CN117286111A - 牛冠状病毒分离株、稳定表达牛冠状病毒n蛋白细胞系及在构建反向遗传操作系统中的应用 - Google Patents
牛冠状病毒分离株、稳定表达牛冠状病毒n蛋白细胞系及在构建反向遗传操作系统中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了牛冠状病毒分离株、稳定表达牛冠状病毒N蛋白细胞系及在构建反向遗传操作系统中的应用。本发明从腹泻犊牛的粪便中分离获得牛冠状病毒内蒙古分离株，该毒株能较好适应细胞传代，在此基础上，采用高效酵母系统构建牛冠状病毒内蒙古分离株的感染性cDNA克隆；本发明还构建了稳定表达牛冠状病毒N蛋白的BHK‑21细胞系。本发明应用所构建的感染性cDNA克隆和BHK‑21细胞系建立了牛冠状病毒内蒙古分离株的反向遗传操作系统，采用该反向遗传系统拯救得到表达外源蛋白的重组牛冠状病毒，为病毒活载体疫苗的研究提供技术平台；还可以拯救得到牛冠状病毒报告病毒，为牛冠状病毒体内、体外复制动态研究提供可视化技术平台。
Description
技术领域
本发明涉及病毒分离株以及稳定表达病毒蛋白的细胞系，尤其涉及牛冠状病毒分离株、稳定表达牛冠状病毒N蛋白的细胞系及其在构建牛冠状病毒反向遗传操作系统中的应用，属于牛冠状病毒反向遗传操作系统的构建及应用领域。
背景技术
牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)属于尼多病毒目、冠状病毒科，冠状病毒属成员。根据基因组结构、核苷酸和氨基酸的相似性、抗原交叉反应等标准，冠状病毒可以分为α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属和δ冠状病毒属共四大类，其中β冠状病毒属又分成了2a、2b、2c和2d四个亚类。牛冠状病毒属于β冠状病毒属2b亚类。该病毒是导致新生犊牛腹泻、成年牛冬季痢疾以及所有年龄段牛的呼吸道疾病的主要病原。
由于BCoV难于体外分离培养、且基因组庞大，因此有关BCoV的病原学、致病性及致病机制研究均比较滞后。国内外均无对该病毒有效防控方法的报道，且尚无可以有效预防BCoV感染的检测方法及疫苗。但是，流行病学研究表明国内外牛群存在较高的病毒感染率。
RNA病毒的反向遗传学是构建RNA病毒的全长cDNA分子，并使之受控于RNA聚合酶启动子，通过体外转录过程再次得到病毒RNA，然后将该转录物RNA转染哺乳动物细胞可拯救到活病毒。能够拯救病毒的全长cDNA称为感染性克隆，该技术彻底改变了人们对病毒发病机制和疫苗开发的认识。通常，利用大肠杆菌可进行全长cDNA克隆，但是对于大的RNA病毒基因组(如冠状病毒)，在大肠杆菌中进行克隆和操作时全长cDNA不稳定。酵母TAR克隆技术可实现较长基因片段的合成，TAR克隆技术是基于含同源序列的DNA片段的自由末端在酵母细胞内能够高效同源重组的原理而建立，已成功应用于巨细胞病毒和单纯疱疹病毒等。但是，现有技术中还未有构建出BCoV感染性cDNA克隆的报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株新的牛冠状病毒(BCoV)分离株；
本发明的目的之二是提供基于酵母系统的牛冠状病毒分离株的感染性cDNA克隆质粒；
本发明的目的之三是构建稳定表达牛冠状病毒N蛋白的BHK-21细胞系；
本发明的目的之四是将牛冠状病毒(BCoV)分离株的感染性cDNA克隆质粒以及稳定表达BCoV N蛋白的BHK-21细胞系应用于构建牛冠状病毒反向遗传系统并用于牛冠状病毒株的拯救。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明的一方面是在腹泻犊牛的粪便中分离获得一株牛冠状病毒(BCoV)内蒙古分离株HM-XC，该毒株能较好适应细胞传代，其微生物保藏编号是：CGMCC No.45267；分类命名是：牛冠状病毒；保藏时间是：2022年9月9日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
