JP2007051157A - プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチン - Google Patents
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Abstract
【課題】粘膜アジュバントとして働くプロテオソームを含む改良された形態のワクチン及びその製造法の提供。
【解決手段】界面活性剤の存在下、少なくとも1の感染性蛋白質抗原とプロテオソーム製剤を2:1乃至2超:1の重量比で混合し、界面活性剤をダイアフィルトレーション又は限外濾過により除去して得られるプロテオソーム−抗原組成物をワクチンに配合する製造方法。当該製造方法により製造されたワクチン。好ましくは、インフルエンザHAを含むインフルエンザ・ワクチンが例示される。
【選択図】なし
【解決手段】界面活性剤の存在下、少なくとも1の感染性蛋白質抗原とプロテオソーム製剤を2:1乃至2超:1の重量比で混合し、界面活性剤をダイアフィルトレーション又は限外濾過により除去して得られるプロテオソーム−抗原組成物をワクチンに配合する製造方法。当該製造方法により製造されたワクチン。好ましくは、インフルエンザHAを含むインフルエンザ・ワクチンが例示される。
【選択図】なし
Description
本出願は、2000年2月15日出願の米国特許出願番号第60/182,476号の優先権を主張し、その内容を本明細書中に援用する。
本発明の分野
本発明は、ワクチン製造の分野にある。タンパク質に基づくワクチンに一般的に応用できる、新しい、そしてインフルエンザに対するワクチンの製造についての改良された技術を説明する。
本発明は、ワクチン製造の分野にある。タンパク質に基づくワクチンに一般的に応用できる、新しい、そしてインフルエンザに対するワクチンの製造についての改良された技術を説明する。
本発明の背景
インフルエンザの発生
ワクチンは、インフルエンザに関連した高い疾病率及び死亡率の減少、並びに甚大な社会的、及び経済的影響の減少の最も有効な方法である。界面活性剤含有分解インフルエンザ・ワクチンが可能ではあるが、特に危険性の高いグループ、例えば幼児及び高齢者においてワクチン接種承諾のレベルが低い。例えば、65歳超に当たる人々の半分未満しか実際にワクチンを受けていないと推測されている。さらに、健常成人における免疫増強に70〜90%有効であるにもかかわらず、現在の注射可能なインフルエンザ・ワクチンは幼児及び老人の人々において単回投与のときに乏しい免疫原性である。高齢者の間で20〜25%まで低い血清変換率が報告された。高齢者におけるこの低下した応答は、この年齢層における細胞傷害性Tリンパ球活性を含めた1型T細胞応答の衰えによると考えられている。減少した承諾と乏しい免疫原性の組合せが、依然として一般の人々の多くがインフルエンザに起因する感染症及び合併症の高い危険性であることを裏付ける。それらをアジュバントと一緒に同時投与することにより注射可能なインフルエンザ・サブユニット・ワクチンの免疫原性を高めるための多くの試みは、ヒトによる動物モデルにおいて見られた、免疫が後に続く局所反応誘発性の受容できない速度及び強い免疫賦活効果を再現できないことのために検証に失敗した。
インフルエンザの発生
ワクチンは、インフルエンザに関連した高い疾病率及び死亡率の減少、並びに甚大な社会的、及び経済的影響の減少の最も有効な方法である。界面活性剤含有分解インフルエンザ・ワクチンが可能ではあるが、特に危険性の高いグループ、例えば幼児及び高齢者においてワクチン接種承諾のレベルが低い。例えば、65歳超に当たる人々の半分未満しか実際にワクチンを受けていないと推測されている。さらに、健常成人における免疫増強に70〜90%有効であるにもかかわらず、現在の注射可能なインフルエンザ・ワクチンは幼児及び老人の人々において単回投与のときに乏しい免疫原性である。高齢者の間で20〜25%まで低い血清変換率が報告された。高齢者におけるこの低下した応答は、この年齢層における細胞傷害性Tリンパ球活性を含めた1型T細胞応答の衰えによると考えられている。減少した承諾と乏しい免疫原性の組合せが、依然として一般の人々の多くがインフルエンザに起因する感染症及び合併症の高い危険性であることを裏付ける。それらをアジュバントと一緒に同時投与することにより注射可能なインフルエンザ・サブユニット・ワクチンの免疫原性を高めるための多くの試みは、ヒトによる動物モデルにおいて見られた、免疫が後に続く局所反応誘発性の受容できない速度及び強い免疫賦活効果を再現できないことのために検証に失敗した。
経鼻ワクチンの利点
インフルエンザ感染は上気道及び下気道に限られるため、経鼻デリバリーされるインフルエンザ・ワクチンは、人々の全ての年齢層で免疫承諾を高めるであろうワクチン接種に対するより緩やかな方法を与える。さらに、注射可能なインフルエンザ・ワクチンが粘膜型IgA誘導で役に立たない一方で、上気道における局所分泌型IgAの産生はインフルエンザ感染を保護しうるため経鼻経路による免疫は、筋中注射に比べてより有効であろう。インフルエンザ特異的分泌型IgAは、ウイルスの変異株について広い交差反応性を示すので、インフルエンザ・ウイルス変異体からのより有効な保護を提供する。特に経鼻インフルエンザ・ワクチンは、高齢者により有効であろう、なぜなら全身性免疫系と異なり粘膜型免疫応答は年齢と共に低下しないからである。全身性免疫応答をも刺激する経鼻インフルエンザ・ワクチンは、血清からの抗体の滲出により下気道(肺)を保護する。加えて、鼻に関連したリンパ組織におけるインフルエンザ特異的細胞傷害性T細胞(CTL)が、感染からの回復に貢献しうる。
インフルエンザ感染は上気道及び下気道に限られるため、経鼻デリバリーされるインフルエンザ・ワクチンは、人々の全ての年齢層で免疫承諾を高めるであろうワクチン接種に対するより緩やかな方法を与える。さらに、注射可能なインフルエンザ・ワクチンが粘膜型IgA誘導で役に立たない一方で、上気道における局所分泌型IgAの産生はインフルエンザ感染を保護しうるため経鼻経路による免疫は、筋中注射に比べてより有効であろう。インフルエンザ特異的分泌型IgAは、ウイルスの変異株について広い交差反応性を示すので、インフルエンザ・ウイルス変異体からのより有効な保護を提供する。特に経鼻インフルエンザ・ワクチンは、高齢者により有効であろう、なぜなら全身性免疫系と異なり粘膜型免疫応答は年齢と共に低下しないからである。全身性免疫応答をも刺激する経鼻インフルエンザ・ワクチンは、血清からの抗体の滲出により下気道(肺)を保護する。加えて、鼻に関連したリンパ組織におけるインフルエンザ特異的細胞傷害性T細胞(CTL)が、感染からの回復に貢献しうる。
低温馴化弱毒生(CAV)インフルエンザ・ワクチンは、伝統的にヒトにおいて鼻を介して使用されてきた。これらのインフルエンザ株は、それにより鼻咽気道において最小限複製させた低温(25℃)での生育に馴化したインフルエンザ・ドナー・ウイルスからの他の内部及び構造タンパク質をコードする6の遺伝子をもつfluウイルスの流行の株のHA及びNA遺伝子を組合わせる遺伝子再集合体である。これらのワクチンは、インフルエンザによる自然の感染症により誘導される、鼻腔洗浄液中の分泌型IgAの増加、再刺激PMNC’sによるインターフェロン・ガンマ産生、及び同じサブタイプのウイルスに対して交差反応を広げる内部ウイルス・タンパク質に特異的なCTLの活性化を含めたものに類似した保護免疫応答の誘導に利点をもつ。CAVインフルエンザ・ワクチンは商品化寸前であり、そして子供及び健常成人において十分に許容的で、そして免疫原性であることが証明されている。健常な子供における最近の研究において、1又は2回服用のCAV fluワクチンは、注射可能な分解fluワクチンと等量の全身性抗体を誘導することが示された。血清反応陰性の子供において>80%保護を誘導するためのCAVの単回服用の能力は、この年齢層における同様の保護を達成するために2度の免疫を必要とする注射可能な分解ワクチンより有利である。健常成人及び高齢者において既存の循環抗原がこれらの年齢層における有効な血清変換を防げる(以下を参照のこと)のに反して、CAV’sは、プラシーボに比べ熱性疾患の数、欠勤日数、及び医療サービス提供者への訪問の有意な減少を証明した。高齢者において、注射可能な分解サブユニットワクチンとの組合わせたCAV’sはプラシーボに比べて研究室レベルで記録されたインフルエンザが有意に減少した。
インフルエンザに対する前記CAVワクチンの利益にもかかわらずいくつかの不利益を有する:以前にインフルエンザ・ウイルスに哂された健常成人及び高齢者はCAVワクチンにわずかにしか反応せず、そしてしばしば保護に関連する血清の血球凝集阻害(HAI)のレベルに達しない。これは特に最も高い危険性のグループ、及び現在全体的なワクチン接種が勧められる唯一のグループの中の高齢者に顕著である。加えて、野生型株への逆戻り及び/又は循環株による組換えの可能性のある問題であるために、CAV’sは免疫抑制された人又は妊婦における使用に勧めない。20年のCAVインフルエンザ・ワクチンの臨床評価にもかかわらず、製造及び品質管理の問題から認可は遅れている。
CAVインフルエンザ・ワクチンに関する潜在的な安全性問題を回避するために、現在経鼻不活化「分解」インフルエンザ・ワクチン(ISIV)の開発の試みがある。不活化分解インフルエンザ・ワクチンは精製インフルエンザ血球凝集素(HA)を含む。単独で又はさまざまな粒子状デリバリー媒体、若しくはエンテロトキシンに基づくアジュバントと共に与えられる不活化分解インフルエンザ・ワクチンは、動物及びヒトにおけるインフルエンザ特異的粘膜及び全身性免疫応答を誘導する。
ISIVの経鼻製剤
それらが注射可能な経路により与えられるのと等量の用量で、抗原を単独で含む経鼻ISIVは、動物及びヒトにおける制限実験において鼻IgAの有意に高いレベルの再現性のある誘導をする。しかしながら、より大量のHAでの2以上の服用の経鼻ISIVは、商業的に実行可能性を欠く前述のワクチンを作る注射可能なISIVと等量の血清HAIの誘導レベルが必要とされる。
それらが注射可能な経路により与えられるのと等量の用量で、抗原を単独で含む経鼻ISIVは、動物及びヒトにおける制限実験において鼻IgAの有意に高いレベルの再現性のある誘導をする。しかしながら、より大量のHAでの2以上の服用の経鼻ISIVは、商業的に実行可能性を欠く前述のワクチンを作る注射可能なISIVと等量の血清HAIの誘導レベルが必要とされる。
エンテロトキシンの添加
誘導されたインフルエンザ特異的粘膜及び血清免疫応答は、マウスにおいてエンテロトキシン、例えばコレラ毒素Bサブユニット(CTB)、Tamura, et al., J. Immunol. (1992) 149 : 981-988(これらの研究ではCTBの組換え起源を使用しないため、CTBと呼ばれるものでさえかなりの量の活性コレラ毒素を含んだ)、及びE.コリ(E.coli)からの組換え熱不安定性毒素(rLT)、Barchfield, et al., Vaccine (1999) 17 : 695-704 を伴う経鼻的なISIV投与により達成されうる。
誘導されたインフルエンザ特異的粘膜及び血清免疫応答は、マウスにおいてエンテロトキシン、例えばコレラ毒素Bサブユニット(CTB)、Tamura, et al., J. Immunol. (1992) 149 : 981-988(これらの研究ではCTBの組換え起源を使用しないため、CTBと呼ばれるものでさえかなりの量の活性コレラ毒素を含んだ)、及びE.コリ(E.coli)からの組換え熱不安定性毒素(rLT)、Barchfield, et al., Vaccine (1999) 17 : 695-704 を伴う経鼻的なISIV投与により達成されうる。
