含本發明之宿主細胞或鳥類星狀病毒之細胞培養或其部份。舉例來說該細胞培養之部份可能是離心細胞培養之上清液或團塊。很明顯的，這些細胞培養或其部份本身可能變成製劑，諸如上述萃取物、溶解物、消化物、均質物或聲波物。

本發明之鳥類星狀病毒之製劑包含一或多種本發明之鳥類星狀病毒之抗原及表位。

因此在另一態樣中，本發明關於一種得自本發明之鳥類星狀病毒之抗原製劑。

本發明之抗原製劑可與本發明之抗體或其部份結合，或本身可被用來誘發結合或中和抗體或其部份。此可有利地被應用於將於下列描述之疫苗及診斷劑。

本發明之抗原製劑係為例如源自本發明之鳥類星狀病毒之蛋白質或該蛋白質之部份。這些蛋白質或其部份可自該病毒分離以獲得。然而，這些病毒或其部份亦可方便地以重組DNA表現技術由本發明之鳥類星狀病毒之核酸產製。舉例來說，可使用SEQ ID NO：4、10、12、14、16、18、20、22、24或26中任一項所述之ORF 1a區域部份之核酸序列；如描述這些cDNA序列含有與SEQ ID NO：4至少88%同一性之核苷酸序列。

因此在另一態樣中本發明提供一種DNA分子，其包含一區域，該區域含有與SEQ ID NO：4至少88%同一性之核苷酸序列。

亦可使用如SEQ ID NO：6或8所述之ORF 1b或ORF 2之核酸。

該核酸序列和cDNA片段可利用該領域已知之recDNA技術選殖及表現，例如次選殖至重組DNA分子以供進一步操作。該recDNA分子可為載體諸如細菌質體。較佳的是源自本發明之鳥類星狀病毒之核酸係與表現控制序列諸如啟動子操作連接，讓它能在適當之宿主細胞或表現系統中表現。或者該核酸、cDNA或重組DNA分子可被導入具有生命之重組載體微生物諸如細菌或病毒中。

類似的是，根據SEQ ID NO：5、11、13、15、17、19、21、23、25和27中所述之假定胺基酸序列和它們的相關序列，本發明在另一態樣中提供一種蛋白質，其包含一區域，該區域含有與SEQ ID NO：5至少93%同一性之胺基酸序列。

這些實施態樣在疫苗及診斷劑之應用上具有高度實際及有利的效用，這將於下描述。

疫苗可自具有生命或不活化之微生物致病原，諸如病毒，或自該微生物之片段製備。該微生物通常藉由在細胞、器官或組織、胚胎蛋或宿主細胞中培養以較小量或較大量工業化產製。在收集含有該微生物之懸浮液之後，此懸浮液被調配成疫苗，最終產物經過包裝。在廣泛測試品質、質量及無菌性之後，該疫苗產品可上市供銷售之用。

疫苗學中之綜合技術及考量係為該領域所熟知，且描述於例如政府法規及手冊中，諸如「獸醫疫苗學(Veterinary vaccinology)」(P.Pastoret et al.ed.,1997,Elsevier,Amsterdam,ISBN：0444819681)和「雷明頓：藥理學之科學及實務(Remington：the science and practice of pharmacy)」(2000,Lippincot,USA,ISBN：683306472)。

疫苗在該領域中通常被認為是代表一種醫藥組成物，其包含於醫藥上可接受之載劑中之免疫性化合物。該免疫性化合物是一種能誘發目標免疫系統活化之具有生命或不活化之微生物或其次單位。

意外發現本發明之鳥類星狀病毒及抗原製劑、宿主細胞、抗體、核酸、蛋白質及用於製備它們的製劑、培養、識別及定量之方法可被應用於疫苗及診斷目的。該疫苗用於保護目標動物不受鳥類星狀病毒感染，或減少該病毒之複製或其造成之疾病症狀。該診斷試驗允許在例如動物田野樣本或病毒製劑中偵測病毒或其抗原。

組合該疫苗與診斷劑允許識別及防備本發明之鳥類星狀病毒造成之感染及/或疾病。

疫苗能力係由所描述之動物實驗證明，其中雞接種本發明之鳥類星狀病毒。此導致產生高專一性之抗體。另外這些抗體被證實能專一性中和本發明之鳥類星狀病毒。如同該領域所熟知的是，誘導中和抗體係有效及具免疫保護性疫苗可行性之重要步驟。

重複接種試驗動物不只補強所產生之抗體量，亦用來作為攻毒感染，試驗中大多數鳥類可耐受及克服。

因此本發明之鳥類星狀病毒或其部份可能被調配成適當之醫藥組成物，並被應用至鳥類以作為疫苗。

進一步最佳化此疫苗係屬該領域之技術人士之能力範圍，舉例來說微調該疫苗之效果及安全性，以使該疫苗在可接受程度之疫苗反應下提供足夠之防備作用。這可藉由調整疫苗劑量、或使用另一形式或劑型之疫苗、或調整該疫苗之其他成分(例如穩定劑或佐劑)、或經由不同途徑施予以達成。

本發明之疫苗之廣為周知之變體可能使用例如具有生命或不活化形式之該新穎之鳥類星狀病毒；當使用本發明之抗原製劑及/或蛋白質時可能為次單位疫苗；當使用本發明之抗體或其片段時可能呈被動疫苗之形式；當使用本發明之DNA分子時可能呈DNA疫苗之形式。

因此本發明之另一態樣提供一種疫苗，其包含如本發明之鳥類星狀病毒、如本發明之抗體或其片段、如本發明之抗原製劑、如本發明之DNA分子或如本發明之蛋白質，及醫藥上可接受之載劑。

類似的是，本發明之其他態樣關於一種用於禽類疫苗之化合物或組成物，其中該化合物或組成物係如本發明之鳥類星狀病毒、如本發明之抗體或其片段、如本發明之抗原製劑、如本發明之DNA分子或如本發明之蛋白質。

在另一態樣中，本發明關於一種化合物或組成物供製造禽類疫苗上之用途，其中該化合物或組成物係如本發明之鳥類星狀病毒、如本發明之抗體或其片段、如本發明之抗原製劑、如本發明之DNA分子或如本發明之蛋白質。

