JP4648603B2 - 舌下投与用の抗原および糖脂質アジュバントの組成物 - Google Patents
舌下投与用の抗原および糖脂質アジュバントの組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4648603B2 JP4648603B2 JP2001551505A JP2001551505A JP4648603B2 JP 4648603 B2 JP4648603 B2 JP 4648603B2 JP 2001551505 A JP2001551505 A JP 2001551505A JP 2001551505 A JP2001551505 A JP 2001551505A JP 4648603 B2 JP4648603 B2 JP 4648603B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- adjuvant
- immune response
- use according
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、限定するものではないが、予防または治療ワクチンとしての免疫法、もしくはアレルギーの治療において使用するための特に舌下投与処方を使用する粘膜性および全身性免疫応答を発生する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
免疫系は、特に、宿主とは異質または新規な物質を検出し、除去するために発達してきた。この物質はウイルス、細菌または寄生生物由来であってもよく、宿主細胞の外部または内部に存在でき、または新生物由来であってもよい。また、これは他の発生源由来であってもよく、全ての対象に病原的にまたは固有に損害を与えないものであってもよい。
粘膜免疫応答系（ＭＩＳ）は、呼吸器、性尿器または胃腸管の内側をおおう上皮の内部および真下にあり、ならびに唾液腺、涙腺および乳腺の腺管系の真下にある、リンパ系組織から成る。ＭＩＳの主な生産物はＩｇＡである。
ワクチン接種は、ヒトの健康に対する免疫学的原理の最もよく知られており、かつ最も成功している用途である。生来、導入および承認されるべきワクチンは効果的でなければならず、全てのワクチンの効果はその時々に見なおされている。多くの因子がワクチンの効果に影響する。例えば、ワクチンは、通常、皮下または筋肉内経路により投与される。近年、舌下投与が治療的アレルギーワクチンの投与に使用されている。効果的ワクチンは、量的および質的効果に関して適当な免疫性を誘発しなければならず、貯蔵において安定でなけらばならない。特に生ワクチンでない場合、しばしば、アジュバントを用いてその免疫原性をブースとする必要性がある。また、これはいくらかの生、例えば弱毒ワクチンに適用できる。アジュバントは抗原に対する免疫応答を増加する物質である。
【０００３】
１９２０年代のヒトの治療用の動物抗血清の生産における研究の間、ある種の物質、特に抗原または抗原を組み入れた乳濁液に加えられたアルミニウム塩が、非常に抗体産生を増加すること、すなわちアジュバントとして作用することが発見された。水酸化アルミニウムは、未だに、例えばジフテリアおよび破傷風毒素と一緒に広く使用されており、不溶性チロシンはいくらかのアレルギーワクチンと一緒に使用されている。他のより可溶性のアジュバントも、高度な免疫応答を誘導するか、または例えばＴＨ１型応答に対する応答を伝達するような望ましい効果を有する。
３脱Ｏアシル化モノホスホリル脂質Ａは、ＧＢ−Ａ−２２２０２１１（Ｒｉｂｉ）から知られている。化学的には、これは３脱Ｏアシル化モノホスホリル脂質Ａと４，５または６アシル化鎖との混合物であることができ、現在Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造されている。３脱Ｏアシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい形態（本明細書においてＭＰＬ（登録商標）アジュバントともいう）が、国際特許出願ＷＯ９２／１６５５６に開示されている。
国際特許出願公開ＷＯ９８／４４９４７は、アレルギー患者の脱感作治療に使用する、所望により修飾されていてもよいアレルギー抗原、チロシンおよび３脱Ｏアシル化モノホスホリル脂質Ａを含む処方を開示している。
特にＴ−細胞媒介応答に対してより良いアジュバントを生産するために多くの努力がなされているが、より近年のアジュバントのほとんど、未だに、従来のヒト使用に対して受け入れられていないことは強調されるべきである。しかしながら、ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、メラノーマワクチンと共に使用することが認められており、ＭＰＬ（登録商標）アジュバントを含むアレルギーワクチンは、ドイツ、イタリアおよびスペインで「スペシャル」として手に入れることができる。
【０００４】
ＷＯ００／５００７８（チロン（Chiron））は、粘膜デリバリー用のアジュバントおよび抗原を組み合わせた生物接着剤を含む組成物を開示している。しかしながら、これは、該組成物でＩｇＧ免疫応答を発生させることを示しているだけである。さらに生物接着剤は、粘液に物理的または化学的に結合する物質である。ある抗原含有組成物のこのような生物接着性に伴って安全性への関心もあると考えられている。舌下的デリバリーは教示されておらず、試験組成物は経鼻内投与されている。
細菌、ウイルスおよび寄生生物から保護するための粘膜および全身性免疫応答を生じ、アレルギーワクチンとして使用できる組成物の必要性があるのは明らかである。理想的には、このような組成物は、舌下経路のような患者が応諾を受けやすい経路を介して投与されなければならない。また、舌下的デリバリーは急速な吸収およびデリバリーされる物質のよい生物学的利用能を与えうることが見出された。また、舌下的投与は、デリバリーされる物質を適当な血中濃度を維持して断続的に注射できる利点がある。好ましくは、組成物は都合良く手に入れられるアジュバントの使用すべきである。
【０００５】
発明の概要
本発明は舌下的デリバリー系に関し、このデリバリーの手段に関する利点を有する。より詳細には、本発明者らは、この度、舌下投与する場合、糖脂質アジュバント、例えばＭＰＬ（登録商標）アジュバントを抗原と一緒に使用して、粘膜免疫応答（ＭＩＲ）を発生させることが可能であることを見出した。本研究者らは糖脂質アジュバントの舌下的使用が粘膜性ＩｇＡ−媒介応答と同様に全身性ＩｇＧを発生できることを認識した最初の者であると理解している。意外にも、本研究者らは、ＭＩＲがデリバリーの舌下部位に対して遠位にあるならびに局部的である部位で生じることを見出した。例えば、ＩｇＡは、他のリンパ組織で、例えば腸管、呼吸管および性尿管で検出できる。これは、例えば、舌下的投与が都合のよい性的に伝染する疾患の治療に対して特に関係しており、したがって、いずれの投与計画にも患者の応諾を受けやすい。
アジュバントの効果が主に２つの活性：リンパ球または他の能力細胞が抗原に曝される部位における抗原の濃度を維持すること（「貯蔵」効果）およびリンパ球機能を調節するサイトカインの誘発であることは明らかである。リポソームおよび免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のようなより新規のデバイスは、そこに閉じ込められた抗原を抗原提示細胞にデリバリーすることを確実にすることにより同様の目的を達成できる。マイコバクテリア細胞壁、エンドトキシン等の細菌生産物は、サイトカインの形成を刺激することにより作用すると考えられている。サイトカイン誘発は、しばしば正常なワクチンに対して応答しない免疫抵抗性減弱性患者に特に有用でありうる。このようなサイトカイン誘発は、また、例えば、ＴＨ１またはＴＨ２細胞感受性だけが望まれる疾患において、望ましい方向に免疫応答を向けることに有用でありうることが期待できる（Roitt ら「Immunology」第４版）。
また、本発明者らは、ＴＨ１応答に見方してＴＨ１−ＴＨ２均衡を傾けることができ、粘膜、好ましくは口、特に舌下部位に投与できる抗原処方を提供する。処方は免疫療法、特にワクチンの分野において有用である。また、免疫応答の研究および抗体の産生においても有用である。
【０００６】
発明の記述
広い意味において、本発明は糖脂質を含む組成物をヒトまたは動物に舌下投与する場合、糖脂質が抗原に対する全身性および粘膜体液応答を生じさせる知見に関する。本発明者らは、いずれの都合よい舌下投与できる賦形剤が使用できることを見出した。抗原と一緒に舌下投与した場合、血清ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを生じさせる糖脂質アジュバントの能力は、本発明がアレルギー脱感作と同様に予防ワクチンに適用できることを示している。加えて、舌下投与後に粘膜ＩｇＡを生じさせる糖脂質アジュバントの能力は、本発明が粘膜免疫性を生じる点で有用であることを示している。粘膜免疫性の発生は、空気伝達の病原体および特に性的に伝染する疾患からの保護に有用であることを示している。
一般には、本発明は、（Ａ）少なくとも１つの抗原および（Ｂ）糖脂質アジュバントを含む組成物およびその使用に関する。
特に、本発明の１の態様により、粘膜および／または全身性免疫応答の発生を必要とするヒトまたは動物におけるその方法であって、少なくとも１つの抗原および糖脂質アジュバントを含む組成物を投与することを特徴とする方法を提供する。
他の点において、本発明は、粘膜および／または全身性免疫応答を発生するための医薬の製造における少なくとも１つの抗原および糖脂質アジュバントの使用に関する。
【０００７】
本発明の他の態様により、粘膜伝染病の治療方法であって、ヒトまたは動物に少なくとも１つの抗原および糖脂質アジュバントを含む組成物を舌下投与することを特徴とする方法を提供する。
他の点において、本発明は、粘膜伝染病の治療用の舌下投与可能な医薬の製造における、少なくとも１つの抗原および糖脂質アジュバントの使用に関する。
本発明のこれらの方法は、ＩｇＡ−媒介免疫応答を生じる。
したがって、本発明は、また、少なくとも１つの抗原および糖脂質アジュバントを含む組成物を舌下投与することを特徴とするヒトまたは動物のＩｇＡ免疫応答の発生方法を提供する。
他の点において、本発明はＩｇＡ免疫応答を発生する舌下投与可能な医薬の製造における少なくとも１つ抗原および糖脂質アジュバントの使用に関する。
組成物は有効量で投与されるべきである。「有効量」なる用語は非毒性を意味するが、望ましい免疫学的応答を与えるための十分な量の組成物を意味する。適当な有効量は当業者により決定できる。
【０００８】
本発明による組成物は、予防的（すなわち、感染の予防）または治療的（感染後の疾患の治療）のどちらであってよい。
好ましくは、組成物はヒト、哺乳類およびヒト以外の霊長類、例えばサルおよびモンキーを含め霊長類、家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ；家庭内哺乳類、例えばイヌおよびネコ；齧歯類、例えばマウス、ラットおよびモルモットを含む実験動物；家庭内、野生および狩猟鳥、例えばニワトリ、七面鳥および他のキジ類のトリ、アヒル、ガチョウ等を含むトリに投与される。 また、本発明の方法はＩｇＧ−媒介免疫応答を生じることができる。
本発明の他の態様により：
（Ａ）１つまたはそれ以上の抗原；および
（Ｂ）糖脂質アジュバント；
を含む組成物を提供する。
特に好ましい具体例において、糖脂質はＴＨ１−誘発アジュバントである。
好ましくは、本発明において有用な組成物は、（Ａ）および（Ｂ）の利用可能性を投与部位（粘膜舌下部位）で補助する舌下投与可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む。
好ましくは、抗原は細菌、ウイルス、プリオン、新生物、自己抗原、植物、動物または他の病原体、もしくは非病原体生物、合成または組み換え物質から由来する。
抗原は抗原分子、または合成または組み換え法により製造される分子の選択部分を含んでいてもよい。
好ましくは、抗原はアレルギー抗原である。アレルギー抗原は、アレルギーを誘発する傾向を有する抗原の型である。アレルギー抗原は、アレルギー抗原分子または合成または組み換え法により製造される分子の選択部分を含むことができる。
以後、抗原なる語、アレルギー抗原なる語を包含する。
好ましくは、抗原はポリペプチド、炭水化物または脂質の形態である。別法として、抗原は抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、上記ポリヌクレオチドが、上記ヌクレオチドの発現を調節する調節配列に作動的に連結したベクターの形態であってもよい。
【０００９】
好ましくは、ＴＨ−１誘発アジュバントは、限定するものではないが、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント、３Ｄ−ＭＰＬまたはその誘導体もしくは塩であるか、またはいくつかの他のＴＨ−１誘発アジュバントまたはそのようなアジュバントの組み合わせであってもよい。
好ましくは、組成物はワクチンの形態である。
好ましくは、組成物は水溶液、ゲル、パッチ、ロゼンジ、カプセル、または錠剤、最も好ましくは水性またはゲル溶液である。
また、本発明は、ヒトまたは動物における細菌性、ウイルス性プリオン感染症、または癌、自己免疫またはアレルギーのような他の疾患の治療または予防用の医薬の製造における組成物の使用を提供する。
さらに、本発明は、抗原を認識する１つまたはそれ以上の抗体の産生法における組成物の使用を提供する。産生された抗体は、ヒトまたは動物における細菌性またはウイルス性感染症、癌、自己免疫またはアレルギーの治療用の医薬の製造において使用できる。本発明は空気伝達の病原体および性的に伝染する疾患に関して特に重要である。
さらに本発明は、ヒトまたは動物に本発明の組成物で免疫を与えることを特徴とする、抗血清またはそれからの免疫グロブリン調製物の調製法を提供する。
また、本発明は、本発明の組成物の調製法であって、抗原および糖脂質アジュバントの溶液と医薬上許容される希釈剤、担体または賦形剤、好ましくは水溶液またはゲルを混合することを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
詳細な記載
本発明のさらに好ましい種々の特徴および具体例を、限定するものではない実施例により記載する。
【００１１】
免疫応答
免疫応答は、特異性抗体および／または細胞毒性細胞が、侵入した微生物、寄生体、移植された組織および生体により異種であると認識される多くの他の物質、すなわち抗原に対して生産される、脊椎動物の免疫系により起こされる選択的応答である。血中に循環する抗体の生産は、体液応答；細胞媒介または細胞の免疫応答としての細胞毒性細胞の生産として知られている。
免疫系に含まれる細胞は、こららの機能を最も効果的に行うために、組織および器官に組織化される。これらの構造はリンパ系として総称されている。リンパ系は、リンパ球、補助的細胞（マクロファージおよび抗原提示細胞）およびいくらかの場合には上皮細胞を含む。これは別個に莢膜化された器官または発広汎性リンパ組織の蓄積のいずれかにアレンジされる。主なリンパ器官および組織は、第１（中枢）または第２（末梢）のいずれかに分類される。本発明は、第２のリンパ器官に焦点をあてるものである。第２のリンパ器官は、粘膜結合組織を含み、リンパ球が互いに、補助細胞および抗原と相互作用できる環境を提供する。
より詳しくは、第１のリンパ器官におけるリンパ球の生成（リンパ球産生）についで、これらの末梢の第２の組織への移動がおこる。第２のリンパ組織は完全に組織化された莢膜器官−脾臓およびリンパ節−および体のいたるところに見られる非莢膜器官の蓄積を含む。非組織化リンパ組織の大部分は粘膜表面と結合して見られ、粘膜結合リンパ組織（ＭＡＬＴ）と称される。
粘膜系は、粘膜上皮表面を介して直接的に体内に入ってくる抗原から生物を保護する。したがって、リンパ組織は腸管、呼吸器および尿生殖器の内側の表面に結合して見られる。本発明は、特に、舌下領域の内側の表面に結合して見られるリンパ組織に関する。それらの部位での主なエフェクター機構は、粘膜の上皮表面または管に直接分泌される分泌ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）である。
分泌ＩｇＡは、分泌物中に見られる全てのＩｇの９５％を超える量に相当し、Ｊ鎖により共有結合された２つの単量体単位で主に２量体である。２量体ＩｇＡは、粘膜上皮細胞の底面の重合体の免疫グロブリン受容体ｐＩＧＲに結合する。このＩｇＡ−ｐＩＧＲ複合体はエンドサイトーシスされ、上皮細胞の先端（ルミナール（luminal））表面に移動する。この移動工程の間、ｐＩＧＲの小さな断片は分泌成分と称される残存成分で開裂される。したがって、ＩｇＡは分泌成分に結合する２量体ＩｇＡとして分泌される。
【００１２】
分泌ＩｇＡは、補体系を活性化しないが、細菌およびポリオ、コクサッキー、ロータおよびヘルペスのようなウイルスをコートし、したがって、上皮組織の内側の粘膜にそれらが付着することを防ぐ。また、上皮表面内のいくらかのウイルスは、ｐＩＧＲ−インターナリゼーションＩｇＡにより中和できる。
分泌ＩｇＡの生成、したがって粘膜免疫応答の生成（以後、ＭＩＲ）は、当該分野で標準的な方法、例えばＥＬＩＳＡを使用して検出できる。単なる例示として、実施例１および２で使用する標準化したオボアルビミンＥＬＩＳＡ試験だけを調製例１に記載する。
抗原に対するＭＩＲは、粘膜または経口耐性として知られる、同様の抗原に対する全身性応答の状態を導くことができる。したがって、粘膜免疫法は、局所免疫応答および全身性免疫投与の両方を刺激する点で効果がある。
【００１３】
抗原
歴史的には、当該分野において、「抗原」なる用語はＢ細胞を誘導し、特異性抗体を産生するいずれの分子に対して使用された。しかしながら、現在は、この用語は免疫応答の適応できる分子、すなわち、Ｂ細胞またはＴ細胞もしくはその両方により明確に認識されうるいずれの分子をも示すために使用できる。したがって、「抗原」なる用語は、当該分野において、予備形成した抗体、および／またはＴおよびＢ細胞上の種々の特異的受容体と反応する分子を意味することは理解される。この定義は、慣習的に「アレルギー抗原」として知られるもの、すなわちＩｇＥ媒介過敏症を生じさせる作用物質、例えば花粉塵を含む。
アレルギー（１型過敏症）は、ＩｇＥ抗体がアレルギー対象において、非アレルギーのヒトと比較して比較的大量に産生され、肥満細胞および、特に好塩基球に接触する環境抗原（アレルギー抗原）に対する応答である。即時過敏反応は、喘息、花粉症、血清症、組織過敏症または接触性皮膚炎を引き起こす肥満細胞または好塩基球の表面上のＩｇＥとアレルギー抗原との間の反応に続いて放出される場合、肥満細胞産生物（ヒスタミン等）により生じる。過敏反応には４つの型がある（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型）。ＩＩ型およびＩＩＩ型は抗体媒介であり、第４の型は、主にＴ細胞およびマクロファージにより媒介される。本発明はアレルギーＩｇＥ免疫応答から離れて非アレルギー免疫応答に偏らせるために、アレルギー抗原で免疫処理するものである。
したがって、本発明で使用される「抗原」は、例えば花粉（例えばブタクサ花粉または樺花粉）、食物、昆虫毒、カビ、動物の毛またはイエダニ（D. farinae または D. pteronyssinus）のようないずれのアレルギー誘発物質から由来の「アレルギー抗原」であってもよい。
本発明で使用される抗原は、好ましくは免疫原、すなわち、免疫細胞を活性化し、それ自体に対する免疫応答を生じさせる抗原である。
