JP2003522802A - プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
76号の優先権を主張し、その内容を本明細書中に援用する。
に応用できる、新しい、そしてインフルエンザに対するワクチンの製造について
の改良された技術を説明する。
甚大な社会的、及び経済的影響の減少の最も有効な方法である。界面活性剤含有
分解インフルエンザ・ワクチンが可能ではあるが、特に危険性の高いグループ、
例えば幼児及び高齢者においてワクチン接種承諾のレベルが低い。例えば、65
歳超に当たる人々の半分未満しか実際にワクチンを受けていないと推測されてい
る。さらに、健常成人における免疫増強に70〜90%有効であるにもかかわら
ず、現在の注射可能なインフルエンザ・ワクチンは幼児及び老人の人々において
単回投与のときに乏しい免疫原性である。高齢者の間で20〜25%まで低い血
清変換率が報告された。高齢者におけるこの低下した応答は、この年齢層におけ
る細胞傷害性Tリンパ球活性を含めた1型T細胞応答の衰えによると考えられて
いる。減少した承諾と乏しい免疫原性の組合せが、依然として一般の人々の多く
がインフルエンザに起因する感染症及び合併症の高い危険性であることを裏付け
る。それらをアジュバントと一緒に同時投与することにより注射可能なインフル
エンザ・サブユニット・ワクチンの免疫原性を高めるための多くの試みは、ヒト
による動物モデルにおいて見られた、免疫が後に続く局所反応誘発性の受容でき
ない速度及び強い免疫賦活効果を再現できないことのために検証に失敗した。
るインフルエンザ・ワクチンは、人々の全ての年齢層で免疫承諾を高めるであろ
うワクチン接種に対するより緩やかな方法を与える。さらに、注射可能なインフ
ルエンザ・ワクチンが粘膜型IgA誘導で役に立たない一方で、上気道における
局所分泌型IgAの産生はインフルエンザ感染を保護しうるため経鼻経路による
免疫は、筋中注射に比べてより有効であろう。インフルエンザ特異的分泌型Ig
Aは、ウイルスの変異株について広い交差反応性を示すので、インフルエンザ・
ウイルス変異体からのより有効な保護を提供する。特に経鼻インフルエンザ・ワ
クチンは、高齢者により有効であろう、なぜなら全身性免疫系と異なり粘膜型免
疫応答は年齢と共に低下しないからである。全身性免疫応答をも刺激する経鼻イ
ンフルエンザ・ワクチンは、血清からの抗体の滲出により下気道(肺)を保護す
る。加えて、鼻に関連したリンパ組織におけるインフルエンザ特異的細胞傷害性
T細胞(CTL)が、感染からの回復に貢献しうる。
て鼻を介して使用されてきた。これらのインフルエンザ株は、それにより鼻咽気
道において最小限複製させた低温(25℃)での生育に馴化したインフルエンザ
・ドナー・ウイルスからの他の内部及び構造タンパク質をコードする6の遺伝子
をもつfluウイルスの流行の株のHA及びNA遺伝子を組合わせる遺伝子再集
合体である。これらのワクチンは、インフルエンザによる自然の感染症により誘
導される、鼻腔洗浄液中の分泌型IgAの増加、再刺激PMNC’sによるイン
ターフェロン・ガンマ産生、及び同じサブタイプのウイルスに対して交差反応を
広げる内部ウイルス・タンパク質に特異的なCTLの活性化を含めたものに類似
した保護免疫応答の誘導に利点をもつ。CAVインフルエンザ・ワクチンは商品
化寸前であり、そして子供及び健常成人において十分に許容的で、そして免疫原
性であることが証明されている。健常な子供における最近の研究において、1又
は2回服用のCAV fluワクチンは、注射可能な分解fluワクチンと等量
の全身性抗体を誘導することが示された。血清反応陰性の子供において>80%
保護を誘導するためのCAVの単回服用の能力は、この年齢層における同様の保
護を達成するために2度の免疫を必要とする注射可能な分解ワクチンより有利で
ある。健常成人及び高齢者において既存の循環抗原がこれらの年齢層における有
効な血清変換を防げる(以下を参照のこと)のに反して、CAV’sは、プラシ
ーボに比べ熱性疾患の数、欠勤日数、及び医療サービス提供者への訪問の有意な
減少を証明した。高齢者において、注射可能な分解サブユニットワクチンとの組
合わせたCAV’sはプラシーボに比べて研究室レベルで記録されたインフルエ
ンザが有意に減少した。
不利益を有する:以前にインフルエンザ・ウイルスに哂された健常成人及び高齢
者はCAVワクチンにわずかにしか反応せず、そしてしばしば保護に関連する血
清の血球凝集阻害(HAI)のレベルに達しない。これは特に最も高い危険性の
グループ、及び現在全体的なワクチン接種が勧められる唯一のグループの中の高
齢者に顕著である。加えて、野生型株への逆戻り及び/又は循環株による組換え
の可能性のある問題であるために、CAV’sは免疫抑制された人又は妊婦にお
ける使用に勧めない。20年のCAVインフルエンザ・ワクチンの臨床評価にも
かかわらず、製造及び品質管理の問題から認可は遅れている。
に、現在経鼻不活化「分解」インフルエンザ・ワクチン(ISIV)の開発の試
みがある。不活化分解インフルエンザ・ワクチンは精製インフルエンザ血球凝集
素(HA)を含む。単独で又はさまざまな粒子状デリバリー媒体、若しくはエン
テロトキシンに基づくアジュバントと共に与えられる不活化分解インフルエンザ
・ワクチンは、動物及びヒトにおけるインフルエンザ特異的粘膜及び全身性免疫
応答を誘導する。
む経鼻ISIVは、動物及びヒトにおける制限実験において鼻IgAの有意に高
いレベルの再現性のある誘導をする。しかしながら、より大量のHAでの2以上
の服用の経鼻ISIVは、商業的に実行可能性を欠く前述のワクチンを作る注射
可能なISIVと等量の血清HAIの誘導レベルが必要とされる。
ンテロトキシン、例えばコレラ毒素Bサブユニット(CTB)、Tamura, et al.