在另一態樣中，本發明關於一種製造禽類疫苗之方法，其中化合物或組成物係與適當之醫藥載劑混合，且其中該化合物或組成物係如本發明之鳥類星狀病毒、如本發明之抗體或其片段、如本發明之抗原製劑、如本發明之DNA分子或如本發明之蛋白質。

「醫藥上可接受之載劑」可為例如無菌水、生理鹽類溶液、或適用於此目的之緩衝液。更複雜形式之載劑本身可能包含其他化合物，諸如佐劑、額外抗原、細胞激素等。

本發明之疫苗可被用於預防及治療用途。

用語「疫苗」係指存在免疫有效量之本發明之鳥類星狀病毒，及存在醫藥上可接受之載劑。

構成「免疫有效量」之本發明之疫苗係依所欲效果及鳥類星狀病毒之特徵及目標生物而定。決定該有效量係屬該領域技術人員之例行技術，例如藉由監測免疫接種或攻毒感染後之免疫反應，例如監測目標物之疾病臨床症狀、血清學參數、或重新分離該致病原，並與未接受免疫接種之動物之反應比較。

在疫苗中使用非常高量之本發明之鳥類星狀病毒、抗原製劑、抗體或其片段、DNA分子或蛋白質雖然在免疫學上非常有效，但就商業考量將不被接受。本發明之疫苗中所包含之本發明之任何這些化合物或組成物之較佳量係介於該疫苗中體積之0.1至90%。更佳之量按優先順序係介於1至50%、1至25%和1至10%。

在不活化或次單位疫苗之例中，本發明之化合物或組成物可以ELISA單位表示。有效之ELISA單位之量需要與具有特定效果之標準化樣本比較以決定。

在本發明之活疫苗之例中，可使用pfu(菌斑形成單位)、cfu(菌落形成單位)、TCID50、EID50或ELD50(胚胎致死劑量50%)之量，以可方便定量鳥類星狀病毒疫苗劑量之方式而定。舉例來說，每支疫苗劑量介於1至10^6 EID50範圍內之活鳥類星狀病毒疫苗劑量可有利地被使用；較佳為介於10至10^5 EID50/劑量範圍，更佳為介於10^2至10^4 EID50/劑量。

在較佳之實施態樣中，本發明關於如本發明中之疫苗，其中如本發明中之鳥類星狀病毒係呈具有生命之形式。

活疫苗通常具有只需要接種少量之優點，因為微生物會自行複製。同時這通常誘發可靠且有效之免疫反應，並伴隨適當之免疫記憶。

如該領域所知，活疫苗可方便的被當作減毒活疫苗應用，表示該疫苗病毒相較於原始病毒分離株具有降低之毒性或致病性。病毒減毒之方法係為該領域所知，且包含例如：持續透過動物或細胞培養繼代；化學減毒；或以分子生物技術減毒。

在另一較佳之實施態樣中，本發明關於如本發明中之疫苗，其中如本發明中之鳥類星狀病毒係呈不活化。

用於病毒不活化之方法及材料已於上描述。該不活化疫苗通常具有相較於活疫苗更為安全之優點，因為它們不會使宿主暴露在任何可能致病之複製活鳥類星狀病毒之中。

在另一較佳之實施態樣中，本發明之疫苗額外包含一佐劑。

佐劑是一種免疫刺激物質，其以非專一性方式加強宿主之免疫反應。許多不同的佐劑係為該領域所知。經常使用之佐劑實例為胞壁酰二肽、脂多糖、一些聚葡萄糖或多糖、聚羧乙烯(Carbopol)、氫氧化鋁(Al(OH)₃ )。這些可與不同乳劑組合，諸如油包水(w/o)乳劑、o/w乳劑和w/o/w雙重乳劑。適用於油性乳劑之油性佐劑係例如礦物油或可代謝油。礦物油為例如Bayol、Marcol和Drakeol；可代謝油為例如植物油，諸如花生油和大豆油，或動物性油脂諸如魚油鯊烯。或者如EP 382,271中所述之維生素E(生育酚)溶解物可有利地被使用。

非常適合之o/w乳劑係從例如5-50%重量/重量比之水相和95-50%重量/重量比之油性佐劑開始獲得，更佳為使用20-50%重量/重量比之水相和80-50%重量/重量比之油性佐劑。

佐劑之添加量將依該佐劑本身之特性以及製造商提供有關該量之資訊決定。

雖然實務上經常使用佐劑與不活化疫苗之組合，一些活疫苗顯示加入佐劑也具有好處。因此此實施態樣亦屬本發明之範圍內。

在另一較佳之實施態樣中，本發明之疫苗額外包含穩定劑。

穩定劑可被添加至本發明之疫苗中以例如防止其降解、延長貨架生命或增進冷凍乾燥效果。有用之穩定劑為例如SPGA(Bovarnik et al.,1950,J.Bacteriology,vol.59,p.509)、脫脂奶、明膠、牛血清白蛋白、碳水化合物例如山梨醇、甘露醇、菌藻糖、澱粉、蔗糖、聚葡萄糖或葡萄糖、蛋白質諸如白蛋白或乾酪素或其降解產物、緩衝液諸如鹼金屬磷酸鹽及聚胺諸如精胺。

亦可添加保存劑，諸如硫柳汞、乙汞硫代水楊酸鈉或建它黴素。

此外，該疫苗可能包含一或多種適當之表面活性化合物或乳化劑，例如Span或Tween。

該疫苗也可能包含所謂的「載劑」。載劑係一種本發明之多肽或蛋白質與其連接但不與其共價結合之化合物。該載劑為例如生物微膠囊、微藻酸鹽、脂質體及大分子物，所有均為該領域所知。該載劑之特殊形式係免疫刺激複合物(ISCOM)。

不用說明即可知道，混合其他穩定劑、載劑、稀釋劑、乳劑及該類似物與本發明之疫苗亦屬本發明之範圍內。該添加劑係描述於廣為周知之手冊諸如「雷明頓」和「獸醫疫苗學」中(同上)。