好ましい具体例において、本発明はワクチンとして使用する処方に関し、抗原はこのようなワクチンに有用なものである。
【００１４】
本発明に使用される抗原は、入手できるか、または入手できるようになるいずれの適当な抗原とすることもできる。
ワクチンに使用される抗原の型は多くの因子に依存している。一般に、微生物の抗原はワクチン中に残っていればいる程良く、生きている生物が死んでいる生物よりも効果的な傾向がある。この役割の例外として、毒素がいずれの病原菌効果の原因である疾患がある。このような場合、ワクチンは、毒素またはトキソイドだけに基づくことができる。
本発明に使用される抗原は、いずれの生物；無傷または死んでいる生物；亜細胞性フラグメント；トキソイド；組み換えＤＮＡに基づく抗原または抗イディオタイプまたは合成抗原から誘導できる。抗原はウイルスまたは細菌であってよい、天然または弱毒生物から誘導できる。抗原の型は被膜多糖類、表面または内部の抗原であってもよい。組み換えＤＮＡを基礎とする抗原の場合、その抗原はクローン化または発現した遺伝子またはネイクドＤＮＡから得ることができる。
抗原は、例えばジアルデヒド、より特別にはグルタルアルデヒドのような架橋剤と反応することにより修飾できる。
【００１５】
例えば、ワクチンが入手できるか、または探し出せる微生物は、Salmonella、Shigella、Klebsiella、Enterobacter、Serratia、Proteus、Yersinia、Vibrio、Aeromonas、Pasteurella、Pseudomonas、Acinetobacter、Moraxella、Flavobacterium、Bordetella、Actinobacillus、Neisseria、Brucella、HaemophilusおよびEscherichia coliを包含する。
好ましいワクチンは、ワクシニア（天然痘）；ハタネズミ桿菌（ＴＢ）；ポリオ；はしか、おたふく風邪；風疹；黄熱病；水痘−帯状疱疹；ＢＧＧ；狂犬病；インフルエンザ；Ａ型肝炎；発疹チフス；百日咳；腸チフス；コレラ；ペスト；ペヌモコッカス（penumoccoccus）；髄膜炎菌；Haemophilus influensae；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；破傷風およびジフテリアを含む。毒素に基づくワクチンは、Chlostridium tetani、Corynebacterium diphtheriae、Vibrio choleraeおよびClostridium perfringensを含む。
ワクチンが有用でありうる他の主な疾患は、ＨＩＶ、ヘルペス、ウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ブドウ球菌、Ａ群連鎖球菌、Mycobacterium leprae、Treponema pallidum、Chlamydia、Candida、Pneumocystis、マラリア、トリパノソーマ症、シャーガス病；住血吸虫症およびオンコセルカ症を含む。
ワクチンが有用でありうる性的に伝染する疾患は、上記のＨＩＶおよびヘルペスに加えて：Neisseria gonorrhoeae、Treponema pallidum、Trichomonas vaginalis、Haemophilus ducreyi、クラミジア、Calymmatobacterium granulomatisおよび肝炎を含む。
【００１６】
また、腫瘍抗原の存在が証明されており、結果として癌に対する予防接種の概念が生じた。また、原則的には、受胎および移植は、広範囲に及ぶ妊娠および他の再生ホルモンに対する免疫性を誘発することにより妨害できる。
典型的には、抗原はポリペプチドであるだろうが、例えば核酸、炭水化物、脂質、例えばウイルス、細菌または原生動物のような完全または弱毒生物のような代わりの抗原構造もまた使用できる。
「ポリペプチド」なる用語は、一般的には、多数のアミノ酸に構成される分子を示すために使用され、アミノ酸は、例えばペプチド結合を介して共に共有結合している。一般的には、ポリペプチドは大きさまたは機能の違いを示さない場合、「蛋白質」または「ペプチド」と相互交換して使用できる。組み換えポリペプチドは、当該分野でよく知られた方法、例えばSambrookらの「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第２巻、Cold Spring Harbor Lab. Press(1989)に記載の方法により調製できる。
【００１７】
糖脂質アジュバント
一般的な用語において、アジュバントは、抗原に対して免疫応答を非特異的に強化する物質、すなわち免疫刺激剤である。一般的な用語において、糖脂質は疎水性尾部に結合する炭水化物鎖を有する細胞膜脂質分子である。本発明の好ましい糖脂質アジュバントは、修飾リポ多糖類である。リポ多糖類はが対応する野生型のリポ多糖類またはそれを誘導してものからのリポ多糖類と比較してその毒性が減少するように修飾される。好ましくは、本発明で使用される糖脂質アジュバントは解毒腸内菌リポ多糖類またはその脂質Ａ成分である。「解毒した」なる用語は、毒素を完全に非毒性として変異体および残りの毒性の低い変異体の両方を意味する。好ましくは、解毒したアジュバントは対応する野生型の毒素の０．０１％未満、より好ましくは約０．００１％未満の毒性を保持する。毒性は形態学的変化を評価することによりＣＨＯ細胞で測定できる。
好ましくは、糖脂質アジュバントはＴＨ−１誘発アジュバントである。「ＴＨ−１誘発アジュバント」とは、本発明者らは抗原に対するＴＨ１応答を増加する特性を有するアジュバントを意味している。しかしながら、このようなアジュバントもまた、ある種の細胞群において、アネルギー−（非応答性）を惹起するサイトカインの修飾を誘発することにより、産生される抗体または抗原特異的細胞のレベルを単に増加する傾向がある。
より詳しくは、抗原に対する免疫応答は、一般的には、Ｔ細胞媒介（細胞殺害を含みうる）または体液性（抗原のエピトープの認識を介する抗体産生）である。免疫応答に関与するＴ細胞によるサイトカイン産生の型は、これらの応答のいずれの型が優勢であるかに影響を与えることができ、例えば、細胞媒介免疫性（ＴＨ１）は、高ＩＬ−２およびＩＦＮγ産生であるが低ＩＬ−２産生により特徴つけられるものに対して体液免疫性（ＴＨ２）において、その型は低ＩＬ−２およびＩＦＮγであるが高ＩＬ−４、ＩＬ１３、ＩＬ−５でありうる。応答は、通常は、第２のリンパ器官または細胞のレベルで調節され、そのため特異的Ｔ細胞および抗原提示細胞のサイトカイン型の薬理学的な操作は、生じた免疫応答の型および広がりに影響を及ぼしうる。
【００１８】
ＴＨ１−ＴＨ２均衡は、ヘルパーＴ細胞の２つの異なる形態の相互変換または優勢を意味する。この２つの形態は大規模であり、免疫系において対立する効果を有することも多い。免疫応答がＴＨ１細胞を好む場合、これらの細胞は抗体産生と共に細胞性応答を誘発し、これに対し、ＴＨ２細胞は抗体優勢応答を誘発するだろう。あるアレルギー反応に関与するイソタイプの抗体、ＩｇＥおよび、関連する炎症応答は、ＴＨ２細胞からのサイトカインにより誘発される。
ＴＨ１−誘発アジュバントとしてのアジュバントの有効性は、ウイルスアジュバントも含む、ワクチン中のこの抗原の投与の結果得られた抗原に対する抗体のプロファイルを測定することにより決定できる。
好ましくは、アジュバントは修飾リポ多糖類である。米国特許第４，９１２，０９４号に記載されているように、腸内細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）は強力な免疫刺激剤である。しかしながら、また、これは有害な、時に致死性の応答を惹起しうる。ＬＰＳに関連するエンドトキシン活性は、脂質Ａ成分から生じることが知られている。したがって、本発明は、より好ましくは、脂質Ａの解毒誘導体を使用する。Corixa Corporationは、本来、リファインド・デトキシファイド・エンドトキシン（ＲＤＥ）として知られる脂質Ａの誘導体を生成したが、それはモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標）アジュバント）として知られるようになった。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、中程度の強度の鉱酸溶液（例えば、０．１ＮのＨＣｌ）中において、約３０分の間、グラム陰性菌（たとえばサルモネラ種）のヘプトースレス変異体から得られるＬＰＳまたは脂質Ａを還流することにより製造できる。この処理により、還元末端グルコサミンの１位で、リン酸基の損失が生じる。加えて、中心の炭水化物を、この処理の間、非還元グルコサミンの６’位から除去できる。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよび３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａならびにその製造法は、米国特許第４，４３６，７２７号および米国特許第４，９１２，０９４号および再審査証明書Ｂ１ ４，９１２，０９４に記載されている。
【００１９】
しかしながら、好ましくは、、解毒脂質Ａが非還元グルコサミンの６’に結合する中心基を保持する修飾ＬＰＳまたは脂質Ａを使用する。このようなＬＰＳおよび脂質Ａの誘導体もまた、米国特許第４，９１２，０９４号に記載されている。より詳しくは、米国特許第４，９１２，０９４号は、リポ多糖類の３’位で還元末端グルコサミンにエステル結合される、リポ多糖類のβ−ヒドロキシミリスチンアシル残基だけを選択的に除去する方法であって、リポ多糖類をアルカリ加水分解に付すことを特徴とする方法により得られる修飾リポ多糖類を開示している。このような脱Ｏアシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標）アジュバント）、ジホスホリル脂質Ａ（ＤＰＬ）およびＬＰＳは、本発明で使用できる。したがって、好ましい具体例において、本発明は還元末端グルコサミンの３’位が脱Ｏアシル化されているＭＰＬ（登録商標）アジュバント、ＤＰＬまたはＬＰＳを使用する。これらの化合物は各々３Ｄ−ＭＰＬ、３Ｄ−ＤＰＬおよび３Ｄ−ＬＰＳとして知られている。
【００２０】
米国特許第４，９８７，２３７号において、構造式：
【化１】
を有するＭＰＬ（登録商標）アジュバントの誘導体が記載されており、ここに、Ｒ１およびＲ２はＨであり、Ｒ３はＣ、Ｈおよび所望によりＯ、ＮおよびＳから成り、１つより多くの原子は同じまたは異なっていてもよい直鎖または分枝鎖の炭化水素であり、Ｃ原子の総数は６０を超えず、環はＭＰＬ核を意味する。
【００２１】
また、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント誘導体は、構造式：
【化２】
[ここに：
【化３】
により示される誘導体の部分は、２〜６０のＣ原子を含み、Ｒ３はＣ、Ｈおよび所望によりＯ、ＮおよびＳから成り、１つより多くの原子が同じまたは異なっていてもよい直鎖または分枝鎖の炭化水素であり、ｘは最低限１であり、全てのｘ部分においてＣ原子の総数が６０を超えないような数とすることができ、各々のＲ３の化学構造は各々の該部分において同じまたは異なっていてもよく、環がＭＰＬ核を意味する]
を有する。
【００２２】
Corixa Corporationより市販されているアジュバントの１つは、２％のスクアレン、０．２％のトゥイーン８０ならびにＭＰＬ（登録商標）アジュバントを含む。
他の市販のアジュバントは、Ｄｅｔｏｘ（登録商標）アジュバント（Corixa Corporation）であり、これはＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびマイコバクテリア細胞壁骨格を含む。
入手できるか、または入手できるようになるＬＰＳまたは脂質Ａの全ての誘導体または塩は本発明に使用できる。好ましい誘導体および塩は、医薬上許容されるものである。
ＴＨ１誘発アジュバントは、投与直前に組成物の他の成分と混合できる。別法として、製品の製造の間、他の成分と一緒に処方することができる。別法として、他の成分と異なる時間で投与できる。投与は多くの経路により行うことができる。好ましくは、糖脂質アジュバントは、１．０ｍｇ〜２５０ｍｇ、より好ましくは２５ｍｇ〜５０ｍｇの量で投与される。
【００２３】
ワクチン
本発明の１の態様は、哺乳類、好ましくはヒトにおける免疫学的応答、好ましくは粘膜免疫学的応答の誘発法であって、個体を本発明の組成物で舌下接種し、抗体、好ましくはＩｇＡおよび／またはＴ細胞免疫応答を産生する方法に関する。好ましくは、応答は上記の個体を感染症、特に菌またはウイルス感染症から保護するために適当である。好ましくは、応答は該個体を疾患から保護するのに適しており、その疾患が該個体において確立されていてもいなくても適している。したがって、免疫学的応答は治療的または予防的に使用できる。
ワクチンは本発明の組成物から調製できる。活性成分としての抗原を含むワクチンの調製は、当業者により知られている。典型的には、このようなワクチンは、液体または懸濁液として調製され；投与前に液体中に溶解または懸濁するのに適当な固体形態としても調製できる。また、製剤はゲル、乳化、またはリポソーム中に莢膜された組成物であってもよい。適当な賦形剤は、例えば、水、リン酸アンモニウム、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびその組み合わせである。
【００２４】
組成物は、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、カルボン酸マグネシウム等のような、通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁系、錠剤、ピル、カプセル、徐放性処方またはパウダーの形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含む。ワクチン組成物は凍結乾燥され、凍結乾燥された物質は投与前に、例えば懸濁液として復元できる。復元は好ましくは緩衝液中で行う。
加えて、望ましい場合、ワクチンは、湿剤または乳濁化剤のような少量の補助物質、ｐＨ緩衝剤および／またはワクチンの効果を増加するさらなるアジュバントを含んでいてもよい。
抗原およびアジュバントの割合は、両方が有効量存在する限り広範囲にわたって変化できる。典型的には、ワクチンは抗原０．２μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１５μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度で含むように処方できる。好ましい処方は公知の投与量の範囲のプロトコルおよび「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」, Mack Publishing Company, 19巻, 1995を参照して決定できる。
処方後に、ワクチンは滅菌できる容器に入れることができ、ついで、その容器をシールし、低温、例えば４℃で保存するか、または凍結乾燥してもよい。凍結乾燥は安定した形態で長期間の貯蔵を可能にする。
本発明で使用される抗原は、中性または塩の形態としてワクチンに処方できる。医薬上許容される塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基との）および無機酸、例えば塩酸またはリン酸、または有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸およびマレイン酸と形成される塩を含む。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄（ＩＩ）のような無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインのような有機塩基から誘導することができる。
組成物は錠剤、カプセルまたは他の都合のよい処方として、そのような処方を製造するために必要な賦形剤と共に与えられる。
【００２５】
発明の組成物を使用する抗体の調製
本発明による組成物は、本明細書に記載されている投与経路により免疫原として、抗血清、特異的免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体を生成するためのさらなるアジュバントを使用することなしに直接使用できる。したがって、本発明は抗原特異的免疫グロブリン産生を誘導する方法であって、以下の工程：
ａ）本発明による組成物で動物に免疫化する工程；および
ｂ）組成物の一連の抗原に特異的な免疫グロブリンを動物の血清から回収する工程；
ｃ）モノクローナル抗体を産生するクローン細胞を選択する工程
を特徴とする方法を提供する。
抗体を生成する方法は、KohlerおよびMilsteinのNature(1975) 256: 495-497に教示されている。
抗体産生に使用される動物は、この目的のために通常使用されるいずれの動物、特に哺乳類であってもよい。特に示されるものは、マウス、ラット、モルモットおよびウサギである。該動物は本明細書に記載の処方で治療できるだろう。
より詳細には、抗原を含む本発明の処方は、抗体、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方を生産するために使用できる。ポリクローナル抗体が望ましい場合、選択された動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫化する。免疫化した動物からの血清を集め、公知の方法により処理される。血清が他の抗原に対するポリクローナル抗体を含む場合、必要とされるポリクローナル抗体は、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。ポリクローナル抗血清の製造および処理方法は当該分野では公知である。
【００２６】
本発明に使用される抗原に対するモノクローナル抗体もまた、当業者により容易に製造できる。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を製造する一般的な方法がよく知られている。永久抗体生成細胞系は、細胞融合、および腫瘍形成ＤＮＡでのＢ−リンパ球の直接的形質転換またはエプスタイン・バール・ウイルスでのトランスフェクションのような他の方法により作成できる。抗原に対して産生されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性；すなわち、イソタイプおよびエピトープ結合性に関してスクリーンできる。
別法として、例えばファージが多種の相補的決定領域（ＣＤＲ）を有するコートの表面でｓｃＦｖフラグメントを発現する、ファージ提示ライブラリーをスクリーンすることを含む。この方法は当該分野で公知である。
抗原に対する抗体、モノクローナルおよびポリクローナルの両方は、診断において特に有用であり、中和しているそれらは受動免疫治療において有用である。特に、モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体を生じさせるために使用できる。抗イディオタイプ抗体は、感染物質に対する保護が望まれるものの抗原の「内部イメージ」を有する免疫グロブミンである。
抗イディオタイプ抗体を生じさせる方法は当該分野で公知である。これらの抗イディオタイプ抗体もまた、治療ならびに抗原の免疫原性領域の解明に有用でありうる。