, J. Immunol. (1992) 149 : 981-988(これらの研究ではCTBの組換え起源を
使用しないため、CTBと呼ばれるものでさえかなりの量の活性コレラ毒素を含
んだ)、及びE.コリ(E.coli)からの組換え熱不安定性毒素(rLT)
、Barchfield, et al., Vaccine (1999) 17 : 695-704 を伴う経鼻的なISIV
投与により達成されうる。
ワクチンを含む対応の抗原に対する強化された粘膜IgA及び血清免疫応答の両
方の誘導を可能にする強力な粘膜アジュバントである。rLTは、ヒトにおいて
ISIVに対する局所性及び全身性HA特異的反応の促進をも示した(Hashiguc
ci, et al., Vaccine (1996) 14 : 113-119 )。しかしながら、ヒトにおける経
鼻的エンテロトキシンに基づくアジュバントの評価は、経鼻投与後にエンテロト
キシンがCNSの嗅球部に達し、そしてその組織において強い炎症反応を誘発し
たことを示す、マウスにおける前臨床毒性試験の結果のために米国FDAにより
中止された。この裁定はこれらのアジュバントを伴うfluワクチン(McGhee,
et al., J. Immunol. (2000) 165 : 4778-4782)の開発を著しく妨げ、そして当
面の間ヒト・ワクチンにおけるこのタイプのアジュバントの使用をおそらく不可
能にするであろう。
るリポソーム製剤)は、不活化インフルエンザ抗原のための有効な経鼻デリバリ
ー媒体として動物実験及びヒトにおいて研究されてきた。粒子状抗原は鼻の感作
リンパ組織内の抗原提示細胞による取り込みを促進しうる。ビロソームは脂質を
含む体球を伴ったインフルエンザ・ウイルス抗原を含むリポソームである。これ
らのワクチンは注射可能なものとして欧州において認可されている。マウスにお
いて、経鼻ビロソームは、有意に高いレベルの粘膜分泌型IgAと一緒に等量の
注射可能な分解抗原と同じレベルまで血清力価を誘導する。ビロソームはヒトに
おいて経鼻免疫の直後に免疫原性であることを示したが、しかし2の治験におい
て、2回服用により与えられる30μgの総HAによる経鼻免疫直後に注射可能
なワクチンと等しい血清抗原の規定の力価を達成するために組換えLTが必須で
あることが証明された(Gluck, et al., J. Infect. Dis. (2000) 181 : 1129-1
132 )。スイスにおいて現在は認可されたが、注射可能なfluワクチンと免疫
原性当量を達成するための、潜在的に神経毒のrLTに関する要件は、北米を含
む多くの地域においてワクチンを不可能にする。開発中の他の粒状デリバリー媒
体は、脂質エンベロープに囲まれた炭水化物の内核を含むバイオベクター(Bi
ovector)システムである。治験において、バイオベクターを伴う経鼻I
SIVは、プラシーボに比べて高い血清HAI及び粘膜IgAを証明した。しか
しながら、バイオベクターを伴うインフルエンザ抗原の試験した最も高いレベル
の2回服用はHAI力価の増加を誘発し、そしてそれはこの技術による協力関係
を廃止した主要なワクチン製造のパートナーによるこの製品の開発継続を正当化
するために有意に十分ではなく、データ検討の結果、保護に関係する血清HAI
レベルを達成するための免疫刺激物を有するバイオベクターの添加の必要性を示
唆された。
十分な対象インフルエンザ物件から有意に異った反応を誘発しなかった。他の技
術であるモノホスホリル・リピドA(MPLA)は、サルモネラ・ミネソタ(S
almonella minnesota)R595のリポポリサッカライドか
ら分離した脂質のオイルに基づく又は水性製剤から成るリポポリサッカライド・
アジュバントである。この技術も前臨床試験において中程度成功したマウスにお
ける経鼻インフルエンザ・ウイルスの作製に使用された。
質の製剤及び他の細菌からの類似の製剤を説明するために使用される。
, et al., Science (1988) 240 : 800-802 ; Lynch, E.C., et al., Biophys. J
. (1984) 45 : 104-107 ; 1998年3月10日発行の米国特許第5,726,292号 ; 1987
年11月17日発行の同第4,707,543号。
ration Vaccines”2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kon
g (1997) pages 193-206、により参照され、この内容を本明細書中に援用する。
プロテオソームはあるウイルスに匹敵するサイズであると説明され、疎水性であ
り、そしてヒトの使用に関して安全である。プロテオソームはさまざまなタンパ
ク質及びペプチドによるワクチンの処方に有用であると言われる。前記の総説は
、可溶性界面活性剤が徹底的な透析技術を用いて選択的に除去される時に形成さ
れる多種抗原とプロテオソームの間の非共有複合体を含む組成物の製剤を説明す
る。細菌性赤痢・ワクチンに関して、限外ろ過が良好であると報告されている。
ワクチンは、ここでは抗原が赤痢菌(shigella)リポポリサッカライド
、ブルセラ(Brucella)リポポリサッカライド、スタフィロコッカル(
Staphylococcal)エンテロトキシンBトキソイド、ヒト免疫不全
ウイルス・エンベロープ・タンパク質、E.コリ(E.coli)線毛接着性タ
ンパク質、並びにさまざまなペプチド、例えばマウス及びインフルエンザ・ウイ
ルス由来のペプチドである。これらの製剤は粘膜適用が意図される。非経口ワク
チンをも処方する。特に、(抗原全体ではなく)インフルエンザ由来のペプチド
をワクチン製造のために使用した。Levi, R., et al., Vaccine (1995) 13 : 13
53-1359を参照のこと。インフルエンザ・ウイルス抗原のための粘膜アジュバン
トとして働く髄膜炎菌からの外膜小胞の補足的な説明は、Dalseg, R., et al.,
Vaccines (1998) 96 : 177-182に記載される。
インフルエンザによる感染症に対する効率的な方法及び有効な組成物に関する必
要性は残っている。
製造方法を説明する。これらのワクチンは製造が簡単で、そしてインフルエンザ
感染症を保護しうる。好ましい態様は不活化インフルエンザ抗原、好ましくはグ
ラム陰性細菌、例えばナイセリア・メニンギチジス(Neisseria me
ningitides)の外膜タンパク質の精製により形成されるプロテオソー
ムによる非共有的に形成されたHAを含む経鼻プロテオソーム・インフルエンザ
・ワクチンである。インフルエンザに対するワクチンは本明細書中に例示したが
、適用された方法は一般的にウイルス・タンパク質抗原を含むワクチン製造に有
用である。
れ、上記方法は、界面活性剤の存在下、少なくとも1のウイルス・タンパク質抗
原とプロテオソーム製剤の混合物を準備し、そしてその界面活性剤を上記混合物
から限外ろ過により除去することを含む。好ましい態様において、前記混合物中
のプロテオソーム対ウイルス抗原の比は1超:1、好ましくは2超:1、より好
ましくは3超:1、そしてより好ましくは4超:1である。
集がウイルス抗原、好ましくはインフルエンザ血球凝集素とプロテオソームの間
で形成されるワクチンに向けられる。好ましいサイズの範囲をも記載する。
ポポリサッカライド抗原は、さまざまな動物種において経鼻又は非経口免疫の結