將本發明之疫苗調配為組合疫苗是高度有效的，因為以此方式可一次投予多種免疫作用劑，以減少時間及勞力成本，同時降低該免疫接種目標動物之不適。

該組合疫苗係藉由組合本發明之疫苗與另一抗原化合物完成，諸如(具有生命或不活化之)病毒、細菌、寄生蟲或其部份諸如蛋白質、碳水化合物或能編碼抗原之核酸。由於本發明之疫苗係意圖用於鳥類目標動物，將其與係為或源自其他禽類致病原之額外抗原組合是有益處的。

因此，在其他較佳之實施態樣中，本發明之疫苗包含至少一種得自對禽類具致病性之微生物之額外抗原。

已知許多鳥類致病原，然而一些比較重要之獸醫經濟致病原為：

-病毒：傳染性支氣管炎病毒、新城雞瘟病毒、禽流感、腺病毒、產蛋下降症候群病毒、傳染性華氏囊病病毒(意即甘保羅病毒)、雞貧血病毒、鳥類腦脊髓炎病毒、鳥痘病毒、土雞鼻氣管炎病毒、鴨瘟病毒(鴨病毒性腸炎)、鴿痘病毒、馬立克病、鳥類白血病病毒、傳染性喉氣管炎病毒、鳥類肺炎病毒及里奧病毒；

-細菌：大腸桿菌、沙門氏桿菌屬、鼻氣管炎鳥疫桿菌(Ornitobacterium rhinitracheale)、副雞嗜血桿菌(Haemophilis paragallinarum)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、丹毒屬、黴漿菌屬及梭菌屬；

-寄生蟲：艾美球蟲屬；

-真菌：例如麴菌屬等。

同樣可想見的是例如在本發明之疫苗中組合二或多種如本發明中之鳥類星狀病毒，以形成對本發明之鳥類星狀病毒之變體有更廣泛效果之組合疫苗。可被用於形成該組合疫苗之鳥類星狀病毒之實例為表1中描述之分離株。

本發明之疫苗可能呈任何適用於投予至禽類之形式，且該形式符合所欲施予之途徑及所欲之效果。

本發明之疫苗製劑係由技術人士廣為周知之方法製備。較佳的是，本發明之疫苗係調配成適用於注射之形式，諸如懸浮液、溶液、分散液、乳化液及該類似物。通常該疫苗以無菌製備。

許多投予方式可以被採用，所有皆為該領域所知。本發明之疫苗若為不活化疫苗係以注射投予為佳；若為活疫苗則以大量使用之方法投予為佳，例如經由飼料、噴霧或飲水。

本發明之疫苗之投予方案理想上係與現存之其他疫苗之免疫接種計畫整合。

本發明之疫苗之較佳目標係鳥類動物。更佳之目標係選自雞、土雞、鴨和鵝。最佳之目標係雞。

應用本發明之疫苗至目標生物之劑量計畫可為單一或多重劑量，該劑量以與該疫苗之劑型相容之方式且以將為免疫有效之該量同時或連續給予。

接受免疫接種之鳥類目標之年齡、體重、性別、免疫狀態及其他參數並無嚴格要求，雖然顯然免疫接種健康目標且儘早免疫接種以防止田野感染係有利的。舉例來說，禽類可因此於孵化當天接受免疫接種，或甚至更早在仍在蛋中時之孵化前3至4天；例如雞胚胎發育(ED)18天或土雞ED 24天。

為了穩定性或經濟性之考量，本發明之疫苗可被冷凍乾燥。一般來說，這將使它能於0℃以上之溫度，例如4℃延長儲存。冷凍乾燥之方法為該領域之技術人士所知，不同規模之冷凍乾燥設備可自商業購得。

因此，在一較佳之實施態樣中，本發明之疫苗係呈冷凍乾燥形式。

重建冷凍乾燥之疫苗組成物時，該組成物被懸浮於生理可接受之稀釋液中。該稀釋液可為例如單純的無菌水，或生理鹽類溶液諸如(磷酸鹽緩衝)鹽水，或該稀釋液可能已經包含佐劑化合物，諸如EP 382,271中所描述之生育酚。更複雜形式之冷凍乾燥疫苗可能被懸浮於乳化液中，例如EP 1,140,152中所述。

因此，在另一較佳之實施態樣中，本發明關於一種藉由重建本發明之冷凍乾燥疫苗得到之疫苗組成物。

本發明之化合物及組成物除了在疫苗上之各種用途以外，這些化合物及組成物亦可被有利地應用於診斷劑，以於例如動物田野樣本或病毒製劑中偵測本發明之病毒或其抗原或核酸。

此亦由血清型試驗之結果證實，如上述之IFT和VN試驗，其中對抗本發明之寄存鳥類星狀病毒之抗血清被用於區別屬於本發明之範圍內之病毒(表1描述之分離株)及該些不屬於本發明之病毒(在許多其他病毒之中：ANV1、CAstV2、里奧病毒等)。同樣的，上述之PCR試驗具有選擇性識別本發明之鳥類星狀病毒之能力。

如技術人士將了解的，此不只應用於本發明之抗體上，同時也應用於本發明之其他化合物及組成物。該診斷試驗舉例來說使用本發明之抗體或其片段以測試抗原；或使用抗原(本發明之病毒、抗原製劑或蛋白質)以測試對抗其之抗體；或使用核酸(源自病毒之RNA，或如本發明之DNA分子)以建立雜交或PCR試驗。

因此，在另一態樣中，本發明關於一種診斷套組，其包含如本發明之鳥類星狀病毒、如本發明之抗原製劑、如本發明之抗體或其片段、如本發明之DNA分子或如本發明之蛋白質。

用語「診斷套組」隱含關於商業銷售套組之特徵，舉例來說包含一些用於進行診斷試驗之成分及一次性用品與說明書；所有物品呈商業可行性包裝形式。

該診斷套組例如因此包含抗體ELISA所需之材料。在該試驗中，舉例來說該ELISA板之孔槽已經塗佈本發明之鳥類星狀病毒以形成抗體ELISA套組，用於偵測對抗本發明之鳥類星狀病毒或其製劑或蛋白質之抗體。在和測試樣本培養之後，與測試樣本中之免疫球蛋白(如果有的話)具反應性之標示抗體被添加至該孔槽中。然後呈色反應顯示特定抗體存在於該測試樣本之中。

