RU2313792C1 - Способ выделения рнк кишечных вирусов для анализа методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции - Google Patents
Способ выделения рнк кишечных вирусов для анализа методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2313792C1 RU2313792C1 RU2006111970/15A RU2006111970A RU2313792C1 RU 2313792 C1 RU2313792 C1 RU 2313792C1 RU 2006111970/15 A RU2006111970/15 A RU 2006111970/15A RU 2006111970 A RU2006111970 A RU 2006111970A RU 2313792 C1 RU2313792 C1 RU 2313792C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rna
- isolation
- pcr
- samples
- analysis
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии и может быть использовано для этиологической диагностики кишечных вирусных инфекций на основе выявления вирусной РНК в биологических субстратах способом обратной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), а также для изучения обнаруженных геномных последовательностей кишечных вирусов. Сущность способа: вирионы разрушают путем прогревания в лизирующем буфере, лизат фракционируют путем центрифугирования в присутствии перхлората натрия, РНК осаждают охлажденным изопропиловым спиртом. Преимущество изобретения заключается в исключении ингибирования реакции обратной транскрипции и повышении чувствительности метода ОТ-ПЦР при анализе образцов копроматериала и сточной воды. 3 ил., 2 табл.
Description
Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии и может быть использовано для этиологической диагностики кишечных вирусных инфекций на основе выявления вирусной РНК в биологических субстратах методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), а также для изучения обнаруженных геномных последовательностей кишечных вирусов. Актуальным является обнаружение таких РНК-содержащих вирусов, как ротавирусы, энтеровирусы, калицивирусы, астровирусы, вирус гепатита А.
Известны следующие способы выделения вирусной РНК из биологических образцов, основанные на различных методических подходах:
1. Фенол-хлороформная экстракция [Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chroroform extraction // Anal. Biochem. - 1987. - v.162. - P.156-159].
2. Экстракция перхлоратом натрия в присутствии додецилсульфата натрия [Халл Р. Очистка, биофизическая и биохимическая характеристика вирусов (преимущественно вирусов растений) // Вирусология. Методы: пер. в англ. - М.: Мир, 1988. - С.35-36].
3. Экстракция в присутствии высоких концентраций хлорида натрия с очисткой РНК с помощью панкреатической ДНК-азы. [Авторское свидетельство SU 1448448 А1 от 24.02.87 «Способ получения двунитевой рибонуклеиновой кислоты ротавирусов» / Новикова Н.А., Епифанова Н.В., Тамойкина Н.А.].
Первый из этих способов пригоден для получения чистых нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), но многостадиен, трудоемок и вреден для здоровья при проведении массовых исследований. Второй способ был предложен для выделения нуклеиновых кислот из предварительно очищенных вирионов вирусов растений, на последующее проведение ОТ-ПЦР не рассчитан, поскольку используемый при выделении додецилсульфат натрия является ингибитором реакции обратной транскрипции. Третий способ разработан для выделения РНК ротавирусов с целью последующего анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле и не рассчитан на использование конечного продукта в ферментативных реакциях.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является метод выделения РНК, основанный на аффинной сорбции силикагелем [Boom R., Sol С., Salimans М. et al. Rapid and simple method for the purification of nucleic acids. // J. Clin. Microbiol. - 1990. - v.28. - P.495-503]. Этот метод позволяет эффективно выделять РНК из большинства используемых в диагностике инфекционных заболеваний биологических субстратов (сывороток крови, спинномозговой жидкости, носоглоточных смывов, эпителиальных соскобов и т.п.) для последующего анализа с использованием метода ОТ-ПЦР и положен в основу коммерческих тест-систем («РИБО-сорб», ООО «ИнтерЛабСервис», Москва). Однако метод аффинной сорбции недостаточно эффективен при использовании в качестве исследуемого материала фекальных образцов от больных кишечными вирусными инфекциями или образцов сточной воды, т.к. не позволяет избавиться от ингибиторов ферментативных реакций, содержащихся в этих образцах. Для этого требуется введение дополнительных ингредиентов (в частности, сыворотки КРС, α-казеина и т.п.).