经序列测定，本发明所分离的牛冠状病毒(BCoV)内蒙古分离株HM-XC的基因组的全长核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
本发明的另一方面是应用所分离的牛冠状病毒(BCoV)内蒙古分离株HM-XC的基因组采用酵母系统构建牛冠状病毒(BCoV)内蒙古分离株HM-XC株的感染性cDNA克隆质粒。
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的牛冠状病毒(BCoV)内蒙古分离株HM-XC的感染性cDNA克隆质粒的构建方法包括：将牛冠状病毒(BCoV)内蒙古分离株HM-XC的全基因cDNA重组到pYESlL质粒中得到重组质粒pYES1L-BCoV，将该重组质粒pYES1L-BCoV转化酵母细胞后将源于酵母的阳性质粒进一步转化到大肠杆菌细胞中，提取质粒，即得。
本发明的另一方面是提供一株稳定表达牛冠状病毒(BCoV)N蛋白的BHK-21细胞系；作为参考，本发明提供了一种构建所述稳定表达牛冠状病毒(BCoV)N蛋白的BHK-21细胞系的方法，包括：将牛冠状病毒N蛋白的编码基因重组到慢病毒载体Plvx-IRES-Puro中得到Plvx-IRES-Puro-N重组质粒，将该Plvx-IRES-Puro-N重组质粒与其它质粒一起转染HEK239T细胞包装得到重组慢病毒；对该重组慢病毒进行筛选并经IFA和WB鉴定，最终获得稳定表达BCoV的N蛋白的BHK-21细胞系；该稳定表达BCoV的N蛋白的BHK-21细胞系的微生物保藏编号是：CGMCC No.45306；分类命名是：BHK-Ns细胞(乳仓鼠肾细胞)；保藏时间是：2022年9月9日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明所构建的稳定表达牛冠状病毒(BCoV)N蛋白的BHK-21细胞系能应用于构建牛冠状病毒反向遗传操作系统并高效拯救牛冠状病毒株，其拯救牛冠状病毒株的效率高达100％。
本发明的再一方面是提供一种牛冠状病毒(BCoV)分离株的反向遗传操作系统，包括：牛冠状病毒(BCoV)内蒙古分离株HM-XC的感染性cDNA克隆质粒和稳定表达牛冠状病毒(BCoV)N蛋白的BHK-21细胞系。
本发明进一步提供了牛冠状病毒(BCoV)分离株的反向遗传操作系统的构建方法，包括：将构建的牛冠状病毒(BCoV)内蒙古分离株HM-XC的感染性cDNA克隆质粒转染稳定表达牛冠状病毒(BCoV)N蛋白的BHK-21细胞系，经过筛选和鉴定拯救得到牛冠状病毒分离株。
本发明所提供的牛冠状病毒(BCoV)分离株的反向遗传系统能够为牛冠状病毒(BCoV)的复制、致病性以及致病机制等基础研究提供试验平台；譬如，可以采用本发明提供的反向遗传系统拯救得到表达荧光蛋白的牛冠状病毒报告病毒，为牛冠状病毒体内、体外复制动态研究提供可视化技术平台；或者采用本发明提供的反向遗传系统拯救得到表达外源蛋白的重组牛冠状病毒，可作为载体，为病毒活载体疫苗的研究提供技术平台。
本发明的一方面是提供了表达外源蛋白的重组BCoV HM-XC株的构建方法，包括：将待表达的外源蛋白的编码基因重组至所构建的pYES1L-BCoV质粒中得到重组质粒；将重组质粒转染稳定表达BCoV的N蛋白的BHK-21细胞，经过拯救获得表达外源蛋白的重组BCoVHM-XC株。
作为参考，本发明提供了一种表达外源蛋白的重组BCoV HM-XC株的一种具体的实施方案，包括：将表达ZsGreen蛋白的编码基因重组至pYES1L-BCoV质粒中构建重组质粒pYES1L-BCoV/Del 32K；将重组质粒pYES1L-BCoV/Del 32K质粒转染稳定表达BCoV的N蛋白的BHK-21细胞并拯救病毒。结果显示，能够成功拯救病毒rBCoV-HM-XC/Zs，P3代rBCoV-HM-XC/Zs的复制滴度稍低于拯救的亲本病毒rBCoV-HM-XC。