本発明の目的に関して、「抗体」なる用語は、特記しない限り、それらの標的抗原に対する結合活性を残した完全な抗体のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。さらに、抗体およびそのフラグメントは、例えばＥＰ−Ａ−２３９４００に記載のようにヒト化抗体であってもよい。
【００２７】
組成物の調製
本発明の組成物は、抗原の水溶液と糖脂質アジュバントとを混合し、この混合の前または後に粘膜投与可能な希釈剤、賦形剤または担体を添加しすることにより調製できる。別法として、糖脂質アジュバントは、抗原と共沈降できる。投与前に組成物の他の成分と混合させるか、または共沈降させることと同様に、糖脂質アジュバントは他の成分と異なる部位および／または時間で投与できる。糖脂質アジュバントおよび抗原の混合物もまた、ゲル、カプセル、ロゼンジ等に組み入れらてもよく、または二または好ましくは単向性でありうるパッチのような種々のデパイスで与えられてもよい。
超音波または他の方法（ＭＰＬ（登録商標）アジュバント溶液の調製に後述されている）により溶解されたＭＰＬ（または他のＴＨ１誘発アジュバント）は、抗原に添加する前に種々の方法により希釈できる。ＭＰＬの調製は、典型的には、０．５ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ、例えば１ｍｇ／ｍｌの濃度で最初に作られる。ついで、５００μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１００μｇ／ｍｌの濃度に希釈できる。希釈は精製水または例えば１％〜５０％グリセロールを含む水性グリセロール溶液のような他の溶媒で行うことができる。
適当な生理学上許容される担体および希釈剤は、滅菌水または５％のデキストロース水溶液を含む。組成物はヒトまたは獣医学的に使用され、粘膜、好ましくは舌下デリバリー用に処方される。
本明細書に記載の投与経路および投与量は単なる指針であり、熟練した医師はいずれの個々の患者および症状に最適な粘膜投与経路および投与量を決定できるだろう。
【００２８】
組成物の処方、投与量および投与
本発明の組成物は、都合よくは、舌下投与に適した医薬上許容される希釈剤、担体または賦形剤と共に処方できる。医薬上賦形剤の詳細は「Handbook of Pharmaceutical Excipients」第２巻（１９９４）、The Pharmaceutical Press、ロンドン、編集者：WadeおよびWellerに見られる。
本発明者らは本発明の重要な態様が本発明の組成物の舌下投与であることを見出した。ゲルまたは他の粘性処方は抗原と舌下表面との接触を増加させるために好ましいことと考えられる。しかしながら、結果は水溶液のような他の処方でもまた達成できる。マウスにおいて、一の単純溶液かつゲル処方と同様の結果をもたらすことが見出された。処方は物理的または化学的に粘膜組織に結合すべきであることは必要でも望ましくもない。
舌下投与に適した処方は、水性および非水性滅菌溶液を包含し、それはその処方個体の体液、好ましくは粘液と等張にする酸化防止剤、緩衝液、静菌化合物および溶質を含んでいてもよく；懸濁化剤または増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性滅菌懸濁液を包含する。処方は単回投与または複数回投与容器、例えばシールしたアンプルおよび瓶で与えられ、使用直前に滅菌液体担体の添加だけを必要とする乾燥凍結状態で貯蔵されていてもよい。
好ましくは、担体もまた本発明の組成物中に与えられる。担体は水乳濁液中の油、またはリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムのようなアルミニウム塩であってもよい。
好ましくは、水乳濁液中の非毒性油は、非毒性油、例えばスクアランまたはスクアレン、水性担体中の乳化剤、例えばトゥイーン８０を含む。水性担体は、例えばリン酸緩衝生理食塩水であってもよい。
【００２９】
本発明はまた、本発明のワクチン処方を他の抗原、特に癌自己免疫疾患および関連する症状の治療に有用な抗原と組み合わせて含む多価ワクチン組成物を提供する。
一般的には、担体は、限定するものではないが、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを含む。
さらに、本発明は１つまたはそれ以上の本発明の前述の組成物の成分を充填した１つまたはそれ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。
これらの組成物の投与は、軟膏、ペースト、ゲル、溶液、粉末等の形態であってもよい。ゲルは、都合よくは、カルボマーとしても知られているカルボポル−カルボキシビニル重合体、またはセルロース基剤増粘剤、例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、メチルセルロースを使用して処方できる。また、ゲルは、都合よくは、アカシア、アルギン酸、ベントナイト、セトステアリルアルコール、ゼラチン、グアールガム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、マルトデキストリン、ポリビニルアルコール、プロピレンカルボネート、プロピレングリコールアルギン酸エステル、コロイド状二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカントおよび／またはキサンタンガムを使用して処方できる。カルボポルおよびセルロース基剤試薬が特に好ましい。
組成物は投与量処方に互換性がある方法で、予防的および／または治療的に効果があるだろう量で投与される。投与量は、一般的には、治療する対象、合成抗体に対する対象の免疫系の能力、および望ましい保護の程度に応じて、投与量当たり０．５μｇ〜２５０μｇの抗原の範囲である。好ましい範囲は、投与量あたり約２μｇ〜約４０μｇである。いくらかの場合、患者は計画に沿った発生する抗体を含む連続投与で治療されるだろう。
適当な投与規模は、約０．１ｍｌであるが、計画の範囲内で、これはより少ない容量で開始し、より多い容量で終ってもよい。投与される活性成分の適確な量は、熟練者の判断に依存し、各々の患者に特有である。
組成物は単回投与計画、または、好ましくは複数回投与計画で与えられることができる。複数回投与計画は、ワクチン接種の主な経過が１〜１０に分割された投与であり、ついで、免疫応答を維持されるか、または強化される次の時間間隔で与えられた他の投与、例えば１〜４ヶ月で第２の投与、必要とする場合、数ヶ月後に次の投与（複数でも可）を含みうる。生成物がアレルギー治療に使用される場合、投与計画はより頻繁な投与を含むだろう。投与量計画は、また、少なくともある程度、各々の必要性および医師の判断に依存して決定されるだろう。
加えて、抗原（複数でも可）を含む組成物は多の免疫制御剤、例えば免疫グロブリンと共同で投与できる。
【００３０】
本発明を以下の実施例に基づいて説明するが、これは何ら本発明を限定するものではなく、単なる例示にすぎない。
実施例
ＭＰＬ（登録商標）アジュバント溶液の調製
１,２‐ジパルミトイル−ＳＮ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）の無水エタノール中４ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。各１．０ｍｇのＭＰＬ−ＴＥＡ（トリエチルアミン）塩を可溶化させるために、２７μｌのＤＰＰＣを添加し、ＭＰＬを溶解させた。ＭＰＬを上記したように調製してもよい。Ｎ２流を該バイアル中に穏やかに流すことによりエタノールを除去した。次に、乾燥させたＭＰＬ／ＤＰＰＣ混合物の１ｍｇのＭＰＬに対して１．０ｍｌの発熱物質不含の注射用水を添加した。その溶液を、透明になるまで、６０−７０℃のソニケーター浴中で音波処理に付した。ついで、ＭＰＬ／ＤＰＰＣ溶液をＳＦＣＡ２９０−４５２０Ｎａｌｇｅｎｅの２μｍフィルターを介して濾過することで濾過滅菌処理した。そのＭＰＬ／ＤＰＰＣ溶液を無菌状態で発熱物質除去したバイアルに１．０ｍｇ／ｍｌで分配し、ＭＰＬ−ＡＦ（界面活性剤ＤＰＰＣに可溶化させたＭＰＬ）を標識し、４℃で貯蔵した。
【００３１】
オボアルブミン（ＸＯＡ）／ＭＰＬ（登録商標）アジュバント／舌下用ゲルの処方
マウスにおけるＴＨ１誘発活性は特異性ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体の産生と同一視することができ、ＴＨ２誘発活性は特異性ＩｇＧ１抗体およびＩｇＥ抗体の産生と同一視することができる。特異性分泌ＩｇＡ抗体は粘膜応答が発生するかどうか、舌下的免疫処理の後にそれが局所的（唾液抗体）または遠位的（膣抗体）であるかどうかを同定することができる。しかしながら、単に血清中の特異性ＩｇＧ応答を測定するだけで、処方の免疫原性の可能性を調べることができる。
したがって、一例として、一の実験をマウスにて行い、モデル抗原として許容され、鶏卵より誘導される周知のアレルゲンでもある、例えば、オボアルブミン（ＸＯＡ）に対するアレルゲン特異的抗体の特性を測定した。
【００３２】
ストック材料
Ｉ．カルボポルＴＲ−１ＮＦストック（０．８３％）
Ａ．２０ｍｌのＷＦＩ（注射用水）中の１００ｍｇのカルボポルＴＲ−１ＮＦ
＝０．９％ｗ／ｖゲル
Ｂ．Ａに０．８ｍｌの１０％ｖ／ｖＴＥＯＡ（トリエタノールアミン）を添加した
＝０．８％ｗ／ｖゲル
【００３３】
ＩＩ．ＭＰＬ ＡＦグリセロール（２０ｍｇ／ｍｌ）
Ａ．ＭＰＬ ４０ｍｇ
ＤＰＰＣ ４．３２ｍｇ
グリセロール ８００μｌ
ＷＦＩ ４０ｍｌまで適量
粒度が略８０ｎｍとなるまで音波処理した。
Ｂ．凍結乾燥化
Ｃ．１．２ｍｌのＷＦＩ−２０ｍｇ／ｍｌのＭＰＬを用いて復元
【００３４】
ＩＩＩ．オボアルブミンストック（３３ｍｇ／ｍｌ）
オボアルブミン ３３ｍｇ
ＷＦＩ １．０ｍｌ
【００３５】
注射用処方
カルボポルストック １９２０μｌ
オボアルブミンストック ４８０μｌ
グリセロール ４８０μｌ
ＷＦＩ ７２０μｌ
ＭＰＬグリセロール ４００μｌ
１．カルボポル、ＸＯＡ、グリセロールおよびＷＦＩを５ｍｌのバイアルに加え、攪拌により混合した。
２．ＭＰＬグリセロールを上記した混合物に加え、さらに攪拌を行った。
【００３６】
マウスの免疫化
一群５匹の８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスをケタミンで麻酔した。マウスが無意識の時に、種々の量のＸＯＡを含有する２０μｌの適当なゲルを舌の下に５分間置いた。５分後に、シリンジおよび胃管針を用いて０．９％セイライン１．０ｍｌでそのゲルを口から洗い流した。
３週間後、マウスを最初の処理と同様に処理した。マウスを第２の処理の後、２週間給餌し、血清を集めた。これらをエライザアッセイを用いてＸＯＡ特異的ＩｇＧ抗体について検定した。
【００３７】
結果
２０μｌのカルボポルゲル中の８３．２μｇまたは３．４μｇのいずれかのオボアルブミンおよび３３．６μｇのＭＰＬを舌下経路により投与し、３週間後にブースター処理し、その後２週間給餌したマウスにおける抗−オボアルブミンＩｇＧ応答（一群５匹のマウスのＯＤ（光学濃度）平均値）
種々の血清希釈度でのＯＤ値
【表１】
【００３８】
実施例２
マウスを免疫化するための材料の調製
カルボポル中の、あるいはまたＭＰＬを含まない希釈液（水性処方）中のＸＯＡ／ＭＰＬの免疫化用量を、種々の用量を用いることを除き、実施例１に記載されるように調製した。
【００３９】
マウスの免疫化
１．各マウスを投与前に麻酔処理した。
２．舌の下に２０μｌの適当な材料を５分間置いた。すなわち、各群のマウスに２０μｌの以下の量の物質を投与した。
【表２】
【００４０】
３．５分後、０．９％セイライン１．０ｍｌで口内の材料を洗い流した。
４．第１のワクチン接種の３週間後と、さらにこの２週間後にマウスを再び処理した。
５．第３の処理の後の２週間、マウスに給餌し、使用するまで−２０℃で血清を貯蔵した。鼻および肺洗浄を行い、同一条件下で貯蔵した。
６．血清および洗浄液を上記したようにオボアルブミン特異性抗体について試験した。
【００４１】
結果
ＸＯＡ力価ｌｏｇ（２）／対照力価（ｌｏｇ）２に特異的な血清ＩｇＧ抗体（ＳＤ）
【表３】
【００４２】
種々の流体中の幾何平均抗ＸＯＡＩｇＡ抗体（ＳＤ）
【表４】
【００４３】
ＸＯＡに対する強い血清ＩｇＧ応答はＭＰＬの添加を必要とし、それはまたＩｇＧ２ａ抗体応答により示されるＴＨ１型応答を刺激するようである。
新規かつ予期せぬ知見はアジュバントとしてＭＰＬを用いた場合にＸＯＡ−特異的ＩｇＡ応答を強く誘発したことであった。
マウスにおいて、賦形剤としてカルボポルを用いることの明瞭な利点はない。実際、カルボポルを含まないＸＯＡおよびＭＰＬの水性処方がＩｇＧおよびＩｇＡ誘発の両方に対してより免疫原性であることを示す強力な証拠があった。このことはカルボポルの不在下でのみ見られる血清ＩｇＡを包含した。しかしながら、ワクチンの処方に賦形剤を用いることは不可欠であり、カルボポルはヒトまたは動物用の有用かつ便利な賦形剤である。
【００４４】
調製例１−オボアルブミンエライザ
１．一群５匹のマウスの各々からの血清（ボレート緩衝液にて１：２に希釈）をエライザアッセイにて試験し、抗−オボアルブミンＩｇＧまたはＩｇＡ抗体力価を測定する。
【００４５】
２．エライザを行うのに、以下の装置および供給物を必要とする。
Ａ．イムロン２プレート、９６ウェル、フラットボトム、ダイナテック・ラボラトリース・カタログ番号０１１−３４５５。（１０匹のマウスからの血清を二重反復試験にて試験するのに十分である）生成物当たり３つのプレートをロット試験した。
Ｂ．オボアルブミン（鶏卵）、シグマ等級５。アッセイを行うたびに、ストック溶液（注射用水中１ｍｇ／ｍＬ）を新たに製造した。
Ｃ．汚染されていない（オートクレーブ処理した）ピペットチップ
Ｄ．２０、１００、２００、１０００μｌのピペッター
Ｅ．８チャネルピペッター；２００μｌサイズ
Ｆ．汚染されていない（新しい）１３ｍｍの試験管または２ｍＬの低温バイアルおよびラック
Ｇ．パラフィンまたはサランラップ
Ｈ．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４
【００４６】
Ｉ．ホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識化抗−ＩｇＧまたは抗−ＩｇＡ第２抗体（１：５０００で使用した）。サザーン・バイオテクノロジー・アソシエート・インコーポレイテッド
Ｊ．ＯＰＤキット：ｏ−フェニレンジアミン錠、一プレートおよび希釈液に付き１つ。アボット・ラボラトリーズ・インビトロ試験番号７１８１Ｅ。集団内部で入手できることも多い。
Ｋ．試験すべきマウス血清。血清は長期間保存するためにボレート緩衝液中に１：２で希釈しなければならない。
Ｌ．ボレート希釈液（ＢＢ）：
次の物質を４Ｌの滅菌ＷＦＩに溶かす：
１２．４ｇのホウ酸、フィッシャー・サイエンティフィック＃Ａ７３−５００
０．７６４ｇのホウ酸ナトリウム（ボラックス）、フィッシャー・サイエンティフィック＃Ｓ２４８−５００
１７．５３ｇの塩化ナトリウム、フィッシャー・サイエンティフィック＃Ｓ２７１−５００
室温で貯蔵し、６ヶ月で廃棄する。
【００４７】
Ｍ．ボレート緩衝液＋０．１％ツィーン２０（ＢＢ−Ｔ２０）：
１ｍＬのツィーン−２０（シグマ＃Ｐ−１３７９）を１リットルのＢＢに加え、完全に混合する。室温で貯蔵し、６ヶ月で廃棄する。
Ｎ．ボレート緩衝液−ツィーン−２０−１％ＢＳＡ（ＢＢ−ＢＳＡ）
１．９０ｇのＥＤＴＡ（テトラナトリウム、フィッシャー・サイエンティフィック＃ＢＰ１２１−５００）および１０ｇのＢＳＡ（フラクションＶ、プロテアーゼ不含、ベーリンガー・マンハイム＃１００−３５０）を１リットルのＢＢ−Ｔ２０に溶かす。
Ｏ．０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液
４．２ｇのＮａＨＣＯ３および５．３ｇのＮａ２ＣＯ３を１リットルのＲＯ水または滅菌灌水に溶かし、ｐＨを９．６に調整する。４℃で貯蔵し、３ヶ月で廃棄する。使用する前に室温に加温する。
【００４８】
Ｐ．自動式ピペッター
Ｑ．攪拌ミキサー
Ｒ．微量遠心分離ラック
Ｓ．４９０ｎｍでのＯ．Ｄ．の読取能を有するプレートリーダー
Ｔ．３７℃にセットされるインキュベーター
Ｕ．２５ｍＬの血清学上のピペット（フィッシャー・サイエンティフィック）
Ｖ．１５ｍＬのポリプロピレン製円錐管
Ｗ．マルチチャネルピペッター用の試薬鉢
Ｘ．自動式プレート洗浄器
【００４９】
３．エライザを行うための操作
Ａ．試験抗原の結合
Ｉ．アジュバントアッセイに使用する結合プレートにある抗原の濃度は５０μｇ／ｍｌである：
２．５ｍＬのストック１ｍｇ／ｍＬオボアルブミン溶液を４７．５ｍＬの０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩溶液に加える。この量はウェル当たり１００μｌで４つの９６ウェルプレートをコートするのに十分である。
ＩＩ．ついで、プレートをサランラップで覆い、４℃、暗所で一夜、水平で静かに放置する。
【００５０】
Ｂ．血清希釈：希釈前に各血清試料を軽く攪拌し、プレートに添加する前に書く希釈試料を軽く攪拌する。希釈を行う場合には、新しいピペットチップを用いてストック管から血清を取り出すべきである。
Ｉ．アジュバントおよびオボアルブミンで免疫化したマウスから得られる血清についての出発希釈は１：６である。
【００５１】
Ｃ．プレートのブロッキング
Ｉ．血清試料をすべて希釈する場合、コーティング緩衝液をシンク中に激しく振盪することによりプレートを調製する。
ＩＩ．過剰な溶液を除去するためにプレートをペーパータオルパッド上で強くラップする。３５０μＬで洗浄し、各洗浄の間で５秒間待機するようにプログラムした自動式プレート洗浄器を用いて該プレートをＢＢ−Ｔ２０洗浄液で３回洗浄する。
ＩＩＩ．マルチチャネルピペッターを用いて、２５０μＬのＢＢ−ＢＳＡを各ウェルに加える。サランラップでカバーしてシールし、３７℃で３０分間インキュベートする。
【００５２】
Ｄ．プレートのローディング
Ｉ．ブロッキング緩衝液をシンク中に激しく振盪し、過剰な溶液を除去するためにプレートをペーパータオルパッド上で強くラップする。
ＩＩ．１００μｌのＢＢ−ＢＳＡを各プレートのすべてのウェルに添加する。１００μｌの適宜希釈した血清試料をカラム＃１にある適当なウェルに加える。各血清試料は二重反復にて試験すべきである。
ＩＩＩ．マルチチャネルピペッターを用い、１００μｌをカラム＃１中で８回上下にピペット処理に付して試料を混合し、ついで１００μｌをカラム＃２に移す。再び、８回上下にピペット処理に付して混合し、１００μｌをカラム＃３に移す。連続希釈をカラム＃１２を介して繰り返す。カラム１２を混合した後、チップにある１００μｌを捨てる。プレートの各ウェルに１００μｌなければならない。
【００５３】
Ｅ．インキュベーション
プレートをサランラップまたはパラフィンでカバーし、シールする。該プレートを３７℃で一時間インキュベートする。工程３ａに示す操作により結合していない抗体を除去し、再び該プレートをＢＢ−Ｔ２０で３回洗浄する。
【００５４】
Ｆ．コンジュゲート
Ｉ．ＢＢ−ＢＳＡに１：５０００で希釈すること（５０ｍＬの円錐管にある５０ｍＬのＢＢ−ＢＳＡ中の１０μｌの抗体）によりペルオキシダーゼ−標識化した抗ＩｇＧ第２抗体コンジュゲートを調製する。該円錐管を２０秒より長く反転させ、３０秒間攪拌し、完全に混合する。希釈した抗体を汚染されていない試薬鉢中に注ぐ。抗ＩｇＡコンジュゲートは対応する方法で調製することもできる。
ＩＩ．１００μｌのコンジュゲート溶液を、ブランクウェルを含む、プレートの各ウェルに加える。