マウスにおいて、これらのエンテロトキシンは、不活化分解インフルエンザ・ワクチンを含む対応の抗原に対する強化された粘膜IgA及び血清免疫応答の両方の誘導を可能にする強力な粘膜アジュバントである。rLTは、ヒトにおいてISIVに対する局所性及び全身性HA特異的反応の促進をも示した(Hashigucci, et al., Vaccine (1996) 14 : 113-119 )。しかしながら、ヒトにおける経鼻的エンテロトキシンに基づくアジュバントの評価は、経鼻投与後にエンテロトキシンがCNSの嗅球部に達し、そしてその組織において強い炎症反応を誘発したことを示す、マウスにおける前臨床毒性試験の結果のために米国FDAにより中止された。この裁定はこれらのアジュバントを伴うfluワクチン(McGhee, et al., J. Immunol. (2000) 165 : 4778-4782)の開発を著しく妨げ、そして当面の間ヒト・ワクチンにおけるこのタイプのアジュバントの使用をおそらく不可能にするであろう。
脂質ベースの配合
粒子状種、例えばビロソーム(virosome)(インフルエンザ抗原によるリポソーム製剤)は、不活化インフルエンザ抗原のための有効な経鼻デリバリー媒体として動物実験及びヒトにおいて研究されてきた。粒子状抗原は鼻の感作リンパ組織内の抗原提示細胞による取り込みを促進しうる。ビロソームは脂質を含む体球を伴ったインフルエンザ・ウイルス抗原を含むリポソームである。これらのワクチンは注射可能なものとして欧州において認可されている。マウスにおいて、経鼻ビロソームは、有意に高いレベルの粘膜分泌型IgAと一緒に等量の注射可能な分解抗原と同じレベルまで血清力価を誘導する。ビロソームはヒトにおいて経鼻免疫の直後に免疫原性であることを示したが、しかし2の治験において、2回服用により与えられる30μgの総HAによる経鼻免疫直後に注射可能なワクチンと等しい血清抗原の規定の力価を達成するために組換えLTが必須であることが証明された(Gluck, et al., J. Infect. Dis. (2000) 181 : 1129-1132 )。スイスにおいて現在は認可されたが、注射可能なfluワクチンと免疫原性当量を達成するための、潜在的に神経毒のrLTに関する要件は、北米を含む多くの地域においてワクチンを不可能にする。開発中の他の粒状デリバリー媒体は、脂質エンベロープに囲まれた炭水化物の内核を含むバイオベクター(Biovector)システムである。治験において、バイオベクターを伴う経鼻ISIVは、プラシーボに比べて高い血清HAI及び粘膜IgAを証明した。しかしながら、バイオベクターを伴うインフルエンザ抗原の試験した最も高いレベルの2回服用はHAI力価の増加を誘発し、そしてそれはこの技術による協力関係を廃止した主要なワクチン製造のパートナーによるこの製品の開発継続を正当化するために有意に十分ではなく、データ検討の結果、保護に関係する血清HAIレベルを達成するための免疫刺激物を有するバイオベクターの添加の必要性を示唆された。
粒子状種、例えばビロソーム(virosome)(インフルエンザ抗原によるリポソーム製剤)は、不活化インフルエンザ抗原のための有効な経鼻デリバリー媒体として動物実験及びヒトにおいて研究されてきた。粒子状抗原は鼻の感作リンパ組織内の抗原提示細胞による取り込みを促進しうる。ビロソームは脂質を含む体球を伴ったインフルエンザ・ウイルス抗原を含むリポソームである。これらのワクチンは注射可能なものとして欧州において認可されている。マウスにおいて、経鼻ビロソームは、有意に高いレベルの粘膜分泌型IgAと一緒に等量の注射可能な分解抗原と同じレベルまで血清力価を誘導する。ビロソームはヒトにおいて経鼻免疫の直後に免疫原性であることを示したが、しかし2の治験において、2回服用により与えられる30μgの総HAによる経鼻免疫直後に注射可能なワクチンと等しい血清抗原の規定の力価を達成するために組換えLTが必須であることが証明された(Gluck, et al., J. Infect. Dis. (2000) 181 : 1129-1132 )。スイスにおいて現在は認可されたが、注射可能なfluワクチンと免疫原性当量を達成するための、潜在的に神経毒のrLTに関する要件は、北米を含む多くの地域においてワクチンを不可能にする。開発中の他の粒状デリバリー媒体は、脂質エンベロープに囲まれた炭水化物の内核を含むバイオベクター(Biovector)システムである。治験において、バイオベクターを伴う経鼻ISIVは、プラシーボに比べて高い血清HAI及び粘膜IgAを証明した。しかしながら、バイオベクターを伴うインフルエンザ抗原の試験した最も高いレベルの2回服用はHAI力価の増加を誘発し、そしてそれはこの技術による協力関係を廃止した主要なワクチン製造のパートナーによるこの製品の開発継続を正当化するために有意に十分ではなく、データ検討の結果、保護に関係する血清HAIレベルを達成するための免疫刺激物を有するバイオベクターの添加の必要性を示唆された。
脂質に基づく乳剤MF59により処方されたISIVは、開発継続の正当化に十分な対象インフルエンザ物件から有意に異った反応を誘発しなかった。他の技術であるモノホスホリル・リピドA(MPLA)は、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)R595のリポポリサッカライドから分離した脂質のオイルに基づく又は水性製剤から成るリポポリサッカライド・アジュバントである。この技術も前臨床試験において中程度成功したマウスにおける経鼻インフルエンザ・ウイルスの作製に使用された。
プロテオソーム技術
「プロテオソーム」は髄膜炎菌(Meningococci)の外膜タンパク質の製剤及び他の細菌からの類似の製剤を説明するために使用される。
「プロテオソーム」は髄膜炎菌(Meningococci)の外膜タンパク質の製剤及び他の細菌からの類似の製剤を説明するために使用される。
Lowell, G.H., et al., J. Exp. Med. (1988) 167 : 658-663 ; Lowell, G.H., et al., Science (1988) 240 : 800-802 ; Lynch, E.C., et al., Biophys. J. (1984) 45 : 104-107 ; 1998年3月10日発行の米国特許第5,726,292号 ; 1987年11月17日発行の同第4,707,543号。
ワクチン処方のためのプロテオソームの使用は、Lowell, G.H., in“New Generation Vaccines”2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong (1997) pages 193-206、により参照され、この内容を本明細書中に援用する。プロテオソームはあるウイルスに匹敵するサイズであると説明され、疎水性であり、そしてヒトの使用に関して安全である。プロテオソームはさまざまなタンパク質及びペプチドによるワクチンの処方に有用であると言われる。前記の総説は、可溶性界面活性剤が徹底的な透析技術を用いて選択的に除去される時に形成される多種抗原とプロテオソームの間の非共有複合体を含む組成物の製剤を説明する。細菌性赤痢・ワクチンに関して、限外ろ過が良好であると報告されている。ワクチンは、ここでは抗原が赤痢菌(shigella)リポポリサッカライド、ブルセラ(Brucella)リポポリサッカライド、スタフィロコッカル(Staphylococcal)エンテロトキシンBトキソイド、ヒト免疫不全ウイルス・エンベロープ・タンパク質、E.コリ(E.coli)線毛接着性タンパク質、並びにさまざまなペプチド、例えばマウス及びインフルエンザ・ウイルス由来のペプチドである。これらの製剤は粘膜適用が意図される。非経口ワクチンをも処方する。特に、(抗原全体ではなく)インフルエンザ由来のペプチドをワクチン製造のために使用した。Levi, R., et al., Vaccine (1995) 13 : 1353-1359を参照のこと。インフルエンザ・ウイルス抗原のための粘膜アジュバントとして働く髄膜炎菌からの外膜小胞の補足的な説明は、Dalseg, R., et al., Vaccines (1998) 96 : 177-182に記載される。
良好なワクチンの処方のための多数の尽力にもかかわらず、個々の免疫、特にインフルエンザによる感染症に対する効率的な方法及び有効な組成物に関する必要性は残っている。
本発明の開示
本発明は、プロテオソーム−インフルエンザ・ウイルス組成物、及びそれらの製造方法を説明する。これらのワクチンは製造が簡単で、そしてインフルエンザ感染症を保護しうる。好ましい態様は不活化インフルエンザ抗原、好ましくはグラム陰性細菌、例えばナイセリア・メニンギチジス(Neisseria meningitides)の外膜タンパク質の精製により形成されるプロテオソームによる非共有的に形成されたHAを含む経鼻プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンである。インフルエンザに対するワクチンは本明細書中に例示したが、適用された方法は一般的にウイルス・タンパク質抗原を含むワクチン製造に有用である。
本発明は、プロテオソーム−インフルエンザ・ウイルス組成物、及びそれらの製造方法を説明する。これらのワクチンは製造が簡単で、そしてインフルエンザ感染症を保護しうる。好ましい態様は不活化インフルエンザ抗原、好ましくはグラム陰性細菌、例えばナイセリア・メニンギチジス(Neisseria meningitides)の外膜タンパク質の精製により形成されるプロテオソームによる非共有的に形成されたHAを含む経鼻プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンである。インフルエンザに対するワクチンは本明細書中に例示したが、適用された方法は一般的にウイルス・タンパク質抗原を含むワクチン製造に有用である。
したがって、1の側面において、本発明はワクチン組成物の製造方法に向けられ、上記方法は、界面活性剤の存在下、少なくとも1のウイルス・タンパク質抗原とプロテオソーム製剤の混合物を準備し、そしてその界面活性剤を上記混合物から限外ろ過により除去することを含む。好ましい態様において、前記混合物中のプロテオソーム対ウイルス抗原の比は1超:1、好ましくは2超:1、より好ましくは3超:1、そしてより好ましくは4超:1である。
他の側面において、本発明は前記の方法により製造されたワクチン、特に、凝集がウイルス抗原、好ましくはインフルエンザ血球凝集素とプロテオソームの間で形成されるワクチンに向けられる。好ましいサイズの範囲をも記載する。
本発明の詳細な説明
プロテオソームと複合体を形成したさまざまな病原生物からのペプチド及びリポポリサッカライド抗原は、さまざまな動物種において経鼻又は非経口免疫の結果高められた粘膜及び全身性免疫応答を誘導することを証明した。本発明は、インフルエンザ感染症の保護のために設計されたワクチンにより説明されるプロテオソーム−タンパク質に基づくワクチンの改良された製造方法、及び改良された組成物を本明細書中で説明する。注射可能なワクチンのそれと等量のHA、ここではHA−インフルエンザ抗原の用量で、説明されるプロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンは、プロテオソームが十分に低い血清反応を誘導することなしに、匹敵するか又は高められた血清ウイルス特異的免疫応答を誘導する。プロテオソーム−インフルエンザ・ワクチンは高いレベルの特異的な粘膜、鼻、及び肺IgAをも産生するが、これに反してインフルエンザ抗原単独の注射又は経鼻投与はわずかな又はとても低いレベルの呼吸粘膜IgAしか誘導しなかった。加えて、プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンは、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を主に2型応答からより平衡のとれた1型/2型応答又は主に1型応答に変換したが、一方で粘膜的又は注射により与えられるインフルエンザ抗原単体は主に2型応答を誘発する。1型応答は、インフルエンザ感染症の消散に重要な細胞傷害性Tリンパ球の誘導を促進する。従来、1型応答には、生病原性又は弱毒化CAV経鼻インフルエンザ・ワクチンを必要とした。先に報告した単独で又はバイオベクター若しくはビロソーム(rLTの有無にかかわらず)のいずれかで投与されるISIVは、好ましくは2型免疫応答を誘導する。
