JPH08508247A

JPH08508247A - 粘膜表面への免疫原の輸送における重合的粘膜付着体

Info

Publication number: JPH08508247A
Application number: JP6520245A
Authority: JP
Inventors: ジャクリーンディーダンカン; デニスピー．スカファー
Original assignee: セクレテック，インク．
Priority date: 1993-03-11
Filing date: 1994-03-11
Publication date: 1996-09-03
Also published as: CA2158040A1; WO1994020070A1; BR9405996A; AU692440B2; EP0688205A1; AU6361694A; CN1120310A

Abstract

(57)【要約】動物の体内で、感染体に対する免疫応答を誘導するための薬剤組成物は、感染体に対する抗原、粘膜付着剤、および、選択的にはアジュバントを含み、動物の体内での免疫応答を高める。好ましくは、抗原はインフルエンザウイルスに由来するものである。本発明の薬剤組成物は、この組成物を動物に経口投与することによって動物を免疫化する方法において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】粘膜表面への免疫原の輸送における重合的粘膜付着体関連する出願の相互参照本出願は、既に放棄された1993年3月11日に出願された出願番号08/029,668（代理人整理番号05060-0003-00000）の一部継続出願である、1993年9月13日に出願された出願番号08/119,578（代理人整理番号05060-0003-01000）の一部継続出願である。これらの各明細書の開示全ては、参照文献として本明細書に包含される。発明の背景免疫原の経口投与は、費用対効果が高く、安全で、コンプライアンスを促進する（患者が確実に服用する）。小腸の免疫原応答組織及び細胞を刺激すると、共通の粘膜免疫系により、他の粘膜表面の、防御的な免疫応答を刺激することは、既によく確認されている。この刺激は血清の反応をも引き起こす場合もある。しかしながら、今日、医療業務における、経口ワクチンの使用は少数のワクチンに限られている。典型的には、経口免疫法では、防御的免疫応答を誘導するために必要な免疫源の用量がかなり多くなり、ワクチンによっては、経口的に投与した場合に、免疫応答を誘起できないものもある。さらに、ワクチンの安全性を高めようとして、弱毒化ワクチンや合成またはサブユニットで調製されたワクチンを用いると、大抵は元のままの抗原より効能の劣った抗原の調製物になってしまいがちである。ムラミルジペプチドやフッ化物を含む様々なアジュバントが、免疫細胞の応答能力を刺激して、免疫反応を高めるために、実験的な経口ワクチンとともに用いられてきた。アジュバントに代わるものとして、抗原を粒子状に”パッケージ” し、免疫系の細胞によって取り込まれやすい形状にして、抗原提示するというものがある。例えば、重合したミクロ粒子やナノ粒子あるいはリポソームに取り込まれたり、付着したりした抗原は、可溶性の抗原に較べて、しばしば免疫原性が強い。これらの粒状の抗原は、粘液にトラップされたり、腸粘膜のＭ細胞により選択的に捕食されたりするので、より効果的かもしれない。上皮細胞に選択的に結合する免疫原（例えば、インフルエンザの赤血球凝集素、コレラ菌）を用いたり、あるいはこれらの細胞に選択的に結合する化合物（赤痢菌やシュードモナス菌のような腸内細菌の付着因子、コレラや百日咳のトキソイド、あるいは花粉粒）を免疫原に連結させたりすることによって、経口免疫後の免疫応答を増大させることもできる。それでもなお、粘膜表面に投与した免疫原に対する免疫反応を増強させるための方法や組成物に関する技術上の需要は、いまだに存在している。発明の要約本発明の目的は、粘膜表面に投与された免疫原に対する免疫反応を強化することにある。本発明の一つの態様において、免疫原を重合的粘膜付着剤に会合させることにより、経口あるいは他の粘膜を経由して免疫した後の免疫反応を誘導ないし強化する。薬剤輸送（殊に、経皮性及び口内性装置による）における、粘膜付着剤ないし他の生体付着因子の理論上または実用上の価値は、当業者によく知られているが、粘膜付着剤をもった免疫原を免疫反応を促進するために利用することは、これまで知られていない。本発明の別の態様において、免疫原および重合的粘膜付着剤にアジュバントを含ませることにより、経口あるいは他の粘膜を経由して免疫した後の免疫反応を誘導ないし強化する。粘膜付着剤に結合した免疫原を経口投与するときのアジュバントの有効性は以前には知られていない。詳細な説明免疫原を宿主に皮下注射すれば、良好な免疫反応を起こせることが、薬剤技術において知られている。さらに、免疫原の粘膜投与、特に経口投与も、ある場合には、至適状態以下でではあるが、免疫反応を誘導できる。本発明の免疫組成物と免疫方法は、免疫原を宿主の粘膜表面に投与したときに、宿主の体内で免疫反応を促進させることを可能にする。この投与方式を用いれば、いくつかの場合には、その強度と持続性において、同じ抗原を皮下注射によって宿主に投与したときに得られる反応にほとんど匹敵するような全身性の免疫反応を実現する一方で、皮下注射や、単独で粘膜に抗原を投与したときよりも強い粘膜性免疫反応を得ることが、本発明によって可能になった。本発明は、宿主の免疫応答を刺激するために、ヒトあるいは獣医学上用いられることが知られている、従来からの免疫原のいずれかを含む免疫組成物とともに実施することができる。ここで用いる「免疫原」という用語は、体内に導入されると、体液性、粘液性あるいは細胞性の免疫を刺激する物質を意味する。ここでは、「免疫原」という用語と「抗原」という用語は、同じ意味を持つものとして用いられる。ここで使われる「免疫応答」という語は、免疫原に接触すると、外来抗原に対する反応性が特異的に変化してゆく過程を意味する。この変化は、抗原に対する粘膜ないし血清抗体の増加によって示されるか、あるいはサイトカインの活性や増殖などの細胞性免疫を測定することによって示される。