Целью изобретения является исключение ингибирования реакции обратной транскрипции и повышение чувствительности метода ОТ-ПЦР при анализе образцов копроматериала и сточной воды.
Сущность изобретения заключается в том, что образец биологического материала, после прогревания в присутствии лизирующего агента, подвергают фракционированию путем центрифугирования в растворе перхлората натрия.
Метод осуществляют следующим образом.
Готовят 10-20%-ную суспензию фекалий в дистиллированной стерильной воде или стерильном физиологическом растворе, пробу осветляют центрифугированием при 3-5 тыс. об/мин в течение 10 мин. Образец сточной воды осветляют при тех же условиях центрифугирования.
К 100 мкл исследуемого образца добавляют равный объем лизирующего буфера, содержащего 4М гуанидинтиоционата, 50 мМ трис-HCl, рН 7,6, 100 мМ ЭДТА, 1% β-меркаптоэтанола. Смесь инкубируют в течение 10 мин при 65°С, охлаждают при 0°С, к суспензии добавляют ×3-кратный объем 100%-ного (вес/объем) раствора перхлората натрия. После встряхивания смесь центрифугируют в течение 5 мин при 3 тыс. об./мин. Водную фазу переносят в чистую микропробирку, содержащую охлажденный изопропанол в объеме вносимой водной фазы, перемешивают и центрифугируют в течение 15-20 мин при 12-16 тыс. об./мин. Осадок РНК отмывают 70%-ным этанолом, высушивают и ресуспендируют в 30-50 мкл 2 мМ раствора дитиотриитола (ДТТ).
Пример 1. Выявление РНК кишечных вирусов.
Выявление РНК кишечных вирусов (ротавирусов, астровирусов, калицивирусов, энтеровирусов, вируса гепатита А) проводят с использованием лабораторных методов ОТ-ПЦР на основе праймеров, специфичных в отношении искомого генома. Применяют пары праймеров, представленные в литературе для обнаружения ротавирусов [Gentsch J.R., Glass R.I., Woods P. et al. Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. - 1992. - V.30. - P.1365-1373.], астровирусов [Belliot G., Laveran H., Monroe S.S. Detection and genetic differentiation of human astroviruses: phylogenetic grouping varies by coding region // Arch Virol. 1997. V.142. №7. P.1323-1334], калицивирусов [Jiang X., P.W.Huang, W.M.Zhong et al. T. Design and evaluation of a primer pair that detects both Norwalk - and Sapporo-like caliciviruses by RT-PCR // J. of Virological Methods. - 1999. - V.83. - P.145-154], вируса гепатита A [Abbasdegan M., Stewart P., LeChevalier M. A strategy for detection of viruses in ground water by PCR // Applied and Environmental Microbiol. - 1999. - V.65. - N 8, P.444-449]. Олигонуклеотидные праймеры синтезируют в фирме «Литех», Москва. Используют реагенты для разных этапов ПЦР-анализа производства ЦНИИЭ, Москва (ООО «ИнтерЛабСервис).
Реакцию обратной транскрипции осуществляют при 42°С в течение 45 мин в объеме 5 мкл. Предварительно 2,3 мкл выделенной РНК денатурируют в присутствии 2 мМ статистических гексануклеотидов в течение 5 мин при 94°С. Затем в пробирки вносят 1,7 мкл смеси, содержащей буфер для ревертазы М-MLV, 0,2 мМ каждого нуклеозидтрифосфата (дНТФ) и 2 е.а. ревертазы М-MLV. Амплификацию кДНК, полученной в результате ОТ, проводят в объеме 25 мкл в термоциклере с активным регулированием «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Для этого к 5 мкл продукта ОТ добавляют реакционную смесь, содержащую 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 50 мМ КСl, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого дНТФ, 2 е.а. Taq-полимеразы, 2 мкМ соответствующих праймеров.