同樣的，抗原ELISA套組可被設計，包含例如塗佈如本發明之病毒、抗原製劑或蛋白質之微滴定盤。

該免疫試驗之設計可能不同。舉例來說，免疫試驗可能根據競爭而非直接結合之原理。另外，該試驗亦可能使用顆粒或細胞材料以取代固體支持之裝置。偵測在試驗中形成之抗體-抗原複合物可能涉及使用標示抗體，其中該標示可能為例如酵素或螢光、化學發光、放射活性或染料分子。

本發明之疫苗及診斷劑現在可被有利地一起使用以設計在特定區域或動物族群中清除本發明之鳥類星狀病毒之方法。

本發明現在將參照下列非限制性實施例進一步描述。

實施例實施例1：自田野樣本分離鳥類星狀病毒：

本發明之鳥類星狀病毒之許多分離株係從來自荷蘭和德國多個農場之雞和土雞分離。此處詳細描述樣本編號161319(分離株19)之分離以作為典型實施例。

分離株19星狀病毒係由4隻36週齡之產蛋雞之氣管混合物中分離，這些來自荷蘭農場之雞出現採食量減少、產蛋下降和次級蛋增加。同時普遍出現消化不良、下痢及運動障礙。

將4隻雞的氣管混合組織(0.5至1.0克)與大約10毫升之「潤濕培養液」(包含：500毫升之HBSS[漢克斯基礎鹽類溶液]+2毫升之苄基青黴素鈉鹽(1000000 IE/ml)+8毫升之鏈黴素(250毫克/毫升)+0.5毫升之兩性黴素B(2.000微克/毫升)+2毫升之碳酸氫鈉7.5%)混合並以均質器均質化2分鐘。該懸浮液於2至8℃以2000g離心15分鐘。接著用450奈米之濾材過濾上清液。

將該產生之液體接種至4顆8至9日齡之SPF雞胚胎蛋之尿囊腔(每顆蛋1毫升)、4顆5至6日齡之SPF雞胚胎蛋之卵黃囊(每顆蛋1毫升)及4顆9日齡之SPF雞胚胎蛋之CAM中(每顆蛋0.5毫升)，並於溫度36.5至38.5℃及濕度40至55%中培養。每天進行照蛋檢視。胚胎在接種一天內死亡被認為不具特異性。

卵黃囊接種蛋之胚胎在接種後7天未顯示任何異常。儘管如此，收集卵黃液以用於第二繼代。

將4毫升從第一代(每顆蛋1毫升)收集到之卵黃液與0.5毫升之「繼代培養液」(包含：HBSS 90毫升+2毫升苄基青黴素鈉鹽(1000000 IE/ml)+8毫升之鏈黴素(250毫克/毫升)+0.5毫升之兩性黴素B(2.000微克/毫升)+2毫升之碳酸氫鈉7.5%)混合。將這個混合物以每顆蛋1毫升之量接種於5顆5日齡SPF胚胎蛋之卵黃囊中，並於溫度36.5至38.5℃及濕度40至55%中培養。每天進行照蛋檢視。

一個胚胎在接種後第6天死亡，顯示身體變紅。取此蛋之尿囊液以在洋菜膠沉降(AGP)試驗中檢測里奧病毒；該液呈里奧病毒陰性。

收集約4至5毫升之此異常胚胎蛋之卵黃並用和第二繼代相同之方式進行更多繼代。

第三代在接種後第5天有三個胚胎死亡且其中二個出現身體變紅。該混合尿囊液於AGP試驗中呈里奧病毒及腺病毒1型陰性。

在之後的繼代中該分離株之力價增加，因為胚胎死亡或在接種後較早顯示症狀。第6代和第7代出現明顯典型之腿和翅膀尖端亮紅染色。

同樣的，尿囊液於HA或AGP試驗中呈現IBDV、里奧病毒、腺病毒、NDV、AIV及IBV陰性。IBDV之PCR試驗亦呈陰性。

收集到之CAM和尿囊液被冷凍保存於-80℃，並用於後續特徵化。

實施例2：病毒RNA分離：

在分離病毒總RNA時，根據廠商說明使用QIAamp病毒RNA迷你套組(QiaGen^TM )。簡單地說，將140微升之含病毒液體諸如尿囊液、或組織或胚胎均質物(通常以介於5至50%重量/體積之量)與先前製備之萃取緩衝液及載體RNA混合。此於室溫中培養10分鐘。接著加入純乙醇(96-100%)並混合，將該混合物裝填入QIAamp迷你離心管柱中(2毫升之收集管)。此於6000g下離心1分鐘。丟棄流過之液體。用含有純乙醇之清洗緩衝液清洗管柱。最後，用60微升之洗提緩衝液洗提管柱。通常在RNA分離之後，直接經由RT反應進行cDNA之製備。

星狀病毒RNA之存在係由標準洋菜膠/甲醯胺RNA膠體電泳證實。

實施例3：經RT反應產製cDNA

第一股cDNA之合成係根據廠商說明使用Amersham-Pharmacia^TM Ready-To-GoYou-Prime First-Strand Beads進行。簡單地說，來自病毒總RNA分離之29微升之洗提RNA在65℃中變性10分鐘，及冰上2分鐘。這被加入含有二顆磁珠之試管中，且添加4微升之10微莫耳引子17(SEQ ID NO：3)至終體積33微升。於室溫中培養1分鐘，用微量吸注器小心混合，並於37℃培養1小時。將cDNA冷凍儲存於-20℃以下直到進一步使用。

實施例4：PCR反應

PCR係用於從得自RT反應之cDNA製備雙股(ds)DNA。PCR亦用來作為診斷式偵測試驗，以特異性區別本發明之鳥類星狀病毒是否存在樣本中。

PCR反應材料係來自HT Biotechnology^TM Ltd.公司：使用1倍濃度之Supertaq緩衝液(10倍濃度)；使用1單位/微升之SupertaqPlus聚合酶酵素(5單位/微升)及使用2毫莫耳之預先混合之dNTP(10毫莫耳)。這些被混合於不含RNAse之蒸餾水中。

使用之引子如表4所列。引子係由荷蘭Invitrogen^TM 公司合成，該引子儲存溶液係於TE緩衝液(pH 8.0)中製成100微莫耳；該工作溶液稀釋為10微莫耳以供直接使用。