プロテオソームと複合体を形成したさまざまな病原生物からのペプチド及びリポポリサッカライド抗原は、さまざまな動物種において経鼻又は非経口免疫の結果高められた粘膜及び全身性免疫応答を誘導することを証明した。本発明は、インフルエンザ感染症の保護のために設計されたワクチンにより説明されるプロテオソーム−タンパク質に基づくワクチンの改良された製造方法、及び改良された組成物を本明細書中で説明する。注射可能なワクチンのそれと等量のHA、ここではHA−インフルエンザ抗原の用量で、説明されるプロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンは、プロテオソームが十分に低い血清反応を誘導することなしに、匹敵するか又は高められた血清ウイルス特異的免疫応答を誘導する。プロテオソーム−インフルエンザ・ワクチンは高いレベルの特異的な粘膜、鼻、及び肺IgAをも産生するが、これに反してインフルエンザ抗原単独の注射又は経鼻投与はわずかな又はとても低いレベルの呼吸粘膜IgAしか誘導しなかった。加えて、プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンは、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を主に2型応答からより平衡のとれた1型/2型応答又は主に1型応答に変換したが、一方で粘膜的又は注射により与えられるインフルエンザ抗原単体は主に2型応答を誘発する。1型応答は、インフルエンザ感染症の消散に重要な細胞傷害性Tリンパ球の誘導を促進する。従来、1型応答には、生病原性又は弱毒化CAV経鼻インフルエンザ・ワクチンを必要とした。先に報告した単独で又はバイオベクター若しくはビロソーム(rLTの有無にかかわらず)のいずれかで投与されるISIVは、好ましくは2型免疫応答を誘導する。
加えて、プロテオソーム経鼻fluワクチンは、マウス及びヒトにおいて非常に良好に許容されることを示した。プロテオソーム・ワクチンにより実施したGLPマウス実験において、嗅球又は他の中枢神経系(CNS)への影響は見られず、前記エンテロトキシンに基づきアジュバントしたfluワクチンよりもプロテオソーム−fluワクチンの方が明らかに本質的に安全であることを示した。
最後に、経鼻プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンは、ヒトにおいて免疫原性であり、そしてCAVを与えられたこの年齢層の被験者において観察されなかった頻度及びレベルで健常成人における血清HAIを有意に高める誘導をする。注射可能なISIVワクチンにより与えられるのと同じ用量で、プロテオソーム−インフルエンザ・ワクチンはヒトの鼻腔洗浄液中に有意なレベルの分泌型IgAを誘導する。したがって、経鼻プロテオソーム−インフルエンザ・ワクチンは、生CAVワクチン及び他の経鼻的にデリバリーされる又はアジュバントされる不活化インフルエンザ・ワクチンより優れた免疫原性及び安全特性を有する不活化経鼻インフルエンザ・ワクチンとしての有用性をもつ。
不活化インフルエンザ抗原を有するプロテオソーム製剤の前記利点の証明は、他の抗原タンパク質を含むプロテオソーム組成物に典型的であり、そして上記組成物はウイルス又は非ウイルス抗原を用いた他の呼吸器系疾患又は非呼吸器系疾患に対する保護にも同様に有効であろう。
本発明のワクチン及び組成物は2の主要な成分を含む。第1の成分はプロテオソームの製剤である。第2の成分はタンパク質抗原、好ましくはウイルス抗原である。故に、天然のタンパク質である細菌由来抗原は、ウイルス抗原と同様に好ましい処方中に使用されうる。前記組成物は部分的に又は完全に精製されたインフルエンザ・ウイルス抗原の製剤の使用により本明細書中に説明される。前記抗原は、定量化しうる量のインフルエンザ血球凝集素(HA)を含むために界面活性剤抽出、そしてショ糖密度勾配遠心分離を用いて精製されうる。細胞培養、例えばバキュロウイルス又は哺乳動物細胞株中に発現され、そしてそこから精製される組換えインフルエンザ・タンパク質、例えば血球凝集素タンパク質を使用することもできる。前記インフルエンザ成分は一般的に(天然起源から精製された抗原に関しては)インフルエンザ分解産物又は分解flu、あるいは組換えHA(rHA)と称される。
「プロテオソームの製造」は、例えば米国特許第5,726,292号(本明細書中に援用)又は同第4,707,543号中で所望される疎水性粒子又は小胞の獲得をもたらす精製工程を受ける外膜タンパク質の抽出を意味する。プロテオソーム製造のための代替の、そして改良された方法は以下の実施例に記載され、そしてフロー図により説明される。小胞の形状の外壁タンパク質成分をもたらすあらゆる製造方法が「プロテオソームの製造」の定義の中に含まれる。
前記2の成分同士の大部分の非共有結合を生じるその成分間の相互作用を最適化するために上記2の成分を記載の方法により特定の初期割合で処方する。前記方法は、選ばれた界面活性剤溶液中での前記成分の混合、そして次に本発明のワクチンのために最適化した流量及び膜のパラメーターを用いたダイアフィルトレーション/限外ろ過法による上記界面活性剤の除去を一般的に含む。
本発明の1の特徴は、製剤中に含まれるプロテオソーム対抗原の比が好ましくは1超:1、より好ましくは3超:1、より好ましくは4超:1であることである。前記の比は8以上:1でもありうる。前記2の成分の界面活性剤に基づく溶液は、同じ界面活性剤か又は異なる界面活性剤を含み、そして1以上の界面活性剤が限外ろ過/ダイアフィルトレーションを受ける前記混合物中に存在しうる。好適な界面活性剤はTriton,Empigen、及びMega−10を含む。他の界面活性剤を使用することもできる。前記界面活性剤は、組成物の製造に使用される成分を溶解させるために働く。界面活性剤の混合物の使用は特に有利である。当然、この混合物は最終的な処方の前にダイアフィルトレーション/限外ろ過により除去される。
後にワクチンに処方される本発明の組成物の製造方法の他の特徴は、得られる組成物が0.8μフィルター、0.45μフィルター、又は0.2μフィルターを通してろ過されることである。これはろ過により行われる滅菌を可能にし、防腐剤、例えばチメロサール添加の必要を未然に防ぐ。前述の汚染物質の存在によるあらゆる合併症を排除するために望ましいので、これは大きな利点である。
本発明の方法により製造された組成物は、所望の場合は前記のとおりのろ過、希釈剤及び担体、バッファー等の添加により最終的にワクチンに処方される。
以下に説明されるとおり、HAを抗原とするワクチン、又は実際にはいずれかのタンパク質抗原を含むワクチンは多価ワクチンとして作製されうる。これは2の方法により達成されうる。ダイアフィルトレーション/限外ろ過前の初期混合物は、場合により異なる界面活性剤の存在下又は同じ界面活性剤の存在下、別々の成分として最初に提供される所望の抗原の混合物を含む;次に、抗原の混合物は界面活性剤−無汚染プロテオソーム製剤と混合し、そして前記のとおり処理する。あるいは、1価(又は多価)抗原からダイアフィルトレーションにより得られた組成物を、1以上のさらなる抗原から同様に調製された製剤と混合しうる。故に以下に説明されるものは、3の異なるHA抗原から作られた3価ワクチンである。
ワクチンに処方される組成物の製造方法の特徴に加え、プロテオソーム組成物自体が改良された方法により製造されうる。故に、従来技術により示されたさまざまなステップを避け、付加的なステップ又は代替ステップを利用する。1の重要な態様において、前記製造方法は、以下の実施例に記載のとおりエタノールの存在下で1回以上沈殿し、続いて0.1〜1%界面活性剤溶液により、典型的にはEmpigenを用いてプロテオソームを再抽出し、それによりより均一な産物を得ることを含む。加えて、エタノール沈殿ステップを利用しないにしても、従来技術の方法として記載の硫安沈殿を排除する。
故に、本発明の方法により製造される組成物は、血清及び粘膜両方の抗体、並びに免疫応答を誘導するために粘膜(例えば鼻、口、口腔咽頭、又は直腸の粘膜)、非経口(例えば筋中又は皮下)、あるいは経皮経路によりデリバリーされるワクチンに処方されうる。
以下に示すとおり、マウスに対して液体又はスプレーによりデリバリーされる経鼻ワクチンは、血清IgG抗体及び血球凝集阻害(HAI)抗体を含む特異的な抗インフルエンザ免疫応答を誘導する。これらの誘導はヒトにおいてインフルエンザの保護と相互に関連することが知られているため、HAI応答は大きな意義を有する。前記ワクチンは鼻腔又は肺から集められる粘膜分泌によるIgAを含めた粘膜抗体を生じ、そしてIgG1/IgG2比及びTh2サイトカイン、例えばIL−5を伴わないTh1サイトカイン、例えばインターフェロン・ガンマの誘導により計測される、主に2型応答から均衡した又は主に1型応答への変化をも生じる。前記の応答は、他の細胞性応答、例えば細胞傷害性T細胞(CTLs)の発達の前兆となる。本発明の経鼻ワクチンのこれらの3タイプの応答を誘発する能力は、(HAI抗体を含む)活性血清抗体、インフルエンザ・ウイルスを中和しうる鼻咽頭及び肺IgA抗体、並びに残存又は細胞内ウイルスの排除を助けるTh1応答が全てインフルエンザ・ウイルス感染症の保護の重要なメディエイターであるため、前記ワクチンがより完全な免疫を提供しうることを示す。これは、前記ワクチンがマウスの病原性インフルエンザ・ウイルスを接種に関連した体重減少及び死亡からマウスを守ることを説明することを示す結果による。
粘膜経路、例えば経鼻投与による投与に加え、本発明のワクチンを、非経口的に、例えば注射(例えば筋中又は皮下)により投与することもできる。筋中注射がプロテオソームなしの分解fluワクチン投与により提供されるよりも高いレベルの血清抗体を提供することを以下に証明する。
以下に示されるとおり、臨床適用(1又は2回免疫)に典型的であるより多数の免疫(3回)を用いても、そして20倍までの用量、つまり最も高い要求されるヒト用量を用いてもマウスに対する経鼻経路による本発明のワクチンの投与は十分に許容された。重要なことに、前記の他のエンテロトキシジェニック粘膜アジュバントとは異なり、CNSの嗅球部における炎症の徴候がなかった。
以下にさらに示すとおり、ヒトにおいて、経鼻スプレーにより与えられた分解インフルエンザ抗原により製造された本発明のワクチンは、いかなる深刻な副作用もなく十分に許容された。最適な用量で前記ワクチンは、(試験したインフルエンザ株に全く血清反応陰性であるボランティアの中でさえ)50%以上のボランティアで、その大部分がインフルエンザ・ウイルスに起因する疾患の保護に関連するのと等価か又はそれを上回る力価を有する血清HAI応答を誘導した。血清HAI力価は、ボランティアの13%未満でHAI応答を誘導した。経鼻的に与えられた分解抗原単体により誘導されたものより有意に高かった。前記ワクチンは、鼻腔洗浄液分泌型IgAを、経鼻的に又は注射により与えられた分解抗原単体による免疫の結果として産生されたものより有意に多くのボランティアで、そして有意に高いレベルでも誘導した。ヒトにおいて粘膜及び全身性免疫応答を誘導するプロテオソーム−fluワクチンの用量(7.5〜30μg)は、最新の注射可能なワクチンのそれ(15μg)に近く、そしてそれは予想できなかった。ヒトにおいて経鼻免疫の結果、最適な血清及び粘膜の免疫応答を得るためにプロテオソーム赤痢菌ワクチンを用いた人体研究において、本発明の方法によるプロテオソーム−fluワクチンのために用いたインフルエンザ血球凝集素抗原の平均用量より(50〜100倍)多い1,000μg〜1,500μgの赤痢菌抗原の用量でプロテオソーム−赤痢菌ワクチンを与えることが必要であった。
前述のとおり、本発明は1価及び(2又は3価を含む)多価ワクチンを含む。前記多価製剤を、別々の1価プロテオソーム−fluワクチンを組合せるか又は1価のインフルエンザ抗原を組合せて多価抗原混合物を形成し、次にプロテオソームと複合体を形成させて多成分プロテオソーム−fluワクチンとして処方される組成物を製造するかにより得ることができる。
非経口的、経鼻的、経口的又は坐剤用途のために、前記ワクチンは、所望のデリバリー形態において製品の安定なデリバリーを提供するために潜在的に大量の、オイル、乳液、ナノ乳液、脂肪、ワックス、緩衝剤又は糖を含む賦形剤又はアジュバントを本技術分野の慣例の希釈剤又は媒質として加えた、活性成分を含みうる。