果高められた粘膜及び全身性免疫応答を誘導することを証明した。本発明は、イ
ンフルエンザ感染症の保護のために設計されたワクチンにより説明されるプロテ
オソーム−タンパク質に基づくワクチンの改良された製造方法、及び改良された
組成物を本明細書中で説明する。注射可能なワクチンのそれと等量のHA、ここ
ではHA−インフルエンザ抗原の用量で、説明されるプロテオソーム・インフル
エンザ・ワクチンは、プロテオソームが十分に低い血清反応を誘導することなし
に、匹敵するか又は高められた血清ウイルス特異的免疫応答を誘導する。プロテ
オソーム−インフルエンザ・ワクチンは高いレベルの特異的な粘膜、鼻、及び肺
IgAをも産生するが、これに反してインフルエンザ抗原単独の注射又は経鼻投
与はわずかな又はとても低いレベルの呼吸粘膜IgAしか誘導しなかった。加え
て、プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンは、インフルエンザ抗原に対す
る免疫応答を主に2型応答からより平衡のとれた1型/2型応答又は主に1型応
答に変換したが、一方で粘膜的又は注射により与えられるインフルエンザ抗原単
体は主に2型応答を誘発する。1型応答は、インフルエンザ感染症の消散に重要
な細胞傷害性Tリンパ球の誘導を促進する。従来、1型応答には、生病原性又は
弱毒化CAV経鼻インフルエンザ・ワクチンを必要とした。先に報告した単独で
又はバイオベクター若しくはビロソーム(rLTの有無にかかわらず)のいずれ
かで投与されるISIVは、好ましくは2型免疫応答を誘導する。
に良好に許容されることを示した。プロテオソーム・ワクチンにより実施したG
LPマウス実験において、嗅球又は他の中枢神経系(CNS)への影響は見られ
ず、前記エンテロトキシンに基づきアジュバントしたfluワクチンよりもプロ
テオソーム−fluワクチンの方が明らかに本質的に安全であることを示した。
疫原性であり、そしてCAVを与えられたこの年齢層の被験者において観察され
なかった頻度及びレベルで健常成人における血清HAIを有意に高める誘導をす
る。注射可能なISIVワクチンにより与えられるのと同じ用量で、プロテオソ
ーム−インフルエンザ・ワクチンはヒトの鼻腔洗浄液中に有意なレベルの分泌型
IgAを誘導する。したがって、経鼻プロテオソーム−インフルエンザ・ワクチ
ンは、生CAVワクチン及び他の経鼻的にデリバリーされる又はアジュバントさ
れる不活化インフルエンザ・ワクチンより優れた免疫原性及び安全特性を有する
不活化経鼻インフルエンザ・ワクチンとしての有用性をもつ。
他の抗原タンパク質を含むプロテオソーム組成物に典型的であり、そして上記組
成物はウイルス又は非ウイルス抗原を用いた他の呼吸器系疾患又は非呼吸器系疾
患に対する保護にも同様に有効であろう。
ソームの製剤である。第2の成分はタンパク質抗原、好ましくはウイルス抗原で
ある。故に、天然のタンパク質である細菌由来抗原は、ウイルス抗原と同様に好
ましい処方中に使用されうる。前記組成物は部分的に又は完全に精製されたイン
フルエンザ・ウイルス抗原の製剤の使用により本明細書中に説明される。前記抗
原は、定量化しうる量のインフルエンザ血球凝集素(HA)を含むために界面活
性剤抽出、そしてショ糖密度勾配遠心分離を用いて精製されうる。細胞培養、例
えばバキュロウイルス又は哺乳動物細胞株中に発現され、そしてそこから精製さ
れる組換えインフルエンザ・タンパク質、例えば血球凝集素タンパク質を使用す
ることもできる。前記インフルエンザ成分は一般的に(天然起源から精製された
抗原に関しては)インフルエンザ分解産物又は分解flu、あるいは組換えHA
(rHA)と称される。
細書中に援用)又は同第4,707,543号中で所望される疎水性粒子又は小
胞の獲得をもたらす精製工程を受ける外膜タンパク質の抽出を意味する。プロテ
オソーム製造のための代替の、そして改良された方法は以下の実施例に記載され
、そしてフロー図により説明される。小胞の形状の外壁タンパク質成分をもたら
すあらゆる製造方法が「プロテオソームの製造」の定義の中に含まれる。
化するために上記2の成分を記載の方法により特定の初期割合で処方する。前記
方法は、選ばれた界面活性剤溶液中での前記成分の混合、そして次に本発明のワ
クチンのために最適化した流量及び膜のパラメーターを用いたダイアフィルトレ
ーション/限外ろ過法による上記界面活性剤の除去を一般的に含む。
は1超:1、より好ましくは3超:1、より好ましくは4超:1であることであ
る。前記の比は8以上:1でもありうる。前記2の成分の界面活性剤に基づく溶
液は、同じ界面活性剤か又は異なる界面活性剤を含み、そして1以上の界面活性
剤が限外ろ過/ダイアフィルトレーションを受ける前記混合物中に存在しうる。
好適な界面活性剤はTriton,Empigen、及びMega−10を含む
。他の界面活性剤を使用することもできる。前記界面活性剤は、組成物の製造に
使用される成分を溶解させるために働く。界面活性剤の混合物の使用は特に有利
である。当然、この混合物は最終的な処方の前にダイアフィルトレーション/限
外ろ過により除去される。
組成物が0.8μフィルター、0.45μフィルター、又は0.2μフィルター
を通してろ過されることである。これはろ過により行われる滅菌を可能にし、防
腐剤、例えばチメロサール添加の必要を未然に防ぐ。前述の汚染物質の存在によ
るあらゆる合併症を排除するために望ましいので、これは大きな利点である。
希釈剤及び担体、バッファー等の添加により最終的にワクチンに処方される。
のタンパク質抗原を含むワクチンは多価ワクチンとして作製されうる。これは2
の方法により達成されうる。ダイアフィルトレーション/限外ろ過前の初期混合
物は、場合により異なる界面活性剤の存在下又は同じ界面活性剤の存在下、別々
の成分として最初に提供される所望の抗原の混合物を含む;次に、抗原の混合物
は界面活性剤−無汚染プロテオソーム製剤と混合し、そして前記のとおり処理す
る。あるいは、1価(又は多価)抗原からダイアフィルトレーションにより得ら
れた組成物を、1以上のさらなる抗原から同様に調製された製剤と混合しうる。
故に以下に説明されるものは、3の異なるHA抗原から作られた3価ワクチンで
ある。
自体が改良された方法により製造されうる。故に、従来技術により示されたさま
ざまなステップを避け、付加的なステップ又は代替ステップを利用する。1の重
要な態様において、前記製造方法は、以下の実施例に記載のとおりエタノールの
存在下で1回以上沈殿し、続いて0.1〜1%界面活性剤溶液により、典型的に
はEmpigenを用いてプロテオソームを再抽出し、それによりより均一な産
物を得ることを含む。加えて、エタノール沈殿ステップを利用しないにしても、
従来技術の方法として記載の硫安沈殿を排除する。
びに免疫応答を誘導するために粘膜(例えば鼻、口、口腔咽頭、又は直腸の粘膜
)、非経口(例えば筋中又は皮下)、あるいは経皮経路によりデリバリーされる
ワクチンに処方されうる。
経鼻ワクチンは、血清IgG抗体及び血球凝集阻害(HAI)抗体を含む特異的
な抗インフルエンザ免疫応答を誘導する。これらの誘導はヒトにおいてインフル
エンザの保護と相互に関連することが知られているため、HAI応答は大きな意
義を有する。前記ワクチンは鼻腔又は肺から集められる粘膜分泌によるIgAを
含めた粘膜抗体を生じ、そしてIgG1/IgG2比及びTh2サイトカイン、