ＩＩＩ．プレートをカバーして３７℃で１時間インキュベートする。
ＩＶ．コンジュゲート溶液を除去し、プレートを工程３ａにあるように３回洗浄する。
【００５５】
Ｇ．発色
Ｉ．３光学濃度の発色錠をホイルカバーした５０ｍＬのポリプロピレン製円錐管中の３０．４ｍＬの基質緩衝液に溶かすことにより、基質／比色試薬を使用する１０‐１５分前に調製する。
ＩＩ．マルチチャネルピペッターを用いて、１００μｌの試薬を各ウェルに添加する。室温で１５分間インキュベートする。
ＩＩＩ．１５分後、マルチチャネルピペッターを用いて５０μｌの１Ｍ硫酸を各ウェルに添加することにより反応を停止させる。
【００５６】
Ｈ．プレートの読取
Ｉ．「停止」から「読取」までの時間がプレート間で矛盾しないように、各プレート間で１−２分の連続的方法にてプレートを「停止」させなければならない（最後のプレートの反応を停止させた後、適当なプレートリーダー上、４９０ｎｍで最初のプレートを読み取る。１‐２分後に第２のプレートを読み、その１‐２分後に第３のプレートを読む）
【００５７】
イムノグロブリン力価の測定
各血清試料の力価をバックグラウンド値の２倍以上のＯＤ値を有する最初の段階的２倍希釈の逆数として定義する。対照動物のＯＤ値は各希釈で平均し、各群の平均力価を決定する。
上述した文献を出典明示により本明細書の一部とする。
発明の分野
本発明は、限定するものではないが、予防または治療ワクチンとしての免疫法、もしくはアレルギーの治療において使用するための特に舌下投与処方を使用する粘膜性および全身性免疫応答を発生する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
免疫系は、特に、宿主とは異質または新規な物質を検出し、除去するために発達してきた。この物質はウイルス、細菌または寄生生物由来であってもよく、宿主細胞の外部または内部に存在でき、または新生物由来であってもよい。また、これは他の発生源由来であってもよく、全ての対象に病原的にまたは固有に損害を与えないものであってもよい。
粘膜免疫応答系（ＭＩＳ）は、呼吸器、性尿器または胃腸管の内側をおおう上皮の内部および真下にあり、ならびに唾液腺、涙腺および乳腺の腺管系の真下にある、リンパ系組織から成る。ＭＩＳの主な生産物はＩｇＡである。
ワクチン接種は、ヒトの健康に対する免疫学的原理の最もよく知られており、かつ最も成功している用途である。生来、導入および承認されるべきワクチンは効果的でなければならず、全てのワクチンの効果はその時々に見なおされている。多くの因子がワクチンの効果に影響する。例えば、ワクチンは、通常、皮下または筋肉内経路により投与される。近年、舌下投与が治療的アレルギーワクチンの投与に使用されている。効果的ワクチンは、量的および質的効果に関して適当な免疫性を誘発しなければならず、貯蔵において安定でなけらばならない。特に生ワクチンでない場合、しばしば、アジュバントを用いてその免疫原性をブースとする必要性がある。また、これはいくらかの生、例えば弱毒ワクチンに適用できる。アジュバントは抗原に対する免疫応答を増加する物質である。
【０００３】
１９２０年代のヒトの治療用の動物抗血清の生産における研究の間、ある種の物質、特に抗原または抗原を組み入れた乳濁液に加えられたアルミニウム塩が、非常に抗体産生を増加すること、すなわちアジュバントとして作用することが発見された。水酸化アルミニウムは、未だに、例えばジフテリアおよび破傷風毒素と一緒に広く使用されており、不溶性チロシンはいくらかのアレルギーワクチンと一緒に使用されている。他のより可溶性のアジュバントも、高度な免疫応答を誘導するか、または例えばＴＨ１型応答に対する応答を伝達するような望ましい効果を有する。
３脱Ｏアシル化モノホスホリル脂質Ａは、ＧＢ−Ａ−２２２０２１１（Ｒｉｂｉ）から知られている。化学的には、これは３脱Ｏアシル化モノホスホリル脂質Ａと４，５または６アシル化鎖との混合物であることができ、現在Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造されている。３脱Ｏアシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい形態（本明細書においてＭＰＬ（登録商標）アジュバントともいう）が、国際特許出願ＷＯ９２／１６５５６に開示されている。
国際特許出願公開ＷＯ９８／４４９４７は、アレルギー患者の脱感作治療に使用する、所望により修飾されていてもよいアレルギー抗原、チロシンおよび３脱Ｏアシル化モノホスホリル脂質Ａを含む処方を開示している。
特にＴ−細胞媒介応答に対してより良いアジュバントを生産するために多くの努力がなされているが、より近年のアジュバントのほとんど、未だに、従来のヒト使用に対して受け入れられていないことは強調されるべきである。しかしながら、ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、メラノーマワクチンと共に使用することが認められており、ＭＰＬ（登録商標）アジュバントを含むアレルギーワクチンは、ドイツ、イタリアおよびスペインで「スペシャル」として手に入れることができる。
【０００４】
ＷＯ００／５００７８（チロン（Chiron））は、粘膜デリバリー用のアジュバントおよび抗原を組み合わせた生物接着剤を含む組成物を開示している。しかしながら、これは、該組成物でＩｇＧ免疫応答を発生させることを示しているだけである。さらに生物接着剤は、粘液に物理的または化学的に結合する物質である。ある抗原含有組成物のこのような生物接着性に伴って安全性への関心もあると考えられている。舌下的デリバリーは教示されておらず、試験組成物は経鼻内投与されている。
細菌、ウイルスおよび寄生生物から保護するための粘膜および全身性免疫応答を生じ、アレルギーワクチンとして使用できる組成物の必要性があるのは明らかである。理想的には、このような組成物は、舌下経路のような患者が応諾を受けやすい経路を介して投与されなければならない。また、舌下的デリバリーは急速な吸収およびデリバリーされる物質のよい生物学的利用能を与えうることが見出された。また、舌下的投与は、デリバリーされる物質を適当な血中濃度を維持して断続的に注射できる利点がある。好ましくは、組成物は都合良く手に入れられるアジュバントの使用すべきである。
【０００５】
発明の概要
本発明は舌下的デリバリー系に関し、このデリバリーの手段に関する利点を有する。より詳細には、本発明者らは、この度、舌下投与する場合、糖脂質アジュバント、例えばＭＰＬ（登録商標）アジュバントを抗原と一緒に使用して、粘膜免疫応答（ＭＩＲ）を発生させることが可能であることを見出した。本研究者らは糖脂質アジュバントの舌下的使用が粘膜性ＩｇＡ−媒介応答と同様に全身性ＩｇＧを発生できることを認識した最初の者であると理解している。意外にも、本研究者らは、ＭＩＲがデリバリーの舌下部位に対して遠位にあるならびに局部的である部位で生じることを見出した。例えば、ＩｇＡは、他のリンパ組織で、例えば腸管、呼吸管および性尿管で検出できる。これは、例えば、舌下的投与が都合のよい性的に伝染する疾患の治療に対して特に関係しており、したがって、いずれの投与計画にも患者の応諾を受けやすい。
アジュバントの効果が主に２つの活性：リンパ球または他の能力細胞が抗原に曝される部位における抗原の濃度を維持すること（「貯蔵」効果）およびリンパ球機能を調節するサイトカインの誘発であることは明らかである。リポソームおよび免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のようなより新規のデバイスは、そこに閉じ込められた抗原を抗原提示細胞にデリバリーすることを確実にすることにより同様の目的を達成できる。マイコバクテリア細胞壁、エンドトキシン等の細菌生産物は、サイトカインの形成を刺激することにより作用すると考えられている。サイトカイン誘発は、しばしば正常なワクチンに対して応答しない免疫抵抗性減弱性患者に特に有用でありうる。このようなサイトカイン誘発は、また、例えば、ＴＨ１またはＴＨ２細胞感受性だけが望まれる疾患において、望ましい方向に免疫応答を向けることに有用でありうることが期待できる（Roitt ら「Immunology」第４版）。
また、本発明者らは、ＴＨ１応答に見方してＴＨ１−ＴＨ２均衡を傾けることができ、粘膜、好ましくは口、特に舌下部位に投与できる抗原処方を提供する。処方は免疫療法、特にワクチンの分野において有用である。また、免疫応答の研究および抗体の産生においても有用である。
【０００６】
発明の記述
広い意味において、本発明は糖脂質を含む組成物をヒトまたは動物に舌下投与する場合、糖脂質が抗原に対する全身性および粘膜体液応答を生じさせる知見に関する。本発明者らは、いずれの都合よい舌下投与できる賦形剤が使用できることを見出した。抗原と一緒に舌下投与した場合、血清ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを生じさせる糖脂質アジュバントの能力は、本発明がアレルギー脱感作と同様に予防ワクチンに適用できることを示している。加えて、舌下投与後に粘膜ＩｇＡを生じさせる糖脂質アジュバントの能力は、本発明が粘膜免疫性を生じる点で有用であることを示している。粘膜免疫性の発生は、空気伝達の病原体および特に性的に伝染する疾患からの保護に有用であることを示している。
一般には、本発明は、（Ａ）少なくとも１つの抗原および（Ｂ）糖脂質アジュバントを含む組成物およびその使用に関する。
特に、本発明の１の態様により、粘膜および／または全身性免疫応答の発生を必要とするヒトまたは動物におけるその方法であって、少なくとも１つの抗原および糖脂質アジュバントを含む組成物を投与することを特徴とする方法を提供する。
他の点において、本発明は、粘膜および／または全身性免疫応答を発生するための医薬の製造における少なくとも１つの抗原および糖脂質アジュバントの使用に関する。
【０００７】
本発明の他の態様により、粘膜伝染病の治療方法であって、ヒトまたは動物に少なくとも１つの抗原および糖脂質アジュバントを含む組成物を舌下投与することを特徴とする方法を提供する。
他の点において、本発明は、粘膜伝染病の治療用の舌下投与可能な医薬の製造における、少なくとも１つの抗原および糖脂質アジュバントの使用に関する。
本発明のこれらの方法は、ＩｇＡ−媒介免疫応答を生じる。
したがって、本発明は、また、少なくとも１つの抗原および糖脂質アジュバントを含む組成物を舌下投与することを特徴とするヒトまたは動物のＩｇＡ免疫応答の発生方法を提供する。
他の点において、本発明はＩｇＡ免疫応答を発生する舌下投与可能な医薬の製造における少なくとも１つ抗原および糖脂質アジュバントの使用に関する。
組成物は有効量で投与されるべきである。「有効量」なる用語は非毒性を意味するが、望ましい免疫学的応答を与えるための十分な量の組成物を意味する。適当な有効量は当業者により決定できる。
【０００８】
本発明による組成物は、予防的（すなわち、感染の予防）または治療的（感染後の疾患の治療）のどちらであってよい。
好ましくは、組成物はヒト、哺乳類およびヒト以外の霊長類、例えばサルおよびモンキーを含め霊長類、家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ；家庭内哺乳類、例えばイヌおよびネコ；齧歯類、例えばマウス、ラットおよびモルモットを含む実験動物；家庭内、野生および狩猟鳥、例えばニワトリ、七面鳥および他のキジ類のトリ、アヒル、ガチョウ等を含むトリに投与される。 また、本発明の方法はＩｇＧ−媒介免疫応答を生じることができる。
本発明の他の態様により：
（Ａ）１つまたはそれ以上の抗原；および
（Ｂ）糖脂質アジュバント；
を含む組成物を提供する。
特に好ましい具体例において、糖脂質はＴＨ１−誘発アジュバントである。
好ましくは、本発明において有用な組成物は、（Ａ）および（Ｂ）の利用可能性を投与部位（粘膜舌下部位）で補助する舌下投与可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む。
好ましくは、抗原は細菌、ウイルス、プリオン、新生物、自己抗原、植物、動物または他の病原体、もしくは非病原体生物、合成または組み換え物質から由来する。
抗原は抗原分子、または合成または組み換え法により製造される分子の選択部分を含んでいてもよい。
好ましくは、抗原はアレルギー抗原である。アレルギー抗原は、アレルギーを誘発する傾向を有する抗原の型である。アレルギー抗原は、アレルギー抗原分子または合成または組み換え法により製造される分子の選択部分を含むことができる。
以後、抗原なる語、アレルギー抗原なる語を包含する。
好ましくは、抗原はポリペプチド、炭水化物または脂質の形態である。別法として、抗原は抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、上記ポリヌクレオチドが、上記ヌクレオチドの発現を調節する調節配列に作動的に連結したベクターの形態であってもよい。
【０００９】
好ましくは、ＴＨ−１誘発アジュバントは、限定するものではないが、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント、３Ｄ−ＭＰＬまたはその誘導体もしくは塩であるか、またはいくつかの他のＴＨ−１誘発アジュバントまたはそのようなアジュバントの組み合わせであってもよい。
好ましくは、組成物はワクチンの形態である。
好ましくは、組成物は水溶液、ゲル、パッチ、ロゼンジ、カプセル、または錠剤、最も好ましくは水性またはゲル溶液である。
また、本発明は、ヒトまたは動物における細菌性、ウイルス性プリオン感染症、または癌、自己免疫またはアレルギーのような他の疾患の治療または予防用の医薬の製造における組成物の使用を提供する。
さらに、本発明は、抗原を認識する１つまたはそれ以上の抗体の産生法における組成物の使用を提供する。産生された抗体は、ヒトまたは動物における細菌性またはウイルス性感染症、癌、自己免疫またはアレルギーの治療用の医薬の製造において使用できる。本発明は空気伝達の病原体および性的に伝染する疾患に関して特に重要である。
さらに本発明は、ヒトまたは動物に本発明の組成物で免疫を与えることを特徴とする、抗血清またはそれからの免疫グロブリン調製物の調製法を提供する。
また、本発明は、本発明の組成物の調製法であって、抗原および糖脂質アジュバントの溶液と医薬上許容される希釈剤、担体または賦形剤、好ましくは水溶液またはゲルを混合することを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
詳細な記載
本発明のさらに好ましい種々の特徴および具体例を、限定するものではない実施例により記載する。
【００１１】
免疫応答
免疫応答は、特異性抗体および／または細胞毒性細胞が、侵入した微生物、寄生体、移植された組織および生体により異種であると認識される多くの他の物質、すなわち抗原に対して生産される、脊椎動物の免疫系により起こされる選択的応答である。血中に循環する抗体の生産は、体液応答；細胞媒介または細胞の免疫応答としての細胞毒性細胞の生産として知られている。
免疫系に含まれる細胞は、こららの機能を最も効果的に行うために、組織および器官に組織化される。これらの構造はリンパ系として総称されている。リンパ系は、リンパ球、補助的細胞（マクロファージおよび抗原提示細胞）およびいくらかの場合には上皮細胞を含む。これは別個に莢膜化された器官または発広汎性リンパ組織の蓄積のいずれかにアレンジされる。主なリンパ器官および組織は、第１（中枢）または第２（末梢）のいずれかに分類される。本発明は、第２のリンパ器官に焦点をあてるものである。第２のリンパ器官は、粘膜結合組織を含み、リンパ球が互いに、補助細胞および抗原と相互作用できる環境を提供する。
より詳しくは、第１のリンパ器官におけるリンパ球の生成（リンパ球産生）についで、これらの末梢の第２の組織への移動がおこる。第２のリンパ組織は完全に組織化された莢膜器官−脾臓およびリンパ節−および体のいたるところに見られる非莢膜器官の蓄積を含む。非組織化リンパ組織の大部分は粘膜表面と結合して見られ、粘膜結合リンパ組織（ＭＡＬＴ）と称される。
粘膜系は、粘膜上皮表面を介して直接的に体内に入ってくる抗原から生物を保護する。したがって、リンパ組織は腸管、呼吸器および尿生殖器の内側の表面に結合して見られる。本発明は、特に、舌下領域の内側の表面に結合して見られるリンパ組織に関する。それらの部位での主なエフェクター機構は、粘膜の上皮表面または管に直接分泌される分泌ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）である。
分泌ＩｇＡは、分泌物中に見られる全てのＩｇの９５％を超える量に相当し、Ｊ鎖により共有結合された２つの単量体単位で主に２量体である。２量体ＩｇＡは、粘膜上皮細胞の底面の重合体の免疫グロブリン受容体ｐＩＧＲに結合する。このＩｇＡ−ｐＩＧＲ複合体はエンドサイトーシスされ、上皮細胞の先端（ルミナール（luminal））表面に移動する。この移動工程の間、ｐＩＧＲの小さな断片は分泌成分と称される残存成分で開裂される。したがって、ＩｇＡは分泌成分に結合する２量体ＩｇＡとして分泌される。
【００１２】
分泌ＩｇＡは、補体系を活性化しないが、細菌およびポリオ、コクサッキー、ロータおよびヘルペスのようなウイルスをコートし、したがって、上皮組織の内側の粘膜にそれらが付着することを防ぐ。また、上皮表面内のいくらかのウイルスは、ｐＩＧＲ−インターナリゼーションＩｇＡにより中和できる。
分泌ＩｇＡの生成、したがって粘膜免疫応答の生成（以後、ＭＩＲ）は、当該分野で標準的な方法、例えばＥＬＩＳＡを使用して検出できる。単なる例示として、実施例１および２で使用する標準化したオボアルビミンＥＬＩＳＡ試験だけを調製例１に記載する。
抗原に対するＭＩＲは、粘膜または経口耐性として知られる、同様の抗原に対する全身性応答の状態を導くことができる。したがって、粘膜免疫法は、局所免疫応答および全身性免疫投与の両方を刺激する点で効果がある。
【００１３】
抗原
歴史的には、当該分野において、「抗原」なる用語はＢ細胞を誘導し、特異性抗体を産生するいずれの分子に対して使用された。しかしながら、現在は、この用語は免疫応答の適応できる分子、すなわち、Ｂ細胞またはＴ細胞もしくはその両方により明確に認識されうるいずれの分子をも示すために使用できる。したがって、「抗原」なる用語は、当該分野において、予備形成した抗体、および／またはＴおよびＢ細胞上の種々の特異的受容体と反応する分子を意味することは理解される。この定義は、慣習的に「アレルギー抗原」として知られるもの、すなわちＩｇＥ媒介過敏症を生じさせる作用物質、例えば花粉塵を含む。
アレルギー（１型過敏症）は、ＩｇＥ抗体がアレルギー対象において、非アレルギーのヒトと比較して比較的大量に産生され、肥満細胞および、特に好塩基球に接触する環境抗原（アレルギー抗原）に対する応答である。即時過敏反応は、喘息、花粉症、血清症、組織過敏症または接触性皮膚炎を引き起こす肥満細胞または好塩基球の表面上のＩｇＥとアレルギー抗原との間の反応に続いて放出される場合、肥満細胞産生物（ヒスタミン等）により生じる。過敏反応には４つの型がある（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型）。ＩＩ型およびＩＩＩ型は抗体媒介であり、第４の型は、主にＴ細胞およびマクロファージにより媒介される。本発明はアレルギーＩｇＥ免疫応答から離れて非アレルギー免疫応答に偏らせるために、アレルギー抗原で免疫処理するものである。
したがって、本発明で使用される「抗原」は、例えば花粉（例えばブタクサ花粉または樺花粉）、食物、昆虫毒、カビ、動物の毛またはイエダニ（D. farinae または D. pteronyssinus）のようないずれのアレルギー誘発物質から由来の「アレルギー抗原」であってもよい。