作为参考，本发明还提供了一种表达ZsGreen绿色荧光蛋白的重组BCoV HM-XC/Zs株的构建方法，包括：将表达ZsGreen蛋白的编码基因重组至pYES1L-BCoV质粒中构建重组质粒pYES1L-BCoV/Del 32K；将重组质粒pYES1L-BCoV/Del 32K质粒转染稳定表达BCoV的N蛋白的BHK-21细胞并拯救病毒；结果显示，能够成功拯救病毒rBCoV-HM-XC/Zs，P3代rBCoV-HM-XC/Zs的复制滴度稍低于拯救的亲本病毒rBCoV-HM-XC。
本发明将稳定表达ZsGreen绿色荧光蛋白的重组BCoV HM-XC/Zs株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号是：CGMCC No.45268；分类命名是：稳定表达ZsGreen报告病毒；保藏时间是：2022年9月9日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明从腹泻犊牛的粪便中分离获得一株牛冠状病毒(BCoV)内蒙古分离株HM-XC，该毒株能较好适应细胞传代，在此基础上，采用高效的酵母系统构建牛冠状病毒内蒙古分离株HM-XC株的感染性cDNA克隆；本发明进一步构建稳定表达牛冠状病毒N蛋白的BHK-21细胞系。本发明应用所构建的HM-XC株的全基因cDNA感染性克隆质粒和稳定表达BCoV N蛋白的BHK-21细胞系建立了牛冠状病毒内蒙古分离株HM-XC的反向遗传操作系统，采用该反向遗传系统或者拯救得到表达外源蛋白的重组牛冠状病毒，作为载体为病毒活载体疫苗的研究提供技术平台，此外，采用该反向遗传系统可以拯救得到牛冠状病毒报告病毒，为牛冠状病毒体内、体外复制动态研究提供可视化技术平台。
附图说明
图1为BCoV分离株HM-XC在HRT-18G细胞上的CPE。
图2为基于BCoVS1蛋白编码基因构建的进化树分析。
图3为BHK-21/BCoVN稳定表达细胞系IFA鉴定。
图4为BHK-21/BCoVN稳定表达细胞系WB鉴定。
图5为牛冠状病毒分段基因片段感染性克隆结构示意图；A，牛冠状病毒的基因组结构；B，牛冠状病毒感染性cDNA克隆的体外组装策略；C，TAR克隆及病毒拯救的工作流程。
图6为重组质粒pYES1L-BCoV的EcoR I酶切图谱。
图7为拯救病毒与亲本病毒的一步生长曲线。
图8为拯救病毒与亲本病毒的IFA鉴定。
图9为拯救病毒与亲本病毒的病毒粒子形态观察。
图10为拯救病毒与亲本病毒N蛋白表达水平鉴定。
图11为拯救病毒与亲本病毒分子标签鉴定。
图12为插入ZsGreen表达基因的报告质粒的构建示意图。
图13为表达ZsGreen报告病毒与亲本病毒的一步生长曲线。
图14为报告病毒rBCoV-HM-XC/Zs和亲本病毒Wt BCoV-HM-XC细胞病变和荧光观察图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1BCoV内蒙古分离株HM-XC的分离与鉴定
1试验方法
1.1引物设计与合成参考GenBank上登录的BCoV Mebus株(登录号U00735.2)基因序列，应用Primer Premier 5.0引物设计软件设计1对扩增BCoV N基因的检测引物BCoV-N-U和BCoV-N-L(表1)。设计末端相互重叠的21对引物(表1)，分别用于病毒全基因组的扩增。所用引物均由库美生物(吉林)股份有限公司合成。
表1扩增BCoV N基因的检测引物和末端相互重叠的21对引物
1.2RNA提取及RT-PCR检测基因组RNA提取按照Axygen公司RNA提取试剂盒说明书进行。利用Prime STAR高保真DNA聚合酶(TaKaRa)对覆盖BCoV基因组的21个重叠片段进行PCR扩增。RT反应体系为5xPSRT buffer 5μl，dNTP Mix 2.5μl，Primerscript 0.5μl，oligod(T)1μl，RNA 16μl，共25μl。RT程序为25℃10min，42℃60min。PCR反应体系为5xPSduffer 5μl，dNTP Mix 2μl，cDNA 5μl，上下游引物各1μl,Prime STAR DNA聚合酶1μl，ddH2O 10μl，共25μl；PCR反应程序为95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测分析，回收纯化后送睿博生物公司进行测序。