標準PCR使用下列材料：27微升蒸餾水，5微升10倍Supertaq Plus緩衝液；1微升(等於1單位)Supertaq Plus酵素；5微升2毫莫耳dNTP混合物；各5微升之正向及反向引子(10微莫耳)；和最後2微升得自RT反應混合物之cDNA；總體積達50微升。

使用引子F-II及R-II-3(SEQ ID NO：28,29)以放大ORF 1a，或使用引子20及21(SEQ ID NO：32,33)放大ORF 1b，典型反應條件為例如：

-95℃ 1分鐘

-40個循環：94℃ 30秒；48℃ 1分鐘；及72℃ 40秒

-72℃ 10分鐘

-固定在20℃。

NB：所有PCR溫度約±1℃

採取一些變化以進行最佳化：以45取代40個循環，循環步驟之黏合溫度及時間之變異：在30秒或1分鐘期間使用介於46至53℃之溫度。

使用引子29和30(SEQ ID NO：30,31)以特異性偵測如本發明之鳥類星狀病毒，用於循環相之最佳條件係：45個循環，黏合步驟為51℃ 30秒。其他條件如同使用引子20/21之反應。

循環定序反應之PCR反應具有實質上不同的設計：25個循環：96℃ 10秒；50℃ 5秒；及60℃ 2分鐘，見下述。

實施例5：以洋菜膠電泳、純化及次選殖之DNA分析：

洋菜膠電泳係用於偵測及檢視所產生之PCR產物。此亦用於純化PCR產物，藉由裁切及萃取可定序或次選殖這些經分離之PCR產物。

簡言之，0.8%洋菜膠(低電滲透型)係於TAE緩衝液(pH 8.0)中鑄造，每100毫升瓊脂溶液包含約50微升之0.5毫克/毫升溴化乙錠溶液。PCR產物之樣本係以1：10之比例與標準樣本裝填緩衝液混合(甘油/SDS/溴酚藍)。通常會包含標記泳道，使用來自Eurogentec^TM 之SmartLadder。沒入TAE緩衝液中進行之電泳通常使用20×20×1公分之膠體以100 V電泳1小時，或直到藍色染料到達膠體末端。使用UV光檢視。數位相機拍攝膠體照片。

洋菜膠電泳也被用於預測經裁切及純化之亮帶之DNA濃度；假使這樣的話，樣本係與一些帶有不同量之DNA分子量梯帶標記之泳道一起進行電泳。

自洋菜膠純化PCR產物之特定亮帶係利用QIAquick膠體萃取套組(QiaGen^TM )依據廠商說明進行，使用微離心或QIAvac真空多聯器。

自洋菜膠裁切及純化之DNA亮帶被次選殖至細菌質體以供進一步使用，諸如選殖、定序、表現或雜交偵測試驗。DNA片段被選殖至質體pCR2.1，根據廠商說明使用TOPO-TA載體及TOPO-TA選殖套組(Invitrogen^TM )。

實施例6：DNA定序：

DNA定序係由標準PCR循環定序進行，所有皆依廠商說明使用Big DyeTerminator Ready Reaction Mix(ABI Prism^TM )及ABI Prism^TM 310自動定序裝置。

在定序反應中通常使用20至70奈克之DNA(純化PCR產物或載體中之選殖片段)，及8微升Big DyeTerminator Ready Reaction Mixture、1微升之10微莫耳引子，並加入蒸餾水至總體積20微升。用於定序之引子通常與該些從cDNA製備雙股DNA產物之PCR中所使用之引子相同。

循環定序PCR進行25個循環：96℃ 10秒、50℃ 5秒及60℃ 2分鐘。

PCR之後，將樣本依照廠商說明使用DyeEx離心管柱(QiaGen^TM )純化以移除Dye-Terminator，使用Eppendorf管及微離心。最後的洗提物以蒸餾水重懸1：2至總體積40微升。

接著在ABI Prism310基因分析儀上進行序列測定分析，使用Data Collection version 1.0.4 en Sequence Analysis version 3軟體。

序列分析係利用數種程式完成，最常使用的是Sequencher(Gene Codes^TM )及Clone Manager(Sci.Ed.Software^TM )。起始及終末序列係經過裁切以移除根據使用之變性PCR引子所導入之核苷酸讀數。

此處SEQ ID NO：4-26(偶數)所表示之DNA序列係源自多重定序反應之共有序列。大多數時候該序列亦可使用正向及反向定序引子由雙股讀取；只有SEQ ID NO：8僅從單股決定。平均重複性約為4x每個核苷酸。

實施例7：在雞胚胎蛋上滴定星狀病毒

使用23G 1吋針頭，將星狀病毒懸浮液之10倍連續稀釋液接種至六日齡SPF雞胚胎蛋之卵黃囊中。接著，該蛋在37℃蛋培養箱中培養7天。

每天照蛋檢視。在接種後24小時內發生之死亡被認為不具特異性，因此含有早期死亡胚胎之該蛋被丟棄並不予計算感染力力價。

檢視從接種後2至7天內死亡之胚胎是否出現本發明之鳥類星狀病毒感染之病灶特徵；也就是該死亡胚胎出現亮紅色腿及翅膀尖端，及腫脹暗紅色之肝臟。感染力力價係利用根據斯皮爾曼-卡博法之電腦程式計算，並以每毫升之ELD50表示。

實施例8：在雞胚胎蛋中產製星狀病毒

使用22G 1 1/2吋針頭，將每顆蛋10^5 ELD50之星狀病毒接種至九日齡SPF雞胚胎蛋之卵黃囊中。接著，蛋在37℃蛋箱中培養。

經過24小時培養後，進行照蛋檢視。在24小時內發生之死亡被認為不具特異性，將這些蛋移除。

48小時培養後，收集所有剩餘蛋之尿囊液。該尿囊液冷凍儲存於-60℃以下。

感染力力價係以上述在雞胚胎蛋或在細胞中滴定之方式建立。

實施例9：產製初代細胞：

CEL細胞係從14至16日齡之SPF雞胚胎蛋中，自胚胎分離肝臟製備。肝臟用PBS/酚紅清洗，於含有胰蛋白酶於PBS之溶液中在室溫下培養8至10分鐘。通過100微米之紗布收集上清液。此步驟再重複二次，接著離心收集細胞，將細胞重懸於含有5%胎牛血清(FCS)之適當豐富培養基中。