本発明によって生ずる免疫応答は、ELISA法によって測定された唾液のIgA量の変化のような、粘膜性免疫の変化を測定することにより、またはELISA法によって測定される抗体レベルの変化といった全身性免疫の変化を検定することにより、あるいはＴ細胞の増殖反応を測定するなどして細胞性免疫の変化を検定することにより、簡便に検定される。インフルエンザウイルスに対して免疫する場合には、血清の赤血球凝集素抑制力価（ＨＩ）を測定するのも便利である。これらの解析技術を採用すると、本発明により、インフルエンザの場合、マウスにおいては、同じ材料を等量、皮下注射した後に得られるのとほぼ同じ程度の免疫応答を、ほぼ同じ経過期間内に得ることが可能になった。本発明による、経口あるいは他の粘膜経由で免疫した後に、共通の粘膜免疫系を刺激するよう用いることのできる免疫原の種類には、制約なしに以下のものが含まれる。１）粘膜表面に抗原投与されると免疫応答を誘導することができる、あらゆる伝染病の抗原で、特に天然の粘膜性免疫原（例えば、インフルエンザウイルス、および、大腸菌やコレラ菌、Helicobacter菌などの腸内細菌の抗原）を含み、抗原ないしリガンドと粘膜上のレセプター間の特異的相互作用によって粘膜上皮に結合するもの、２）生の弱毒化された腸内性病原体（例えば、ポリオウイルス、ロタウイルス）、３）合成された粒状抗原（例えば、抗原を含むマイクロスフェアやナノスフェア）、４）粘膜に結合するアレルゲン（例えば、ブタクサの花粉）、５）自己抗原および組織抗原（例えば、ミエリン塩基性蛋白質、ＣＤ４、メラノーマ特異的蛋白質）。免疫原は、そのままの、完全な免疫原であったり、改変された免疫原であったり、これらの合成免疫原ないしサブユニットであるかもしれないが、これらの材料は、ウイルス（例えば、インフルエンザ、ＨＩＶ、ロタウイルス、肝炎ウイルス）、細菌（例えば、赤痢菌、百日咳菌あるいはクラミジア菌）、真核寄生生物（例えば、マラリアの原因生物であるプラスモディウム）、毒素（例えば、コレラ毒、内毒素）、アレルゲン（例えば、ブタクサ花粉）、組織マーカー（例えば、メラノーマ、ＣＤ４、あるいはミエリン塩基性蛋白質）に由来する。本発明の好ましい態様において、免疫原はウイルスに由来する。本発明は、ワクチンを必要としている広範なウイルスに適用することができる。本発明は、特に、通常の呼吸器性あるいは腸内性のウイルスに対して用いるのに適している。実例をあげて説明するために、ここではインフルエンザウイルスについて述べるが、本発明をここで述べる態様で用いられるインフルエンザウイルスやインフルエンザウイルスの系統に限定する意図はない。本発明を用いて対応しうる他のウイルスには、例えばパラインフルエンザウイルスやＲＳウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、アデノウイルスがある。インフルエンザウイルスの場合には、ワクチンが由来するウイルスの選択は、予防しようとするインフルエンザの系統またはサブタイプが何かにもよるであろう。ある特定のインフルエンザの系統に対して有効なワクチンを得るためには、ワクチンが用いられる系統と、少なくとも一つは共通の抗原決定基を持っているインフルエンザの系統を、ワクチンの出発材料として用いることが好ましい。所与のサブタイプの異なった系統を用いるのと同じように、本発明があらゆる動物インフルエンザウイルスのタイプやサブタイプにも用いることができることが理解できるであろう。インフルエンザウイルスは、典型的にはニワトリやアヒルあるいはブタなどの動物に感染する。本発明は、殊にヒトを含む霊長類に用いるのに適している。したがって、例えば、本発明は、ヒトのインフルエンザのサブタイプであるH0N1、H3N8、H2N2（流行性アジア型ウイルス）、H3N2（流行性香港型ウイルス）、H1N1（流行性ロシア型ウイルス）、あるいは抗原連続変異によるサブタイプだけでなく、抗原不連続変異によって生じた他のウイルスのサブタイプに用いることができる。本発明において用いられた既知のサブタイプの系統の実例はインフルエンザウイルスA/Udorn/307/72（H3N2）で、これはB.R.Murphy 博士（国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）から贈与されたものである。このサブタイプは、リスザルやネズミにも感染する、ヒトインフルエンザウイルスの一系統である。A/Udorn/307/72サブタイプは、マウス感染モデル系のような動物実験に用いるのに充分適している。本発明において、粘膜付着剤は、免疫原の粘膜免疫系への輸送効率を高めるために、抗原とともに用いられる。最近では様々な粘膜付着剤が、製薬業においては、薬剤輸送のためのフィルム形成体や増粘剤などとして用いられており、食品業においても用いられている。そして、これらの粘膜付着剤は、一般に、食品および薬品を管理する当局によって安全だと認められている。これには以下の実例が含まれる。カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボポル、ポリカルボフィル、アルギン酸ナトリウム、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース。発明者らは、経口免疫すると、粘膜付着剤とムチン層の相互作用によって、粘膜付着剤とそれに結合した免疫原が、すべての腸粘膜に接しているムチン層に結合できるようになると考える。この結合は、（１）化合物を中央腸管腔から、粘膜上皮に接し、比較的固定した粘膜層に移動させて、化合物が腸粘膜の免疫細胞およびその免疫応答性のある細胞と相互作用できる時間幅を増加すること、（２）化合物を腸管腔中の大量の分泌液や物質から分離して、粘膜に接した比較的薄いムチン層に移すことにより化合物の実効濃度を上昇させること、また、（３）ムチン層では重合ムチンが拡散性の障壁になって、腸中のpHの変化や代謝酵素から分子を保護するため、免疫原をこのムチン層の中に回収することで、免疫原が変性するのを防ぐこと、などによって粘膜とそれに結合した化合物の相互作用の効率を上昇させるかもしれない。免疫原と粘膜付着重合体の相互作用により、免疫原は相変化や胆汁酸の界面活性作用から保護されるかもしれない。最終的に、粘膜付着剤は、その疎水性により、周囲から水分を除去する脱水粘膜付着剤になる。このような粘膜上皮層の脱水は免疫原の生物的利用能を高めることになる。さらに、免疫原が重合体に結合すると免疫原を安定化させることができる。これらの要素は粘膜付着剤の有効性を説明するものではあるが、発明者らはこれらの説明の厳密性によって制約されることは望んでいない。既知の粘膜付着剤は、疎水結合やファンデルワールス力、荷電基間の相互作用、重合体の混合、直鎖結合、特異的残基の結合、レセプターとリガンドの相互作用などの、一つ以上の機構により、負の電荷を帯びて、重合したムチンに結合する重合体である。既知の粘膜付着剤はすべて重合体で、文献上も当然のこととして扱われているが、単量体の粘膜付着剤も存在し得よう。粘膜付着剤は、一般に、それ自体は免疫原性がなく、多くのものは人体にも安全である。これらは、現在、擬似粘膜剤、外科用接着剤、創傷治療用添加剤などとして用いられ、抗下痢剤や抗便秘剤の中にも用いられ、薬剤の輸送のためにも用いられている。粘膜付着剤は、ペプチド薬を含む薬剤の経皮輸送システムや、薬剤（例えば、利尿剤やインシュリン）の鼻腔輸送、口腔内へ薬剤（例えば、ステロイド）を制御して局所輸送することに応用して成功してきた。粘膜付着剤は非経口免疫において貯蔵アジュバントとして用いられており、また、ペプチド薬の輸送のための制御された投薬システムになる可能性があるとして研究されてきたが、これまでにワクチンの粘膜輸送のためには利用されてこなかった。粘膜付着剤として働くと考えられている化合物の例には以下のものが含まれる。カルボキシメチルセルロースナトリウムポリ（アクリル酸）トラガカントポリ（無水メチル・ビニルエーテル・コマレイン酸）ポリ（酸化エチレン）メチルセルロースアルギン酸ナトリウムヒドロキシプロピルメチルセルロースカルヤゴムメチルエチルセルロース可溶デンプンゼラチンペクチンポリ（ビニルピロロジン）ポリ（エチレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）ポリ（ヒドロキシエチルメチルアクリル酸）ヒドロキシプロピルセルロースカルボポルポリカルボフィルこれらの粘膜付着剤は、本発明の組成物及び方法において用いることができる。好ましい粘膜付着剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウムと他のセルロース化合物、ポリカルボフィルおよびカルボポルである。カルボキシメチルセルロースナトリウムは特に好ましい粘膜付着剤である。これらの粘膜付着剤の混合物も利用できると考えられよう。本発明の免疫組成物は、宿主における免疫応答の感度あるいは持続期間を増加し、免疫原によって刺激を受ける免疫グロブリンだけでなく、異なった免疫グロブリンクラスに属する抗体を刺激したりして、被検者の応答の質を向上するのに充分な量のアジュバントをも含むことが出来る。アジュバントは、宿主の身体に全身または局所的な刺激を与えることなしに、細胞性および液性免疫応答を効果的に誘導するはずである。好ましくは、アジュバントは低発熱性であることが望ましい。よく知られたアジュバントの処方をヒトや家畜に適用するために利用できる。このようなアジュバントはマイコバクテリア含む、あるいは含まない乳化剤に基ずくもの、又はアルミニウム塩に抗原を吸着させたものに基ずき、特に水酸化アルミニウムあるいはリン酸アルミニウムに吸着させたものである。これらのアジュバントの中には、鉱物性、動物性または植物性の油脂を基にした油性アジュバントもある。油脂を基にしたアジュバントは、家畜動物のワクチンを抗原とし、これに対する液性応答を促進するのに有用である。そして、一定の油脂性アジュバントがヒトへの使用のために試験されてきた。典型的なアジュバントはフロイントの完全アジュバントとフロイントの不完全アジュバントである。さらに最近になって開発された適当なアジュバントには、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭｓ）、およびスクアレンまたはスクアレン乳液がある。アジュバント活性をもつ界面活性剤も利用できるであろう。これらには、ＩＳＣＯＭｓにおけるサポニン様クワイルＡ分子、およびスクアレン乳液を安定化させるために用いられるPluronicブロック共重合体が含まれる。サポニンは植物に広く分布する界面活性剤である。ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）のスレオニン類似体やリポ多糖（ＬＰＳ）といったＭＤＰあるいはムラミルトリペプチド（ＭＴＰ）の類似体で、アジュバント活性があり副作用を弱めたものも、アジュバントとして用いるのに適している。ＬＰＳはマウスにおいて良い効果を生むことが分かっている。ＭＤＰの合成類似体および脂質Ａの一リン酸誘導体もアジュバント活性があり、発熱性が低いことで知られている。他の適当なペプチドは合成ムラミルペプチドＭＴＰ−ＰＥ（Ｎ −アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン− ２−［１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシフォスフォリルオキシ）］エチルアミド）である。特に適した処方はシンテックス・アジュバント処方−１即ちＳＡＦ−１で、これはプルロニックＬ-１２１トリブロック重合体を含む賦形剤におけるＭＤＰのスレオニン類似体をスクアレン及び乳化用界面活性剤としてのＴＷＥＥＮ８０と組み合わせたものである。ヒトに用いるのに好ましいアジュバントは、ＭＤＰとその類似体で、スクアレン、サポニンあるいは脂質Ａの一リン酸誘導体を含んだり、含まなかったりするものである。その他の化合物でも、抗原と共に経口的に投与するとアジュバントの性質を持つものが見つかっている。これらのアジュバントには、ウシ胆汁、ＤＥＡＥ−４デキストランやポリオルニチンなどのポリカチオン、ドデシルベンジン硫酸ナトリウム、脂質結合物質、ストレプトマイシン、ビタミンＡ、および、他の薬品で、それらが付着する粘膜表面の構造または機能の維持に影響するものなどが含まれる。本発明の組成および方法において、アジュバントが免疫原および粘膜付着剤と組み合わされると、免疫応答がさらに強化されるのが観察される。再言すると、いずれの作用説にも結び付けられていないが、粘膜付着剤は免疫原とアジュバントの応答細胞への提示を促進し、それによってこれらの基質の効果を相助作用的な態様で高めると考えられる。抗原を投与するために粘膜付着剤を利用できる粘膜表面には胃腸粘膜（胃、小腸、大腸、結腸、直腸を含む）、口部粘膜（頬部と食道粘膜およびへん桃表面を含む）、呼吸器粘膜（鼻腔、咽頭、気管及び気管支粘膜を含む）、性器（膣、頸管および尿道粘膜を含む）、および眼の粘膜が含まれる。本発明に係る組成物の宿主への好ましい投与経路は、口腔、鼻腔、直腸経由および、綿棒による扁桃への塗布である。経口投与は、簡単で、比較的侵襲性でないため、特に好ましい投与方法である。また、何れの投与方法を組み合わせることもできると考えられる。例えば、最初の用量を経口的に投与し、鼻腔経由で効能促進剤を投与する、あるいはその逆などである。本発明の免疫組成物はワクチンにも利用できると考えられる。ワクチンは、免疫原として一つ以上の病原生物に由来する抗原を含む治療用物質であり、抗原をヒトあるいは動物に投与すると、能動免疫を刺激して、病原生物またはそれに関連する生物の感染を防御したり感染強度を弱めることができる。ワクチンは、生ワクチン、不活化ワクチン、弱毒ワクチンあるいはサブユニットまたは混合ワクチンである。本発明に係る組成物は、いずれかの適当な輸送システムと組み合わせることもできる。例えば、抗原、粘膜付着剤およびアジュバントは、水、緩衝食塩水あるいは動植物から採った食用油など、薬学上許容される液状の賦形剤と組み合わせることができる。本組成物は、セルロース、セルロース誘導体、ショ糖、ゼラチン、スターチ1500、NuTab、ラクトース、マルトデキストリン、滑石、Cabosil、ステアリン酸マグネシウム、アルギン酸、Actisol、PEG 400、Myvacet、Triacet ine、シロップ、油脂、ソルビトール、マンニトールあるいはPlasdoneのような薬事上許容される一つ以上の適当な賦形剤ないし芯素材と組み合わせることもできる。ここに挙げたリストは網羅的なものではなく、また列挙したものに限定しようというものでもないので、これらに代わるあるいはこれらに加えて他の賦形剤ないし芯素材を用いることができる。本発明に係る組成物は、胃の中のpHを中和できる化学試薬をも含ませて処方化できると考えられる。適当な中和剤には、Ｈ２拮抗薬、重炭酸ソーダ、炭酸カルシウム、水酸化アルミニウムなどが含まれる。本発明に係る組成物は、エリキシル剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エアゾール剤などの形で利用できる。本組成物は、また、粒子、顆粒、ビーズ、錠剤、ゼラチン硬性カプセル、ゼラチン軟性カプセルなどの経口投与に適した用量単位で調製できる。免疫組成物は、抗原、粘膜付着剤またはアジュバントが目的の部位に到達する前に崩壊するのを防ぐための処理を施すことができる。一つの態様において、調剤単位、例えば、錠剤やカプセル毎に、全コーティング、ウルスター法あるいは先端スプレー法などによる流動床コーティング、スプレー乾燥、乳化あるいは微小カプセル化法などの従来の方法を用いて、腸内用にコーティングされる。選択的には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースやOpadry、Drycleanなどの副コーティング剤も利用することができる。それぞれの用量単位毎に腸内用コーティングが施される。腸内用コーティングは薬剤として許容される素材で、抗原を保護し、腸内で抗原を放出するものである。副コーティングまたは腸内コーティングの選択と量は当業の範囲内であり、部分的には調剤形態、例えば、錠剤かカプセルかにもよるであろう。適当な腸内用コーティングの例は、HPMCP55（フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、CAP（フタル酸酢酸セルロース）、Eud ragit、Aquateric、Coateric、Surlease、セラック及び蝋などである。免疫原と粘膜付着剤およびアジュバントを合わせて、感染体に対する免疫応答を起こすのに必要な量にして用いることができる。これはセロコンバージョン、即ち、免疫前と後の抗体のレベルを測定すればよい。もし、宿主が抗原に対する抗体力価を予め持っていたら、免疫が成功したか否かは特異的抗体のレベルが上昇する程度で決めることができる。セロコンバージョンと防御反応の間に相関関係がないときには、細胞免疫応答を測定することができる。免疫原と粘膜付着剤およびアジュバントの服用量単位当りの量は、望ましい服用量と投与回数による。抗原としてインフルエンザ、粘膜付着剤としてカルボキシメチルセルロース、アジュバントとしてムラミルジペプチドから成る組成物の場合、一回の用量単位には、以下の量を含ませることができる。抗原量は、約10μgから約150μgの赤血球凝集素（ＨＡ）、好ましくは約５μg から約45μg。粘膜付着剤量は約10μgから約１gであり、好ましくは、約１mgから約50mgである。そしてアジュバントの量は約１μgから約２μg、好ましくは約 10μgから約200μgである。この場合の、抗原:粘膜付着剤:アジュバントの相対重量比は、およそ5-45:1000-50000:0-200である。正確な組成は、選択した抗原、アジュバント、および粘膜付着剤や免疫する生物種によって、またその他の要素によって異ならざるを得ない。そして、至適な処方を捜し出すことは、当業者の能力の及ぶところである。効能促進剤には、初回の免疫応答を強化するのに充分な抗原量を含まれ得る。この用量は、抗原と宿主に応じた、それぞれのプロトコールに合わせて決められるべきである。子供や分かっている限り抗原との接触体験のない個体については複数回服用する方が適切である。一つの態様においては、それぞれの用量単位は、ウイルスと接触したことのある動物を病気から保護するのに有効なインフルエンザの抗原量を含んでいる。服用量は、個体において免疫応答を惹き起こすのに必要な免疫原の量として定義される。例えば、血清中の同種の中和抗体のレベルによって、その個体の、同種のインフルエンザ系統による感染に対する感受性を予測できる。約1:32から1: 40あるいはそれ以上の血清の赤血球凝集阻害力価が、同種ウイルスによる自然感染に対しても防御できる値と考えられている。したがって、好ましいインフルエンザ抗原の用量は、標準的方法で測定された、約1:32から1:40あるいはそれ以上の血清の赤血球凝集力価である。免疫原の防御効果は、また、免疫後に判明する、血清の赤血球凝集阻害レベルあるいは粘膜抗体力価レベルの上昇という形で現れる。インフルエンザに関する処置においては、免疫後７−21日間にわたって血清のＨＩ力価が４倍に上昇するのは、防御反応だとみなされる。７−21日間にわたって粘膜抗体の力価（例えば、唾液や鼻腔洗浄液中のIgA）が４倍に上昇するのは、インフルエンザに対する防御反応だとみなす者もいる。したがって、本発明によれば、免疫組成物の好ましい用量は、ヒトにおいて、特異的抗体のレベルをこれらの範囲まで上昇させるものである。免疫用量は検出可能な抗体力価になるまで調整することができ、好ましくは中和抗体力価が得られる。本発明は、あらゆる寄生、細菌、あるいはウイルスのタイプまたはサブタイプに対して、また、あるサブタイプの異なる系統に対しても、免疫原とともに用いることができると考えられる。寄生体、細菌またはウイルスは、典型的には、犬や猫、家禽類、豚、馬、牛などの動物、また特にヒトを含む霊長類などの哺乳類に感染するものである。免疫原は、粘膜付着剤かアジュバントの前か後に投与できるが、一般的には免疫原と粘膜付着剤、アジュバントは同時に対象者に対して投与される。本発明に係る免疫組成物は、単に免疫原と粘膜付着剤とアジュバントを一緒に混ぜるだけで、共有結合させたり、成分を一緒に結合させたりする必要はない。従って、本組成物は調製が容易だという付加的利点も持つ。本発明については以下の実施例においてさらに詳しく述べる。実施例１ワクチン抗原インフルエンザウイルスA/Udorn/307/72（H3N2）、BK6、Egg3、クローン3A（7 -25-89）はB.R.Murphy博士（ＮＩＨ、メリーランド州ベセスダ）から分与されたものである。このウイルスは胚発生している鶏卵に一度継代接種して、尿嚢液を保存用ウイルス（感染濃度は0.2ml当り2.53×10⁷プラーク形成単位（p.f.u.））として−130℃に保存した。胚発生後10日目の鶏卵（400-500）に、SPG（2.18M蔗糖、0.038M KH₂PO₄、0.072M K₂HPO₄、0.049Mグルタミン酸一ナトリウム）を添加したL-15培地で１:1000に希釈した0.1mlの保存用ウイルスを感染させた。35-36 ℃で48時間インキュベートした後尿嚢液を集めて、3700g_avで20分間遠心分離して不純物を除去した。そして、1000,000g_avで45分間遠心分離して上清からウイルスを回収した。このときの沈澱に0.5mlのリン酸緩衝食塩水（PBS）を加えて、一晩０℃におき、６mlのPBSで希釈し、よく混合してから、1300g_avで15分間遠心分離して凝集物を除いた。この過程を３回繰り返した。３回目の遠心分離の後、沈殿を超音波破砕して、再び遠心分離した。ウイルスの懸濁液も含めて、上清液は一つにまとめて、PBSに溶いた10-60％の蔗糖密度勾配液の一番上に載せ、スウィングローター中に入れて、1000,000g_avで２時間遠心分離した。ウイルスのバンドを回収して、PBSで1:1に希釈し、フォルマリン（1:4000v/v）を加えて37℃で72 時間インキュベートしてウイルスを不活化した。この材料をPBSで、４℃で一晩透析して、上記のように沈澱させ、PBSか水で１mlあたり５mg蛋白質になるよう再懸濁して-80℃に保存した。水酸化ナトリウムで崩壊させたウイルスの蛋白質量をクマシーブルー結合アッセイ（ピアス社、合衆国イリノイ州ロックフォード）により測定した。粘膜付着剤を付加したワクチンの調製すべての粘膜付着剤について、製造業者から入手可能な簡単な方法に従って、ゲルを調製した。本実験に用いたカルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC ）はアクアロン社（ウィルミントン、デラウエア州）から購入した。CMCゲルはH₂ Oで２％溶液にして調製した。カルボポルとポリカルボフィル・アクリル重合体は、B.F.グッドリッチ社（オハイオ州、クリーブランド）から購入した。カルボポルはH₂Oで0.25％の懸濁液に、ポリカルボフィルはH₂Oで0.5％の懸濁液に調製して、これらの重合体からゲルを作った。これらの溶液のpHは、1N NaOHを数滴加えながら、およそ３から４に上げた。アクリルポリマーの懸濁液はpHが４になるとゲルになる。アルギン酸ナトリウムは、メルク社の一部門であるケルコ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。このゲルはH₂Oで２％溶液を調製して作った。ジラクチンはジラ製薬会社（アリゾナ州フェニックス）から購入した。ジラクチンは免疫する直前に、H₂Oで1:10に希釈して、調製した。インフルエンザワクチン溶液（リン酸緩衝食塩水10μl当りウイルス蛋白質50 μg）に粘膜付着剤ゲルを混合して、ワクチンとゲルが1:50の割合になるようにした（各用量についてワクチン溶液10μl、粘膜付着剤490μl）。全ての場合、均一の溶液になるのを確認するまで、混合は約１〜２分間、単に振盪して行なった。これは免疫する直前に混合した。マウスの免疫チャールスリバーまたはジャクソン研究所から入手した５個体のBALB/cマウス（生後８週間の雌）群を用いた。ワクチン入りの粘膜付着剤（500μl）を動物給餌用の針を用いて胃内に投与した。対照用の一集団にも、インフルエンザワクチンを0.1M NaHCO₃溶液に溶かして、動物給餌用の管を通して胃内に投与した。対照用集団を全身免疫するには、粘膜付着剤に結合していない、抗原入りの食塩水（50μg／マウス）を皮下経由で接種した。サンプルの採取免疫前と免疫後一定の時期に、マウスの尾の静脈から血液を採取した。血液は遠心分離して血漿を採取して凍結した。塩化カルバミル−コリン（１μg／マウス）をマウスに腹膜注射した後、刺激を受けた唾液を毛細管を用いて採取した。ダイズ・トリプシンインヒビター、フッ化フェニルメチルスルフォニル、アジ化ナトリウムおよびウシ胎児血清をそれぞれ２μg加えてから、不純物を除去して −80℃に保存した。ＥＬＩＳＡ法抗原特異的抗体を測定するために、４μg ml^-1の濃度の、精製されたA/Udorn インフルエンザウイルスでコートした96穴のポリスチレン製微量滴定用プレート（ダイナテック社、合衆国ヴァージニア州アレキサンドリア）でELISA法を行なった。血清および唾液の滴定終点をホースラディッシュ・パーオキシダーゼで標識した、抗マウスIgまたはIgAのヤギIgG（サザンバイオテクノロジー・アソシエイツ、合衆国、アラバマ州、バーミンガム）、および、基質として2、2'−アジノ −ビス−（3-エチルベンズチアゾリン）スルホン酸（シグマ社、合衆国、ミズーリ州、セント・ルイス）を用いて測定した。Ｖマックス光度計（モレキュラー・デバイセズ、合衆国、カリフォルニア州、パロ・アルト）で414nmでの発色を測定した。ＨＩアッセイ法 PBSAで1:5に希釈されたマウス血清を用いて、赤血球凝集阻害（HI）反応を行ない、その後、非特異的阻害物質を除くための処理を（56℃で30分加熱し、酸で処理した15％カオリンを加えて30分間インキュベートし、さらにニワトリの赤血球の10％懸濁液に入れて30分間インキュベートした）行った。血清を２倍ずつ希釈したものを96穴微量滴定用プレートに用意した。ウイルス懸濁液（８HA単位で等量）を各ウエルに加えて室温で30分間インキュベートした。ニワトリの赤血球の0.5％懸濁液を各ウエルに加えて室温で45〜60分間インキュベートした。HI力価は赤血球の凝集を完全に阻害する、最も高い希釈度の逆数で表した。実施例２ワクチン抗原インフルエンザウイルスA/Udorn/307/72（H3N2）、BK6、Egg3、クローン3A（7 -25-89）はB.R.Murphy博士（ＮＩＨ、メリーランド州ベセスダ）から分与されたものである。このウイルスは胚発生している鶏卵に一度継代接種して、尿嚢液を保存用ウイルス（感染濃度は0.2ml当り2.53×10⁷プラーク形成単位（p.f.u.））として−130℃に保存した。胚発生後10日目の鶏卵（400-500）に、SPG（2.18M蔗糖、0.038M KH₂PO₄、0.072M K₂HPO₄、0.049Mグルタミン酸一ナトリウム）を添加したL-15培地で1:1000に希釈した0.1mlの保存用ウイルスを感染させた。35-36℃ で48時間インキュベートした後尿嚢液を集めて、3700g_avで20分間遠心分離して不純物を除去した。この沈澱に0.5mlのリン酸緩衝食塩水（PBS）を加えて、一晩０℃におき、６mlのPBSで希釈し、よく混合してから、1300g_avで15分間遠心分離して凝集物を除いた。この過程を３回繰り返した。３回目の遠心分離の後、沈殿を超音波破砕して、再び遠心分離した。ウイルスの懸濁液も含めて、上清液は一つにまとめて、PBSに溶いた10-60％の蔗糖密度勾配液の一番上に載せ、スウィングローター中に入れて、100,000g_avで２時間遠心分離した。ウイルスのバンドを回収して、PBSで1:1に希釈し、フォルマリン（1:4000v/v）を加えて37℃で72時間インキュベートしてウイルスを不活化した。この材料をPBSで、４℃で一晩透析して、上記のように沈澱させ、PBSか水で１mlあたり５mg蛋白質になるよう再懸濁して-80℃に保存した。水酸化ナトリウムで崩壊させたウイルスの蛋白質量をクマシーブルー結合アッセイ（ピアス社、合衆国イリノイ州ロックフォード）により測定した。粘膜付着剤を付加したワクチンの調製すべての粘膜付着剤について、製造業者から入手可能な簡単な方法に従って、ゲルを調製した。本実験に用いたカルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC ）は７ＭＦ型でアクアロン社（ウィルミントン、デラウェア州）から購入した。 CMCゲルはH₂Oで２％溶液にして調製した。カルボポルとポリカルボフィル・アクリル重合体は、B.F.グッドリッチ社（オハイオ州、クリーブランド）から購入した。カルボポルはH₂Oで0.25％の懸濁液に、ポリカルボフィルはH₂Oで0.5％の懸濁液に調製して、これらの重合体からゲルを作った。これらの溶液のpHは、1N N aOHを数滴加えながら、およそ３から４に上げた。アクリルポリマーの懸濁液はpHが４になるとゲルになる。アルギン酸ナトリウムは、メルク社の一部門であるケルコ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。このゲルはH₂Oで２％溶液を調製して作った。ジラクチンはジラ製薬会社（アリゾナ州フェニックス）から購入した。ジラクチンは免疫する直前に、H₂Oで1:10に希釈して、調製した。インフルエンザワクチン溶液（リン酸緩衝食塩水10μl当りウイルス蛋白質50 μg）に粘膜付着剤ゲルを混合して、ワクチンとゲルが1:50の割合になるようにした（各用量についてワクチン溶液10μl、粘膜付着剤490μl）。全ての場合、混合は約１〜２分間、単に振盪して、均一の溶液になるのを確認するまで行なった。これは免疫する直前に混合した。マウスの免疫チャールスリバーまたはジャクソン研究所から入手した５個体のBALB/cマウス（生後８週間の雌）群を用いた。ワクチン入りの粘膜付着剤（500μl）を動物給餌用の針を用いて胃内に投与した。対照用の一集団にも、インフルエンザワクチンを0.1M NaHCO₃溶液に溶かして、動物給餌用の管を通して胃内に投与した。対照用集団を全身免疫するには、粘膜付着剤に結合していない、抗原入りの食塩水（50μg／マウス）を皮下経由で接種した。サンプルの採取免疫前と免疫後一定の時期に、マウスの尾の静脈から血液を採取した。血液は遠心分離して血漿を採取して凍結した。塩化カルバミル−コリン（１μg／マウス）をマウスに腹膜注射した後、刺激を受けた唾液を毛細管を用いて採取した。ダイズ・トリプシンインヒビター、フッ化フェニルメチルスルフォニル、アジ化ナトリウムおよびウシ胎児血清をそれぞれ２μg加えてから、不純物を除去して −80℃に保存した。ＥＬＩＳＡ法抗原特異的抗体を測定するために、４μgml^-1の濃度の、精製されたA/Udornインフルエンザウイルスでコートした96穴のポリスチレン製微量滴定用プレート（ダイナテック社、合衆国ヴァージニア州アレキサンドリア）でELISA法を行なった。血清および唾液の滴定終点をホースラディッシュ・パーオキシダーゼで標識した、抗マウスIgまたはIgAのヤギIgG（サザンバイオテクノロジー・アソシエイツ、合衆国、アラバマ州、バーミンガム）、および、基質として2、2'-アジノ-ビス-（3-エチルベンズチアゾリン）スルホン酸（シグマ社、合衆国、ミズーリ州、セント・ルイス）を用いて測定した。Ｖマックス光度計（モレキュラー・デバイセズ、合衆国、カリフォルニア州、パロ・アルト）で414nmでの発色を測定した。赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイ法 PBSAで1:5に希釈されたマウス血清を用いて、赤血球凝集阻害（HI）アッセイを行ない、その後、非特異的阻害物質を除くため、処理を（56℃で30分加熱し、酸で処理した15％カオリンを加えて30分間インキュベートし、さらにニワトリの赤血球の10％懸濁液に入れて30分間インキュベートした）行った。血清を２倍ずつ希釈したものを96穴微量滴定用プレートに用意した。ウイルス懸濁液（８HA単位で等量）を各ウエルに加えて室温で30分間インキュベートした。ニワトリの赤血球の0.5％懸濁液を各ウエルに加えて室温で45〜60分間インキュベートした。H I力価は赤血球の凝集を完全に阻害する、最も高い希釈度の逆数で表した。結果表１に示すように、粘膜付着剤にウイルスを入れた調製剤で経口免疫したマウス群はすべて、血清免疫グロブリンの産生量と赤血球凝集力価が高く、唾液中の IgA力価も高かった。本実施例においては、カルボキシメチルセルロース粘膜付着剤が最も良好な免疫応答を示した。実施例３最適な免疫応答を得るために必要な粘膜付着剤の濃度を決定するために、様々の濃度の粘膜付着剤カルボキシメチルセルロース（代替型7MF）のなかで調製されたウイルスを、経口胃管法によりマウスに免疫投与した。さらに、２つのマウス群には、カルボキシメチルセルロースの代替型9M31FPHまたは12M31Pの中で調製したインフルエンザA/Udornウイルスを経口胃管法で免疫投与した。１群当り５個体の雌のBALB/cマウスからなる、10個のマウス群を、実施例２で述べたように調製したホルマリン処理インフルエンザウイルス（A/Udorn）を含む粘膜付着剤を調製して免疫した。但し、ウイルスを回収するときに、防腐剤のチメロサールを0.02％（w/v）の濃度で腹水に加え、それ以後の全てウイルス調製の段階でも同じ濃度で維持した。マウスを免疫して、血清を採取し、赤血球凝集阻害力価を測定した。フリーのウイルスを皮下注射したときは、免疫後14日目と28日目に陽性の血清赤血球凝集阻害力価を得ることができたが、粘膜付着剤カルボキシメチルセルロースを0.05％から4.0％（w/v）の濃度で含ませて経口免疫したときは、血清の赤血球凝集阻害力価を得ることはできなかった。ELISA法による、唾液のIgAとその抗体レベルを測定することはできなかった。実施例４経口胃管法を行なう時の胃の内容物が免疫結果に及ぼす影響を、マウスの飼育法に修正することによって調べた。各群が５個体の雌のBALB/cマウスからなる、４群のマウスを、２％（w/v）のカルボキシメチルセルロース粘膜付着剤と、50 μgのホルマリン処理されたインフルエンザウイルスA/Udornとを含む調製物で、経口胃管法により免疫する前に、餌も水もない飼育状態においた。インフルエンザウイルスは実施例３で述べたように調製された。即ち、ウイルスは防腐剤（0. 02％チメロサール）の存在下で調製された。マウスを免疫し、採血して、実施例２で述べたように血清の赤血球凝集力価を測定した。餌も水も自由に与えられた対照群を含めて、これらの群のいずれからも、14日目には血清の赤血球凝集阻害力価は得られなかった。ELISA法では、唾液のIgAと抗体レベルを測定することができなかった。実施例５実施例２でみると、そこで述べたプロトコールに従って調製したインフルエンザウイルス（A/Udorn）で経口免疫したときは、カルボキシメチルセルロースなどの粘膜付着剤の存在下で経口胃管法により免疫すれば、陽性の血清の赤血球凝集力価が得られたことが分かる。これに対して、実施例３と４を見ると、実施例３に従って調製したインフルエンザA/Udornウイルスは、カルボキシメチルセルロースの存在下で経口免疫しても、陽性の血清の赤血球凝集力価は得られなかっが、皮下注射によりフリーのウイルスで免疫したときは、陽性の血清の赤血球凝集力価を得た。実施例３によるインフルエンザウイルスの調製に用いたプロトコールには、防腐剤のチメロサールを使用することも含まれていた。実施例２で述べたように、ウイルスの調製中に、この防腐剤を使用しないとウイルスの保存液に細菌が混入してしまった。このため、細菌が混入しているか否かを確かめるために、ウイルス保存液を培養した。チメロサール存在下で調製した保存液にはバクテリアは混入していなかったが、チメロサールを入れないで調製するとウイルス保存液に細菌が混入することが分かった。このウイルス調製液を詳しく分析したところ、混入した細菌はKlebsiella planticolaとXanthomonas maltophiliaであると同定された。Klebsiella planticolaとXanthomonas maltophiliaが混入したインフルエンザウイルスA/Udorn/307/72（H3N2）、BK6、Egg3、クローン3A（7 -25-89）は、メリーランド州ロックビルのAmerican Type Culture Collectionに寄託した。実施例６ウイルス保存液への細菌の混入が、カルボキシメチルセルロースの存在下で免疫したときの結果に与えた影響を、実施例３に従って調製し、細菌混入がないと分かっている保存液で免疫したマウスと、Klebsiella planticola菌とXanthomonas maltophilia菌が混入していると分かっている保存液で免疫したマウスとを比較して測定した。マウスを免疫し、採血して、血清の赤血球凝集阻害力価と血清の抗インフルエンザ全イムノグロブリン抗体をELISA法によって測定した。ELISA法については、実施例２で述べたのと全く同じ方法で決定した。結果表２に示したように、実施例２に従って調製し、チメロサールを入れなかったために細菌が混入したと分かっているインフルエンザウイルスの保存液は、ELIS A法で、または血清の赤血球凝集素阻害を測定すると、皮下的に投与しても、経口的に投与しても、マウスにおいては免疫応答を効果的に誘導した。粘膜付着剤と混入細菌の存在下で、経口免疫によって誘導された免疫応答は、粘膜付着剤なしで混入細菌を含む免疫原によって誘導される免疫応答よりも強かった。このことは、免疫応答を有効に誘導するためには、混入細菌および粘膜付着剤ともに必要だということを示している。これに対し、実施例３に従い、チメロサールを入れて調製され、細菌の混入がないことが分かっているウイルス保存液は、皮下的に免疫すると免疫応答を誘導することができたが、経口的に免疫すると、粘膜付着剤のカルボキシメチルセルロースの存在下で行なっても、有意な免疫応答を誘導することはできなかった。さらに、第１、２および４群について、ELISA法で得られた結果を組み合わせて、その合計を第５群の結果と較べてみると、免疫原とアジュバントおよび本発明に係る粘膜付着剤との間に相乗作用が起きたと見られる。実施例７実施例６に示したように、細菌が混入していると分かっているウイルス調製剤を、粘膜付着剤のカルボキシメチルセルロースの存在下で経口投与すると、免疫応答を誘導することができた。これに対し、細菌が混入していないウイルス調製剤を、粘膜付着剤のカルボキシメチルセルロースの存在下で経口投与しても、免疫応答を誘導しなかった。実施例６で細菌がアジュバントとして機能した可能性をみるために、処方の中に他の既知のアジュバントを加えて検定した。そして、粘膜付着剤であるカルボキシメチルセルロースの存在下で、アジュバントであるリポ多糖およびムラミルジペプチドの効果を測定した。細菌混入がないことが分かっているインフルエンザウイルス50μg調製し、500μlの２％カルボキシメチルセルロースと混ぜて、これにアジュバントとしてLPSあるいはMDPを加えたものと加えないもので、マウスを経口的に免疫した。結果表３に示したように、肺炎杆菌または大腸菌に由来するＬＰＳをカルボキシメチルセルロース粘膜付着剤調製剤に添加し、血清の赤血球凝集力価または唾液Ig A力価を測定すると、免疫応答の誘導は陽性であった。ムラミルジペプチドを添加したときも、血清の赤血球凝集素力価または唾液IgAの力価を測定すると、免疫応答を誘導したが、唾液IgAの力価のレベルは、LPSで得られたものより僅かに低かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．免疫化できる量の抗原、および、抗原に対する免疫応答を誘導するか、促進するのに充分な量の粘膜付着剤を含む免疫組成物。２．抗原がインフルエンザウイルス抗原である請求の範囲１の組成物。３．粘膜付着剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび他のセルロース化合物、ポリカルボフィル、およびカルボポルからなる群から選択されたものである請求の範囲１の組成物。４．（ａ）免疫化できる量の抗原、および、（ｂ）抗原に対する免疫応答を誘導するか、促進するのに充分な量の粘膜付着剤およびアジュバントを含む免疫組成物。５．抗原がインフルエンザウイルス抗原である請求の範囲４の組成物。６．粘膜付着剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび他のセルロース化合物、ポリカルボフィル、およびカルボポルからなる群から選択されたものである請求の範囲４の組成物。７．アジュバントは、ムラミルペプチド、スクアレン、サポニン、およびリピドＡ一リン酸誘導体からなる群から選択されたものである請求の範囲４の組成物。８．動物を免疫化する方法において、請求の範囲１の組成物の免疫化に必要な量を、動物に投与することを含む方法。９．抗原がインフルエンザウイルス抗原である請求の範囲８の方法。 10．粘膜付着剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび他のセルロース化合物、ポリカルボフィル、およびカルボポルからなる群から選択されるものである請求の範囲８の方法。 11．経口的に、あるいは鼻腔、直腸から、あるいは扁桃に塗布する方法で、免疫組成物を投与する請求の範囲８の方法。 12．動物を免疫化する方法において、請求の範囲４の組成物の免疫化に必要な量を、動物に投与することを含む方法。 13．抗原がインフルエンザウイルス抗原である請求の範囲12の方法。 14．粘膜付着剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび他のセルロース化合物、ポリカルボフィル、およびカルボポルからなる群から選択されたものである請求の範囲12の方法。 15．アジュバントは、ムラミルペプチド、スクアレン、サポニン、およびリピドＡの一リン酸誘導体からなる群から選択されたものである請求の範囲12の方法。 16．経口的に、あるいは鼻腔、直腸から、あるいはへん桃に塗布する方法で、免疫組成物を投与する請求の範囲12の方法。 17．動物を免疫する方法において、請求の範囲４の組成物の免疫化量を、動物に経口的に投与することを含む方法。 18．抗原がインフルエンザウイルス抗原である請求の範囲17の方法。 19．請求の範囲18に記載の方法において、腸用にコーティングした用量単位で、動物に抗原投与する方法。 20．請求の範囲19に記載の方法において、抗原、粘膜付着剤およびアジュバントを同時に動物に投与する方法。