例えばIL−5を伴わないTh1サイトカイン、例えばインターフェロン・ガン
マの誘導により計測される、主に2型応答から均衡した又は主に1型応答への変
化をも生じる。前記の応答は、他の細胞性応答、例えば細胞傷害性T細胞(CT
Ls)の発達の前兆となる。本発明の経鼻ワクチンのこれらの3タイプの応答を
誘発する能力は、(HAI抗体を含む)活性血清抗体、インフルエンザ・ウイル
スを中和しうる鼻咽頭及び肺IgA抗体、並びに残存又は細胞内ウイルスの排除
を助けるTh1応答が全てインフルエンザ・ウイルス感染症の保護の重要なメデ
ィエイターであるため、前記ワクチンがより完全な免疫を提供しうることを示す
。これは、前記ワクチンがマウスの病原性インフルエンザ・ウイルスを接種に関
連した体重減少及び死亡からマウスを守ることを説明することを示す結果による
。
に、例えば注射(例えば筋中又は皮下)により投与することもできる。筋中注射
がプロテオソームなしの分解fluワクチン投与により提供されるよりも高いレ
ベルの血清抗体を提供することを以下に証明する。
の免疫(3回)を用いても、そして20倍までの用量、つまり最も高い要求され
るヒト用量を用いてもマウスに対する経鼻経路による本発明のワクチンの投与は
十分に許容された。重要なことに、前記の他のエンテロトキシジェニック粘膜ア
ジュバントとは異なり、CNSの嗅球部における炎症の徴候がなかった。
インフルエンザ抗原により製造された本発明のワクチンは、いかなる深刻な副作
用もなく十分に許容された。最適な用量で前記ワクチンは、(試験したインフル
エンザ株に全く血清反応陰性であるボランティアの中でさえ)50%以上のボラ
ンティアで、その大部分がインフルエンザ・ウイルスに起因する疾患の保護に関
連するのと等価か又はそれを上回る力価を有する血清HAI応答を誘導した。血
清HAI力価は、ボランティアの13%未満でHAI応答を誘導した。経鼻的に
与えられた分解抗原単体により誘導されたものより有意に高かった。前記ワクチ
ンは、鼻腔洗浄液分泌型IgAを、経鼻的に又は注射により与えられた分解抗原
単体による免疫の結果として産生されたものより有意に多くのボランティアで、
そして有意に高いレベルでも誘導した。ヒトにおいて粘膜及び全身性免疫応答を
誘導するプロテオソーム−fluワクチンの用量(7.5〜30μg)は、最新
の注射可能なワクチンのそれ(15μg)に近く、そしてそれは予想できなかっ
た。ヒトにおいて経鼻免疫の結果、最適な血清及び粘膜の免疫応答を得るために
プロテオソーム赤痢菌ワクチンを用いた人体研究において、本発明の方法による
プロテオソーム−fluワクチンのために用いたインフルエンザ血球凝集素抗原
の平均用量より(50〜100倍)多い1,000μg〜1,500μgの赤痢
菌抗原の用量でプロテオソーム−赤痢菌ワクチンを与えることが必要であった。
前記多価製剤を、別々の1価プロテオソーム−fluワクチンを組合せるか又は
1価のインフルエンザ抗原を組合せて多価抗原混合物を形成し、次にプロテオソ
ームと複合体を形成させて多成分プロテオソーム−fluワクチンとして処方さ
れる組成物を製造するかにより得ることができる。
リバリー形態において製品の安定なデリバリーを提供するために潜在的に大量の
、オイル、乳液、ナノ乳液、脂肪、ワックス、緩衝剤又は糖を含む賦形剤又はア
ジュバントを本技術分野の慣例の希釈剤又は媒質として加えた、活性成分を含み
うる。
ロトコールが適用されうる。前記ワクチンは、本発明のワクチンのいくつかの投
与方法を含む別々のプロトコールにより使用されうるか又は本発明のワクチンは
他の製剤と一緒に併用プロトコールにより使用されうる。抗原の選択は、感染性
物質の性質により決定される;用量レベル及び服用の時期を含む投与に関する特
定のプロトコールの設計は、当業者に周知の決まりきったやり方を用いた当該手
順の最適化により決定される。インフルエンザ・ワクチン接種について説明する
一方で、例示されたがしかし他の抗原を含むものに類似のワクチンは、粘膜経路
により、すなわち吸入、並びに摂取又は性感染により取得したウイルス性又は細
菌性疾患、あるいは特定の毒素又は生物学的な脅威物質又はアレルギーからのヒ
ト又は(獣医の使用による)動物の保護に成功する。本発明は、細菌性疾患、ア
レルギー又は癌に対するワクチンのための細胞表面又は細胞内タンパク質抗原を
用いた粘膜的又は非経口的経路によりデリバリーされる予防的又は治療的ワクチ
ンを含む。
なる。例えば弱毒化生低温馴化ワクチン(CAV)と異なり、本明細書に記載の
ワクチンは、精製されるか又は組換え成分である死んだ抗原を含む。プロテオソ
ームが細菌外膜タンパク質を本来構成し、そしてごくわずかな又は少量の天然の
細菌脂質を含むのに対して、MF59脂質乳液、リポソーム又はビロソームが大
量の脂質から成る一方でMPLA及びバイオベクター技術は少量(MPLA)又
は大量(バイオベクター)のサッカライドが存在する脂質サッカライドであるた
め、前記組成物はMF59乳液、リポソーム、ビロソーム、モノホスホリル脂質
A(MPLA)又はバイオベクター技術と異なる。これらのアジュバントは、大
量の(細菌の又は他の)タンパク質を含まない。
に記載のものとの性質及び特性の比較は、本発明の利点を証明する。前記のDa
lsegの組成物は弱毒化ウイルスに関する前述の欠点に悩まされる;Dals
egワクチン中の抗原成分は、本発明のワクチンに使用した精製タンパク質に対
抗する、ホルマリン不活化全インフルエンザ・ウイルスである。不特定の方法に
よりナイセリア・メニンギチジスからの抽出された外膜調製物として得られた小
胞をホルマリン不活化インフルエンザ・ウイルスと混合し、そして超音波処理す
るか又は単に混合した。前記混合物に対してダイアフィルトレーション又は限外
ろ過処理を適用しないため、界面活性剤が、その中に残存する小胞を含む組成物
中に存在する。故にDalsegにより調製された組成物は本発明のワクチンの
それより劣った結果を提供する;効果を観察するためにDalseg組成物の4
回投与を必要とした。
った先に報告した組成物は1以下:1のプロテオソーム対抗原の比を利用した;
1:20位低い比を用いた。そこに記載の最適の効果を示す従来技術のワクチン
は、最適の効果が1,000μg又は15,000μgまでの抗原用量を必要と
することを要求した一方で、本発明のワクチンは7.5〜30μgの範囲の抗原
用量を用いてヒトにおいて有効である。
00,000の分画分子量の使用であるために高められた効率をもたらすことが
示される;同様に、より効率的なものは、プロテオソームの存在下、いくつかの
抗原を同時にワンステップ・ダイアフィルトレーション/限外ろ過手順に供する
可能性である。
い。
トの1M塩化カルシウム含有6% Empigen BB(EBB)(Albright
and Wilson, Whithaven, UK)溶液を用いた抽出によるB群2型ナイセリア・メ
ニンギチジス(Neisseria meningitides)からの精製を
実施し、引き続きエタノールにより沈殿させ、1% EBB−Tris/EDT
A生理食塩水中に溶解し、そして次に硫安により沈殿させた。その沈殿物を1%
EBBバッファー中に再溶解し、透析し、−70℃、0.1% EBB中で保
存した。前記方法のフロー図(フロー図1)を以下のページに示す。プロテオソ
ームは、工程を短縮するために硫安沈殿のステップの省略によっても得られうる
(フロー図1A)。それでも成功する代替方法をフロー図1Bに示す。
接種した卵から尿膜腔液を採取し、続いてウイルスを清澄し、不活性化し、ダイ
アフィルトレーション/限外ろ過により濃縮し、そのウイルスをショ糖密度勾配
遠心分離によりバンドにし、ペレットを形成させ、再懸濁したペレットをTri
ton X−100若しくはNP−40又は他の好適な界面活性剤により抽出し
、そして遠心分離して上清を回収することを含む。必要であればこの工程をくり
返し、前記上清をフロー図2に記載のとおり分析し、蓄積し、そして2〜8℃で
保存した。
せ、そして(Gail Smith, et al.を参照のこと)に記載のとおり慣甲の技術によ
り精製した。得られたタンパク質を、PAGE還元ゲルにより測定し>95%H
Aであった。HAを、濃度計を用いて確定的な複合体の状態で定量化し、そして
その複合体の組換えHAバンドの強度を既知の濃度の組換えタンパク質のバンド
の強度と比較した。
、そしてフロー図3に記載のダイアフィルトレーション/限外ろ過法又は透析法
を用いてプロテオソームと処方した。いずれの方法についても、前記インフルエ
ンザ分解産物を所望の界面活性剤、例えばEmpigen BB(EBB)を1
%で又は0.1%〜2%のEBB、あるいは使用された界面活性剤のタイプに依
存する他の好適な界面活性剤を含む生理食塩緩衝溶液中に溶解し、そして次にそ
れを生理食塩緩衝化1% Empigen溶液(又は前記のとおり適当な濃度で
他の適当な界面活性剤)中のプロテオソームと1:4、1:1、2:1、4:1
、及び8:1を含む4:1〜8:1の範囲をもつさまざまなプロテオソーム:H
A(wt/wt)の割合で混合した。Empigenを除去するために、次に前記混
合物をフロー図3に記載のとおり限外ろ過/ダイアフィルトレーション技術に供
するか、又は10,000の分画分子量(MWCO)を有する透析膜若しくは1
,000〜30,000のMWCO範囲を有する機能的に類似の膜を緩衝化生理
食塩水に対して4℃で1〜2週間、毎日少なくとも500分の1の緩衝液を交換
して徹底的に透析した。
さまざまな割合でプロテオソームを伴う処方の分解flu抗原の含量を正確に測
定するためにハロ免疫拡散(halo immunodiffusion)技術
を用いた。この方法は、確定的なバイアルに入れた物質に関する血球凝集素含量
に基づく分解flu産物についての伝統的な有効性アッセイである。試薬を国立
生物学的製剤研究所(NIBSC)、Hertfordshire, United Kingdom から得た
。参考文献:Hudson, L. and Hay, F.C., Practical Immunology, ed. Blackwel
l Scientific Publication : Third Edition, ; pages 230-233。
的な処方の前に所望の割合でそれらを組合わせ、そして充填することにより製造
しうる。多価製剤を、個々の抗体を所望の割合で合わせ、そしてフロー図3に概
説のとおりプロテオソームと混合物を形成させることにより処方することもでき
る。ワクチンを0.8μmのポア・サイズの薄膜フィルターに通し、そして免疫
前及びその間4℃で保存した。
をそれぞれ分解インフルエンザ抗原としてA/Taiwan/1/86又はA/
Beijing/262/95、あるいはバキュロウイルス組換え体としてA/
Texas/36/91を0.3〜10μg HAで含む、単独又は1:4、1
:1、2:1、4:1、及び8:1(wt/wt)の複合体開始値でのプロテオソー
ム:HA比でプロテオソームと処方される(プロテオソーム−fluワクチン又
はプロテオソームrHA)、25又は100μlの量の抗原により1及び21日
目に鼻腔内又は筋中に免疫した。いくつかの実施例において、対照マウスをリン
酸緩衝生理食塩水又は0.04LD50のマウス馴化生インフルエンザA/Tai
wan/12/86のいずれかにより1日目に単回の鼻腔内免疫で与えた。動物
を20日目及び35日目に眼窩血脈洞(orbital sinus vein
)からか又は心臓穿刺により放血させた。鼻及び肺の洗浄サンプルを35日目に
採取した。各マウスの肺を外科的に露出させ、そしてカニューレを気管に挿入し
た。0.1%ウシ血清アルブミン及びプロテアーゼ阻害剤(0.2mM AEBS
F、1μg/mlアプロチニン、3.25μMベスタチン、及び10μMロイペプ
チン)を加えたリン酸緩衝生理食塩水を含んだシリンジを用いて、1の鼻洗浄サ
ンプル(約1ml)及び2の肺洗浄サンプル(2×1ml)を回収した。前記肺洗浄
液を合わせ、そして個々の動物からの洗浄液をボルテックスにかけ、そして細胞
の破片を除くために遠心分離し、そして上清をELISAによる分析まで−70
℃で保存した。
6℃で加温する。非特異的な凝集の排除をレセプター破壊酵素(RDE)により
マウス血清を処理することで達成した。0.1mlの血清に0.4mlのRDE(1
00unit/ml)を加え37℃で12〜18時間処理した。前記RDEの不活化の
ために300mlのクエン酸ナトリウム(2.5%)を加え56℃で30分間処理
した。前記サンプルの容量をPBSにより1mlにした(1:10の最終的なサン
プル希釈倍率を得た)。2倍の連続希釈の各サンプルを標準的なHAIアッセイ
によりA/Taiwan/1/86ウイルスによる0.5%ニワトリ赤血球細胞
の凝集の阻害に対するそれらの活性について試験した。
洗浄液及び肺洗浄液の開始希釈倍率を1/4とし、そして血清の開始希釈倍率を
1/100とした。完全体のウイルスを検出抗原として用いてELISAを実施
した。簡単に言うと、96ウェル平底マイクロタイター・プレート(Immul
on2、Dynatech、Chantilly、Virginia)を抗原に
よりコートし、そして一晩インキュベートした。プレート洗浄装置を用いてその
抗原を吸引した後、プレートをTween含有PBS(PBS−T)により1度
洗浄し、そして2%粉ミルクを加えたPBS−Tを含むブロッキング溶液と一緒
にインキュベートした。ブロッキング溶液を吸引し、そしてPBS−Tにより洗
浄した後、ブロッキング溶液により連続的に2倍希釈された血清、肺又は鼻腔洗
浄液のサンプルを加え、そしてそのプレートを37℃で2時間インキュベートし
た。PBS−Tによる洗浄の後、アフィニティー精製したホースラディッシュ・
ペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗マウスIgG又はIgAを加え、そして
そのプレートを37℃で30分間インキュベートした。吸引し、そしてPBS−
Tによる2度の洗浄の後、現像溶液を加え、そしてマイクロタイターELISA
プレート・リーダー(Molecular Devices、Menlo Pa
rk、California)を用いた吸光度の値の測定に先立ち室温で15分
間インキュベートした。前記ELISAプレート・リーダーにより吸光度を特定
の時間で測定した。図中の抗体力価を、アフィニティー精製マウスIgG及びI
gA標準(Sigma)を用いたELISA捕捉アッセイを用いて作製した標準
曲線から確定した特異的IgG又はIgAのng/mlとして示す。
(CPE)の直接的な観察により測定した。このアッセイを96ウェル・プレー
トにより実施した。各サンプルを8重で供した。試験サンプル(血清又は肺洗浄
液)の連続希釈物を100 TCID50の、ワクチン株と相同なインフルエンザ
・ウイルスと一緒に室温で90分間インキュベートし、そして2.4×105 M