CEK細胞係以類似方式製備，使用來自約18日齡之SPF雞胚胎之腎臟。將腎臟溫和地剝除、清洗，加入一次胰蛋白酶，在室溫下作用20分鐘。接下來，過濾CEK細胞並加入含FCS之培養基中。

實施例10：IFT試驗

免疫螢光試驗(IFT)係用來研究特定抗血清之跨種專一性，也用於病毒滴定。通常IFT係於微滴定板上之初代細胞進行。

當CEK細胞被用於IFT時，這些細胞以10^5細胞/100微升被接種至96孔微滴定板之孔槽中。該細胞係於含2% FCS和抗生素之標準豐富培養基中，在37℃、5% CO₂ 大氣中培養。隔天將病毒接種至細胞上。

用於滴定之目的應使用病毒之連續稀釋液。然後繼續培養孔板二天。接著，移除上清液，用純乙醇在-70℃固定細胞。該孔板在使用前被儲存於-20℃。為了檢視用於滴定之病毒，該板用專一性抗血清染色。因此，令該板在室溫中回溫，倒掉酒精，用PBS清洗孔板。抗星狀病毒血清之稀釋液係以已知提供良好螢光性但背景值不會太高之強度製備。此第一抗血清接著被加入該板中，於濕潤大氣、37℃中培養1小時。該板接著用PBS清洗3次。然後製備第二抗體共軛物，其為山羊抗雞IgG-FITC共軛物(Nordic^TM )。此以所需之稀釋濃度被加入於孔板中，再次於37℃培養1小時。此次培養後再用PBS清洗該板3次，之後添加PBS：甘油之1：1混合物。然後將孔板儲存於4℃暗處直到用螢光顯微鏡讀取。陽性信號為偵測到與細胞層中之cpe徵狀相關之特異性螢光。

以血清特徵及病毒種交叉反應試驗而言，微滴定板係依類似之方式製備，使用CEK或CEL細胞。隔天這些細胞被所欲測試之不同病毒感染，例如本發明之星狀病毒分離株，還有ANV1及CAstV2，以及其他鳥類致病原：里奧病毒、IBV、NDV、FPV、腺病毒、AIV等。病毒之量為固定或稀釋量，視何者方便為主。培養該孔板2至3天。

為了測試特定抗血清與不同病毒結合之能力，該血清係於孔板上培養，且藉由與共軛物培養以增強信號。為了最佳化結合與背景信號，數個抗血清於PBS中之稀釋液係於各種病毒之不同稀釋液中測試。

實施例11：雞感染星狀病毒

本發明之鳥類星狀病毒係於雞測試，該試驗設計是為了重現在田野觀察到之疾病症狀，並自這些二次感染動物中再分離出該微生物。這是為了符合柯霍氏假說以建立該受測之分離株係為致病性及毒性微生物且為造成所觀察到之田野症狀之感染源。

同時，雞接受重複感染以測試由活接種物所提供之防備後續攻毒感染之疫苗效果。

最後，自實驗感染雞分離全血清以獲得防備該接種星狀病毒之特定多株抗血清。

為達此目的，將三週齡白色來亨種之公母SPF產蛋雞轉移至負壓隔離室。隨機選擇以將動物分配至治療組，以雙翼帶個別標示動物。標準食物及飲水可任意採食。

在實驗期間的規律間隔同時在第0天採集血液樣本以測定免疫狀態。接著15隻雞由三種途徑接種：各0.2毫升經眼及肌肉內途徑，以及0.5毫升經口途徑，0.2毫升劑量為10^5 EID50，0.5毫升劑量為10^5.4 EID50。該接種物係寄存之星狀病毒分離株19，重懸於水以供注射。5隻置於相同隔離室之雞不接受接種以作為對照組及崗哨組。每天檢視動物是否出現疾病之臨床症狀或死亡。

在接種後(p.i.)第20天，一些雞被放血以進行死後組織病理學檢查。接種後第23天，其他(先前接受接種)雞接受類似劑量之接種物補強。再經過23天該試驗結束，活著的動物被放血及檢查。

有些鳥類一開始未接受接種但與該接種/感染鳥類飼養於相同之隔離室；如預期的，這些鳥類經由星狀病毒之水平散播而受到感染。

實施例11a：組織病理學結果

動物試驗之組織病理學結果如下：2隻雞死亡，5隻雞(其中有3之對照組)出現下痢。在組織病理學上，一些動物從接種後第7天就開始出現或多或少的嚴重腎臟及腸道病理學。腎臟呈現嚴重的間質性腎炎，腎小管變性是最顯著的症狀。胸腺及華氏囊出現淋巴細胞溶解；胰臟出現細胞凋亡及腺細胞萎縮；及十二指腸出現絨毛變短及融合。

水平感染未接種之對照雞顯示該星狀病毒接種物具有毒性及感染力。

實施例11b：PCR結果

所有雞之腎臟樣本進行PCR檢測是否出現本發明之鳥類星狀病毒。經均質化及分離RNA之後，製備RT樣本。這些樣本以引子SEQ ID NO：30和31進行PCR測試。所有感染動物之樣本皆呈陽性結果，也就是出現可識別本發明之鳥類星狀病毒之特異性260個鹼基對之亮帶。適當之陽性及陰性對照組被包括。

這證實了造成死亡及組織病理症狀之致病原係本發明之鳥類星狀病毒。所觀察到之症狀如腎炎及下痢亦出現在田野觀察到之病例。腿的問題無法被重現；最可能的原因是所使用之鳥類過瘦以致無法呈現該問題，及/或SPF雞在隔離室之狀態不足以模擬鳥類在田野間所經歷之多重感染壓力。

實施例11c：VN結果

固定量之星狀病毒分離株19係與接種後第0天、第20天及第46天之雞抗血清於37℃培養1小時。這些病毒樣本接著被接種至6日齡之SPF雞胚胎蛋，並培養數日。在蛋接種後4天，接受第0天血清處理之病毒之胚胎死亡，並顯示本發明之鳥類星狀病毒感染之典型症狀。