本発明で使用される抗原は、好ましくは免疫原、すなわち、免疫細胞を活性化し、それ自体に対する免疫応答を生じさせる抗原である。
好ましい具体例において、本発明はワクチンとして使用する処方に関し、抗原はこのようなワクチンに有用なものである。
【００１４】
本発明に使用される抗原は、入手できるか、または入手できるようになるいずれの適当な抗原とすることもできる。
ワクチンに使用される抗原の型は多くの因子に依存している。一般に、微生物の抗原はワクチン中に残っていればいる程良く、生きている生物が死んでいる生物よりも効果的な傾向がある。この役割の例外として、毒素がいずれの病原菌効果の原因である疾患がある。このような場合、ワクチンは、毒素またはトキソイドだけに基づくことができる。
本発明に使用される抗原は、いずれの生物；無傷または死んでいる生物；亜細胞性フラグメント；トキソイド；組み換えＤＮＡに基づく抗原または抗イディオタイプまたは合成抗原から誘導できる。抗原はウイルスまたは細菌であってよい、天然または弱毒生物から誘導できる。抗原の型は被膜多糖類、表面または内部の抗原であってもよい。組み換えＤＮＡを基礎とする抗原の場合、その抗原はクローン化または発現した遺伝子またはネイクドＤＮＡから得ることができる。
抗原は、例えばジアルデヒド、より特別にはグルタルアルデヒドのような架橋剤と反応することにより修飾できる。
【００１５】
例えば、ワクチンが入手できるか、または探し出せる微生物は、Salmonella、Shigella、Klebsiella、Enterobacter、Serratia、Proteus、Yersinia、Vibrio、Aeromonas、Pasteurella、Pseudomonas、Acinetobacter、Moraxella、Flavobacterium、Bordetella、Actinobacillus、Neisseria、Brucella、HaemophilusおよびEscherichia coliを包含する。
好ましいワクチンは、ワクシニア（天然痘）；ハタネズミ桿菌（ＴＢ）；ポリオ；はしか、おたふく風邪；風疹；黄熱病；水痘−帯状疱疹；ＢＧＧ；狂犬病；インフルエンザ；Ａ型肝炎；発疹チフス；百日咳；腸チフス；コレラ；ペスト；ペヌモコッカス（penumoccoccus）；髄膜炎菌；Haemophilus influensae；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；破傷風およびジフテリアを含む。毒素に基づくワクチンは、Chlostridium tetani、Corynebacterium diphtheriae、Vibrio choleraeおよびClostridium perfringensを含む。
ワクチンが有用でありうる他の主な疾患は、ＨＩＶ、ヘルペス、ウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ブドウ球菌、Ａ群連鎖球菌、Mycobacterium leprae、Treponema pallidum、Chlamydia、Candida、Pneumocystis、マラリア、トリパノソーマ症、シャーガス病；住血吸虫症およびオンコセルカ症を含む。
ワクチンが有用でありうる性的に伝染する疾患は、上記のＨＩＶおよびヘルペスに加えて：Neisseria gonorrhoeae、Treponema pallidum、Trichomonas vaginalis、Haemophilus ducreyi、クラミジア、Calymmatobacterium granulomatisおよび肝炎を含む。
【００１６】
また、腫瘍抗原の存在が証明されており、結果として癌に対する予防接種の概念が生じた。また、原則的には、受胎および移植は、広範囲に及ぶ妊娠および他の再生ホルモンに対する免疫性を誘発することにより妨害できる。
典型的には、抗原はポリペプチドであるだろうが、例えば核酸、炭水化物、脂質、例えばウイルス、細菌または原生動物のような完全または弱毒生物のような代わりの抗原構造もまた使用できる。
「ポリペプチド」なる用語は、一般的には、多数のアミノ酸に構成される分子を示すために使用され、アミノ酸は、例えばペプチド結合を介して共に共有結合している。一般的には、ポリペプチドは大きさまたは機能の違いを示さない場合、「蛋白質」または「ペプチド」と相互交換して使用できる。組み換えポリペプチドは、当該分野でよく知られた方法、例えばSambrookらの「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第２巻、Cold Spring Harbor Lab. Press(1989)に記載の方法により調製できる。
【００１７】
糖脂質アジュバント
一般的な用語において、アジュバントは、抗原に対して免疫応答を非特異的に強化する物質、すなわち免疫刺激剤である。一般的な用語において、糖脂質は疎水性尾部に結合する炭水化物鎖を有する細胞膜脂質分子である。本発明の好ましい糖脂質アジュバントは、修飾リポ多糖類である。リポ多糖類はが対応する野生型のリポ多糖類またはそれを誘導してものからのリポ多糖類と比較してその毒性が減少するように修飾される。好ましくは、本発明で使用される糖脂質アジュバントは解毒腸内菌リポ多糖類またはその脂質Ａ成分である。「解毒した」なる用語は、毒素を完全に非毒性として変異体および残りの毒性の低い変異体の両方を意味する。好ましくは、解毒したアジュバントは対応する野生型の毒素の０．０１％未満、より好ましくは約０．００１％未満の毒性を保持する。毒性は形態学的変化を評価することによりＣＨＯ細胞で測定できる。
好ましくは、糖脂質アジュバントはＴＨ−１誘発アジュバントである。「ＴＨ−１誘発アジュバント」とは、本発明者らは抗原に対するＴＨ１応答を増加する特性を有するアジュバントを意味している。しかしながら、このようなアジュバントもまた、ある種の細胞群において、アネルギー−（非応答性）を惹起するサイトカインの修飾を誘発することにより、産生される抗体または抗原特異的細胞のレベルを単に増加する傾向がある。
より詳しくは、抗原に対する免疫応答は、一般的には、Ｔ細胞媒介（細胞殺害を含みうる）または体液性（抗原のエピトープの認識を介する抗体産生）である。免疫応答に関与するＴ細胞によるサイトカイン産生の型は、これらの応答のいずれの型が優勢であるかに影響を与えることができ、例えば、細胞媒介免疫性（ＴＨ１）は、高ＩＬ−２およびＩＦＮγ産生であるが低ＩＬ−２産生により特徴つけられるものに対して体液免疫性（ＴＨ２）において、その型は低ＩＬ−２およびＩＦＮγであるが高ＩＬ−４、ＩＬ１３、ＩＬ−５でありうる。応答は、通常は、第２のリンパ器官または細胞のレベルで調節され、そのため特異的Ｔ細胞および抗原提示細胞のサイトカイン型の薬理学的な操作は、生じた免疫応答の型および広がりに影響を及ぼしうる。
【００１８】
ＴＨ１−ＴＨ２均衡は、ヘルパーＴ細胞の２つの異なる形態の相互変換または優勢を意味する。この２つの形態は大規模であり、免疫系において対立する効果を有することも多い。免疫応答がＴＨ１細胞を好む場合、これらの細胞は抗体産生と共に細胞性応答を誘発し、これに対し、ＴＨ２細胞は抗体優勢応答を誘発するだろう。あるアレルギー反応に関与するイソタイプの抗体、ＩｇＥおよび、関連する炎症応答は、ＴＨ２細胞からのサイトカインにより誘発される。
ＴＨ１−誘発アジュバントとしてのアジュバントの有効性は、ウイルスアジュバントも含む、ワクチン中のこの抗原の投与の結果得られた抗原に対する抗体のプロファイルを測定することにより決定できる。
好ましくは、アジュバントは修飾リポ多糖類である。米国特許第４，９１２，０９４号に記載されているように、腸内細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）は強力な免疫刺激剤である。しかしながら、また、これは有害な、時に致死性の応答を惹起しうる。ＬＰＳに関連するエンドトキシン活性は、脂質Ａ成分から生じることが知られている。したがって、本発明は、より好ましくは、脂質Ａの解毒誘導体を使用する。Corixa Corporationは、本来、リファインド・デトキシファイド・エンドトキシン（ＲＤＥ）として知られる脂質Ａの誘導体を生成したが、それはモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標）アジュバント）として知られるようになった。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、中程度の強度の鉱酸溶液（例えば、０．１ＮのＨＣｌ）中において、約３０分の間、グラム陰性菌（たとえばサルモネラ種）のヘプトースレス変異体から得られるＬＰＳまたは脂質Ａを還流することにより製造できる。この処理により、還元末端グルコサミンの１位で、リン酸基の損失が生じる。加えて、中心の炭水化物を、この処理の間、非還元グルコサミンの６’位から除去できる。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよび３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａならびにその製造法は、米国特許第４，４３６，７２７号および米国特許第４，９１２，０９４号および再審査証明書Ｂ１ ４，９１２，０９４に記載されている。
【００１９】
しかしながら、好ましくは、、解毒脂質Ａが非還元グルコサミンの６’に結合する中心基を保持する修飾ＬＰＳまたは脂質Ａを使用する。このようなＬＰＳおよび脂質Ａの誘導体もまた、米国特許第４，９１２，０９４号に記載されている。より詳しくは、米国特許第４，９１２，０９４号は、リポ多糖類の３’位で還元末端グルコサミンにエステル結合される、リポ多糖類のβ−ヒドロキシミリスチンアシル残基だけを選択的に除去する方法であって、リポ多糖類をアルカリ加水分解に付すことを特徴とする方法により得られる修飾リポ多糖類を開示している。このような脱Ｏアシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標）アジュバント）、ジホスホリル脂質Ａ（ＤＰＬ）およびＬＰＳは、本発明で使用できる。したがって、好ましい具体例において、本発明は還元末端グルコサミンの３’位が脱Ｏアシル化されているＭＰＬ（登録商標）アジュバント、ＤＰＬまたはＬＰＳを使用する。これらの化合物は各々３Ｄ−ＭＰＬ、３Ｄ−ＤＰＬおよび３Ｄ−ＬＰＳとして知られている。
【００２０】
米国特許第４，９８７，２３７号において、構造式：
【化１】
【００２１】
また、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント誘導体は、構造式：
【化２】
【化３】
を有する。
【００２２】
Corixa Corporationより市販されているアジュバントの１つは、２％のスクアレン、０．２％のトゥイーン８０ならびにＭＰＬ（登録商標）アジュバントを含む。
他の市販のアジュバントは、Ｄｅｔｏｘ（登録商標）アジュバント（Corixa Corporation）であり、これはＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびマイコバクテリア細胞壁骨格を含む。
入手できるか、または入手できるようになるＬＰＳまたは脂質Ａの全ての誘導体または塩は本発明に使用できる。好ましい誘導体および塩は、医薬上許容されるものである。
ＴＨ１誘発アジュバントは、投与直前に組成物の他の成分と混合できる。別法として、製品の製造の間、他の成分と一緒に処方することができる。別法として、他の成分と異なる時間で投与できる。投与は多くの経路により行うことができる。好ましくは、糖脂質アジュバントは、１．０ｍｇ〜２５０ｍｇ、より好ましくは２５ｍｇ〜５０ｍｇの量で投与される。
【００２３】
ワクチン
本発明の１の態様は、哺乳類、好ましくはヒトにおける免疫学的応答、好ましくは粘膜免疫学的応答の誘発法であって、個体を本発明の組成物で舌下接種し、抗体、好ましくはＩｇＡおよび／またはＴ細胞免疫応答を産生する方法に関する。好ましくは、応答は上記の個体を感染症、特に菌またはウイルス感染症から保護するために適当である。好ましくは、応答は該個体を疾患から保護するのに適しており、その疾患が該個体において確立されていてもいなくても適している。したがって、免疫学的応答は治療的または予防的に使用できる。
ワクチンは本発明の組成物から調製できる。活性成分としての抗原を含むワクチンの調製は、当業者により知られている。典型的には、このようなワクチンは、液体または懸濁液として調製され；投与前に液体中に溶解または懸濁するのに適当な固体形態としても調製できる。また、製剤はゲル、乳化、またはリポソーム中に莢膜された組成物であってもよい。適当な賦形剤は、例えば、水、リン酸アンモニウム、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびその組み合わせである。
【００２４】
組成物は、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、カルボン酸マグネシウム等のような、通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁系、錠剤、ピル、カプセル、徐放性処方またはパウダーの形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含む。ワクチン組成物は凍結乾燥され、凍結乾燥された物質は投与前に、例えば懸濁液として復元できる。復元は好ましくは緩衝液中で行う。
加えて、望ましい場合、ワクチンは、湿剤または乳濁化剤のような少量の補助物質、ｐＨ緩衝剤および／またはワクチンの効果を増加するさらなるアジュバントを含んでいてもよい。
抗原およびアジュバントの割合は、両方が有効量存在する限り広範囲にわたって変化できる。典型的には、ワクチンは抗原０．２μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１５μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度で含むように処方できる。好ましい処方は公知の投与量の範囲のプロトコルおよび「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」, Mack Publishing Company, 19巻, 1995を参照して決定できる。
処方後に、ワクチンは滅菌できる容器に入れることができ、ついで、その容器をシールし、低温、例えば４℃で保存するか、または凍結乾燥してもよい。凍結乾燥は安定した形態で長期間の貯蔵を可能にする。
本発明で使用される抗原は、中性または塩の形態としてワクチンに処方できる。医薬上許容される塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基との）および無機酸、例えば塩酸またはリン酸、または有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸およびマレイン酸と形成される塩を含む。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄（ＩＩ）のような無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインのような有機塩基から誘導することができる。
組成物は錠剤、カプセルまたは他の都合のよい処方として、そのような処方を製造するために必要な賦形剤と共に与えられる。
【００２５】
発明の組成物を使用する抗体の調製
本発明による組成物は、本明細書に記載されている投与経路により免疫原として、抗血清、特異的免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体を生成するためのさらなるアジュバントを使用することなしに直接使用できる。したがって、本発明は抗原特異的免疫グロブリン産生を誘導する方法であって、以下の工程：
ａ）本発明による組成物で動物に免疫化する工程；および
ｂ）組成物の一連の抗原に特異的な免疫グロブリンを動物の血清から回収する工程；
ｃ）モノクローナル抗体を産生するクローン細胞を選択する工程
を特徴とする方法を提供する。
抗体を生成する方法は、KohlerおよびMilsteinのNature(1975) 256: 495-497に教示されている。
抗体産生に使用される動物は、この目的のために通常使用されるいずれの動物、特に哺乳類であってもよい。特に示されるものは、マウス、ラット、モルモットおよびウサギである。該動物は本明細書に記載の処方で治療できるだろう。
より詳細には、抗原を含む本発明の処方は、抗体、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方を生産するために使用できる。ポリクローナル抗体が望ましい場合、選択された動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫化する。免疫化した動物からの血清を集め、公知の方法により処理される。血清が他の抗原に対するポリクローナル抗体を含む場合、必要とされるポリクローナル抗体は、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。ポリクローナル抗血清の製造および処理方法は当該分野では公知である。
【００２６】
本発明に使用される抗原に対するモノクローナル抗体もまた、当業者により容易に製造できる。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を製造する一般的な方法がよく知られている。永久抗体生成細胞系は、細胞融合、および腫瘍形成ＤＮＡでのＢ−リンパ球の直接的形質転換またはエプスタイン・バール・ウイルスでのトランスフェクションのような他の方法により作成できる。抗原に対して産生されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性；すなわち、イソタイプおよびエピトープ結合性に関してスクリーンできる。
別法として、例えばファージが多種の相補的決定領域（ＣＤＲ）を有するコートの表面でｓｃＦｖフラグメントを発現する、ファージ提示ライブラリーをスクリーンすることを含む。この方法は当該分野で公知である。
抗原に対する抗体、モノクローナルおよびポリクローナルの両方は、診断において特に有用であり、中和しているそれらは受動免疫治療において有用である。特に、モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体を生じさせるために使用できる。抗イディオタイプ抗体は、感染物質に対する保護が望まれるものの抗原の「内部イメージ」を有する免疫グロブミンである。
抗イディオタイプ抗体を生じさせる方法は当該分野で公知である。これらの抗イディオタイプ抗体もまた、治療ならびに抗原の免疫原性領域の解明に有用でありうる。
本発明の目的に関して、「抗体」なる用語は、特記しない限り、それらの標的抗原に対する結合活性を残した完全な抗体のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。さらに、抗体およびそのフラグメントは、例えばＥＰ−Ａ−２３９４００に記載のようにヒト化抗体であってもよい。
【００２７】
組成物の調製