本技術分野で周知のとおり、本発明のワクチンを投与するためにさまざまなプロトコールが適用されうる。前記ワクチンは、本発明のワクチンのいくつかの投与方法を含む別々のプロトコールにより使用されうるか又は本発明のワクチンは他の製剤と一緒に併用プロトコールにより使用されうる。抗原の選択は、感染性物質の性質により決定される;用量レベル及び服用の時期を含む投与に関する特定のプロトコールの設計は、当業者に周知の決まりきったやり方を用いた当該手順の最適化により決定される。インフルエンザ・ワクチン接種について説明する一方で、例示されたがしかし他の抗原を含むものに類似のワクチンは、粘膜経路により、すなわち吸入、並びに摂取又は性感染により取得したウイルス性又は細菌性疾患、あるいは特定の毒素又は生物学的な脅威物質又はアレルギーからのヒト又は(獣医の使用による)動物の保護に成功する。本発明は、細菌性疾患、アレルギー又は癌に対するワクチンのための細胞表面又は細胞内タンパク質抗原を用いた粘膜的又は非経口的経路によりデリバリーされる予防的又は治療的ワクチンを含む。
本発明の方法から得られる組成物は、本技術分野で知られる技術と明らかに異なる。例えば弱毒化生低温馴化ワクチン(CAV)と異なり、本明細書に記載のワクチンは、精製されるか又は組換え成分である死んだ抗原を含む。プロテオソームが細菌外膜タンパク質を本来構成し、そしてごくわずかな又は少量の天然の細菌脂質を含むのに対して、MF59脂質乳液、リポソーム又はビロソームが大量の脂質から成る一方でMPLA及びバイオベクター技術は少量(MPLA)又は大量(バイオベクター)のサッカライドが存在する脂質サッカライドであるため、前記組成物はMF59乳液、リポソーム、ビロソーム、モノホスホリル脂質A(MPLA)又はバイオベクター技術と異なる。これらのアジュバントは、大量の(細菌の又は他の)タンパク質を含まない。
本発明のワクチンと前記Dalseg, R., et al., Vaccines (1998) 96 : 177-182に記載のものとの性質及び特性の比較は、本発明の利点を証明する。前記のDalsegの組成物は弱毒化ウイルスに関する前述の欠点に悩まされる;Dalsegワクチン中の抗原成分は、本発明のワクチンに使用した精製タンパク質に対抗する、ホルマリン不活化全インフルエンザ・ウイルスである。不特定の方法によりナイセリア・メニンギチジスからの抽出された外膜調製物として得られた小胞をホルマリン不活化インフルエンザ・ウイルスと混合し、そして超音波処理するか又は単に混合した。前記混合物に対してダイアフィルトレーション又は限外ろ過処理を適用しないため、界面活性剤が、その中に残存する小胞を含む組成物中に存在する。故にDalsegにより調製された組成物は本発明のワクチンのそれより劣った結果を提供する;効果を観察するためにDalseg組成物の4回投与を必要とした。
前記のLowellによる総論において解説されたとおりプロテオソームを使った先に報告した組成物は1以下:1のプロテオソーム対抗原の比を利用した;1:20位低い比を用いた。そこに記載の最適の効果を示す従来技術のワクチンは、最適の効果が1,000μg又は15,000μgまでの抗原用量を必要とすることを要求した一方で、本発明のワクチンは7.5〜30μgの範囲の抗原用量を用いてヒトにおいて有効である。
調製方法自体については、ダイアフィルトレーション/限外ろ過手順により100,000の分画分子量の使用であるために高められた効率をもたらすことが示される;同様に、より効率的なものは、プロテオソームの存在下、いくつかの抗原を同時にワンステップ・ダイアフィルトレーション/限外ろ過手順に供する可能性である。
以下の実施例は本発明を説明することを意図し、本発明を制限するものではない。
実施例1
プロテオソームの調製
外膜タンパク質プロテオソームの調製を、フェノールで死滅させた細菌ペーストの1M塩化カルシウム含有6% Empigen BB(EBB)(Albright and Wilson, Whithaven, UK)溶液を用いた抽出によるB群2型ナイセリア・メニンギチジス(Neisseria meningitides)からの精製を実施し、引き続きエタノールにより沈殿させ、1% EBB−Tris/EDTA生理食塩水中に溶解し、そして次に硫安により沈殿させた。その沈殿物を1% EBBバッファー中に再溶解し、透析し、−70℃、0.1% EBB中で保存した。前記方法のフロー図(フロー図1)を以下のページに示す。プロテオソームは、工程を短縮するために硫安沈殿のステップの省略によっても得られうる(フロー図1A)。それでも成功する代替方法をフロー図1Bに示す。
プロテオソームの調製
外膜タンパク質プロテオソームの調製を、フェノールで死滅させた細菌ペーストの1M塩化カルシウム含有6% Empigen BB(EBB)(Albright and Wilson, Whithaven, UK)溶液を用いた抽出によるB群2型ナイセリア・メニンギチジス(Neisseria meningitides)からの精製を実施し、引き続きエタノールにより沈殿させ、1% EBB−Tris/EDTA生理食塩水中に溶解し、そして次に硫安により沈殿させた。その沈殿物を1% EBBバッファー中に再溶解し、透析し、−70℃、0.1% EBB中で保存した。前記方法のフロー図(フロー図1)を以下のページに示す。プロテオソームは、工程を短縮するために硫安沈殿のステップの省略によっても得られうる(フロー図1A)。それでも成功する代替方法をフロー図1Bに示す。
実施例2
定量化された量のインフルエンザ血球凝集素(HA)を含むインフルエンザ抗原(インフルエンザHA又はFlu−HA)の調製
分解抗原:
調製をフロー図2に概説したとおり実施した。簡単に言えば、調製はウイルス接種した卵から尿膜腔液を採取し、続いてウイルスを清澄し、不活性化し、ダイアフィルトレーション/限外ろ過により濃縮し、そのウイルスをショ糖密度勾配遠心分離によりバンドにし、ペレットを形成させ、再懸濁したペレットをTriton X−100若しくはNP−40又は他の好適な界面活性剤により抽出し、そして遠心分離して上清を回収することを含む。必要であればこの工程をくり返し、前記上清をフロー図2に記載のとおり分析し、蓄積し、そして2〜8℃で保存した。
定量化された量のインフルエンザ血球凝集素(HA)を含むインフルエンザ抗原(インフルエンザHA又はFlu−HA)の調製
分解抗原:
調製をフロー図2に概説したとおり実施した。簡単に言えば、調製はウイルス接種した卵から尿膜腔液を採取し、続いてウイルスを清澄し、不活性化し、ダイアフィルトレーション/限外ろ過により濃縮し、そのウイルスをショ糖密度勾配遠心分離によりバンドにし、ペレットを形成させ、再懸濁したペレットをTriton X−100若しくはNP−40又は他の好適な界面活性剤により抽出し、そして遠心分離して上清を回収することを含む。必要であればこの工程をくり返し、前記上清をフロー図2に記載のとおり分析し、蓄積し、そして2〜8℃で保存した。
組換えバキュロウイルスが発現したインフルエンザHA:
簡単に言えば、インフルエンザHA(A/Texas/36/91)を発現させ、そして(Gail Smith, et al.を参照のこと)に記載のとおり慣甲の技術により精製した。得られたタンパク質を、PAGE還元ゲルにより測定し>95%HAであった。HAを、濃度計を用いて確定的な複合体の状態で定量化し、そしてその複合体の組換えHAバンドの強度を既知の濃度の組換えタンパク質のバンドの強度と比較した。
簡単に言えば、インフルエンザHA(A/Texas/36/91)を発現させ、そして(Gail Smith, et al.を参照のこと)に記載のとおり慣甲の技術により精製した。得られたタンパク質を、PAGE還元ゲルにより測定し>95%HAであった。HAを、濃度計を用いて確定的な複合体の状態で定量化し、そしてその複合体の組換えHAバンドの強度を既知の濃度の組換えタンパク質のバンドの強度と比較した。
実施例3
プロテオソーム・インフルエンザHAワクチンの製造
保存のインフルエンザ分解産物抗原の一部をプロテオソームと複合体形成させ、そしてフロー図3に記載のダイアフィルトレーション/限外ろ過法又は透析法を用いてプロテオソームと処方した。いずれの方法についても、前記インフルエンザ分解産物を所望の界面活性剤、例えばEmpigen BB(EBB)を1%で又は0.1%〜2%のEBB、あるいは使用された界面活性剤のタイプに依存する他の好適な界面活性剤を含む生理食塩緩衝溶液中に溶解し、そして次にそれを生理食塩緩衝化1% Empigen溶液(又は前記のとおり適当な濃度で他の適当な界面活性剤)中のプロテオソームと1:4、1:1、2:1、4:1、及び8:1を含む4:1〜8:1の範囲をもつさまざまなプロテオソーム:HA(wt/wt)の割合で混合した。Empigenを除去するために、次に前記混合物をフロー図3に記載のとおり限外ろ過/ダイアフィルトレーション技術に供するか、又は10,000の分画分子量(MWCO)を有する透析膜若しくは1,000〜30,000のMWCO範囲を有する機能的に類似の膜を緩衝化生理食塩水に対して4℃で1〜2週間、毎日少なくとも500分の1の緩衝液を交換して徹底的に透析した。
プロテオソーム・インフルエンザHAワクチンの製造
保存のインフルエンザ分解産物抗原の一部をプロテオソームと複合体形成させ、そしてフロー図3に記載のダイアフィルトレーション/限外ろ過法又は透析法を用いてプロテオソームと処方した。いずれの方法についても、前記インフルエンザ分解産物を所望の界面活性剤、例えばEmpigen BB(EBB)を1%で又は0.1%〜2%のEBB、あるいは使用された界面活性剤のタイプに依存する他の好適な界面活性剤を含む生理食塩緩衝溶液中に溶解し、そして次にそれを生理食塩緩衝化1% Empigen溶液(又は前記のとおり適当な濃度で他の適当な界面活性剤)中のプロテオソームと1:4、1:1、2:1、4:1、及び8:1を含む4:1〜8:1の範囲をもつさまざまなプロテオソーム:HA(wt/wt)の割合で混合した。Empigenを除去するために、次に前記混合物をフロー図3に記載のとおり限外ろ過/ダイアフィルトレーション技術に供するか、又は10,000の分画分子量(MWCO)を有する透析膜若しくは1,000〜30,000のMWCO範囲を有する機能的に類似の膜を緩衝化生理食塩水に対して4℃で1〜2週間、毎日少なくとも500分の1の緩衝液を交換して徹底的に透析した。
さまざまなステップで、有効性の計測のために一元放射免疫拡散法を用いた。さまざまな割合でプロテオソームを伴う処方の分解flu抗原の含量を正確に測定するためにハロ免疫拡散(halo immunodiffusion)技術を用いた。この方法は、確定的なバイアルに入れた物質に関する血球凝集素含量に基づく分解flu産物についての伝統的な有効性アッセイである。試薬を国立生物学的製剤研究所(NIBSC)、Hertfordshire, United Kingdom から得た。参考文献:Hudson, L. and Hay, F.C., Practical Immunology, ed. Blackwell Scientific Publication : Third Edition, ; pages 230-233。
多価ワクチンを、個々の1価プロテオソームワクチンを作り、そして次に最終的な処方の前に所望の割合でそれらを組合わせ、そして充填することにより製造しうる。多価製剤を、個々の抗体を所望の割合で合わせ、そしてフロー図3に概説のとおりプロテオソームと混合物を形成させることにより処方することもできる。ワクチンを0.8μmのポア・サイズの薄膜フィルターに通し、そして免疫前及びその間4℃で保存した。
実施例4
本実施例は使用したマウス免疫プロトコールを説明する
最初の免疫の前日に無作為抽出したマウスを前採血した。BALB/cマウスをそれぞれ分解インフルエンザ抗原としてA/Taiwan/1/86又はA/Beijing/262/95、あるいはバキュロウイルス組換え体としてA/Texas/36/91を0.3〜10μg HAで含む、単独又は1:4、1:1、2:1、4:1、及び8:1(wt/wt)の複合体開始値でのプロテオソーム:HA比でプロテオソームと処方される(プロテオソーム−fluワクチン又はプロテオソームrHA)、25又は100μlの量の抗原により1及び21日目に鼻腔内又は筋中に免疫した。いくつかの実施例において、対照マウスをリン酸緩衝生理食塩水又は0.04LD50のマウス馴化生インフルエンザA/Taiwan/12/86のいずれかにより1日目に単回の鼻腔内免疫で与えた。動物を20日目及び35日目に眼窩血脈洞(orbital sinus vein)からか又は心臓穿刺により放血させた。鼻及び肺の洗浄サンプルを35日目に採取した。各マウスの肺を外科的に露出させ、そしてカニューレを気管に挿入した。0.1%ウシ血清アルブミン及びプロテアーゼ阻害剤(0.2mM AEBSF、1μg/mlアプロチニン、3.25μMベスタチン、及び10μMロイペプチン)を加えたリン酸緩衝生理食塩水を含んだシリンジを用いて、1の鼻洗浄サンプル(約1ml)及び2の肺洗浄サンプル(2×1ml)を回収した。前記肺洗浄液を合わせ、そして個々の動物からの洗浄液をボルテックスにかけ、そして細胞の破片を除くために遠心分離し、そして上清をELISAによる分析まで−70℃で保存した。
本実施例は使用したマウス免疫プロトコールを説明する
最初の免疫の前日に無作為抽出したマウスを前採血した。BALB/cマウスをそれぞれ分解インフルエンザ抗原としてA/Taiwan/1/86又はA/Beijing/262/95、あるいはバキュロウイルス組換え体としてA/Texas/36/91を0.3〜10μg HAで含む、単独又は1:4、1:1、2:1、4:1、及び8:1(wt/wt)の複合体開始値でのプロテオソーム:HA比でプロテオソームと処方される(プロテオソーム−fluワクチン又はプロテオソームrHA)、25又は100μlの量の抗原により1及び21日目に鼻腔内又は筋中に免疫した。いくつかの実施例において、対照マウスをリン酸緩衝生理食塩水又は0.04LD50のマウス馴化生インフルエンザA/Taiwan/12/86のいずれかにより1日目に単回の鼻腔内免疫で与えた。動物を20日目及び35日目に眼窩血脈洞(orbital sinus vein)からか又は心臓穿刺により放血させた。鼻及び肺の洗浄サンプルを35日目に採取した。各マウスの肺を外科的に露出させ、そしてカニューレを気管に挿入した。0.1%ウシ血清アルブミン及びプロテアーゼ阻害剤(0.2mM AEBSF、1μg/mlアプロチニン、3.25μMベスタチン、及び10μMロイペプチン)を加えたリン酸緩衝生理食塩水を含んだシリンジを用いて、1の鼻洗浄サンプル(約1ml)及び2の肺洗浄サンプル(2×1ml)を回収した。前記肺洗浄液を合わせ、そして個々の動物からの洗浄液をボルテックスにかけ、そして細胞の破片を除くために遠心分離し、そして上清をELISAによる分析まで−70℃で保存した。
実施例5
本実施例は血清血球凝集素阻害アッセイ(HAI)を説明する
HAI活性の測定の前に、成分を不活化するためにマウス又はヒトの血清を56℃で加温する。非特異的な凝集の排除をレセプター破壊酵素(RDE)によりマウス血清を処理することで達成した。0.1mlの血清に0.4mlのRDE(100unit/ml)を加え37℃で12〜18時間処理した。前記RDEの不活化のために300mlのクエン酸ナトリウム(2.5%)を加え56℃で30分間処理した。前記サンプルの容量をPBSにより1mlにした(1:10の最終的なサンプル希釈倍率を得た)。2倍の連続希釈の各サンプルを標準的なHAIアッセイによりA/Taiwan/1/86ウイルスによる0.5%ニワトリ赤血球細胞の凝集の阻害に対するそれらの活性について試験した。
本実施例は血清血球凝集素阻害アッセイ(HAI)を説明する
HAI活性の測定の前に、成分を不活化するためにマウス又はヒトの血清を56℃で加温する。非特異的な凝集の排除をレセプター破壊酵素(RDE)によりマウス血清を処理することで達成した。0.1mlの血清に0.4mlのRDE(100unit/ml)を加え37℃で12〜18時間処理した。前記RDEの不活化のために300mlのクエン酸ナトリウム(2.5%)を加え56℃で30分間処理した。前記サンプルの容量をPBSにより1mlにした(1:10の最終的なサンプル希釈倍率を得た)。2倍の連続希釈の各サンプルを標準的なHAIアッセイによりA/Taiwan/1/86ウイルスによる0.5%ニワトリ赤血球細胞の凝集の阻害に対するそれらの活性について試験した。
実施例6
本実施例は、血清中、肺及び鼻腔洗浄液中の特異的な抗flu抗体を計測するための血清ELISAアッセイを説明する
血清を各免疫の後に回収し;肺及び鼻腔洗浄液を最終免疫後に回収した。鼻腔洗浄液及び肺洗浄液の開始希釈倍率を1/4とし、そして血清の開始希釈倍率を1/100とした。完全体のウイルスを検出抗原として用いてELISAを実施した。簡単に言うと、96ウェル平底マイクロタイター・プレート(Immulon2、Dynatech、Chantilly、Virginia)を抗原によりコートし、そして一晩インキュベートした。プレート洗浄装置を用いてその抗原を吸引した後、プレートをTween含有PBS(PBS−T)により1度洗浄し、そして2%粉ミルクを加えたPBS−Tを含むブロッキング溶液と一緒にインキュベートした。ブロッキング溶液を吸引し、そしてPBS−Tにより洗浄した後、ブロッキング溶液により連続的に2倍希釈された血清、肺又は鼻腔洗浄液のサンプルを加え、そしてそのプレートを37℃で2時間インキュベートした。PBS−Tによる洗浄の後、アフィニティー精製したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗マウスIgG又はIgAを加え、そしてそのプレートを37℃で30分間インキュベートした。吸引し、そしてPBS−Tによる2度の洗浄の後、現像溶液を加え、そしてマイクロタイターELISAプレート・リーダー(Molecular Devices、Menlo Park、California)を用いた吸光度の値の測定に先立ち室温で15分間インキュベートした。前記ELISAプレート・リーダーにより吸光度を特定の時間で測定した。図中の抗体力価を、アフィニティー精製マウスIgG及びIgA標準(Sigma)を用いたELISA捕捉アッセイを用いて作製した標準曲線から確定した特異的IgG又はIgAのng/mlとして示す。
本実施例は、血清中、肺及び鼻腔洗浄液中の特異的な抗flu抗体を計測するための血清ELISAアッセイを説明する
血清を各免疫の後に回収し;肺及び鼻腔洗浄液を最終免疫後に回収した。鼻腔洗浄液及び肺洗浄液の開始希釈倍率を1/4とし、そして血清の開始希釈倍率を1/100とした。完全体のウイルスを検出抗原として用いてELISAを実施した。簡単に言うと、96ウェル平底マイクロタイター・プレート(Immulon2、Dynatech、Chantilly、Virginia)を抗原によりコートし、そして一晩インキュベートした。プレート洗浄装置を用いてその抗原を吸引した後、プレートをTween含有PBS(PBS−T)により1度洗浄し、そして2%粉ミルクを加えたPBS−Tを含むブロッキング溶液と一緒にインキュベートした。ブロッキング溶液を吸引し、そしてPBS−Tにより洗浄した後、ブロッキング溶液により連続的に2倍希釈された血清、肺又は鼻腔洗浄液のサンプルを加え、そしてそのプレートを37℃で2時間インキュベートした。PBS−Tによる洗浄の後、アフィニティー精製したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗マウスIgG又はIgAを加え、そしてそのプレートを37℃で30分間インキュベートした。吸引し、そしてPBS−Tによる2度の洗浄の後、現像溶液を加え、そしてマイクロタイターELISAプレート・リーダー(Molecular Devices、Menlo Park、California)を用いた吸光度の値の測定に先立ち室温で15分間インキュベートした。前記ELISAプレート・リーダーにより吸光度を特定の時間で測定した。図中の抗体力価を、アフィニティー精製マウスIgG及びIgA標準(Sigma)を用いたELISA捕捉アッセイを用いて作製した標準曲線から確定した特異的IgG又はIgAのng/mlとして示す。
実施例7
本実施例は、血清及び肺洗浄液中のインフルエンザ・ウイルス中和抗体を計測するためのインビトロ中和アッセイを説明する
ウイルスの感染性の中和を、MDCK細胞における細胞溶解及び細胞変性効果(CPE)の直接的な観察により測定した。このアッセイを96ウェル・プレートにより実施した。各サンプルを8重で供した。試験サンプル(血清又は肺洗浄液)の連続希釈物を100 TCID50の、ワクチン株と相同なインフルエンザ・ウイルスと一緒に室温で90分間インキュベートし、そして2.4×105 MDCK細胞/ウェルを加えた。プレートをアッセイの残りの期間、32℃/5% CO2 でインキュベートした。ウイルスの中和を、倒立顕微鏡を用いたCPEの評価によりウイルス増殖期(5〜7日間のインキュベーション)の間、測定した。中和力価をKaerberの公式(TCID50=Δ−δ(S−0.5))により確定した、ここで「Δ」は100%陽性な培養となる希釈倍率のlog10であり、「δ」は希釈係数のlog10であり、そして「S」は100%感染した培養となる希釈倍率でそれらを含む希釈物当たりの陽性培養の合計である。
本実施例は、血清及び肺洗浄液中のインフルエンザ・ウイルス中和抗体を計測するためのインビトロ中和アッセイを説明する
ウイルスの感染性の中和を、MDCK細胞における細胞溶解及び細胞変性効果(CPE)の直接的な観察により測定した。このアッセイを96ウェル・プレートにより実施した。各サンプルを8重で供した。試験サンプル(血清又は肺洗浄液)の連続希釈物を100 TCID50の、ワクチン株と相同なインフルエンザ・ウイルスと一緒に室温で90分間インキュベートし、そして2.4×105 MDCK細胞/ウェルを加えた。プレートをアッセイの残りの期間、32℃/5% CO2 でインキュベートした。ウイルスの中和を、倒立顕微鏡を用いたCPEの評価によりウイルス増殖期(5〜7日間のインキュベーション)の間、測定した。中和力価をKaerberの公式(TCID50=Δ−δ(S−0.5))により確定した、ここで「Δ」は100%陽性な培養となる希釈倍率のlog10であり、「δ」は希釈係数のlog10であり、そして「S」は100%感染した培養となる希釈倍率でそれらを含む希釈物当たりの陽性培養の合計である。
実施例8
プロテオソーム−HAワクチンにより誘発された向上した血清HAI及びウイルス特異的IgG力価により計測された向上した免疫原性及び免疫性の証明
この実施例は、透析法によりA/Taiwan/91インフルエンザ分解抗原(図1及び2)又は精製バキュロウイルス組換えHA(A/Texas/36/91)(表1)に対して製造された単価ワクチンによる経鼻免疫の結果としてプロテオソーム−fluワクチンにより誘導される血清及び粘膜抗体応答を示す。同様の結果を測定可能なダイアフィルトレーション法により製造したプロテオソーム−fluワクチンを用いて得た(実施例12以降を参照のこと)。
プロテオソーム−HAワクチンにより誘発された向上した血清HAI及びウイルス特異的IgG力価により計測された向上した免疫原性及び免疫性の証明
この実施例は、透析法によりA/Taiwan/91インフルエンザ分解抗原(図1及び2)又は精製バキュロウイルス組換えHA(A/Texas/36/91)(表1)に対して製造された単価ワクチンによる経鼻免疫の結果としてプロテオソーム−fluワクチンにより誘導される血清及び粘膜抗体応答を示す。同様の結果を測定可能なダイアフィルトレーション法により製造したプロテオソーム−fluワクチンを用いて得た(実施例12以降を参照のこと)。
ここでHAIにより分析される血清中の抗インフルエンザIgG抗体;血清中のIgG、並びに肺及び鼻腔洗浄液中のIgA抗体をELISAにより分析し;そして血清中のIgG、並びに肺洗浄液中のIgA及びIgGをウイルス中和活性について試験した。前記応答を、生理食塩水で免疫した動物及びプロテオソームなしに単独でデリバリーされたインフルエンザ分解産物により免疫された動物からのサンプル、あるいはプロテオソーム及び無関係の抗原(HBs Ag)を含む対照ワクチンにより免疫された動物によるサンプルのコレクションと比較した。結果を図1〜2、及び表1に示し、そしてまとめた。簡単に言うと:プロテオソーム対HAの最適な割合での経鼻プロテオソーム−flu及びプロテオソームrHAワクチン、すなわち最適の免疫応答が、4:1〜8:1のプロテオソーム:HA配合割合の時に得られた。
1.経鼻的に単独で与えられた分解Fluよりも6〜32倍高い血清HAI応答、そし て注射により単独で分解作製HAワクチンが与えられることで誘発されたHAI力 価と等価の力価が誘発され(図1A及び表1)、
2.経鼻的に単独で与えられた分解Fluよりも250倍高い血清IgG応答、そして 経鼻生ワクチンに匹敵する、あるいは注射(筋中)により与えられた分解fluと 等価か又は5倍高い誘発応答が誘発され(図1B及び表1)、
3.注射可能な分解インフルエンザ・ワクチンと等価の、そして経鼻経路による単独の 分解flu抗原よりも>100倍高い血清中和力価が誘導され(図1C)、
4.注射(筋中)によるか又は経鼻的に単独で与えられた分解Fluより>1,000 倍高いIgA応答が鼻において誘発され(図2A)、
5.注射(筋中)によるか又は経鼻的に単独で与えられた分解Fluより20〜1,0 00倍高いIgA応答が肺において誘発され(図2B及び表1)、
6.生ウイルスと同じか又は優れた応答が誘発され(図1〜2)、
7.肺洗浄液分泌物の状態で中和抗体が誘発され、経鼻免疫により、4:1プロテオソ ーム−fluワクチンだけが<1/2希釈で8/8反復、ウイルスの細胞変性効果 を完全に阻害しうる機能的な抗体を肺洗浄液中に誘導した。経鼻又は筋中免疫のい ずれの結果でも、単独でFlu抗原により免疫されたマウスからの肺洗浄液につい てインビトロでの中和は観察されず、そして
8.非経口免疫の結果単独の分解抗原に比べ向上した血清IgG及び等価の血清HAI 力価が誘発された(表2)。
2.経鼻的に単独で与えられた分解Fluよりも250倍高い血清IgG応答、そして 経鼻生ワクチンに匹敵する、あるいは注射(筋中)により与えられた分解fluと 等価か又は5倍高い誘発応答が誘発され(図1B及び表1)、
3.注射可能な分解インフルエンザ・ワクチンと等価の、そして経鼻経路による単独の 分解flu抗原よりも>100倍高い血清中和力価が誘導され(図1C)、
4.注射(筋中)によるか又は経鼻的に単独で与えられた分解Fluより>1,000 倍高いIgA応答が鼻において誘発され(図2A)、
5.注射(筋中)によるか又は経鼻的に単独で与えられた分解Fluより20〜1,0 00倍高いIgA応答が肺において誘発され(図2B及び表1)、
6.生ウイルスと同じか又は優れた応答が誘発され(図1〜2)、
7.肺洗浄液分泌物の状態で中和抗体が誘発され、経鼻免疫により、4:1プロテオソ ーム−fluワクチンだけが<1/2希釈で8/8反復、ウイルスの細胞変性効果 を完全に阻害しうる機能的な抗体を肺洗浄液中に誘導した。経鼻又は筋中免疫のい ずれの結果でも、単独でFlu抗原により免疫されたマウスからの肺洗浄液につい てインビトロでの中和は観察されず、そして
8.非経口免疫の結果単独の分解抗原に比べ向上した血清IgG及び等価の血清HAI 力価が誘発された(表2)。
実施例9
本実施例はマウス免疫生ウイルス接種プロトコール及び結果を説明する
生ウイルス接種に対するワクチン誘導される保護を証明するために、(前記実施例4に記載のとおり経鼻プロテオソーム−flu(A/Taiwan/12/86)ワクチンにより処理した)ワクチン免疫した動物の群及び対照動物に36日目に特定の4LD50の生マウス馴化インフルエンザを接種した。マウスの保護を、接種後14日間にわたる動物の体重変化の観察により評価した。開始体重からの30%以上の減少したマウス及び臨床的病的な状態の深刻な徴候を示したマウスを屠殺した。プロテオソーム−fluワクチンにより誘発された保護を示すデータを図3に示し、そしてまとめた。
本実施例はマウス免疫生ウイルス接種プロトコール及び結果を説明する
生ウイルス接種に対するワクチン誘導される保護を証明するために、(前記実施例4に記載のとおり経鼻プロテオソーム−flu(A/Taiwan/12/86)ワクチンにより処理した)ワクチン免疫した動物の群及び対照動物に36日目に特定の4LD50の生マウス馴化インフルエンザを接種した。マウスの保護を、接種後14日間にわたる動物の体重変化の観察により評価した。開始体重からの30%以上の減少したマウス及び臨床的病的な状態の深刻な徴候を示したマウスを屠殺した。プロテオソーム−fluワクチンにより誘発された保護を示すデータを図3に示し、そしてまとめた。
簡単に言えば、悪性の相同ウイルスの接種による有意な又は致命的な体重減少に対する完璧な保護を4:1〜8:1のPr:HA比で製造された経鼻プロテオソーム−fluワクチンについて示した一方で、プロテオソームなしのHAは実験の間に有意な体重減少を示した。さらに、誘導された保護は、注射により単独で与えられた分解fluワクチンにより誘導されたのと同じであった。たとえその製剤が最適下の血清及び粘膜免疫応答を誘導するとしてもより低いPr:HA比(例えば1:1)において処方されたワクチンについて得られうる保護は、最適下の開始配合比で製造された製剤の間で有効に変化することに対して上記動物保護モデルが効率的に変化できないために存在する。
実施例10
本実施例は経鼻プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンによる2型から1型への免疫応答の変化を説明する。
本実施例は経鼻プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンによる2型から1型への免疫応答の変化を説明する。
マウス血清におけるIgG1/IgG2比は、ワクチンにより誘導されたT細胞応答のタイプの代替マーカーである。Th1(IgG1/IgG2比<1)は(血清抗体に加えて)強い細胞性免疫応答の誘導に関連し;一方Th2(IgG/IgG2比>1)は強い体液性免疫応答の誘導を予測させる。プロテオソーム−fluワクチン又は1価の分解インフルエンザ・ワクチン若しくは組換えバキュロウイルス誘導HAのいずれかを用いた単独のflu抗原により経鼻又は筋中免疫に伴う血清中のマウスIgGサブタイプであるIgG1及びIgG2のレベルを、ELISAアッセイ・キット(SBA Clonotyping System/HRP,Southern Biotech Assoc.)を用いて測定した。
図4及び表3に示すとおり、そのワクチンがプロテオソームを含む場合、分解flu抗原に対する経鼻及び注射されたワクチンの両者に関してIgG1/IgG2比を14〜20(Flu抗原単独について)から1〜2の範囲まで下げる変化をさせ;そしてバキュロHA抗原に関して6〜60から1.7まで下げる変化をさせた。Th2からTh1応答への免疫性のこの変化は、不活化精製インフルエンザ・ウイルスにより免疫された動物からの脾臓細胞の再刺激に伴い産生されたサイトカインの計測により組換えHA抗原に関して確認された。簡単に言うと、Balb/cマウスを2次免疫の14日後安楽死させ、そして各群からの5のマウスから脾臓を採取し、そして細胞を100μmナイロン細胞ろ過器(Becton Dickinson NJ )を用いて単細胞懸濁液の状態にそいだ。脾臓細胞を、8%ウシ胎児血漿(56℃で1時間加熱し不活化;Gibco BRL)、2mMグルタミン(Gibco BRL)、50μM 2−メルカプトエタノール(Sigma Chemical Co., St-Louis, MO)及び50μg/mlゲンタマイシン(Gibco BRL)含有RPMI1640培地(Gibco BRL, Life technologies, Burlington, ON)中、2.0×106 細胞/ml(200μl/ウェル)で、UV不活化X−113(A/Texas/36/94(H1N1)及びX−31(H3N2)再集合体);インフルエンザ・ウイルス(NIBSC, Hertfordshire, UK)を伴うか又はそれなしに96ウェル細胞培養クラスター(Corning, NY )中で培養した。細胞を37℃で72時間インキュベートし、そして上清を採取し、そして−80℃で冷凍した。マウスのサイトカイン・レベルをPharmingen (San Diego, CA )から購入したサンドイッチELISAs(Opt EIAセット)を用いて製造業者の指示に従って計測した。組換えサイトカインを標準物質として用いた。
IgG1/IgG2a比を群当たり5のマウスから集めた血清について計測した:**INFγ及びIL−5を全不活化ウイルス(IL−5用に1.25μg/mL、INFγ用に0.625μg/mL)で、実施例11に記載のとおり再刺激したマウス脾臓細胞の上清について測定し、そしてpg/ml培養上清で表した。結果は3の培養の平均である。
表3に示されるとおり、経鼻プロテオソームHAワクチンはTh2サイトカインであるIL−5を伴わずTh1サイトカインであるインターフェロン・ガンマを誘導し;一方で経鼻又は筋中経路のいずれかにより投与された組換え抗原はIL−5とインターフェロン・ガンマの両方を誘導した。これらのデータは、経鼻プロテオソームHAワクチンが免疫の他の武器、例えば細胞傷害性T細胞の惹起を助けるサイトカイン環境を作り上げていることを示唆する。CTLが感染細胞からのウイルスの排除によるウイルス感染からの回復、及び変異型インフルエンザ株に対する交差保護に関して重要であることから、これは有益である。
実施例11
3価の製剤の免疫原性
3価のプロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンを、インフルエンザ・ウイルスのA/Beijing/26/95(H1N1)、A/Sydney/05/97(H3N2)、及びB/Yamanashi/166/98サブタイプからの界面活性剤分解抗原を用いて実施例3に概説した手順を用いて製造した。各菌株個別に、及び3価となるようにそれらを組合せて作製したプロテオソーム−fluワクチンについて図5A〜Fに示されるとおり、それらの無プロテオソーム複合体対照に比べ菌株特異的な血清IgG(図5A、C、及びE)並びに経鼻IgA(図5B,D、及びE)応答を増強する。1価及び3価のプロテオソーム−fluワクチンにより誘導されたイムノグロブリン力価は有意に異なることはなかった。したがって、多価のインフルエンザ抗原を含むワクチンは各成分に対して個々の1価のワクチンにより誘導されるのと等価の血清及び粘膜免疫応答を誘発する。
3価の製剤の免疫原性
3価のプロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンを、インフルエンザ・ウイルスのA/Beijing/26/95(H1N1)、A/Sydney/05/97(H3N2)、及びB/Yamanashi/166/98サブタイプからの界面活性剤分解抗原を用いて実施例3に概説した手順を用いて製造した。各菌株個別に、及び3価となるようにそれらを組合せて作製したプロテオソーム−fluワクチンについて図5A〜Fに示されるとおり、それらの無プロテオソーム複合体対照に比べ菌株特異的な血清IgG(図5A、C、及びE)並びに経鼻IgA(図5B,D、及びE)応答を増強する。1価及び3価のプロテオソーム−fluワクチンにより誘導されたイムノグロブリン力価は有意に異なることはなかった。したがって、多価のインフルエンザ抗原を含むワクチンは各成分に対して個々の1価のワクチンにより誘導されるのと等価の血清及び粘膜免疫応答を誘発する。