Реакцию на каждый вирус проводят в отдельной пробирке со своей парой праймеров. Для постановки ПНР используют следующую программу: [95°С - 1 мин; (94°С - 10 сек, 55°С - 10 сек, 72°С - 10 сек) - 42 цикла; 72°С - 5 мин]. Результатом амплификации является фрагмент кДНК, специфический для каждого искомого вирусного агента.
Идентификацию продуктов амплификации проводят методом электрофореза в 1,5% агарозном геле в присутствии бромида этидия с использованием 0,089 М трис-боратного буферного раствора, рН 8,0, при 110 V на гель в течение 20 минут.
Пример 2. Сравнение предлагаемого метода солевой очистки РНК с классическим методом фенол-хлороформной депротеинизации нуклеиновых кислот.
Для сравнительного анализа аналитической чувствительности методов использовали фекальные экстракты. Три образца фекалий контаминировали культуральной жидкостью, содержащей 1,0, 0,1 и 0,01 TCID50 полиовируса вакцинного происхождения (в расчете на 1 реакцию ОТ-ПЦР). Из проб параллельно была выделена РЫК с использованием фенол-хлороформной смеси и солевым способом, затем проанализированы в ОТ-ПЦР с использованием универсальных для энтеровирусов праймеров. В таблице 1 видно, что аналитическая чувствительность солевого метода выделения РНК соответствует фенол/хлороформной депротеинизации. Оба метода позволяют обнаружить 0,1 TCID50 энтеровирусов. На следующем этапе проведено сравнение методов при обследовании 78 пациентов с подозрением на энтеровирусную инфекцию. Из таблицы 2 видно, что частота обнаружения энтеровирусов методом ОТ-ПЦР при тестировании одних и тех же биопроб не отличалась достоверно в зависимости от способа экстракции РНК.
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют, что предлагаемый способ выделения РНК кишечных вирусов по своей аналитической и относительной чувствительности не уступает классическому референтному способу фенол-хлороформной депротеинизации нуклеиновых кислот.
Таблица 1 | |||||||||
Сравнение способов выделения РНК энтеровирусов из образцов фекалий | |||||||||
№ биопробы | Фенол-хлороформная экстракция | Солевая очистка | |||||||
1,0 TCID50 | 0,1 TCID50 | 0,01 TCID50 | 1,0 TCID50 | 0,1 TCID50 | 0,01 TCID50 | ||||
1 | + | + | - | + | + | - | |||
2 | + | + | - | + | + | - | |||
3 | + | + | - | + | + | - | |||
Таблица 2 | |||||||||
Частота обнаружения энтеровирусов в образцах фекалий при разных способах выделения РНК | |||||||||
Способ | Исследовано (абс.) | Обнаружено | |||||||
абс. | % | ||||||||
Солевая очистка | 78 | 11 | 14,10±3,94 | ||||||
Фенол-хлороформная экстракция | 78 | 10 | 12,82±3,79 | ||||||
• -р<0,05 |
Пример 3. Сравнение солевого метода выделения РЫК и метода «РИБО-сорб» (OOO «ИнтерЛабСервис»).
Сравнение было проведено с использованием образцов фекалий, заведомо содержащих ротавирусы, астровирусы и энтеровирусы.
На фиг.1 представлены результаты проведения ОТ-ПЦР после выделения РНК ротавирусов с использованием двух методов. Как видно на электрофореграмме, солевая экстракция позволяет выявить ротавирусную РНК во всех 12 пробах (100%). В случае использования системы «РИБО-сорб» в пробах №1, 3, 12 наблюдалась менее эффективная амплификация, а в пробе №4 - ингибирование реакции. Полученные результаты свидетельствуют о большей эффективности солевого метода выделения РНК кишечных вирусов из фекалий.
Проведено исследование проб при серии десятикратных разведений исходного материала (1:10, 1:100, 1:1000) на примере астровирусов. Как видно на фиг.2, при солевой экстракции интенсивность сигнала амплификации незначительно снижается только при разведении исходной пробы 1:1000, аффинная сорбция уже при разведении 1:10 не позволяет уверенно выявить РНК астровируса.
Представленные результаты убедительно свидетельствуют о большей чувствительности солевого метода выделения РНК кишечных вирусов.
Сравнительный анализ солевого и сорбционного методов выделения РНК с использованием титрования образцов проведен и при индикации РНК энтеровирусов (фиг.3). Для выявления РНК энтеровирусов использовали набор реагентов «АмплиСенс Энтеровирус-207» (000 «ИнтерЛабСервис», Москва). На фиг.3 видно, что солевой метод выделения РНК позволяет обнаружить РНК энтеровирусов не только в исходных пробах, но и при разведениях 1:1000 (проба 1) и 1:10 (проба 2), при аффинной сорбции - только в исходной пробе. В пробе №3, содержащей ингибиторы для обратной транскрипции, солевой метод выделения РНК позволил обнаружить энтеровирусы при разведении пробы в 100 раз. Метод аффинной сорбции даже при таком разведении пробы сорбировал ингибиторы ферментативных реакций.
Таким образом, использование предлагаемого солевого способа выделения РНК кишечных вирусов для их индикации методом ОТ-ПЦР обеспечивает следующие преимущества:
- по сравнению с аналогом (1) исключает использование технического вещества (фенола) за счет очистки целевого продукта путем фракционирования в присутствии перхлората натрия;
- в отличие от аналога (2) предлагаемый способ применен для выделения РНК вирусов человека из образцов клинического материала от больных;
- в отличие от аналога (3) конечный продукт не содержит компонентов, способных препятствовать реакции обратной транскрипции (додецилсульфат натрия, ДНК-аза).
По сравнению с прототипом солевой метод выделения РНК позволяет избавиться от ингибиторов ферментативных реакций и повысить выход конечного продукта, что подтверждается успешным выявлением вирусной РНК при многократном разведении исследуемых проб.
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Обнаружение ротавирусов в фекальных образцах методом ОТ-ПЦР после выделения РНК с использованием солевой экстракции (А) и набора реагентов «РИБО-сорб» (Б).
К+ - положительный контроль;
К- - отрицательный контроль;
212 н.о. - размер фрагмента кДНК.
Фиг.2. Обнаружение астровирусов в образцах фекалий методом ОТ-ПЦР после выделения РНК с использованием солевой экстракции (А) и набора реагентов «РИБО-сорб» (Б) при титровании образцов.
1а, 2а, 3а - исходные образцы; б - 1:10; в - 1:100; г - 1:1000;
К+ - положительный контроль;
К- - отрицательный контроль;
289 н.о. - размер фрагмента кДНК.
Фиг.3.Обнаружение энтеровирусов в образцах фекалий методом ОТ-ПЦР после выделения РНК с использованием солевой экстракции (А) и набора реагентов «РИБО-сорб» (Б) при титровании образцов.
1а, 2а, 3а - исходные образцы; б - 1:10; в - 1:100; г - 1:1000;
К+ - положительный контроль;
К- - отрицательный контроль;
М - Маркер;
207 н.о. - размер фрагмента ДНК.
Claims (1)
- Способ выделения РНК кишечных вирусов для анализа с использованием обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции, включающий разрушение вирионов путем прогревания в лизирующем буфере, фракционирование лизата и осаждение целевого продукта, отличающийся тем, что фракционирование лизата проводят путем центрифугирования в присутствии перхлората натрия, РНК осаждают охлажденным изопропиловым спиртом.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006111970/15A RU2313792C1 (ru) | 2006-04-10 | 2006-04-10 | Способ выделения рнк кишечных вирусов для анализа методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006111970/15A RU2313792C1 (ru) | 2006-04-10 | 2006-04-10 | Способ выделения рнк кишечных вирусов для анализа методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2313792C1 true RU2313792C1 (ru) | 2007-12-27 |
Family
ID=39019038
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006111970/15A RU2313792C1 (ru) | 2006-04-10 | 2006-04-10 | Способ выделения рнк кишечных вирусов для анализа методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2313792C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2547589C2 (ru) * | 2008-04-28 | 2015-04-10 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Новый птичий астровирус |
-
2006
- 2006-04-10 RU RU2006111970/15A patent/RU2313792C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BOOM R. et al., Rapid and simple methods of nucleic acids., J. Clin. Microbiol, 1990, v.28, №3, pp.495-503. ВИРУСОЛОГИЯ. Методы, под ред. Мейхи Б., 1988, М., Мир, стр.33-36. ТРАНСКРИПЦИЯ И ТРАНСЛЯЦИЯ. Методы, под ред. Хеймса Б. и Хиггинса С., 1987, М., Мир, стр.254-275. КЛОНИРОВАНИЕ ДНК. Методы, под ред. Гловера Д., 1988, М., Мир, стр.358, 367-371. МАНИАТИС Т. и др. Молекулярное клонирование, М., Мир, 1984, стр.186-195. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2547589C2 (ru) * | 2008-04-28 | 2015-04-10 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Новый птичий астровирус |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Casas et al. | New method for the extraction of viral RNA and DNA from cerebrospinal fluid for use in the polymerase chain reaction assay | |
Elia et al. | Detection of canine distemper virus in dogs by real-time RT-PCR | |
Suehiro et al. | A simplified method for obtaining plant viral RNA for RT-PCR | |
CN108410951B (zh) | 一种新的核酸提取试剂及其应用 | |
JP6472788B2 (ja) | 粘土鉱物およびアルカリ性溶液を使用して核酸含有試料を調製するための方法 | |
US20060240409A1 (en) | Method for extraction and identification of nucleic acids | |
Adamska et al. | Comparison of efficiency of various DNA extraction methods from cysts of Giardia intestinalis measured by PCR and TaqMan real time PCR | |
Magome et al. | Single-strand conformation polymorphism analysis of apple stem grooving capillovirus sequence variants | |
Gambino | Multiplex RT-PCR method for the simultaneous detection of nine grapevine viruses | |
CN110343784B (zh) | 基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒 | |
CA2035471A1 (en) | Techniques for the amplification of nucleic acid | |
Hataya et al. | Detection of hop latent viroid (HLVd) using reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) | |
Li et al. | An improved reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for the detection of two cherry flexiviruses in Prunus spp. | |
RU2313792C1 (ru) | Способ выделения рнк кишечных вирусов для анализа методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции | |
KR20200066164A (ko) | 노로바이러스의 검출 방법 | |
JP2018000124A (ja) | ウイルスからの核酸抽出増幅キット及びそれを用いた抽出増幅方法 | |
RU2743352C1 (ru) | Способ дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B | |
Singh et al. | An alkaline solution simplifies nucleic acid preparation for RT-PCR and infectivity assays of viroids from crude sap and spotted membrane | |
RU2361924C1 (ru) | Способ обнаружения вируса гриппа а подтипа h5n1 | |
CN113817870A (zh) | 同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用 | |
CN113699279A (zh) | 一种用于禽流感病毒检测的试剂盒及其检测方法 | |
RU2542968C2 (ru) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых днк-зондов для идентификации рнк энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита а и е из водной среды методом мультиплексной пцр | |
Sipahioğlu et al. | Comparison of three conventional extraction methods for the detection of plant virus/viroid RNAs from heat dried high-phenolic host leaves | |
RU2610434C1 (ru) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации РНК энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов из водной среды методом мультиплексной ПЦР | |
RU2441917C2 (ru) | Способ идентификации 5'-нтр генома энтеровирусов геногруппы эвi и геногруппы эвii с использованием полимеразной цепной реакции |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100411 |