1.3样品处理与接种细胞将采集的犊牛腹泻粪便样本与PBS按照1:3的比例漩涡混合，反复冻融3次，8000rpm离心8min，取上清用0.22μm滤器除菌后加入终浓度为50μg/ml的胰酶，37℃处理1h。培养48h的HRT-18G细胞PBS洗两遍，胰酶处理后的样品接种至HRT-18G细胞，37℃孵育1h。弃掉吸附液，加入含5μg/ml胰酶的无血清DMEM维持液，置37℃5％CO2培养箱中培养，逐天观察，5d后收毒。按上述方法继续盲传3代后，经RT-PCR进一步鉴定。
1.4TCID50测定分离株培养物于4℃低温离心机以3000rpm离心10min，取上清液按10倍倍比稀释为10-1～10-8，接种96孔板培养的HRT-18G单层细胞，每个稀释度接种8孔，每孔加入0.1mL病毒稀释液，于37℃5％CO2培养箱中培养，96h后进行IFA，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。
1.5IFA鉴定取病毒液按照1.3中的接毒方法将病毒接种在铺满HRT-18G细胞的96孔板中，设8个重复孔，并设阴性对照。加入维持液培养72h后，弃去维持液并用PBST洗涤3次。每孔加入预冷的95％无水乙醇200μl，室温固定20min，弃掉无水乙醇，自然风干。每孔加入1:200倍稀释的兔抗BCoV N蛋白的多克隆抗体。37℃孵育1h，PBST洗3遍。加入山羊抗兔IgG-FITC(1:200)二抗，37℃孵育1h，弃去二抗，再用PBST洗涤3次，加入一滴甘油后，用倒置荧光显微镜观察。
1.6病毒粒子的电镜观察取培养的病毒液，以8000rpm离心10min，除去细胞碎片。将离心后的上清转入超速离心管中，40000rpm离心3h。将离心后的沉淀以适量PBS Buffer重悬，置于4℃过夜。次日12000rpm离心5min，取上清滴于铜网上，以2％磷钨酸溶液(pH6.8)进行负染，在透射电镜下观察病毒粒子的形态。
1.7全基因组扩增及序列测定利用设计的21对引物进行全基因扩增，按照cDNA末端快速扩增试剂盒SMARTer RACE5'/3'Kit操作指南对BCoV分离株的5'/3'两端进行扩增，对PCR扩增产物进行序列测定。
2试验结果
试验结果显示，其中一份粪便样品在HRT-18G细胞上传3代，出现典型细胞病变(CPE)，CPE呈细胞变圆、融合形成合胞体、融合细胞脱落等特征，对照组无CPE(图1)；IFA结果显示，接种病料的细胞出现特异性的绿色荧光，阴性对照无荧光(图1)；S1蛋白编码基因遗传进化分析结果显示，分离株与中国青海省牦牛源毒株Yak/BCoV-China/QH1/S1亲缘关系最近，聚为同一个分支，与中国四川、辽宁、新疆毒株聚为一大支，与BCoV Mebus经典株进化关系较远，具有国内BCoV流行株的分子特征(图2)，表明分离的BCoV为中国流行株，命名为HM-XC。经全基因序列测定，获得BCoV HM-XC株全长基因组的准确序列，全长为31029bp(SEQ IDNo.1)，该基因组结构与已发表的BCoV参考株一致(表2)。
表2BCoVHM-XC株的基因组结构
实施例2稳定表达BCoV N蛋白的BHK细胞系的构建、筛选及鉴定
以BCoVN蛋白为基础的体外病毒拯救方法的建立和应用，是建立高效的体外病毒拯救系统的基础，本实施例利用逆转录病毒转导技术建立了稳定表达BCoVN蛋白的细胞系。
1试验方法
1.1重组慢病毒质粒Plvx-IRES-Puro-N的构建根据慢病毒载体Plvx-IRES-Puro的多克隆位点设计了引物P1和P2。在上游引物P1中引入ECORI酶切位点、Kozak序列及同源载体互补序列15nt；下游引物P2中引入了Not I酶切位点和6xHis标签肽序列及同源载体互补序列15nt；应用引物P1、P2扩增获得BCoV N基因序列。
1.2BCoV总RNA的提取和N基因的扩增利用Prime STAR高保真DNA聚合酶(TaKaRa)对BCoV N基因组的片段进行PCR扩增。RT反应体系为5xPSRT buffer 5μl，dNTP Mix 2.5μl，Primerscript 0.5μl，oligod(T)1μl，RNA 16μl，共25μl。RT程序为25℃10min，42℃60min。PCR反应体系为5xPS duffer 5μl，dNTP Mix 2μl，cDNA 5μl，上下游引物各1μl,Prime STARDNA聚合酶1μl，ddH2O 10μl，共25μl；PCR反应程序为95℃5min，95℃30s,55℃30s,72℃1min,30个循环；72℃10min。PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测分析，回收纯化。
1.3Plvx-IRES-Puro-N重组质粒构建Plvx-IRES-Puro质粒经ECOR I、Not I双酶切后回收目的片段，参照In Fusion说明书按适当的摩尔比例55℃连接15min后，转化感受态细胞DH5α，挑取单菌落经PCR鉴定为阳性克隆的菌种，进行测序分析。
1.4重组慢病毒的包装转染前一天将HEK239T细胞铺于细胞皿中，待细胞在5％CO2的37℃细胞培养箱中，生长至80％-90％时进行转染。取一个EP管，在无血清Opti-MEM中按3：2：1比例分别加入重组质粒Plvx-IRES-Puro、辅助质粒pSPAX2和pMD2.0G，混匀，另取一个EP管，在无血清Opti-MEM中加入PEI试剂，混匀，室温静置5min后，将两者混合，室温静置15min。弃去细胞培养液，更换新鲜无血清细胞培养液后将转染复合物逐滴加入细胞培养液，并置于5％CO2的37℃细胞培养箱中继续培养72h。
1.5重组慢病毒的收集分别收集48h、72h的细胞培养上清，收集细胞上清液3000r/min离心10min，去除细胞碎片，上清液用0.45μm过滤器过滤，滤液用超滤管进行浓缩。
1.6嘌呤霉素(Puro)的有效筛选工作浓度24孔板中以5～8×104cells/孔的密度接种BHK-21细胞，过夜培养，待细胞密度达70％–80％时，弃去孔内旧的细胞培养基，1×PBS洗涤2次，在培养过夜后的细胞中更换新鲜配制的筛选培养基，该筛选培养基为含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml等)，在细胞培养箱中继续培养过夜。每个筛选浓度平行做3孔重复，未加药物的细胞作为阴性对照；连续培养7d，每隔2–3d更换新鲜筛选培养基；每天观察细胞形态、存活率，一周后，有效杀死所有细胞的Puro最低浓度为7ug/ml，确定此浓度为Puro抗性筛选BHK-21细胞最佳工作浓度。
1.7哺乳动物稳定表达细胞株的筛选将BHK-21细胞铺于培养皿中，待细胞密度约为60％-70％,弃去细胞培养液，用PBS洗细胞2次，将浓缩后的慢病毒与5ug/ml聚凝胺(Polyberne)混合液加入细胞中，轻轻混匀。感染24h后，弃去细胞培养液，换成含有7ug/mlPuro的新鲜10％DMEM培养基，连续培养7d，每隔2–3d更换新鲜筛选培养基，对照组正常细胞应该100％死亡，处理组中存活的细胞为稳定表达BCoV N基因的BHK-21细胞。如此加压筛选4～5代后，获得的重组细胞系能在Puro筛选培养基中稳定生长，命名为BHK-21/BCoV N。
1.8细胞系的间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay，IFA)鉴定将能够在Puro培养基稳定贴壁生长的BHK-21/BCoV N细胞系，铺于12孔细胞板，同时设BHK-21细胞系为阴性对照，16～18h后待细胞长满，以BCoV N蛋白的单克隆抗体为一抗(1:500稀释)，羊抗鼠IgG-FITC荧光抗体为二抗(1:1000稀释)，进行IFA，在荧光显微镜下观察。
1.9细胞系的Western Blot(WB)鉴定将能够在嘌呤霉素培养基稳定表达牛冠状病毒N蛋白贴壁生长的BHK-21/BCoV N细胞系，铺于6孔细胞板，同时设BHK-21空白细胞为阴性对照，48h后待细胞长满，PBS清洗细胞2次，200μl/孔IP裂解液裂解细胞，冰上裂解1h，按比例加入5×SDS上样缓冲液，100℃金属浴变性10min，随后利用12％SDS-PAGE进行电泳，并将蛋白转印至NC膜上(120V，10min)，然后将NC膜于5％的脱脂奶粉中室温封闭1h，以BCoV N蛋白的单克隆抗体为一抗(1:1000)4℃孵育过夜，HRP标记的二抗(山羊抗小鼠，1:10000)室温孵育1h，用Odyssey近红外激光成像系统扫描，观察结果。
2试验结果
试验结果显示，经IFA(图3)和WB(图4)鉴定，BHK-21/BCoV N细胞可以稳定表达BCoV的N蛋白，将该稳定表达BCoV的N蛋白的BHK-21/BCoV细胞系提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号是CGMCC No.45306。
实施例3基于酵母系统的HM-XC株全长cDNA克隆的组装及其构建
1试验方法
1.1引物的设计与合成以BCoV总RNA的oligod(T)反转录产物为模板，用引物YES1L-BCoV-AF和YES1L-BCoV-AR扩增A片段，用引物YES1L-BCoV-BF和YES1L-BCoV-BR扩增B片段，用引物YES1L-BCoV-CF和YES1L-BCoV-CR扩增C片段，用引物YES1L-BCoV-DF和YES1L-BCoV-DR扩增D片段，用引物YES1L-BCoV-EF和YES1L-BCoV-ER扩增E片段，用引物YES1L-BCoV-FF和YES1L-BCoV-FR扩增F片段；相邻各DNA片段之间的重叠区域为35nt。以pYESlL质粒为模板，用引物Vector-F和Vector-R扩增，获得线性化的pYES1L载体。
1.2重组质粒的构建根据高阶遗传组装系统(赛默飞世尔科技)的制造商说明进行操作，简而言之，用PEG/LiAc溶液将100ng线性化pYES1L载体和A-F每个DNA片段的200ng混合物进行混合，对MaV203感受态酵母细胞(赛默飞世尔科技)进行转化。使用引物进行菌落PCR以筛选含有全长cDNA克隆pYES1L-BCoV的酵母菌落。将阳性酵母菌落提取质粒进一步转化到DH10B感受态的大肠杆菌细胞中，以使用/>Xtra Midi试剂盒(MACHEREY-NAGEL)制备pYES1L-BCoV质粒。重组质粒的构建过程及示意图见图5。
2试验结果
试验结果显示：对质粒pYES1L-BCoV进行EcoR I酶切鉴定，可出现与预期一致的酶切图谱(图6)，表明重组质粒构建成功。
实施例4HM-XC株的高效反向遗传系统的构建及其应用
(1)BCoV HM-XC株感染性cDNA克隆质粒的构建
1.1HM-XC株全基因组序列测定取冻存的BCoV HM-XC株细胞培养物200μl，按Axygen核酸提取试剂盒说明书进行操作，提取总RNA。根据BCoV HM-XC株测序准确的序列，将病毒全基因组序列划分为6个目标片段，用软件Primer Premier 5.0设计了6对特异性引物分别扩增目标片段1-6。以提取的RNA为模板，以oligod(T)引物进行反转录。利用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶(TaKaRa)对覆盖BCoV基因组的6个重叠片段进行PCR扩增。RT反应体系为5xPSRT buffer 5μl，dNTP Mix 2.5μl，Primerscript 0.5μl，oligod(T)1μl，RNA 16μl，共25μl。RT程序为25℃10min，42℃60min。PCR反应体系为5xPS duffer 5μl，dNTP Mix 2μl，cDNA 5μl，上下游引物各1μl,Prime STAR DNA聚合酶1μl，ddH2O 10μl，共25μl；PCR反应程序为95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃6min，30个循环；72℃10min。PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测分析，回收纯化后送睿博生物公司进行测序。
1.2HM-XC引物的设计与合成以BCoV的总RNA的oligod(T)反转录产物为模板，用引物YES1L-BCoV-AF和YES1L-BCoV-AR扩增A片段，用引物YES1L-BCoV-BF和YES1L-BCoV-BR扩增B片段，用引物YES1L-BCoV-CF和YES1L-BCoV-CR扩增C片段，用引物YES1L-BCoV-DF和YES1L-BCoV-DR扩增D片段，用引物YES1L-BCoV-EF和YES1L-BCoV-ER扩增E片段，用引物YES1L-BCoV-FF和YES1L-BCoV-FR扩增F片段；相邻各DNA片段之间的重叠区域为35nt，引物详细信息见表3。
表3扩增引物
以pYESlL质粒为模板，用引物Vector-F和Vector-R扩增，获得线性化的pYES1L载体。
1.3重组质粒的构建根据高阶遗传组装系统(赛默飞世尔科技)的制造商的说明书进行操作，简而言之，用PEG/LiAc溶液将100ng线性化pYES1L载体和每个A-F DNA片段的200ng混合物进行混合，对MaV203感受态酵母细胞(赛默飞世尔科技)进行转化。使用引物进行菌落PCR以筛选含有全长cDNA克隆pYES1L-BCoV的酵母菌落。将源于酵母的阳性质粒进一步转化到DH10B感受态的大肠杆菌细胞中，使用/>Xtra Midi试剂盒(MACHEREY-NAGEL)制备pYES1L-BCoV质粒。
(2)BCoV HM-XC株感染性cDNA克隆质粒的转染及病毒拯救
2.1感染性cDNA克隆质粒的转染BCoV N蛋白稳定表达细胞系BHK-21/BCoV N接种于12孔板，根据细胞贴壁情况于含5％CO2的37℃温箱中孵育8-24h，当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前换入1mL预热的无血清培养基。重组质粒pYES1L-BCoV 2μg/孔，PEI转染试剂与质粒的体积质量比为3:1进行充分混匀后，室温静置15min，用于转染复合物的制备。将转染复合物逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀，置于含5％～7％CO2的37℃温箱孵育3d。
2.2病毒的拯救及鉴定上述转染的BHK-21/BCoV N细胞培养72h，冻融2次，接种HRT-18G细胞进行病毒培养，3-4天出现典型CPE，传至3代进行鉴定。对第3代拯救病毒按实施例1中的相关方法进行鉴定，包括一步生长曲线、IFA、电子显微镜观察以及分子标签鉴定。
结果显示，拯救病毒rBCoV-HM-XC和亲本病毒Wt BCoV-HM-XC具有一致的复制动态(图7)、CPE特征和IFA反应性(图8)、病毒粒子形态(图9)以及N蛋白表达水平(图10)，但拯救病毒rBCoV-HM-XC具有人工设计的分子标签(2117nt T突变为C)(图11)，结果表明，成功拯救病毒。
(3)HM-XC株的高效反向遗传系统的应用
表达ZsGreen绿色荧光蛋白的重组BCoV HM-XC/Zs株的构建及鉴定