ワクチンを、所望の量のそれぞれ個別の抗原を3価の抗原プールに組合せ、そして続けて組合せた抗原プールをプロテオソームと複合体を形成させて多価のプロテオソーム−fluワクチンを作り出すことにより製造することもできる。前述のワクチンに好適な粒子サイズの均一性及び一貫性の証明を以下の実施例14に示す。前述のワクチンの有効性の証明をインフルエンザ・ワクチンについての標準的な有効性試験、すなわち実施例3に記載のSRID試験を用いて見出した。SRID試験の使用により、ろ過していないサンプル、並びに0.8μm又は0.2μmフィルターを用いてろ過したサンプルの両者において、8:1、4:1又は2:1のいずれかのプロテオソーム:HA比で作製された多価ワクチンに使用された3の菌株のそれぞれに対して有効なHAの十分な保持率を認めた。例えばそれぞれ3の異なるプロテオソーム:HA比(8:1、4:1、及び2:1)で0.8μmフィルターの使用により、80%〜86%のHA平均保持率を3の3価ワクチンにおいて3のインフルエンザ菌株、H1N1、H3N2、及びBから認めた。これらのデータは、多価ワクチンがこの方法を用いて作製されうることを示している。
実施例12
ヒトにおける血清HAI及び鼻洗浄液中sIgAの誘導
フェーズI用量増加安全性及び免疫原性試験を健常の血清反応陰性の成人において実施した。被験者(群当たり8〜13人)の群は、14日おきに、GMPグレードのプロテオソーム−A/Beijing/262/95ワクチン又はA/Beijing/262/95抗原単体として7.5、15又は30μgHAのいずれかの2回の経鼻服用を受けた。HAI GMTを実施例5に記載のとおり測定した。ヒト鼻腔洗浄液標本中の着目の抗原に対して特異的な分泌型IgAを下記のとおり計測した。鼻腔洗浄液標本を激しく混合し、そして次に50kDの分画分子量の膜を用いた遠心濃縮器により4〜5倍濃縮した。総分泌型抗体(圧倒的に二量体分泌型IgA、つまりsIgA)を、精製ヒトsIgA標準物質を用いたヒト分泌型要素に対する抗体を含むアガロースによる一元放射免疫拡散法により計測した。抗原特異的sIgAを動的酵素結合免疫測定法(KELISA)により検出した。マイクロタイター・プレートを規定の濃度の抗原によりコードした。前記プレートの洗浄後、各濃縮鼻腔洗浄液サンプルを(典型的な標本の>95%に関して前記アッセイのダイナミック・レンジ内にシグナルを生じるための予備実験により選ばれた)1の希釈倍率での3のウェル中に加えた。インキュベーションの後、そのプレートを洗浄し、そして結合したsIgAをビオチン化ヤギ抗ヒト分泌型要素と、そしてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合したアビジンと一緒に連続的にインキュベートすることで検出した。最後の洗浄に続いて、TMB基質を加え、そして9秒ごとに5分間650nmで吸光度を計測した。過剰な検出試薬の存在下、抗原に結合したsIgAの濃度にちょうど比例する着色の速度( mOD/分)を計算した。各標本についての結果を以下の式:
標準化KELISA速度=(標本KELISA速度×150)÷
標本の総sIgA濃度
により150μg/mLの標準sIgA濃度に標準化する。
ヒトにおける血清HAI及び鼻洗浄液中sIgAの誘導
フェーズI用量増加安全性及び免疫原性試験を健常の血清反応陰性の成人において実施した。被験者(群当たり8〜13人)の群は、14日おきに、GMPグレードのプロテオソーム−A/Beijing/262/95ワクチン又はA/Beijing/262/95抗原単体として7.5、15又は30μgHAのいずれかの2回の経鼻服用を受けた。HAI GMTを実施例5に記載のとおり測定した。ヒト鼻腔洗浄液標本中の着目の抗原に対して特異的な分泌型IgAを下記のとおり計測した。鼻腔洗浄液標本を激しく混合し、そして次に50kDの分画分子量の膜を用いた遠心濃縮器により4〜5倍濃縮した。総分泌型抗体(圧倒的に二量体分泌型IgA、つまりsIgA)を、精製ヒトsIgA標準物質を用いたヒト分泌型要素に対する抗体を含むアガロースによる一元放射免疫拡散法により計測した。抗原特異的sIgAを動的酵素結合免疫測定法(KELISA)により検出した。マイクロタイター・プレートを規定の濃度の抗原によりコードした。前記プレートの洗浄後、各濃縮鼻腔洗浄液サンプルを(典型的な標本の>95%に関して前記アッセイのダイナミック・レンジ内にシグナルを生じるための予備実験により選ばれた)1の希釈倍率での3のウェル中に加えた。インキュベーションの後、そのプレートを洗浄し、そして結合したsIgAをビオチン化ヤギ抗ヒト分泌型要素と、そしてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合したアビジンと一緒に連続的にインキュベートすることで検出した。最後の洗浄に続いて、TMB基質を加え、そして9秒ごとに5分間650nmで吸光度を計測した。過剰な検出試薬の存在下、抗原に結合したsIgAの濃度にちょうど比例する着色の速度( mOD/分)を計算した。各標本についての結果を以下の式:
標準化KELISA速度=(標本KELISA速度×150)÷
標本の総sIgA濃度
により150μg/mLの標準sIgA濃度に標準化する。
得られた標準化速度は、鼻腔洗浄液中標準濃度の総sIgA中に含まれる抗原特異的sIgAの量に比例する線形(例えば力価のように動的でない)の読みを提供した。
前記プロテオソーム・ワクチンを全投与計画の完了を認め各抗原用量で十分に許容した。表4及び図6AはGMT血清HAI力価の結果を示し、そして図6Bは42日目、及び0〜42日目それぞれの鼻腔洗浄液中分泌型IgAの計測を示す。簡単に言うと、この全く血清反応陰性の人々でさえ、被験者の約50%はGMT血清HAIが上昇し、そして大部分が保護に関連する≧40の免疫力価を示した(表4)。さらに図6Aの血清HAI免疫応答の時間的経過により示されるとおり、2次服用を投与する前の14日目において3の用量レベルのそれぞれにより免疫された被験者から得た血清中に強い応答を認め、ワクチンの1回服用が大部分の個人で十分でありうることを示した。
血清HAIに加え、プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンは、最も低い(7.5μg)用量のワクチンを受けていた人の75%を含む全被験者の85%超において粘膜sIgA(≧2.9倍)の有意な上昇を誘導した(図6B)。これらのデータは、ヒトにおいて保護的な免疫応答を誘導する前記発明の可能性を証明する。これらの応答は、経鼻免疫に伴い粘膜応答は誘導したが血清応答に乏しかったこの年齢層におけるCAVインフルエンザ・ワクチンに関して得られたそれを上回る。
ヒトにおいて有意な免疫応答を与えるプロテオソーム−fluワクチンの用量は、低く、そしてここでプロテオソーム赤痢菌LPSワクチンによる経鼻免疫に伴う有意な全身性及び粘膜応答のために67〜100倍高い用量の抗原を必要とする従来の結果からは予測できないであろう(要約又は刊行物に投稿された原稿を参照のこと)。
実施例13
プロテオソームとインフルエンザHA抗原の複合体形成を証明するプロテオソームHAワクチン複合体についてのSDS−PAGE分析
複合体を形成していないプロテオソームは、界面活性剤の不存在下で水系に不溶であり;水溶性抗原との複合体形成がプロテオソームを溶解化する。サンプルの遠心分離により不溶画分を可溶画分から分離し、そして各成分の正体をSDS−PAGEにより決定する。可溶抗原を伴う上清中のプロテオソーム・タンパク質の存在は、界面活性剤(detergent or surfactant)の不存在下、抗原により複合体形成していない時、プロテオソーム・タンパク質は溶解性でないため抗原との複合体形成の証明となる。抗原−プロテオソーム複合体の凝集状態を決定するために、複合体サンプルを遠心分離により沈降させ存在しうる粒子を沈殿させたペレットとした。その上清を他の容器に移し、そしてそのペレットをTNSバッファーにより洗浄する。次に前記上清とペレットの両方を基準として同じゲル上に泳動した非複合体形成抗原を伴うSDS−PAGEにより分析した。そのゲルをクーマシー・ブルー染色法により染色し、写真撮影し、そして感度を増すために銀染色法により染色した。
プロテオソームとインフルエンザHA抗原の複合体形成を証明するプロテオソームHAワクチン複合体についてのSDS−PAGE分析
複合体を形成していないプロテオソームは、界面活性剤の不存在下で水系に不溶であり;水溶性抗原との複合体形成がプロテオソームを溶解化する。サンプルの遠心分離により不溶画分を可溶画分から分離し、そして各成分の正体をSDS−PAGEにより決定する。可溶抗原を伴う上清中のプロテオソーム・タンパク質の存在は、界面活性剤(detergent or surfactant)の不存在下、抗原により複合体形成していない時、プロテオソーム・タンパク質は溶解性でないため抗原との複合体形成の証明となる。抗原−プロテオソーム複合体の凝集状態を決定するために、複合体サンプルを遠心分離により沈降させ存在しうる粒子を沈殿させたペレットとした。その上清を他の容器に移し、そしてそのペレットをTNSバッファーにより洗浄する。次に前記上清とペレットの両方を基準として同じゲル上に泳動した非複合体形成抗原を伴うSDS−PAGEにより分析した。そのゲルをクーマシー・ブルー染色法により染色し、写真撮影し、そして感度を増すために銀染色法により染色した。
非複合体形成を基準ゲージとして泳動する。プロテオソームの基準ゲージ及び分子量マーカーは:OMP001基準ゲージ:GMPプロテオソームの混合物ロット:0175、0566、0621、0621である。
分子量マーカー:Broad Range SDS−PAGE Standard
1:4〜8:1の範囲をとるPr:HA比を含む複合体を有するプロテオソーム−fluワクチンを作製した。ワクチンを、免疫原性及び前記のとおり遠心分離されたサンプル上清中のプロテオソーム・タンパク質の存在により示される複合体形成の生化学的証明に関して試験した。プロテオソーム・タンパク質の特徴的なバンドがHAインフルエンザ抗原を伴って上清中にSDS−PAGEゲルにより認められたため、そのデータはプロテオソームとHA flu抗原の複合体形成の証拠を示す。前記上清中のプロテオソームの存在は、複合体を形成しないとプロテオソームが水性基質中で不溶であるため複合体形成の証明となる。驚いたことに、高いプロテオソーム対HA比、例えば4:1(特に)又は8:1を含む好ましい態様を使用した時、上清中にそれに比例したさらなるプロテオソームを確認した一方で、低い比を使用した時、減少したプロテオソームを確認した。明らかに、高いPr:HA比(例えば4:1)での製剤は高い複合体形成を可能にし、そして低い比ではインフルエンザ・抗原との効果的な複合体形成を可能にする用量限度量のプロテオソームを含まなかった。
1:4〜8:1の範囲をとるPr:HA比を含む複合体を有するプロテオソーム−fluワクチンを作製した。ワクチンを、免疫原性及び前記のとおり遠心分離されたサンプル上清中のプロテオソーム・タンパク質の存在により示される複合体形成の生化学的証明に関して試験した。プロテオソーム・タンパク質の特徴的なバンドがHAインフルエンザ抗原を伴って上清中にSDS−PAGEゲルにより認められたため、そのデータはプロテオソームとHA flu抗原の複合体形成の証拠を示す。前記上清中のプロテオソームの存在は、複合体を形成しないとプロテオソームが水性基質中で不溶であるため複合体形成の証明となる。驚いたことに、高いプロテオソーム対HA比、例えば4:1(特に)又は8:1を含む好ましい態様を使用した時、上清中にそれに比例したさらなるプロテオソームを確認した一方で、低い比を使用した時、減少したプロテオソームを確認した。明らかに、高いPr:HA比(例えば4:1)での製剤は高い複合体形成を可能にし、そして低い比ではインフルエンザ・抗原との効果的な複合体形成を可能にする用量限度量のプロテオソームを含まなかった。
実施例14
プロテオソームのインフルエンザHA抗原との複合体形成を証明するプロテオソームHAワクチン複合体の粒子サイズ分析
さまざまな割合のPr−HA複合体を説明する数加重log 分析粒子サイズをBrookhaven Instruments model 90 plus粒子サイズ分析装置により計測した。図8に示されるとおり、1超:1のPr:HA比をもつ1価及び3価のプロテオソーム−fluワクチンは、プロテオソームを伴わない分解flu HA対照ワクチンのそれよりも明らかに大きな粒子サイズ分布を含んだ。各ワクチン製剤が入るサイズの範囲は狭く、そしてそのワクチン製剤のパラメーターに特徴的であったことに留意のこと。有効平均サイズは、プロテオソーム:HAに依存した、これらの平均値を囲む典型的なベル形曲線の粒子サイズ分布をもつ約150〜1,000nmの範囲をとり、そして固有の抗原、並びに剤パラメーター、例えば使用した界面活性剤のタイプ又はろ過フィルターのサイズに特徴的である。
プロテオソームのインフルエンザHA抗原との複合体形成を証明するプロテオソームHAワクチン複合体の粒子サイズ分析
さまざまな割合のPr−HA複合体を説明する数加重log 分析粒子サイズをBrookhaven Instruments model 90 plus粒子サイズ分析装置により計測した。図8に示されるとおり、1超:1のPr:HA比をもつ1価及び3価のプロテオソーム−fluワクチンは、プロテオソームを伴わない分解flu HA対照ワクチンのそれよりも明らかに大きな粒子サイズ分布を含んだ。各ワクチン製剤が入るサイズの範囲は狭く、そしてそのワクチン製剤のパラメーターに特徴的であったことに留意のこと。有効平均サイズは、プロテオソーム:HAに依存した、これらの平均値を囲む典型的なベル形曲線の粒子サイズ分布をもつ約150〜1,000nmの範囲をとり、そして固有の抗原、並びに剤パラメーター、例えば使用した界面活性剤のタイプ又はろ過フィルターのサイズに特徴的である。
実施例15
電子顕微鏡による複合体形成の証明
標識プロテオソーム−flu(1価A/Beijing)複合体のEM像を得た。抗HAモノクローナル抗体及びプロテインA−金により標識した場合の4:1 Pr:HAワクチン複合体の透過電子顕微鏡(TEM)像は、大部分のHAが複合体ワクチンの粒子又は粒子凝集体の小胞構造に結合されている。いくつかの標識跡は粒子に結合されていない。
電子顕微鏡による複合体形成の証明
標識プロテオソーム−flu(1価A/Beijing)複合体のEM像を得た。抗HAモノクローナル抗体及びプロテインA−金により標識した場合の4:1 Pr:HAワクチン複合体の透過電子顕微鏡(TEM)像は、大部分のHAが複合体ワクチンの粒子又は粒子凝集体の小胞構造に結合されている。いくつかの標識跡は粒子に結合されていない。
抗HAモノクローナル抗体と一緒にインキュベートし、続いてプロテインA−金と一緒にインキュベートした4:1 Pr−HA複合体の走査電子顕微鏡(SEM)像は、小胞の三次元構造の証拠を示す。金粒子の見かけの明るさは、小胞の裏の方が不鮮明に、そして小胞の表よりも弱く見え、小胞−金粒子内のそれらの位置に依存する。
Claims (49)
- ウイルス感染症に対して有効なワクチンの製造方法であって、以下の:
界面活性剤の存在下、プロテオソーム製剤と少なくとも1のインフルエンザ血球凝集素抗原とを2:1又は2超:1の重量対重量比で混合した混合物を用意し;
界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除去してプロテオソーム−抗原組成物を得;そして
上記組成物をワクチンに配合する、
ことを含む上記方法。 - 前記比が8:1又は8超:1である、請求項1に記載の方法。
- 2以上のインフルエンザ血球凝集素抗原を含む、請求項1に記載の方法。
- 感染症に対して有効なワクチンの製造方法であり、以下の:
界面活性剤の存在下、少なくとも1の感染性タンパク質抗原とプロテオソーム製剤との混合物を用意し、ここで、上記混合物中のプロテオソーム対抗原の重量対重量比が2:1又は2超:1であり;
界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除去してプロテオソーム−抗原組成物を得;そして
上記組成物をワクチンに配合する
ことを含む上記方法。 - 前記比が8:1又は8超:1である、請求項4に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法により製造されたワクチン。
- 請求項1に記載の方法により製造された、プロテオソームを配合されて少なくとも1のインフルエンザ血球凝集素(HA)を含むインフルエンザ・ワクチン。
- 前記HAとプロテオソームが、光散乱により計測されるとき150〜1,000nmの範囲のメジアン径をもつ粒子の形態である、請求項7に記載のワクチン。
- プロテオソーム対インフルエンザHA比が2:1又は2超:1である、請求項7に記載のワクチン。
- 前記比が8:1又は8超:1である、請求項9に記載のワクチン。
- ウイルス感染症に対して有効な多価ワクチンの製造方法であって以下の:
界面活性剤の存在下、プロテオソーム製剤と少なくとも2のウイルス・タンパク質抗原とを2:1又は2超:1の重量対重量比で混合した混合物を用意し;
界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除去してプロテオソーム−多価抗原組成物を得;そして
上記組成物をワクチンに配合する、
ことを含む上記方法。 - 前記少なくとも2のウイルス抗原がインフルエンザ・ウイルス由来である、請求項11に記載の方法。
- 前記少なくとも2のウイルス・タンパク質抗原がインフルエンザ血球凝集素(HA)である、請求項12に記載の方法。
- 前記比が8:1又は8超:1である、請求項11に記載の方法。
- 感染症に対して有効な多価ワクチンの製造方法であって、以下の:
界面活性剤の存在下、少なくとも2のウイルス・タンパク質抗原とプロテオソーム製剤との混合物を用意し、ここで上記混合物におけるプロテオソーム対ウイルス抗原比が2:1又は2超:1であり;
界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除去してプロテオソーム−多価抗原組成物を得;そして
上記組成物をワクチンに配合する
ことを含む上記方法。 - 前記比が8:1又は8超:1である、請求項15に記載の方法。
- ウイルス感染症に対して有効なワクチンの製造方法であり、請求項1に記載のとおり製造した、少なくとも1のインフルエンザ血球凝集素抗原をそれぞれ含む少なくとも2の組成物を混合し、そして上記組成物をワクチンに処方することを含む上記方法。
- 感染症に対して有効な多価ワクチンの製造方法であり、以下の:
請求項4に記載のとおり製造した、少なくとも1のタンパク質抗原をそれぞれ含む組成物を混合し、そして
上記混合物をワクチンに処方し、
ここで上記混合物においてプロテオソーム対ウイルス抗原の重量対重量比が2:1又は2超:1である、
ことを含む上記方法。 - 対象におけるインフルエンザに対する免疫応答の誘発のための医薬組成物であり、上記応答の誘発に有効な一定量の請求項7に記載のワクチンを含む上記医薬組成物。
- 前記対象がヒトである、請求項19に記載の医薬組成物。
- 経鼻経路により投与される、請求項19に記載の医薬組成物。
- 非経口経路により投与される、請求項19に記載の医薬組成物。
- 筋中注射により投与される、請求項22に記載の医薬組成物。
- 前記界面活性剤が2以上の界面活性剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 0.2又は0.8μmフィルターによりろ過される、請求項1に記載のとおり製造した組成物。
- 0.2又は0.8μmフィルターによりろ過される、請求項4に記載のとおり製造した組成物。
- 0.2又は0.8μmフィルターによりろ過される、請求項11に記載のとおり製造した組成物。
- 0.2又は0.8μmフィルターによりろ過される、請求項15に記載のとおり製造した組成物。
- アレルギーに対して有効なワクチンの製造方法であって、以下の:
界面活性剤の存在下、プロテオソーム製剤と少なくとも1のアレルギー・タンパク質抗原とを2:1又は2超:1の重量対重量比で混合した混合物を用意し;
界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除去してプロテオソーム−抗原組成物を得;そして
上記組成物をワクチンに配合する、
ことを含む上記方法。 - 前記アレルギーが、粘膜又は摂取経路を介して獲得された、請求項29に記載の方法。
- 前記タンパク質抗原が、細胞表面タンパク質抗原又は内在性タンパク質抗原である、請求項29に記載の方法。
- 前記タンパク質抗原が、組み換え抗原である、請求項30に記載の方法。
- 癌に対して有効なワクチンの製造方法であって、以下の:
界面活性剤の存在下、プロテオソーム製剤と少なくとも1の癌抗原とを2:1又は2超:1の重量対重量比で混合した混合物を用意し;
界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除去してプロテオソーム−抗原組成物を得;そして
上記組成物をワクチンに配合する、
ことを含む上記方法。 - 前記抗原が、細胞表面タンパク質抗原又は内在性タンパク質抗原である、請求項33に記載の方法。
- 前記抗原が、ウイルス抗原である、請求項33に記載の方法。
- 前記抗原が、組み換え抗原である、請求項33に記載の方法。
- 生物学的脅威物質(biologic threat agent)に対して有効なワクチンの製造方法であって、以下の:
界面活性剤の存在下、少なくとも1の生物学的脅威物質抗原とプロテオソーム製剤との混合物を用意し;
界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除去してプロテオソーム−抗原組成物を得;そして
上記組成物をワクチンに配合する、
ことを含む上記方法。 - 前記生物学的脅威物質抗原が、毒素である、請求項37に記載の方法。
- アレルギー、癌又は生物学的脅威物質に対して有効な多価ワクチンの製造方法であって、以下の:
界面活性剤の存在下、少なくとも2の、アレルギー、癌又は生物学的脅威タンパク質抗原とプロテオソーム製剤との混合物を用意し;
界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除去してプロテオソーム−多価抗原組成物を得;そして
上記組成物をワクチンに配合する、
ことを含む上記方法。 - アレルギーに対して有効なワクチンの製造方法であり、請求項29に記載の方法により製造した、少なくとも1のアレルギー・タンパク質抗原をそれぞれ含む少なくとも2の組成物を混合し、そして上記組成物をワクチンに処方することを含む上記方法。
- 癌又は生物学的脅威物質に対して有効なワクチンの製造方法であり、請求項33又は請求項37に記載の方法により製造した、少なくとも1の癌又は生物学的脅威タンパク質抗原をそれぞれ含む少なくとも2の組成物を混合し、そして上記組成物をワクチンに処方することを含む上記方法。
- 請求項29〜41のいずれか1項に記載の方法により製造したワクチン。
- 配合の前に0.2又は0.8μmフィルターによりろ過される、請求項29に記載の方法により製造した組成物。
- 0.2又は0.8μmフィルターによりろ過される、請求項33に記載の方法により製造した組成物。
- 0.2又は0.8μmフィルターによりろ過される、請求項37に記載の方法により製造した組成物。
- 0.2又は0.8μmフィルターによりろ過される、請求項39に記載の方法により製造した組成物。
- 0.2又は0.8μmフィルターによりろ過される、請求項40に記載の方法により製造した組成物。
- 感染症、癌、アレルギー又は生物学的脅威物質に対する免疫応答の2型応答から1型応答に向けた転換に有効なワクチンの製造方法であって、以下の:
界面活性剤の存在下、少なくとも1の感染性、癌、アレルギー又は生物学的脅威タンパク質抗原とプロテオソーム製剤との混合物を用意し;
界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除去してプロテオソーム−抗原組成物を得;そして
上記組成物をワクチンに配合する、
ことを含む上記方法。 - 請求項1,4,11,15,29,33,37〜41、又は48のいずれか1項に記載の方法により製造した組成物を含む、動物における感染症、アレルギー、癌又は生物学的脅威物質の予防、あるいは治療のための医薬組成物。
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