本発明の組成物は、抗原の水溶液と糖脂質アジュバントとを混合し、この混合の前または後に粘膜投与可能な希釈剤、賦形剤または担体を添加しすることにより調製できる。別法として、糖脂質アジュバントは、抗原と共沈降できる。投与前に組成物の他の成分と混合させるか、または共沈降させることと同様に、糖脂質アジュバントは他の成分と異なる部位および／または時間で投与できる。糖脂質アジュバントおよび抗原の混合物もまた、ゲル、カプセル、ロゼンジ等に組み入れらてもよく、または二または好ましくは単向性でありうるパッチのような種々のデパイスで与えられてもよい。
超音波または他の方法（ＭＰＬ（登録商標）アジュバント溶液の調製に後述されている）により溶解されたＭＰＬ（または他のＴＨ１誘発アジュバント）は、抗原に添加する前に種々の方法により希釈できる。ＭＰＬの調製は、典型的には、０．５ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ、例えば１ｍｇ／ｍｌの濃度で最初に作られる。ついで、５００μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１００μｇ／ｍｌの濃度に希釈できる。希釈は精製水または例えば１％〜５０％グリセロールを含む水性グリセロール溶液のような他の溶媒で行うことができる。
適当な生理学上許容される担体および希釈剤は、滅菌水または５％のデキストロース水溶液を含む。組成物はヒトまたは獣医学的に使用され、粘膜、好ましくは舌下デリバリー用に処方される。
本明細書に記載の投与経路および投与量は単なる指針であり、熟練した医師はいずれの個々の患者および症状に最適な粘膜投与経路および投与量を決定できるだろう。
【００２８】
組成物の処方、投与量および投与
本発明の組成物は、都合よくは、舌下投与に適した医薬上許容される希釈剤、担体または賦形剤と共に処方できる。医薬上賦形剤の詳細は「Handbook of Pharmaceutical Excipients」第２巻（１９９４）、The Pharmaceutical Press、ロンドン、編集者：WadeおよびWellerに見られる。
本発明者らは本発明の重要な態様が本発明の組成物の舌下投与であることを見出した。ゲルまたは他の粘性処方は抗原と舌下表面との接触を増加させるために好ましいことと考えられる。しかしながら、結果は水溶液のような他の処方でもまた達成できる。マウスにおいて、一の単純溶液かつゲル処方と同様の結果をもたらすことが見出された。処方は物理的または化学的に粘膜組織に結合すべきであることは必要でも望ましくもない。
舌下投与に適した処方は、水性および非水性滅菌溶液を包含し、それはその処方個体の体液、好ましくは粘液と等張にする酸化防止剤、緩衝液、静菌化合物および溶質を含んでいてもよく；懸濁化剤または増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性滅菌懸濁液を包含する。処方は単回投与または複数回投与容器、例えばシールしたアンプルおよび瓶で与えられ、使用直前に滅菌液体担体の添加だけを必要とする乾燥凍結状態で貯蔵されていてもよい。
好ましくは、担体もまた本発明の組成物中に与えられる。担体は水乳濁液中の油、またはリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムのようなアルミニウム塩であってもよい。
好ましくは、水乳濁液中の非毒性油は、非毒性油、例えばスクアランまたはスクアレン、水性担体中の乳化剤、例えばトゥイーン８０を含む。水性担体は、例えばリン酸緩衝生理食塩水であってもよい。
【００２９】
本発明はまた、本発明のワクチン処方を他の抗原、特に癌自己免疫疾患および関連する症状の治療に有用な抗原と組み合わせて含む多価ワクチン組成物を提供する。
一般的には、担体は、限定するものではないが、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを含む。
さらに、本発明は１つまたはそれ以上の本発明の前述の組成物の成分を充填した１つまたはそれ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。
これらの組成物の投与は、軟膏、ペースト、ゲル、溶液、粉末等の形態であってもよい。ゲルは、都合よくは、カルボマーとしても知られているカルボポル−カルボキシビニル重合体、またはセルロース基剤増粘剤、例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、メチルセルロースを使用して処方できる。また、ゲルは、都合よくは、アカシア、アルギン酸、ベントナイト、セトステアリルアルコール、ゼラチン、グアールガム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、マルトデキストリン、ポリビニルアルコール、プロピレンカルボネート、プロピレングリコールアルギン酸エステル、コロイド状二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカントおよび／またはキサンタンガムを使用して処方できる。カルボポルおよびセルロース基剤試薬が特に好ましい。
組成物は投与量処方に互換性がある方法で、予防的および／または治療的に効果があるだろう量で投与される。投与量は、一般的には、治療する対象、合成抗体に対する対象の免疫系の能力、および望ましい保護の程度に応じて、投与量当たり０．５μｇ〜２５０μｇの抗原の範囲である。好ましい範囲は、投与量あたり約２μｇ〜約４０μｇである。いくらかの場合、患者は計画に沿った発生する抗体を含む連続投与で治療されるだろう。
適当な投与規模は、約０．１ｍｌであるが、計画の範囲内で、これはより少ない容量で開始し、より多い容量で終ってもよい。投与される活性成分の適確な量は、熟練者の判断に依存し、各々の患者に特有である。
組成物は単回投与計画、または、好ましくは複数回投与計画で与えられることができる。複数回投与計画は、ワクチン接種の主な経過が１〜１０に分割された投与であり、ついで、免疫応答を維持されるか、または強化される次の時間間隔で与えられた他の投与、例えば１〜４ヶ月で第２の投与、必要とする場合、数ヶ月後に次の投与（複数でも可）を含みうる。生成物がアレルギー治療に使用される場合、投与計画はより頻繁な投与を含むだろう。投与量計画は、また、少なくともある程度、各々の必要性および医師の判断に依存して決定されるだろう。
加えて、抗原（複数でも可）を含む組成物は多の免疫制御剤、例えば免疫グロブリンと共同で投与できる。
【００３０】
本発明を以下の実施例に基づいて説明するが、これは何ら本発明を限定するものではなく、単なる例示にすぎない。
実施例
ＭＰＬ（登録商標）アジュバント溶液の調製
１,２‐ジパルミトイル−ＳＮ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）の無水エタノール中４ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。各１．０ｍｇのＭＰＬ−ＴＥＡ（トリエチルアミン）塩を可溶化させるために、２７μｌのＤＰＰＣを添加し、ＭＰＬを溶解させた。ＭＰＬを上記したように調製してもよい。Ｎ２流を該バイアル中に穏やかに流すことによりエタノールを除去した。次に、乾燥させたＭＰＬ／ＤＰＰＣ混合物の１ｍｇのＭＰＬに対して１．０ｍｌの発熱物質不含の注射用水を添加した。その溶液を、透明になるまで、６０−７０℃のソニケーター浴中で音波処理に付した。ついで、ＭＰＬ／ＤＰＰＣ溶液をＳＦＣＡ２９０−４５２０Ｎａｌｇｅｎｅの２μｍフィルターを介して濾過することで濾過滅菌処理した。そのＭＰＬ／ＤＰＰＣ溶液を無菌状態で発熱物質除去したバイアルに１．０ｍｇ／ｍｌで分配し、ＭＰＬ−ＡＦ（界面活性剤ＤＰＰＣに可溶化させたＭＰＬ）を標識し、４℃で貯蔵した。
【００３１】
オボアルブミン（ＸＯＡ）／ＭＰＬ（登録商標）アジュバント／舌下用ゲルの処方
マウスにおけるＴＨ１誘発活性は特異性ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体の産生と同一視することができ、ＴＨ２誘発活性は特異性ＩｇＧ１抗体およびＩｇＥ抗体の産生と同一視することができる。特異性分泌ＩｇＡ抗体は粘膜応答が発生するかどうか、舌下的免疫処理の後にそれが局所的（唾液抗体）または遠位的（膣抗体）であるかどうかを同定することができる。しかしながら、単に血清中の特異性ＩｇＧ応答を測定するだけで、処方の免疫原性の可能性を調べることができる。
したがって、一例として、一の実験をマウスにて行い、モデル抗原として許容され、鶏卵より誘導される周知のアレルゲンでもある、例えば、オボアルブミン（ＸＯＡ）に対するアレルゲン特異的抗体の特性を測定した。
【００３２】
ストック材料
Ｉ．カルボポルＴＲ−１ＮＦストック（０．８３％）
Ａ．２０ｍｌのＷＦＩ（注射用水）中の１００ｍｇのカルボポルＴＲ−１ＮＦ
＝０．９％ｗ／ｖゲル
Ｂ．Ａに０．８ｍｌの１０％ｖ／ｖＴＥＯＡ（トリエタノールアミン）を添加した
＝０．８％ｗ／ｖゲル
【００３３】
ＩＩ．ＭＰＬ ＡＦグリセロール（２０ｍｇ／ｍｌ）
Ａ．ＭＰＬ ４０ｍｇ
ＤＰＰＣ ４．３２ｍｇ
グリセロール ８００μｌ
ＷＦＩ ４０ｍｌまで適量
粒度が略８０ｎｍとなるまで音波処理した。
Ｂ．凍結乾燥化
Ｃ．１．２ｍｌのＷＦＩ−２０ｍｇ／ｍｌのＭＰＬを用いて復元
【００３４】
ＩＩＩ．オボアルブミンストック（３３ｍｇ／ｍｌ）
オボアルブミン ３３ｍｇ
ＷＦＩ １．０ｍｌ
【００３５】
注射用処方
カルボポルストック １９２０μｌ
オボアルブミンストック ４８０μｌ
グリセロール ４８０μｌ
ＷＦＩ ７２０μｌ
ＭＰＬグリセロール ４００μｌ
１．カルボポル、ＸＯＡ、グリセロールおよびＷＦＩを５ｍｌのバイアルに加え、攪拌により混合した。
２．ＭＰＬグリセロールを上記した混合物に加え、さらに攪拌を行った。
【００３６】
マウスの免疫化
一群５匹の８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスをケタミンで麻酔した。マウスが無意識の時に、種々の量のＸＯＡを含有する２０μｌの適当なゲルを舌の下に５分間置いた。５分後に、シリンジおよび胃管針を用いて０．９％セイライン１．０ｍｌでそのゲルを口から洗い流した。
３週間後、マウスを最初の処理と同様に処理した。マウスを第２の処理の後、２週間給餌し、血清を集めた。これらをエライザアッセイを用いてＸＯＡ特異的ＩｇＧ抗体について検定した。
【００３７】
結果
２０μｌのカルボポルゲル中の８３．２μｇまたは３．４μｇのいずれかのオボアルブミンおよび３３．６μｇのＭＰＬを舌下経路により投与し、３週間後にブースター処理し、その後２週間給餌したマウスにおける抗−オボアルブミンＩｇＧ応答（一群５匹のマウスのＯＤ（光学濃度）平均値）
種々の血清希釈度でのＯＤ値
【表１】
実施例２
マウスを免疫化するための材料の調製
カルボポル中の、あるいはまたＭＰＬを含まない希釈液（水性処方）中のＸＯＡ／ＭＰＬの免疫化用量を、種々の用量を用いることを除き、実施例１に記載されるように調製した。
【００３９】
マウスの免疫化
１．各マウスを投与前に麻酔処理した。
２．舌の下に２０μｌの適当な材料を５分間置いた。すなわち、各群のマウスに２０μｌの以下の量の物質を投与した。
【表２】
３．５分後、０．９％セイライン１．０ｍｌで口内の材料を洗い流した。
４．第１のワクチン接種の３週間後と、さらにこの２週間後にマウスを再び処理した。
５．第３の処理の後の２週間、マウスに給餌し、使用するまで−２０℃で血清を貯蔵した。鼻および肺洗浄を行い、同一条件下で貯蔵した。
６．血清および洗浄液を上記したようにオボアルブミン特異性抗体について試験した。
【００４１】
結果
ＸＯＡ力価ｌｏｇ（２）／対照力価（ｌｏｇ）２に特異的な血清ＩｇＧ抗体（ＳＤ）
【表３】
種々の流体中の幾何平均抗ＸＯＡＩｇＡ抗体（ＳＤ）
【表４】
ＸＯＡに対する強い血清ＩｇＧ応答はＭＰＬの添加を必要とし、それはまたＩｇＧ２ａ抗体応答により示されるＴＨ１型応答を刺激するようである。
新規かつ予期せぬ知見はアジュバントとしてＭＰＬを用いた場合にＸＯＡ−特異的ＩｇＡ応答を強く誘発したことであった。
マウスにおいて、賦形剤としてカルボポルを用いることの明瞭な利点はない。実際、カルボポルを含まないＸＯＡおよびＭＰＬの水性処方がＩｇＧおよびＩｇＡ誘発の両方に対してより免疫原性であることを示す強力な証拠があった。このことはカルボポルの不在下でのみ見られる血清ＩｇＡを包含した。しかしながら、ワクチンの処方に賦形剤を用いることは不可欠であり、カルボポルはヒトまたは動物用の有用かつ便利な賦形剤である。
【００４４】
調製例１−オボアルブミンエライザ
１．一群５匹のマウスの各々からの血清（ボレート緩衝液にて１：２に希釈）をエライザアッセイにて試験し、抗−オボアルブミンＩｇＧまたはＩｇＡ抗体力価を測定する。
【００４５】
２．エライザを行うのに、以下の装置および供給物を必要とする。
Ａ．イムロン２プレート、９６ウェル、フラットボトム、ダイナテック・ラボラトリース・カタログ番号０１１−３４５５。（１０匹のマウスからの血清を二重反復試験にて試験するのに十分である）生成物当たり３つのプレートをロット試験した。
Ｂ．オボアルブミン（鶏卵）、シグマ等級５。アッセイを行うたびに、ストック溶液（注射用水中１ｍｇ／ｍＬ）を新たに製造した。
Ｃ．汚染されていない（オートクレーブ処理した）ピペットチップ
Ｄ．２０、１００、２００、１０００μｌのピペッター
Ｅ．８チャネルピペッター；２００μｌサイズ
Ｆ．汚染されていない（新しい）１３ｍｍの試験管または２ｍＬの低温バイアルおよびラック
Ｇ．パラフィンまたはサランラップ
Ｈ．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４
【００４６】
Ｉ．ホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識化抗−ＩｇＧまたは抗−ＩｇＡ第２抗体（１：５０００で使用した）。サザーン・バイオテクノロジー・アソシエート・インコーポレイテッド
Ｊ．ＯＰＤキット：ｏ−フェニレンジアミン錠、一プレートおよび希釈液に付き１つ。アボット・ラボラトリーズ・インビトロ試験番号７１８１Ｅ。集団内部で入手できることも多い。
Ｋ．試験すべきマウス血清。血清は長期間保存するためにボレート緩衝液中に１：２で希釈しなければならない。
Ｌ．ボレート希釈液（ＢＢ）：
次の物質を４Ｌの滅菌ＷＦＩに溶かす：
１２．４ｇのホウ酸、フィッシャー・サイエンティフィック＃Ａ７３−５００
０．７６４ｇのホウ酸ナトリウム（ボラックス）、フィッシャー・サイエンティフィック＃Ｓ２４８−５００
１７．５３ｇの塩化ナトリウム、フィッシャー・サイエンティフィック＃Ｓ２７１−５００
室温で貯蔵し、６ヶ月で廃棄する。
【００４７】
Ｍ．ボレート緩衝液＋０．１％ツィーン２０（ＢＢ−Ｔ２０）：
１ｍＬのツィーン−２０（シグマ＃Ｐ−１３７９）を１リットルのＢＢに加え、完全に混合する。室温で貯蔵し、６ヶ月で廃棄する。
Ｎ．ボレート緩衝液−ツィーン−２０−１％ＢＳＡ（ＢＢ−ＢＳＡ）
１．９０ｇのＥＤＴＡ（テトラナトリウム、フィッシャー・サイエンティフィック＃ＢＰ１２１−５００）および１０ｇのＢＳＡ（フラクションＶ、プロテアーゼ不含、ベーリンガー・マンハイム＃１００−３５０）を１リットルのＢＢ−Ｔ２０に溶かす。
Ｏ．０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液
４．２ｇのＮａＨＣＯ３および５．３ｇのＮａ２ＣＯ３を１リットルのＲＯ水または滅菌灌水に溶かし、ｐＨを９．６に調整する。４℃で貯蔵し、３ヶ月で廃棄する。使用する前に室温に加温する。
【００４８】
Ｐ．自動式ピペッター
Ｑ．攪拌ミキサー
Ｒ．微量遠心分離ラック
Ｓ．４９０ｎｍでのＯ．Ｄ．の読取能を有するプレートリーダー
Ｔ．３７℃にセットされるインキュベーター
Ｕ．２５ｍＬの血清学上のピペット（フィッシャー・サイエンティフィック）
Ｖ．１５ｍＬのポリプロピレン製円錐管
Ｗ．マルチチャネルピペッター用の試薬鉢
Ｘ．自動式プレート洗浄器
【００４９】
３．エライザを行うための操作
Ａ．試験抗原の結合
Ｉ．アジュバントアッセイに使用する結合プレートにある抗原の濃度は５０μｇ／ｍｌである：
２．５ｍＬのストック１ｍｇ／ｍＬオボアルブミン溶液を４７．５ｍＬの０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩溶液に加える。この量はウェル当たり１００μｌで４つの９６ウェルプレートをコートするのに十分である。
ＩＩ．ついで、プレートをサランラップで覆い、４℃、暗所で一夜、水平で静かに放置する。
【００５０】
Ｂ．血清希釈：希釈前に各血清試料を軽く攪拌し、プレートに添加する前に書く希釈試料を軽く攪拌する。希釈を行う場合には、新しいピペットチップを用いてストック管から血清を取り出すべきである。
Ｉ．アジュバントおよびオボアルブミンで免疫化したマウスから得られる血清についての出発希釈は１：６である。
【００５１】
Ｃ．プレートのブロッキング
Ｉ．血清試料をすべて希釈する場合、コーティング緩衝液をシンク中に激しく振盪することによりプレートを調製する。
ＩＩ．過剰な溶液を除去するためにプレートをペーパータオルパッド上で強くラップする。３５０μＬで洗浄し、各洗浄の間で５秒間待機するようにプログラムした自動式プレート洗浄器を用いて該プレートをＢＢ−Ｔ２０洗浄液で３回洗浄する。
ＩＩＩ．マルチチャネルピペッターを用いて、２５０μＬのＢＢ−ＢＳＡを各ウェルに加える。サランラップでカバーしてシールし、３７℃で３０分間インキュベートする。
【００５２】
Ｄ．プレートのローディング
Ｉ．ブロッキング緩衝液をシンク中に激しく振盪し、過剰な溶液を除去するためにプレートをペーパータオルパッド上で強くラップする。
ＩＩ．１００μｌのＢＢ−ＢＳＡを各プレートのすべてのウェルに添加する。１００μｌの適宜希釈した血清試料をカラム＃１にある適当なウェルに加える。各血清試料は二重反復にて試験すべきである。
ＩＩＩ．マルチチャネルピペッターを用い、１００μｌをカラム＃１中で８回上下にピペット処理に付して試料を混合し、ついで１００μｌをカラム＃２に移す。再び、８回上下にピペット処理に付して混合し、１００μｌをカラム＃３に移す。連続希釈をカラム＃１２を介して繰り返す。カラム１２を混合した後、チップにある１００μｌを捨てる。プレートの各ウェルに１００μｌなければならない。
【００５３】
Ｅ．インキュベーション
プレートをサランラップまたはパラフィンでカバーし、シールする。該プレートを３７℃で一時間インキュベートする。工程３ａに示す操作により結合していない抗体を除去し、再び該プレートをＢＢ−Ｔ２０で３回洗浄する。
【００５４】
Ｆ．コンジュゲート
Ｉ．ＢＢ−ＢＳＡに１：５０００で希釈すること（５０ｍＬの円錐管にある５０ｍＬのＢＢ−ＢＳＡ中の１０μｌの抗体）によりペルオキシダーゼ−標識化した抗ＩｇＧ第２抗体コンジュゲートを調製する。該円錐管を２０秒より長く反転させ、３０秒間攪拌し、完全に混合する。希釈した抗体を汚染されていない試薬鉢中に注ぐ。抗ＩｇＡコンジュゲートは対応する方法で調製することもできる。
ＩＩ．１００μｌのコンジュゲート溶液を、ブランクウェルを含む、プレートの各ウェルに加える。
ＩＩＩ．プレートをカバーして３７℃で１時間インキュベートする。
ＩＶ．コンジュゲート溶液を除去し、プレートを工程３ａにあるように３回洗浄する。
【００５５】
Ｇ．発色
Ｉ．３光学濃度の発色錠をホイルカバーした５０ｍＬのポリプロピレン製円錐管中の３０．４ｍＬの基質緩衝液に溶かすことにより、基質／比色試薬を使用する１０‐１５分前に調製する。
ＩＩ．マルチチャネルピペッターを用いて、１００μｌの試薬を各ウェルに添加する。室温で１５分間インキュベートする。
ＩＩＩ．１５分後、マルチチャネルピペッターを用いて５０μｌの１Ｍ硫酸を各ウェルに添加することにより反応を停止させる。
