CN117736934A - 一种鸡滑液囊支原体及其在制备灭活疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡滑液囊支原体及其在制备灭活疫苗中的应用，属于微生物与免疫技术领域。本发明的鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)为保藏编号为CCTCC NO：M20232224的鸡滑液囊支原体NY‑1，其生长速度快、滴度高，37℃培养18～24h可以达到10^12～13CCU/mL，且免疫保护力强，可用于制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗。本发明的鸡滑液囊支原体免疫保护力强，将其制备成灭活疫苗使用对临床上鸡滑液囊支原体疾病起到更加有效的防治；生长速度快、生长滴度高，可大大的节约时间和成本，减少疫苗的生产成本。

Description

一种鸡滑液囊支原体及其在制备灭活疫苗中的应用

技术领域

本发明属于微生物与免疫技术领域，具体涉及一种鸡滑液囊支原体及其在制备灭活疫苗中的应用。

背景技术

滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae，MS)是引起鸡、鸭、鹅等家禽的一种急性或慢性传染病。可感染各种日龄的商品肉鸡、蛋鸡和种鸡，一年四季均可发生。滑液囊支原体感染可引起鸡系统性感染并导致传染性滑膜炎，鸡和火鸡主要呈现为关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎；并使产蛋鸡产蛋量降低、蛋品质以及孵化率降低。MS与鸡新城疫病毒或鸡传染性支气管炎病毒及其他病毒的混合感染时，还可导致气囊炎，出现亚临床性上呼吸道症状。病变特征在于腱鞘呈现滑膜炎、滑液囊肿胀及靠近末端处有水泡样肿胀，水泡腔内渗出白色或淡黄色液体，关节、爪垫肿胀，剖开肿胀部位可见大量的渗出液。

支原体是能够独立存活的细菌中染色体最小且不能合成细胞壁，由于其没有细胞壁，致使临床上很多抗生素对其引起的感染治疗无效，因此通过疫苗预防该病是最有效策略。目前，临床上针对该病应用的疫苗有弱毒疫苗和灭活疫苗。澳大利亚研制的MS-H疫苗株是应用比较普遍的滑液囊支原体弱毒疫苗，可以有效降低鸡滑液囊支原体的发病，但不能完全阻止MS对鸡群的感染。此外，弱毒疫苗一般只能应用于无MS感染的鸡场，并且可能存在毒力返祖的风险，这很大程度上限制了其应用。灭活疫苗具有使用安全，易于保存，无污染危险等优点，然而其缺点在于接种剂量大。在鸡滑液囊支原体灭活疫苗的生产过程中，其生长速度慢、滴度低的特性增加了生产成本。为了降低鸡滑液囊支原体的生产成本，分离出生长速度快、滴度高的鸡滑液囊支原体尤为重要。

MS分离和鉴定工作费时、难度大，特别是MS与鸡毒支原体、鸡传染性支气管炎等疾病混合感染的情况下，成功分离MS的几率很低。另外，鸡滑液囊支原体对营养要求高、生长缓慢且滴度不高，因此可供疫苗生产的菌株极为有限。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种生长速度快、滴度高且免疫保护力强的鸡滑液囊支原体菌株及其在制备灭活疫苗中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种鸡滑液囊支原体，命名为鸡滑液囊支原体NY-1株，该菌株于2023年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为鸡滑液囊支原体NY-1Mycoplasma synoviae NY-1，保藏编号为CCTCC NO：M 20232224。

所述的鸡滑液囊支原体NY-1株具有生长速度快、滴度高且免疫保护力强等特点，其可用于制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗。所述鸡滑液囊支原体NY-1株在改良Friis培养基中37℃培养18～24h，滴度可以达到10^12～13CCU/mL。

一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗，包含所述的鸡滑液囊支原体NY-1株，还可以包含其药学上可接受的佐剂。

一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：将上述鸡滑液囊支原体NY-1株培养后，进行灭活；灭活后的鸡滑液囊支原体与佐剂混合进行乳化，得到鸡滑液囊支原体灭活疫苗。其中，所述的灭活优选使用甲醛进行；所述的佐剂优选为氢氧化铝佐剂；灭活后的鸡滑液囊支原体用生理盐水稀释后与佐剂优选按1：4的体积比混合进行乳化。

本发明具有如下优点和有益效果：相较于已报道的鸡滑液囊支原体，本发明的鸡滑液囊支原体有生长速度快、滴度高(37℃培养18～24h可以达到10^12～13CCU/mL)且免疫保护力强等特点，可作为理想的候选疫苗，对临床上MS疾病起到更加有效的防治；生长速度快且生长滴度高，可大大的节约时间和成本，减少疫苗的生产成本。

附图说明

图1：MS分离株菌落形态和PCR鉴定结果图。图中，M：DL2000 DNAMarker；1：XY-1株；2：TH-1株；3：TH-2株；4：NY-1株；5：NY-2株；6：ATCC 25204标准株基因组阳性对照；7：PBS阴性对照。

图2：NY-1株的生长滴度测定结果。

图3：感染MS NY-1株的鸡爪部出现肿胀、流渗出液等典型病变。

图4：NY-1株疫苗免疫组和攻毒对照组鸡爪剖解图。

图5：NY-1株疫苗和商品化疫苗免疫组免疫后抗体水平变化图。

生物材料保藏信息

鸡滑液囊支原体NY-1株：分类命名为鸡滑液囊支原体NY-1Mycoplasma synoviaeNY-1，保藏日期为2023年11月15日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 20232224。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例中所用的改良Friis培养基的配制如下：PPLO肉汤粉4.0g，脑心浸出物(BHI)3.0g，10×Hanks’液30mL，青霉素200U/mL，酵母浸出液30mL，0.25％酚红10mL，猪血清(经56℃灭活30min)125mL，马血清(经56℃灭活30min)125mL，用1M NaOH将pH调至7.6，加入纯水定容到1L，经0.22μm滤膜无菌过滤后分装，放置于4℃备用。

实施例1

本发明的鸡滑液囊支原体分离自河南省南阳市多家规模化肉鸡场，其分离过程为：在疑似鸡滑液嚢支原体感染的多家病鸡场，无菌采集35份肿胀跗关节腔内的关节液及内容物、足垫内容物以及病鸡气囊组织、内脏组织，放于无菌EP管中，并加入2mL灭菌PBS，放于研磨仪中研磨；使用60赫兹研磨300秒后，放于4℃离心机中4000r/min离心8min；使用0.45μm滤器除去离心后组织上清液中的细菌，将过滤后的上清液放于无菌试管中，随后加入4倍体积的改良Friis液体培养基，放于含5％CO₂的培养箱中，37℃培养3～5天后，将第一代培养物转接到新鲜的培养基中(F2代)，接着培养2～3天后，将F2代培养物吸取100μL，涂布于改良Friis固体培养基上，置于37℃、5％CO₂环境中培养3～4天，低倍显微镜下可见圆形、边缘整齐、隆起的典型的“油煎蛋”样菌落形态(图1A)，符合NY/T 4035-2021标准中的描述。进一步，收集菌液进行PCR鉴定。

PCR鉴定方法为采用OIE推荐和NY/T 553-2015标准中的引物序列，进行PCR扩增。其中引物序列如下：

MS-P1：GAGAAGCAAAATAGTGATATCA，

MS-P2：CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA，扩增片段211bp。

共成功分离到5株MS，分别命名为NY-1、NY-2、XY-1、TH-1、TH-2。PCR结果显示以分离株基因组为模板扩增的16sRNA目的基因片段与阳性对照组(以鸡滑液囊支原体ATCC25204标准株基因组为模板)扩增的目的片段大小一致(图1B)。扩增产物经凝胶电泳检测后由南京金斯瑞生物科技公司测序，采用MegAlign软件将测序结果与NCBI中登录的ATCC25204标准株16sRNA基因(GenBank:NZ_CP011096.1)序列比对，其同源性为99％以上。因此可判定分离株为鸡滑液囊支原体。

实施例2

目前测定MS生长滴度的方法主要是颜色变化单位(Colour Change Unit，CCU)滴度实验。因为MS可以代谢葡萄糖产酸，因此用酚红作为指示剂使液体培养基的pH值发生变化便可应用于间接测定培养物中MS的数量。将分离的5株MS按1:5加入到改良Frris液体培养基中，并放入含5％CO₂培养箱中于37℃复苏，初代复苏需要2～3天，随后按1:10转接于改良Frris液体培养基，培养24h，此时培养基颜色由红变黄，pH下降至6.8左右时收获菌液作为F2代，将F2代菌液按1:10转接于改良Frris液体培养基并每18～24h传一代。经过适应驯化后，当传至第6代时，根据CCU实验，测定MS分离株的滴度，具体操作步骤如下：准备14个7mL的无菌西林瓶，每个瓶中加入1.8mL的培养基，取长至稳定期的分离株菌液200μL，进行连续10倍倍比稀释，放置培养箱中观察14天，每隔24h观察一次，以第14天不再变色的稀释梯度为其CCU；同时设空白对照(未转接培养物的改良Frris培养基)。CCU测定表明，NY-1株在培养24h后可达到10¹³CCU/mL滴度，具有最高的生长滴度(图2)。

2018年，西北农林科技大学石晓磊的论文《鸡滑液囊支原体的分离鉴定及其活疫苗免疫效果的评价》中报道了一株MS的分离培养，其生长滴度最大可以达到10¹¹CCU/mL且需要2天。本发明分离的NY-1菌株在培养18～24h后就可以达到最大滴度10^12～13CCU/mL，生长滴度相比之前的报道提高了10-100倍且培养时间缩短至18个小时。由于NY-1株具有最快的生长速度和最高的滴度，所以选其进行后续的毒力及免疫保护效果评估。

NY-1菌株于2023年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为鸡滑液囊支原体NY-1Mycoplasma synoviae NY-1，保藏编号为CCTCCNO：M 20232224。

实施例3

MS是引起鸡场关节炎、呼吸道症状的主要病原之一，该病原致死率低但致病率极高，一旦感染该病原则很难根除。根据大量的文献报道，MS的病变特征在于腱鞘呈现滑膜炎、滑液囊肿胀及靠近末端处有水泡样肿胀，水泡腔内渗出白色或淡黄色液体，关节、爪垫肿胀，剖开肿胀部位可见大量的渗出液。本发明的MS NY-1株可引起鸡只出现关节、爪垫肿胀等典型病变(图3)，表明MS NY-1株是一株强毒株。

NY-1株生长速度快、滴度高，而且毒力强，因此可作为MS疫苗生产的候选菌株。为了研究其作为灭活疫苗的保护效果，本实施例进行了其免疫保护效果的评估，并和商业化灭活疫苗做了对比试验。具体实验步骤如下：1)灭活疫苗的制备：将鸡滑液囊支原体NY-1株按1：10比例接种于1000mL改良Frris液体培养基，培养18～24h后，加入终浓度为0.2％的甲醛溶液，同时做CCU计数。将培养物放入37℃振荡速度180r/min的恒温摇床中灭活48h，经检验灭活完全后，用生理盐水稀释灭活的MS NY-1株，并按1：4的比例加入氢氧化铝佐剂，经乳化机对灭活疫苗进行乳化，制备成MS NY-1株灭活疫苗。2)免疫保护试验：33只14-21日龄大小SPF鸡，分为A、B、C、D，其中，A组10只鸡皮下接种NY-1株灭活疫苗0.5mL(1×10⁹CCU)，B组10只鸡皮下接种商业化灭活疫苗(青岛易邦生物工程有限公司，鸡滑液支原体灭活疫苗)0.5mL(灭活前活菌数不低于1.9×10⁹CCU)，C组10只鸡皮下接种无菌培养基(攻毒对照组)，D组3只鸡作为空白对照组。免疫后第7、14、21、28d采集血液并分离血清，用MS抗体检测试剂盒(上海轩泽康生物有限公司，鸡滑液囊支原体抗体(MS-Ab)ELISA检测试剂盒)测定免疫组抗体水平，A、B、C组于免疫后28天，进行NY-1株足垫注射攻毒，攻毒剂量为(1×10¹⁰CCU)。攻毒后，观察鸡的生长状态及临床表现，并于30天后进行剖解。

临床保护效果评估表明，NY-1免疫组和商业化疫苗免疫组在攻毒后，鸡只的精神状况良好、无羽毛蓬松，鸡冠肉髯无发紫现象。NY-1免疫组只有2只鸡出现站立不稳，关节肿胀病变，其保护率为80％(8/10)，商业化免疫组有3只鸡出现站立不稳，关节肿胀病变，其保护率为70％(7/10)，见表1；攻毒对照组在攻毒后有3只鸡出现精神沉郁，羽毛蓬松表现，7只鸡(7/10)出现站立不稳，出现关节、爪垫肿胀等典型病变，说明攻毒有效，见图4。免疫后血清抗体检测结果显示，NY-1株免疫组和商品化疫苗免疫组在免疫后14d(14dpi)可以诱导鸡只产生高水平的抗体(图5)。综上，免疫效果评估表明，NY-1株疫苗株也具有很好的免疫保护效果。

表1：NY-1株免疫组保护率结果

上述结果表明本发明的鸡滑液囊支原体NY-1株作为疫苗株不仅可以降低成本而且其免疫保护效果也很好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)，其特征在于：所述的鸡滑液囊支原体为保藏编号为CCTCC NO：M 20232224的鸡滑液囊支原体NY-1。

2.权利要求1所述的鸡滑液囊支原体在制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗中的应用。

3.一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗，其特征在于：包含权利要求1所述的鸡滑液囊支原体。

4.根据权利要求3所述的鸡滑液囊支原体灭活疫苗，其特征在于：还包含药学上可接受的佐剂。

5.根据权利要求4所述的鸡滑液囊支原体灭活疫苗，其特征在于：所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。

6.一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将权利要求1所述的鸡滑液囊支原体培养后，进行灭活；灭活后的鸡滑液囊支原体与佐剂混合进行乳化，得到鸡滑液囊支原体灭活疫苗。

7.根据权利要求6所述的鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法，其特征在于：进行灭活为使用甲醛进行灭活。

8.根据权利要求6所述的鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的佐剂为氢氧化铝佐剂；灭活后的鸡滑液囊支原体用生理盐水稀释后与佐剂按1：4的体积比混合进行乳化。