然而，經第20天或第46天採集之血清培養之病毒不影響胚胎。這證實了分離株19病毒可有效地被特異性雞抗血清中和。

這也證實了，本發明之鳥類星狀病毒之活接種物可於雞誘發具有VN能力之有效抗血清。

實施例11d：IFT結果

使用雞多株抗血清之交叉反應IFT試驗之結果證實抗分離株19之抗血清不認識除了本發明之鳥類星狀病毒之病毒分離株以外之任何病毒。

同樣的，對ANV1或CAstV2具有專一性之抗血清也只認識該曾與它們一起培養之特定病毒。一樣重要的是，不論抗ANV1或抗ChAstV2血清都不與本發明之鳥類星狀病毒之病毒分離株結合。這甚至適用於所測試之最高抗體量(該最低稀釋樣本)。

對抗其他鳥類致病原(最重要之里奧病毒)之抗血清也不會與本發明之鳥類星狀病毒之病毒分離株結合，反之亦然。

這表示本發明之鳥類星狀病毒係自成一型之新穎且獨特之血清型，因此證實該所識別之獨特分子生物差異。

CEK細胞孔板係以連續10倍稀釋之第3代星狀病毒分離株19感染。在二天後，該孔板以不同之抗血清固定及染色：

-接種後33天之抗分離株19混合血清，1：20於PBS中

-於雞產生之抗ANV1(SE-027/2株)，1：20於PBS中(該ANV1係德國ANV1分離株，當以DNA定序特定區域時顯示與此處所使用之來自GenBank之參照ANV1序列非常密切地相關)

-於雞產生之抗CAstV2(TS9L株)，1：500於PBS中(該CAstV1係源自以寄存編號I-2932寄存於法國巴黎CNCM中之樣本)

-陰性對照組，只有PBS。

實施例12：其他免疫接種試驗不活化疫苗：

土雞和雞將被以本發明之星狀病毒之不活化佐劑疫苗免疫接種，以最佳化抗原劑量。

星狀病毒分離株19係如前述於CEL中培養，並依據標準程序在溫度及pH之控制下使用β-丙內酯(BPL)不活化。利用標準程序，將不活化星狀病毒均質化成為由輕礦物油和適當乳化劑組成之標準w/o乳劑。

土雞和雞將被飼養在隔離單位中：120隻二週齡之普通土雞將被分成6個不同的組(第1至6組)，以使各組含有20隻動物。在三週齡時，第1至4組之土雞將經由肌肉內途徑接受含有不活化之星狀病毒分離株19之油包水乳劑疫苗之免疫接種。第5組之土雞將經由皮下途徑接受該相同之油包水乳劑疫苗之免疫接種，第6組之土雞將不接受免疫接種以作為對照組。

同樣的，180隻一日齡之SPF產蛋雞將被分成9個不同的組(第7至15組)，以使各組含有20隻動物。在三週齡時，第7至10組之雞將經由肌肉內途徑接受含有不活化之星狀第3型病毒之油包水乳劑疫苗之免疫接種。第11至14組之雞將經由皮下途徑接受該相同疫苗之免疫接種，第15組之雞將不接受免疫接種以作為對照組。

在試驗開始之前及免疫接種後第4、8及12週，從所有土雞和雞採集血液樣本。利用在CEL細胞上之IFT試驗或利用VN試驗，檢測該血清是否含有對本發明之星狀病毒具特異性之抗體及它們的力價。

此方法可輕易地被調整以包括一段如果有關之免疫試驗期間；例如藉由將該免疫接種鳥類飼養於隔離室中另外6至12個月，接著以本發明之鳥類星狀病毒攻毒感染。

活疫苗：

雞將被以本發明之活星狀病毒疫苗免疫接種，接著將以星狀病毒攻毒，以最佳化活星狀病毒疫苗之使用途徑。

100隻一日齡之商用MDA+(母源性抗體陽性)種雞將被分成5個不同的組，以使各組含有20隻雞。在一日齡時，第1至4組之雞將經由滴眼液、粗噴霧、氣體噴霧或飲水接受來自尿囊液之活星狀病毒分離株19之免疫接種。第5組之雞將不接種以作為未經免疫之對照組。在免疫接種後4週，所有雞將以本發明之鳥類星狀病毒攻毒。在攻毒後3週期間，每天觀察所有雞是否出現星狀病毒感染之臨床症狀特徵及/或死亡。攻毒後21天，所有剩餘雞將被犧牲以進行組織病理學檢查。

圖1：顯示源自本發明之鳥類星狀病毒之數個經選擇之分離株之ORF 1a區段之cDNA序列之多重比對。參照序列源自分離株19。向外參照係ANV1參照病毒之基因組(SEQ ID NO：1)之cDNA序列之對應部份。該方框區域標示該12個核苷酸區域，其不存在於ANV1 ORF 1a之中。

圖2：顯示由圖1列示之cDNA序列經電腦轉譯製備之假定胺基酸序列之多重比對。該方框區域標示該4個胺基酸，它們不存在於由ANV1 ORF 1a所編碼之蛋白質之中。

圖3：顯示圖1所示之核苷酸序列比對結果之樹狀圖。

圖4：以圖示說明引子SEQ ID NO：30和31之雜交區域，及其與本發明之鳥類星狀病毒所獨具之該12個核苷酸區域(以粗體表示)之相關位置。

圖5：顯示經溴化乙錠染色、UV光照射之洋菜膠照片，該洋菜膠上為在一些cDNA樣本上使用引子SEQ ID NO：30和31進行PCR反應之產物的電泳結果。陽性PCR之期待產物僅在泳道5清楚地看見，其為約260個鹼基對之亮帶。前置RT反應係由引子SEQ ID NO：3進行。

泳道1：陰性對照(在PCR反應中無cDNA)

泳道2：未感染雞之肝臟均質物

泳道3：ANV1；1991年之德國分離株，經1x CAM、4x卵黃囊放大，收集尿囊液。

泳道4：CAstV2；源自以編號CNCM I-2392寄存於CNCM之病毒，尿囊液。

泳道5：本發明之鳥類星狀病毒之分離株19，尿囊液。

M：DNA大小標記泳道：200、400、600、800、1000鹼基對等之亮帶。

<110>英特威特國際股份有限公司 <120>新穎之鳥類星狀病毒 <130> 2008-003-PD <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6927 <212> DNA <213>鳥類腎炎病毒1 <400> 1 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 來自ORF1a之12個核苷酸共通序列區 <400> 2<210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> RT反應引子17 <400> 3<210> 4 <211> 407 <212> DNA <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株19 <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <400> 4<210> 5 <211> 135 <212> PRT <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株19 <400> 5<210> 6 <211> 255 <212> DNA <213>新穎之鳥類星狀病毒分離株19 <220> <221> CDS <222> (1)..(255) <400> 6 <210> 7 <211> 85 <212> PRT <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株19 <400> 7<210> 8 <211> 380 <212> DNA <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株19 <220> <221> CDS <222> (3)..(380) <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223>n係a,c,g或t <400> 8<210> 9 <211> 126 <212> PRT <213>新潁之鳥類星狀病毒-分離株19 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223>位置13之'Xaa'代表Glu或Asp <400> 9<210> 10 <211> 407 <212> DNA <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株637 <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <400> 10 <210> 11 <211> 135 <212> PRT <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株637 <400> 11 <210> 12 <211> 407 <212> DNA <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株686 <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <400> 12 <210> 13 <211> 135 <212> PRT <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株686 <400> 13<210> 14 <211> 407 <212> DNA <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株714 <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <400> 14<210> 15 <211> 135 <212> PRT <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株714 <400> 15 <210> 16 <211> 407 <212> DNA <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株715 <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <400> 16 <210> 17 <211> 135 <212> PRT <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株715 <400> 17 <210> 18 <211> 407 <212> DNA <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株1736 <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <400> 18 <210> 19 <211> 135 <212> PRT <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株1736 <400> 19<210> 20 <211> 407 <212> DNA <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株2383 <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <400> 20<210> 21 <211> 135 <212> PRT <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株2383 <400> 21 <210> 22 <211> 413 <212> DNA <213>新穎之鳥類星狀病毒分離株2388 <220> <221> CDS <222> (1)..(411) <400> 22 <210> 23 <211> 137 <212> PRT <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株2388 <400> 23 <210> 24 <211> 407 <212> DNA <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株7279 <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <400> 24 <210> 25 <211> 135 <212> PRT <213>新穎之鳥類星狀病毒分離株7279 <400> 25<210> 26 <211> 407 <212> DNA <213>新穎之鳥類星狀病毒-分離株161317 <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <400> 26<210> 27 <211> 135 <212> PRT <213>新穎之鳥類星狀病毒分離株l61317 <400> 27 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> ORF1a正向定序引子F-Ⅱ <400> 28<210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> ORF1a反向定序引子R-Ⅱ-3 <400> 29<210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> PCR偵測引子29,正向 <400> 30<210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> PCR偵測引子30,反向 <400> 31<210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 定序引子20,ORF1b正向 <400> 32<210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 定序引子21,ORF1b反向 <400> 33<210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 定序引子,ORF2-R <400> 34

Claims

一種具有開放閱讀框(ORF)1a、1b及2基因組區域之禽腎炎病毒3，其特徵為當與禽腎炎病毒1之ORF 1a比較時，該禽腎炎病毒3之ORF 1a含有12個核苷酸之插入序列，該插入序列係位於對應SEQ ID NO：1之第2485與2486個核苷酸之該等核苷酸之間且具有如SEQ ID NO：2所示之核酸序列。
如申請專利範圍第1項之禽腎炎病毒3，其中該禽腎炎病毒3之ORF 1a包含與SEQ ID NO：4至少88%同一性之核苷酸序列。
如申請專利範圍第1項之禽腎炎病毒3，其中利用SEQ ID NO：30及31所示之引子組，可在PCR反應中從該禽腎炎病毒3之ORF 1a產製約260個核苷酸之PCR產物。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之禽腎炎病毒3，其中該禽腎炎病毒3不能被針對禽腎炎病毒1或土雞星狀病毒2之抗體所中和。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之禽腎炎病毒3，其中經該禽腎炎病毒3感染及培養之禽胚胎蛋顯現腿和翅膀尖端之亮紅染色。
一種抗體或其片段，其可於病毒中和試驗中中和如申請專利範圍第1至5項中任一項之禽腎炎病毒3。
一種抗原製劑，其可得自如申請專利範圍第1至5項中任一項之禽腎炎病毒3。
一種DNA分子，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列。
一種蛋白質，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
一種疫苗，其包含如申請專利範圍第1至5項中任一項之禽腎炎病毒3、如申請專利範圍第6項之抗體或其片段、如申請專利範圍第7項之抗原製劑、如申請專利範圍第8項之DNA分子或如申請專利範圍第9項之蛋白質，及醫藥上可接受之載劑。
如申請專利範圍第10項之疫苗，其包含至少一種可得自禽類之致病微生物之額外抗原。
一種用於禽類疫苗之化合物或組成物，其中該化合物或組成物係如申請專利範圍第1至5項中任一項之禽腎炎病毒3、如申請專利範圍第6項之抗體或其片段、如申請專利範圍第7項之抗原製劑、如申請專利範圍第8項之DNA分子或如申請專利範圍第9項之蛋白質。
一種化合物或組成物供製造禽類疫苗之用途，其中該化合物或組成物係如申請專利範圍第1至5項中任一項之禽腎炎病毒3、如申請專利範圍第6項之抗體或其片段、如申請專利範圍第7項之抗原製劑、如申請專利範圍第8項之DNA分子或如申請專利範圍第9項之蛋白質。
一種製造禽類疫苗之方法，其中化合物或組成物係與適當之醫藥載劑混合，且其中該化合物或組成物係如申請專利範圍第1至5項中任一項之禽腎炎狀病毒3、如申請專利範圍第6項之抗體或其片段、如申請專利範圍第7項之抗原製劑、如申請專利範圍第8項之DNA分子或如申請專利範圍第9項之蛋白質。
一種診斷套組，其包含如申請專利範圍第1至5項中任一項之禽腎炎病毒3、如申請專利範圍第6項之抗體或其片段、如申請專利範圍第7項之抗原製劑、如申請專利範圍第8項之DNA分子或如申請專利範圍第9項之蛋白質。