【００５６】
Ｈ．プレートの読取
Ｉ．「停止」から「読取」までの時間がプレート間で矛盾しないように、各プレート間で１−２分の連続的方法にてプレートを「停止」させなければならない（最後のプレートの反応を停止させた後、適当なプレートリーダー上、４９０ｎｍで最初のプレートを読み取る。１‐２分後に第２のプレートを読み、その１‐２分後に第３のプレートを読む）
【００５７】
イムノグロブリン力価の測定
各血清試料の力価をバックグラウンド値の２倍以上のＯＤ値を有する最初の段階的２倍希釈の逆数として定義する。対照動物のＯＤ値は各希釈で平均し、各群の平均力価を決定する。
上述した文献を出典明示により本明細書の一部とする。
Claims (11)
- 粘膜性および全身性免疫応答を生じさせる舌下投与用医薬の製造における少なくとも１つの抗原と、ＴＨ１−誘発性糖脂質アジュバントとの使用であって、その粘膜性免疫応答が舌下投与の部位に対して遠位にある、ならびに局部的である部位で引き起こされ、そのＴＨ１−誘発性糖脂質アジュバントが３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａまたはその塩であるところの、使用。
- ＩｇＡ免疫応答を生じさせる請求項１記載の使用。
- ＩｇＧ免疫応答を生じさせる請求項１または２記載の使用。
- ヒトまたは動物における細菌性またはウイルス性感染、自己免疫、癌またはアレルギーを治療するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
- 抗原が細菌、ウイルス、プリオン、新生物、自己抗原、動物、植物、組み換え体または合成物質から誘導される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
- 抗原がポリペプチドの形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
- 抗原がアレルギー抗原である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
- 抗原が抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの形態であり、そのポリヌクレオチドが該ポリヌクレオチドの発現をレギュレートする調節配列に作動的に連結する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
- 少なくとも１の抗原と糖脂質アジュバントとが単一の組成物中に配合されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
- 組成物が水溶液、ゲル、ロゼンジ、カプセルまたは錠剤の形態である、請求項９記載の使用。
- 粘膜性および全身性免疫応答を生じさせる舌下投与用医薬組成物であって、
（Ａ）少なくとも１つの抗原；
（Ｂ）ＴＨ１−誘発性糖脂質アジュバント；および
（Ｃ）舌下投与可能な希釈剤、賦形剤または担体
を含み、その粘膜性免疫応答が舌下投与の部位に対して遠位にある、ならびに局部的である部位で引き起こされ、そのＴＨ１−誘発性糖脂質アジュバントが３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａまたはその塩であるところの、医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0000891.2 | 2000-01-14 | ||
| GBGB0000891.2A GB0000891D0 (en) | 2000-01-14 | 2000-01-14 | Formulation |
| PCT/GB2001/000142 WO2001051082A1 (en) | 2000-01-14 | 2001-01-15 | Composition of antigen and glycolipid adjuvant sublingual administration |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003519669A JP2003519669A (ja) | 2003-06-24 |
| JP2003519669A5 JP2003519669A5 (ja) | 2006-05-11 |
| JP4648603B2 true JP4648603B2 (ja) | 2011-03-09 |
Family
ID=9883730
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001551505A Expired - Fee Related JP4648603B2 (ja) | 2000-01-14 | 2001-01-15 | 舌下投与用の抗原および糖脂質アジュバントの組成物 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8470331B2 (ja) |
| EP (3) | EP2322212A1 (ja) |
| JP (1) | JP4648603B2 (ja) |
| AR (1) | AR027924A1 (ja) |
| AU (1) | AU2001228625A1 (ja) |
| CA (1) | CA2397359C (ja) |
| CZ (1) | CZ304941B6 (ja) |
| DE (1) | DE60139305D1 (ja) |
| DK (1) | DK2100616T3 (ja) |
| ES (2) | ES2561360T3 (ja) |
| GB (2) | GB0000891D0 (ja) |
| HU (1) | HU230545B1 (ja) |
| PL (1) | PL356963A1 (ja) |
| SK (1) | SK288411B6 (ja) |
| WO (1) | WO2001051082A1 (ja) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060052757A1 (en) * | 1996-06-04 | 2006-03-09 | Vance Products Incorporated, D/B/A Cook Urological Incorporated | Implantable medical device with analgesic or anesthetic |
| US20060030826A1 (en) * | 1996-06-04 | 2006-02-09 | Vance Products Incorporated,d/b/a Cook Urological Incorporated | Implantable medical device with anti-neoplastic drug |
| US20060025726A1 (en) * | 1996-06-04 | 2006-02-02 | Vance Products Incorporated, D/B/A Cook Urological Incorporated | Implantable medical device with pharmacologically active layer |
| GB9706957D0 (en) | 1997-04-05 | 1997-05-21 | Smithkline Beecham Plc | Formulation |
| GB9820525D0 (en) | 1998-09-21 | 1998-11-11 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
| WO2004047793A1 (en) | 2002-11-26 | 2004-06-10 | Alk-Abelló A/S | Pharmaceutical allergen product |
| US8012505B2 (en) | 2003-02-28 | 2011-09-06 | Alk-Abello A/S | Dosage form having a saccharide matrix |
| WO2005115449A1 (en) * | 2004-05-28 | 2005-12-08 | Alk-Abelló A/S | Method of treating allergy and infection by eliciting an iga antibody response |
| ITMI20061117A1 (it) * | 2006-06-09 | 2007-12-10 | Michele Bonanomi | Una composizione farmaceutica per la somministrazione sublinguale di vaccini metodo per la sua preparazione e sui usi |
| US20090181078A1 (en) | 2006-09-26 | 2009-07-16 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| CN101516396B (zh) | 2006-09-26 | 2013-10-09 | 传染性疾病研究院 | 包含合成佐剂的疫苗组合物 |
| WO2010127144A1 (en) | 2009-04-29 | 2010-11-04 | Muniyappa Pravin K | Device and method for the diagnosis of gastrointestinal allergy |
| US8722064B2 (en) | 2009-06-05 | 2014-05-13 | Infectious Disease Research Institute | Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants |
| GB201009273D0 (en) * | 2010-06-03 | 2010-07-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel vaccine |
| EP3632463A1 (en) | 2011-04-08 | 2020-04-08 | Immune Design Corp. | Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses |
| JP5650780B2 (ja) | 2012-04-04 | 2015-01-07 | 日東電工株式会社 | ワクチン組成物 |
| NZ701881A (en) | 2012-05-16 | 2016-10-28 | Immune Design Corp | Vaccines for hsv-2 |
| EP3711768A1 (en) | 2013-04-18 | 2020-09-23 | Immune Design Corp. | Gla monotherapy for use in cancer treatment |
| US9463198B2 (en) | 2013-06-04 | 2016-10-11 | Infectious Disease Research Institute | Compositions and methods for reducing or preventing metastasis |
| WO2017173398A1 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Duke University | Alpha-helical peptide nanofibers as a self-adjuvanting vaccine platform |
| JP2023518924A (ja) * | 2020-03-24 | 2023-05-09 | チョル アン，ビョン | 幼い哺乳動物の粘膜関連伝染性疾病を予防または治療するための血清組成物の製造方法、前記方法によって製造された血清組成物及びその用途 |
| KR102151962B1 (ko) | 2020-03-24 | 2020-09-04 | 안병철 | 어린 포유동물의 전염성 질병을 예방 또는 치료하기 위한 혈청 조성물의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 혈청 조성물 및 이의 용도 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02113A (ja) * | 1987-09-30 | 1990-01-05 | Univ Saskatchewan | ＧｎＲＨに対する免疫応答を刺激し、哺乳動物を免疫的に生殖不能化するための剤及び方法 |
| JPH08508247A (ja) * | 1993-03-11 | 1996-09-03 | セクレテック，インク． | 粘膜表面への免疫原の輸送における重合的粘膜付着体 |
| JPH08253426A (ja) * | 1995-03-16 | 1996-10-01 | Lg Chem Ltd | 単一注射ワクチン剤形 |
| WO1997042947A1 (en) * | 1996-05-14 | 1997-11-20 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Methods of treating type i hypersensitivity using monophosphoryl lipid a |
Family Cites Families (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1128637A (en) | 1966-09-13 | 1968-09-25 | Beecham Group Ltd | Influenza vaccine |
| US3541201A (en) | 1968-12-18 | 1970-11-17 | Ethan Alan Brown | Novel sodium chloride encapsulated injectionable substances |
| GB1377074A (en) | 1971-07-13 | 1974-12-11 | Beecham Group Ltd | Process for preparing injectable compositions |
| GB1492973A (en) | 1974-02-16 | 1977-11-23 | Beecham Group Ltd | Process for preparing injectable compositions |
| US4070455A (en) * | 1974-02-16 | 1978-01-24 | Beecham Group Limited | Process for preparing injectable desensitizing compositions and products thereof in microparticle form |
| EP0182442B2 (en) | 1978-12-22 | 1996-04-03 | Biogen, Inc. | Recombinant DNA molecules and their method of production |
| US4258029A (en) * | 1979-04-23 | 1981-03-24 | Connaught Laboratories Limited | Synthetic adjuvants for stimulation of antigenic responses |
| US4436727A (en) | 1982-05-26 | 1984-03-13 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Refined detoxified endotoxin product |
| US4987237A (en) * | 1983-08-26 | 1991-01-22 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Derivatives of monophosphoryl lipid A |
| DE3521994A1 (de) * | 1985-06-20 | 1987-01-02 | Bayer Ag | N-(2-aminoacylamido-2-desoxy-hexosyl)-amide-, -carbamate und -harnstoffe, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung in arzneimitteln |
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| US5244663A (en) * | 1987-01-28 | 1993-09-14 | Medibrevex | Therapeutic method against allergy |
| FR2621916B1 (fr) * | 1987-10-19 | 1990-03-09 | Bioeurope | Derives de la l-tyrosine solubles dans l'eau et procede pour leur preparation |
| US4912094B1 (en) | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
| GB9106048D0 (en) | 1991-03-21 | 1991-05-08 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
| EP0640347A1 (en) | 1992-03-03 | 1995-03-01 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Oral vaccine |
| PT761231E (pt) * | 1992-06-25 | 2000-06-30 | Smithkline Beecham Biolog | Composicao de vacina contendo adjuvantes |
| EP1175912A1 (en) * | 1993-03-23 | 2002-01-30 | SmithKline Beecham Biologics SA | Vaccine compositions containing 3-O deacylated monophosphoryl lipid A |
| AU676340B2 (en) | 1993-05-25 | 1997-03-06 | Wyeth Holdings Corporation | Adjuvants for vaccines against respiratory syncytial virus |
| CA2167691A1 (en) * | 1993-08-27 | 1995-03-02 | Martin J. Blaser | Campylobacter jejuni antigens, and methods for their production and use |
| GB9326253D0 (en) * | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