DCK細胞/ウェルを加えた。プレートをアッセイの残りの期間、32℃/5%
CO2 でインキュベートした。ウイルスの中和を、倒立顕微鏡を用いたCPE
の評価によりウイルス増殖期(5〜7日間のインキュベーション)の間、測定し
た。中和力価をKaerberの公式(TCID50=Δ−δ(S−0.5))に
より確定した、ここで「Δ」は100%陽性な培養となる希釈倍率のlog10であ
り、「δ」は希釈係数のlog10であり、そして「S」は100%感染した培養と
なる希釈倍率でそれらを含む希釈物当たりの陽性培養の合計である。
(図1及び2)又は精製バキュロウイルス組換えHA(A/Texas/36/
91)(表1)に対して製造された単価ワクチンによる経鼻免疫の結果としてプ
ロテオソーム−fluワクチンにより誘導される血清及び粘膜抗体応答を示す。
同様の結果を測定可能なダイアフィルトレーション法により製造したプロテオソ
ーム−fluワクチンを用いて得た(実施例12以降を参照のこと)。
のIgG、並びに肺及び鼻腔洗浄液中のIgA抗体をELISAにより分析し;
そして血清中のIgG、並びに肺洗浄液中のIgA及びIgGをウイルス中和活
性について試験した。前記応答を、生理食塩水で免疫した動物及びプロテオソー
ムなしに単独でデリバリーされたインフルエンザ分解産物により免疫された動物
からのサンプル、あるいはプロテオソーム及び無関係の抗原(HBs Ag)を
含む対照ワクチンにより免疫された動物によるサンプルのコレクションと比較し
た。結果を図1〜2、及び表1に示し、そしてまとめた。簡単に言うと:プロテ
オソーム対HAの最適な割合での経鼻プロテオソーム−flu及びプロテオソー
ムrHAワクチン、すなわち最適の免疫応答が、4:1〜8:1のプロテオソー
ム:HA配合割合の時に得られた。
施例4に記載のとおり経鼻プロテオソーム−flu(A/Taiwan/12/
86)ワクチンにより処理した)ワクチン免疫した動物の群及び対照動物に36
日目に特定の4LD50の生マウス馴化インフルエンザを接種した。マウスの保護
を、接種後14日間にわたる動物の体重変化の観察により評価した。開始体重か
らの30%以上の減少したマウス及び臨床的病的な状態の深刻な徴候を示したマ
ウスを屠殺した。プロテオソーム−fluワクチンにより誘発された保護を示す
データを図3に示し、そしてまとめた。
に対する完璧な保護を4:1〜8:1のPr:HA比で製造された経鼻プロテオ
ソーム−fluワクチンについて示した一方で、プロテオソームなしのHAは実
験の間に有意な体重減少を示した。さらに、誘導された保護は、注射により単独
で与えられた分解fluワクチンにより誘導されたのと同じであった。たとえそ
の製剤が最適下の血清及び粘膜免疫応答を誘導するとしてもより低いPr:HA
比(例えば1:1)において処方されたワクチンについて得られうる保護は、最
適下の開始配合比で製造された製剤の間で有効に変化することに対して上記動物
保護モデルが効率的に変化できないために存在する。
胞応答のタイプの代替マーカーである。Th1(IgG1/IgG2比<1)は
(血清抗体に加えて)強い細胞性免疫応答の誘導に関連し;一方Th2(IgG
/IgG2比>1)は強い体液性免疫応答の誘導を予測させる。プロテオソーム
−fluワクチン又は1価の分解インフルエンザ・ワクチン若しくは組換えバキ
ュロウイルス誘導HAのいずれかを用いた単独のflu抗原により経鼻又は筋中
免疫に伴う血清中のマウスIgGサブタイプであるIgG1及びIgG2のレベ
ルを、ELISAアッセイ・キット(SBA Clonotyping Sys
tem/HRP,Southern Biotech Assoc.)を用いて
測定した。
flu抗原に対する経鼻及び注射されたワクチンの両者に関してIgG1/Ig
G2比を14〜20(Flu抗原単独について)から1〜2の範囲まで下げる変
化をさせ;そしてバキュロHA抗原に関して6〜60から1.7まで下げる変化
をさせた。Th2からTh1応答への免疫性のこの変化は、不活化精製インフル
エンザ・ウイルスにより免疫された動物からの脾臓細胞の再刺激に伴い産生され
たサイトカインの計測により組換えHA抗原に関して確認された。簡単に言うと
、Balb/cマウスを2次免疫の14日後安楽死させ、そして各群からの5の
マウスから脾臓を採取し、そして細胞を100μmナイロン細胞ろ過器(Becton
Dickinson NJ )を用いて単細胞懸濁液の状態にそいだ。脾臓細胞を、8%ウシ
胎児血漿(56℃で1時間加熱し不活化;Gibco BRL)、2mMグルタミン(Gibco
BRL)、50μM 2−メルカプトエタノール(Sigma Chemical Co., St-Louis
, MO)及び50μg/mlゲンタマイシン(Gibco BRL)含有RPMI1640培地
(Gibco BRL, Life technologies, Burlington, ON)中、2.0×106 細胞/
ml(200μl/ウェル)で、UV不活化X−113(A/Texas/36/
94(H1N1)及びX−31(H3N2)再集合体);インフルエンザ・ウイ
ルス(NIBSC, Hertfordshire, UK)を伴うか又はそれなしに96ウェル細胞培養
クラスター(Corning, NY )中で培養した。細胞を37℃で72時間インキュベ
ートし、そして上清を採取し、そして−80℃で冷凍した。マウスのサイトカイ
ン・レベルをPharmingen (San Diego, CA )から購入したサンドイッチELIS
As(Opt EIAセット)を用いて製造業者の指示に従って計測した。組換
えサイトカインを標準物質として用いた。
た:**INFγ及びIL−5を全不活化ウイルス(IL−5用に1.25μg/
mL、INFγ用に0.625μg/mL)で、実施例11に記載のとおり再刺激し
たマウス脾臓細胞の上清について測定し、そしてpg/ml培養上清で表した。結果
は3の培養の平均である。
ンであるIL−5を伴わずTh1サイトカインであるインターフェロン・ガンマ
を誘導し;一方で経鼻又は筋中経路のいずれかにより投与された組換え抗原はI
L−5とインターフェロン・ガンマの両方を誘導した。これらのデータは、経鼻
プロテオソームHAワクチンが免疫の他の武器、例えば細胞傷害性T細胞の惹起
を助けるサイトカイン環境を作り上げていることを示唆する。CTLが感染細胞
からのウイルスの排除によるウイルス感染からの回復、及び変異型インフルエン
ザ株に対する交差保護に関して重要であることから、これは有益である。
ルスのA/Beijing/26/95(H1N1)、A/Sydney/05
/97(H3N2)、及びB/Yamanashi/166/98サブタイプか
らの界面活性剤分解抗原を用いて実施例3に概説した手順を用いて製造した。各
菌株個別に、及び3価となるようにそれらを組合せて作製したプロテオソーム−
fluワクチンについて図5A〜Fに示されるとおり、それらの無プロテオソー
ム複合体対照に比べ菌株特異的な血清IgG(図5A、C、及びE)並びに経鼻
IgA(図5B,D、及びE)応答を増強する。1価及び3価のプロテオソーム
−fluワクチンにより誘導されたイムノグロブリン力価は有意に異なることは
なかった。したがって、多価のインフルエンザ抗原を含むワクチンは各成分に対
して個々の1価のワクチンにより誘導されるのと等価の血清及び粘膜免疫応答を
誘発する。
して続けて組合せた抗原プールをプロテオソームと複合体を形成させて多価のプ
ロテオソーム−fluワクチンを作り出すことにより製造することもできる。前
述のワクチンに好適な粒子サイズの均一性及び一貫性の証明を以下の実施例14
に示す。前述のワクチンの有効性の証明をインフルエンザ・ワクチンについての
標準的な有効性試験、すなわち実施例3に記載のSRID試験を用いて見出した
。SRID試験の使用により、ろ過していないサンプル、並びに0.8μm又は
0.2μmフィルターを用いてろ過したサンプルの両者において、8:1、4:
1又は2:1のいずれかのプロテオソーム:HA比で作製された多価ワクチンに
使用された3の菌株のそれぞれに対して有効なHAの十分な保持率を認めた。例
えばそれぞれ3の異なるプロテオソーム:HA比(8:1、4:1、及び2:1
)で0.8μmフィルターの使用により、80%〜86%のHA平均保持率を3
の3価ワクチンにおいて3のインフルエンザ菌株、H1N1、H3N2、及びB
から認めた。これらのデータは、多価ワクチンがこの方法を用いて作製されうる
ことを示している。
いて実施した。被験者(群当たり8〜13人)の群は、14日おきに、GMPグ
レードのプロテオソーム−A/Beijing/262/95ワクチン又はA/
Beijing/262/95抗原単体として7.5、15又は30μgHAの
いずれかの2回の経鼻服用を受けた。HAI GMTを実施例5に記載のとおり
測定した。ヒト鼻腔洗浄液標本中の着目の抗原に対して特異的な分泌型IgAを
下記のとおり計測した。鼻腔洗浄液標本を激しく混合し、そして次に50kDの分
画分子量の膜を用いた遠心濃縮器により4〜5倍濃縮した。総分泌型抗体(圧倒
的に二量体分泌型IgA、つまりsIgA)を、精製ヒトsIgA標準物質を用
いたヒト分泌型要素に対する抗体を含むアガロースによる一元放射免疫拡散法に
より計測した。抗原特異的sIgAを動的酵素結合免疫測定法(KELISA)
により検出した。マイクロタイター・プレートを規定の濃度の抗原によりコード
した。前記プレートの洗浄後、各濃縮鼻腔洗浄液サンプルを(典型的な標本の>
95%に関して前記アッセイのダイナミック・レンジ内にシグナルを生じるため
の予備実験により選ばれた)1の希釈倍率での3のウェル中に加えた。インキュ
ベーションの後、そのプレートを洗浄し、そして結合したsIgAをビオチン化
ヤギ抗ヒト分泌型要素と、そしてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合
したアビジンと一緒に連続的にインキュベートすることで検出した。最後の洗浄
に続いて、TMB基質を加え、そして9秒ごとに5分間650nmで吸光度を計測
した。過剰な検出試薬の存在下、抗原に結合したsIgAの濃度にちょうど比例
する着色の速度( mOD/分)を計算した。各標本についての結果を以下の式: 標準化KELISA速度=(標本KELISA速度×150)÷ 標本の総sIgA濃度 により150μg/mLの標準sIgA濃度に標準化する。
特異的sIgAの量に比例する線形(例えば力価のように動的でない)の読みを
提供した。
許容した。表4及び図6AはGMT血清HAI力価の結果を示し、そして図6B
は42日目、及び0〜42日目それぞれの鼻腔洗浄液中分泌型IgAの計測を示
す。簡単に言うと、この全く血清反応陰性の人々でさえ、被験者の約50%はG
MT血清HAIが上昇し、そして大部分が保護に関連する≧40の免疫力価を示
した(表4)。さらに図6Aの血清HAI免疫応答の時間的経過により示される
とおり、2次服用を投与する前の14日目において3の用量レベルのそれぞれに
より免疫された被験者から得た血清中に強い応答を認め、ワクチンの1回服用が
大部分の個人で十分でありうることを示した。
(7.5μg)用量のワクチンを受けていた人の75%を含む全被験者の85%
超において粘膜sIgA(≧2.9倍)の有意な上昇を誘導した(図6B)。こ
れらのデータは、ヒトにおいて保護的な免疫応答を誘導する前記発明の可能性を
証明する。これらの応答は、経鼻免疫に伴い粘膜応答は誘導したが血清応答に乏
しかったこの年齢層におけるCAVインフルエンザ・ワクチンに関して得られた
それを上回る。
は、低く、そしてここでプロテオソーム赤痢菌LPSワクチンによる経鼻免疫に
伴う有意な全身性及び粘膜応答のために67〜100倍高い用量の抗原を必要と
する従来の結果からは予測できないであろう(要約又は刊行物に投稿された原稿
を参照のこと)。
溶であり;水溶性抗原との複合体形成がプロテオソームを溶解化する。サンプル
の遠心分離により不溶画分を可溶画分から分離し、そして各成分の正体をSDS
−PAGEにより決定する。可溶抗原を伴う上清中のプロテオソーム・タンパク
質の存在は、界面活性剤(detergent or surfactant)
の不存在下、抗原により複合体形成していない時、プロテオソーム・タンパク質
は溶解性でないため抗原との複合体形成の証明となる。抗原−プロテオソーム複
合体の凝集状態を決定するために、複合体サンプルを遠心分離により沈降させ存
在しうる粒子を沈殿させたペレットとした。その上清を他の容器に移し、そして
そのペレットをTNSバッファーにより洗浄する。次に前記上清とペレットの両
方を基準として同じゲル上に泳動した非複合体形成抗原を伴うSDS−PAGE
により分析した。そのゲルをクーマシー・ブルー染色法により染色し、写真撮影
し、そして感度を増すために銀染色法により染色した。
分子量マーカーは:OMP001基準ゲージ:GMPプロテオソームの混合物ロ
ット:0175、0566、0621、0621である。
rd 1:4〜8:1の範囲をとるPr:HA比を含む複合体を有するプロテオソー
ム−fluワクチンを作製した。ワクチンを、免疫原性及び前記のとおり遠心分
離されたサンプル上清中のプロテオソーム・タンパク質の存在により示される複
合体形成の生化学的証明に関して試験した。プロテオソーム・タンパク質の特徴
的なバンドがHAインフルエンザ抗原を伴って上清中にSDS−PAGEゲルに
より認められたため、そのデータはプロテオソームとHA flu抗原の複合体
形成の証拠を示す。前記上清中のプロテオソームの存在は、複合体を形成しない
とプロテオソームが水性基質中で不溶であるため複合体形成の証明となる。驚い
たことに、高いプロテオソーム対HA比、例えば4:1(特に)又は8:1を含
む好ましい態様を使用した時、上清中にそれに比例したさらなるプロテオソーム
を確認した一方で、低い比を使用した時、減少したプロテオソームを確認した。
明らかに、高いPr:HA比(例えば4:1)での製剤は高い複合体形成を可能
にし、そして低い比ではインフルエンザ・抗原との効果的な複合体形成を可能に
する用量限度量のプロテオソームを含まなかった。
ookhaven Instruments model 90 plus粒子サイズ分析装置により計測した。図8
に示されるとおり、1超:1のPr:HA比をもつ1価及び3価のプロテオソー
ム−fluワクチンは、プロテオソームを伴わない分解flu HA対照ワクチ
ンのそれよりも明らかに大きな粒子サイズ分布を含んだ。各ワクチン製剤が入る
サイズの範囲は狭く、そしてそのワクチン製剤のパラメーターに特徴的であった
ことに留意のこと。有効平均サイズは、プロテオソーム:HAに依存した、これ
らの平均値を囲む典型的なベル形曲線の粒子サイズ分布をもつ約150〜1,0
00nmの範囲をとり、そして固有の抗原、並びに剤パラメーター、例えば使用し
た界面活性剤のタイプ又はろ過フィルターのサイズに特徴的である。
た。抗HAモノクローナル抗体及びプロテインA−金により標識した場合の4:
1 Pr:HAワクチン複合体の透過電子顕微鏡(TEM)像は、大部分のHA
が複合体ワクチンの粒子又は粒子凝集体の小胞構造に結合されている。いくつか
の標識跡は粒子に結合されていない。
金と一緒にインキュベートした4:1 Pr−HA複合体の走査電子顕微鏡(S
EM)像は、小胞の三次元構造の証拠を示す。金粒子の見かけの明るさは、小胞
の裏の方が不鮮明に、そして小胞の表よりも弱く見え、小胞−金粒子内のそれら
の位置に依存する。
。
より誘導された免疫応答の変化を示すグラフである。
る応答をグラフで示したものである。
腔洗浄液中のIgAシグナルそれぞれを示すグラフである。
Claims (34)
- 【請求項1】 ウイルス感染症に対して有効なワクチンの製造方法であって
、以下の: 界面活性剤の存在下、少なくとも1のウイルス・タンパク質抗原とプロテオソ
ーム製剤との混合物を用意し; 界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除
去してプロテオソーム−抗原組成物を得;そして 上記組成物をワクチンに配合する、 ことを含む上記方法。 - 【請求項2】 前記少なくとも1のウイルス抗原がインフルエンザ・ウイル
ス由来の抗原である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記少なくとも1のインフルエンザ抗原が血球凝集素(HA
)である、請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記混合物中のプロテオソーム対ウイルス抗原比が1超:1
である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 前記比が少なくとも4:1である、請求項4に記載の方法。
- 【請求項6】 2以上のウイルス抗原を含む、請求項1に記載の方法。
- 【請求項7】 感染症に対して有効なワクチンの製造方法であり、以下の: 界面活性剤の存在下、少なくとも1のタンパク質抗原とプロテオソーム製剤と
の混合物を用意し; 界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除
去してプロテオソーム−抗原組成物を得;そして 上記組成物をワクチンに配合し、 ここで、上記混合物中のプロテオソーム対ウイルス抗原の比が1超:1である
、 ことを含む上記方法。 - 【請求項8】 前記比が少なくとも4:1である、請求項7に記載の方法。
- 【請求項9】 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法により製造された
ワクチン。 - 【請求項10】 界面活性剤の実質的な不存在下、プロテオソームを配合さ
れて少なくとも1のインフルエンザ血球凝集素(HA)を含むインフルエンザ・
ワクチン。 - 【請求項11】 前記HAとプロテオソームが、光散乱により計測されると
き150〜1,000nMの範囲のメジアン径をもつ粒子の形態である、請求項1
0に記載のワクチン。 - 【請求項12】 プロテオソーム対インフルエンザHA比が1超:1である
、請求項10に記載のワクチン。 - 【請求項13】 前記比が少なくとも4:1である、請求項12に記載のワ
クチン。 - 【請求項14】 ウイルス感染症に対して有効な多価ワクチンの製造方法で
あって以下の: 界面活性剤の存在下、少なくとも2のウイルス・タンパク質抗原とプロテオソ
ーム製剤との混合物を用意し; 界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除
去してプロテオソーム−多価抗原組成物を得;そして 上記組成物をワクチンに配合する、 ことを含む上記方法。 - 【請求項15】 前記ウイルス抗原がインフルエンザ・ウイルス由来である
、請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】 前記インフルエンザ抗原が血球凝集素(HA)である、請
求項15に記載の方法。 - 【請求項17】 前記混合物中のプロテオソーム対ウイルス抗原比が1超:
1である、請求項14に記載の方法。 - 【請求項18】 前記比が少なくとも4:1である、請求項17に記載の方
法。 - 【請求項19】 感染症に対して有効な多価ワクチンの製造方法であって、
以下の: 界面活性剤の存在下、少なくとも2のウイルス・タンパク質抗原とプロテオソ
ーム製剤との混合物を用意し; 界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除
去してプロテオソーム−多価抗原組成物を得;そして 上記組成物をワクチンに配合し、 ここで上記混合物におけるプロテオソーム対ウイルス抗原比が1超:1である
、 ことを含む上記方法。 - 【請求項20】 前記比が少なくとも4:1である、請求項19に記載の方
法。 - 【請求項21】 ウイルス感染症に対して有効なワクチンの製造方法であり
、請求項1に記載のとおり製造した、少なくとも1のウイルス・タンパク質抗原
をそれぞれ含む少なくとも2の組成物を混合し、そして上記組成物をワクチンに
処方することを含む上記方法。 - 【請求項22】 感染症に対して有効な多価ワクチンの製造方法であり、以
下の: 請求項1に記載のとおり製造した、少なくとも1のタンパク質抗原をそれぞれ
含む組成物を混合し、そして 上記混合物をワクチンに処方し、 ここで上記混合物においてプロテオソーム対ウイルス抗原の比が1超:1であ
る、 ことを含む上記方法。 - 【請求項23】 対象におけるインフルエンザに対する免疫応答の誘発方法
であり、上記応答の誘発に有効な一定量の請求項10に記載のワクチンの上記対
象への投与を含む上記方法。 - 【請求項24】 前記対象がヒトである、請求項23に記載の方法。
- 【請求項25】 前記投与が経鼻経路による、請求項23に記載の方法。
- 【請求項26】 前記投与が非経口経路による、請求項25に記載の方法。
- 【請求項27】 前記投与が筋中注射による、請求項26に記載の方法。
- 【請求項28】 その改良がエタノール存在下での沈殿、それに引き続く0
.1〜1%界面活性剤溶液による抽出を含む1以上のステップの実施を含む改良
されたプロテオソーム製造方法。 - 【請求項29】 硫酸アンモニウムによる沈殿を省くことを含む改良された
プロテオソーム製造方法。 - 【請求項30】 前記界面活性剤が2以上の界面活性剤を含む、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項31】 配合又は充填の前に0.8μフィルターによりろ過される
、請求項1に記載のとおり製造した組成物。 - 【請求項32】 配合又は充填の前に0.8μフィルターによりろ過される
、請求項7に記載のとおり製造した組成物。 - 【請求項33】 配合又は充填の前に0.8μフィルターによりろ過される
、請求項14に記載のとおり製造した組成物。 - 【請求項34】 配合又は充填の前に0.8μフィルターによりろ過される
、請求項19に記載のとおり製造した組成物。
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