采用前述技术方案，将表达ZsGreen蛋白的编码基因重组至pYES1L-BCoV质粒中，进而构建重组质粒pYES1L-BCoV/Del 32K(图12)。将质粒pYES1L-BCoV/Del 32K按上述技术方案进行转染细胞、并拯救病毒。结果显示，能够成功拯救病毒rBCoV-HM-XC/Zs，P3代rBCoV-HM-XC/Zs的复制滴度稍低于拯救的亲本病毒rBCoV-HM-XC(图13)；光学显微镜和荧光显微镜下观察，rBCoV-HM-XC/Zs与rBCoV-HM-XC具有一致的CPE特征，并且rBCoV-HM-XC/Zs可见明显绿色荧光，而拯救的亲本病毒rBCoV-HM-XC则未见荧光(图14)；rBCoV-HM-XC/Zs传至P10代，仍可见明显绿色荧光，且与P3代无差别(图14)。本发明将表达ZsGreen绿色荧光蛋白的重组BCoV HM-XC/Zs株提交专利认可的机构进行保藏，其其微生物保藏编号是CGMCCNo.45268。
上述试验结果表明，表达ZsGreen绿色荧光蛋白的重组BCoV HM-XC/Zs株能够高效拯救，并能稳定表达外源蛋白，因此，应用此平台技术，可以构建表达其他外源蛋白的重组BCoV，进而作为活疫苗载体进行广泛应用。
Claims (10)
1.一株牛冠状病毒(bovinecoronavirus)内蒙古分离株，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCCNo.45267。
2.牛冠状病毒内蒙古分离株的全基因cDNA，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
3.权利要求2所述的全基因cDNA在构建牛冠状病毒内蒙古分离株的感染性cDNA克隆质粒中的应用。
4.牛冠状病毒内蒙古分离株的感染性cDNA克隆质粒，其特征在于，其构建方法包括：将权利要求2所述的全基因cDNA重组到pYESlL质粒中得到重组质粒pYES1L-BCoV，将该重组质粒pYES1L-BCoV转化酵母细胞后将源于酵母的阳性质粒进一步转化到大肠杆菌细胞中，提取质粒，即得。
5.稳定表达牛冠状病毒N蛋白的BHK-21细胞系，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCCNo.45306。
6.权利要求4所述的感染性cDNA克隆质粒或/和权利要求5述的稳定表达牛冠状病毒N蛋白的BHK-21细胞系在构建牛冠状病毒反向遗传操作系统中的应用。
7.牛冠状病毒的反向遗传操作系统，其特征在于，包括：权利要求4所述的感染性cDNA克隆质粒和权利要求5所述的稳定表达牛冠状病毒N蛋白的BHK-21细胞系；优选的，还包括：将外源蛋白的编码基因重组到权利要求4所述的感染性cDNA克隆质粒中；其中，所述的外源蛋白是ZsGreen蛋白。
8.应用权利要求7所述的反向遗传操作系统拯救得到的重组牛冠状病毒株。
9.应用权利要求7所述的反向遗传操作系统拯救得到的表达ZsGreen绿色荧光蛋白的重组牛冠状病毒株，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCCNo.45268。
10.权利要求8或9所述的重组牛冠状病毒株作为牛冠状病毒报告病毒或在制备防治或者诊断牛冠状病毒疫苗或试剂中的应用。
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| CN117802275A (zh) * | 2024-03-01 | 2024-04-02 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 犊牛腹泻主要病原三重荧光定量pcr检测方法及其应用 |
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2023
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| CN117802275B (zh) * | 2024-03-01 | 2024-05-17 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 犊牛腹泻主要病原三重荧光定量pcr检测方法及其应用 |
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