| US5514665A (en) | 1993-12-30 | 1996-05-07 | University Of British Columbia | Method of preventing or reducing the risk of infection by bacterial pathogens utilizing simple and conjugated dextrans |
| US5997873A (en) * | 1994-01-13 | 1999-12-07 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Method of preparation of heat shock protein 70-peptide complexes |
| US5646115A (en) * | 1994-10-07 | 1997-07-08 | Heska Corporation | Ectoparasite saliva proteins and apparatus to collect such proteins |
| AU4977896A (en) * | 1995-02-17 | 1996-09-04 | Immunotherapy, Inc. | Immunotherapy screening, prognosis, and treatment methods and compositions |
| GB9508785D0 (en) | 1995-04-29 | 1995-06-21 | Smithkline Beecham Plc | Novel compositions |
| US5973128A (en) * | 1996-11-22 | 1999-10-26 | The Hospital For Sick Children Research And Development Lp | Glycolipid mimics and methods of use thereof |
| WO1998040097A2 (en) * | 1997-03-10 | 1998-09-17 | Bayer Corporation | Bovine respiratory and enteric coronavirus as a vaccine |
| US6491919B2 (en) * | 1997-04-01 | 2002-12-10 | Corixa Corporation | Aqueous immunologic adjuvant compostions of monophosphoryl lipid A |
| NZ338101A (en) * | 1997-04-01 | 2002-03-28 | Corixa Corp | Adjuvant compositions of Monophosphoryl Lipid A (MPL) and a phospholipid based surfactant (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)) suitable for intranasal administration |
| GB9706957D0 (en) * | 1997-04-05 | 1997-05-21 | Smithkline Beecham Plc | Formulation |
| AU7983198A (en) * | 1997-06-23 | 1999-01-04 | Ludwig Institute For Cancer Research | Improved methods for inducing an immune response |
| GB9717953D0 (en) | 1997-08-22 | 1997-10-29 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| GB9720585D0 (en) | 1997-09-26 | 1997-11-26 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| WO1999024577A1 (en) | 1997-11-10 | 1999-05-20 | Statens Serum Institut | NUCLEIC ACID FRAGMENTS AND POLYPEPTIDE FRAGMENTS DERIVED FROM $i(M. TUBERCULOSIS) |
| AU4563099A (en) * | 1998-06-11 | 1999-12-30 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | Methods and compositions for delivering proteins to macrophage cells and cells of macrophage derived lineage |
| WO1999066043A1 (en) | 1998-06-12 | 1999-12-23 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Recombinant production of toxoplasma sag1 antigen |
| EP1087788A1 (fr) | 1998-06-26 | 2001-04-04 | Aventis Pasteur | Immunisation a ciblage mucosal |
| GB9820525D0 (en) * | 1998-09-21 | 1998-11-11 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
| US6734172B2 (en) * | 1998-11-18 | 2004-05-11 | Pacific Northwest Research Institute | Surface receptor antigen vaccines |
| ES2173679T3 (es) * | 1999-01-27 | 2002-10-16 | Idea Ag | Inmunizacion/transporte transnasal con vehiculos altamente adaptables. |
| EP2275133A1 (en) * | 1999-02-26 | 2011-01-19 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Use of bioadhesives and adjuvants for the mucosal delivery of antigens |
| GB9909077D0 (en) | 1999-04-20 | 1999-06-16 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compositions |
| EP1173573A1 (en) * | 1999-04-23 | 2002-01-23 | Pharmexa A/S | Method for down-regulating il5 activity |
| UA81216C2 (en) | 1999-06-01 | 2007-12-25 | Prevention and treatment of amyloid disease | |
| WO2000076476A1 (en) | 1999-06-11 | 2000-12-21 | Endorex Corporation | Adjuvant-containing polymerized liposomes for oral, mucosal or intranasal vaccination |
| GB9924529D0 (en) * | 1999-10-15 | 1999-12-15 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| AU2001264079A1 (en) | 2000-06-14 | 2001-12-24 | William Leslie Porter | Lipids for modulating immune response |
| GB0020089D0 (en) | 2000-08-15 | 2000-10-04 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine Composition |
-
2000
- 2000-01-14 GB GBGB0000891.2A patent/GB0000891D0/en active Pending
-
2001
- 2001-01-12 AR ARP010100157A patent/AR027924A1/es unknown
- 2001-01-15 AU AU2001228625A patent/AU2001228625A1/en not_active Abandoned
- 2001-01-15 CZ CZ2002-2417A patent/CZ304941B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-01-15 PL PL01356963A patent/PL356963A1/xx unknown
- 2001-01-15 WO PCT/GB2001/000142 patent/WO2001051082A1/en active Application Filing
- 2001-01-15 SK SK1041-2002A patent/SK288411B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-01-15 DK DK09159908.4T patent/DK2100616T3/en active
- 2001-01-15 DE DE60139305T patent/DE60139305D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-15 US US10/181,684 patent/US8470331B2/en active Active
- 2001-01-15 EP EP10011044A patent/EP2322212A1/en not_active Withdrawn
- 2001-01-15 EP EP09159908.4A patent/EP2100616B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-15 ES ES09159908.4T patent/ES2561360T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-15 EP EP01942305.2A patent/EP1255563B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-15 CA CA2397359A patent/CA2397359C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-15 GB GB0101035A patent/GB2360210B/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-15 JP JP2001551505A patent/JP4648603B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-15 ES ES01942305.2T patent/ES2328336T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-15 HU HU0203972A patent/HU230545B1/hu unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02113A (ja) * | 1987-09-30 | 1990-01-05 | Univ Saskatchewan | ＧｎＲＨに対する免疫応答を刺激し、哺乳動物を免疫的に生殖不能化するための剤及び方法 |
| JPH08508247A (ja) * | 1993-03-11 | 1996-09-03 | セクレテック，インク． | 粘膜表面への免疫原の輸送における重合的粘膜付着体 |
| JPH08253426A (ja) * | 1995-03-16 | 1996-10-01 | Lg Chem Ltd | 単一注射ワクチン剤形 |
| WO1997042947A1 (en) * | 1996-05-14 | 1997-11-20 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Methods of treating type i hypersensitivity using monophosphoryl lipid a |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB0101035D0 (en) | 2001-02-28 |
| GB2360210A (en) | 2001-09-19 |
| JP2003519669A (ja) | 2003-06-24 |
| ES2328336T5 (es) | 2016-06-21 |
| EP2100616B1 (en) | 2015-11-25 |
| GB2360210B (en) | 2004-12-15 |
| PL356963A1 (en) | 2004-07-12 |
| DK2100616T3 (en) | 2016-02-08 |
| WO2001051082A1 (en) | 2001-07-19 |
| EP1255563A1 (en) | 2002-11-13 |
| EP1255563B2 (en) | 2016-03-02 |
| CZ20022417A3 (cs) | 2003-03-12 |
| US8470331B2 (en) | 2013-06-25 |
| CZ304941B6 (cs) | 2015-02-04 |
| CA2397359A1 (en) | 2001-07-19 |
| AR027924A1 (es) | 2003-04-16 |
| CA2397359C (en) | 2012-06-05 |
| EP1255563B1 (en) | 2009-07-22 |
| EP2322212A1 (en) | 2011-05-18 |
| AU2001228625A1 (en) | 2001-07-24 |
| DE60139305D1 (de) | 2009-09-03 |
| HUP0203972A2 (hu) | 2003-03-28 |
| ES2561360T3 (es) | 2016-02-25 |
| US20030165512A1 (en) | 2003-09-04 |
| GB0000891D0 (en) | 2000-03-08 |
| HU230545B1 (hu) | 2016-11-28 |
| EP2100616A2 (en) | 2009-09-16 |
| EP2100616A3 (en) | 2009-09-23 |
| ES2328336T3 (es) | 2009-11-12 |
| SK10412002A3 (sk) | 2003-05-02 |
| SK288411B6 (sk) | 2016-10-03 |
| HUP0203972A3 (en) | 2011-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4648603B2 (ja) | 舌下投与用の抗原および糖脂質アジュバントの組成物 | |
| JP4743928B2 (ja) | 処方物 | |
| JP2010265330A6 (ja) | 処方物 | |
| PT762875E (pt) | Sistema de entraga de microparticulas | |
| Wikingsson et al. | Polyacryl starch microparticles as adjuvant in oral immunisation, inducing mucosal and systemic immune responses in mice | |
| Heritage et al. | Novel polymer‐grafted starch microparticles for mucosal delivery of vaccines | |
| EP2514438B1 (en) | ADJUVANT CONTAINING ß-HEMATIN | |
| AU2003268581B2 (en) | Formulation | |
| AU2001266197A1 (en) | Contraceptive vaccines for pest control |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060309 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060309 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090609 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090817 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090824 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091008 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091016 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091109 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091116 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091209 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100427 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100727 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100803 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100827 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101116 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101210 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131217 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4648603 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |