ES2328336T5 - Composición de antígeno y adyuvante glicolipídico para administración sublingual - Google Patents
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Description
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DESCRIPCION
Composicion de antlgeno y adyuvante glicolipidico para administration sublingual Campo de la invention
La presente invencion se refiere a un metodo para producir una respuesta inmunitaria mucosal y sistemica usando una formulation administrada por via sublingual en particular, pero no de forma exclusiva, para uso en inmunizacion como una vacuna profilactica o terapeutica, o en el tratamiento de alergia.
Antecedentes de la invencion
El sistema inmunitario ha evolucionado especlficamente para detectar y eliminar material extrano o nuevo de un hospedador. Este material puede ser de origen vlrico, bacteriano, o parasitario y se puede encontrar fuera o dentro de las celulas del hospedador, o tener un origen neoplasico. Tambien puede ser de otras fuentes y no patogeno o no danar de forma intrlnseca a todos los sujetos.
El sistema inmunitario mucosal (MIS) consiste en tejidos linfoides dentro y directamente por debajo del revestimiento epitelial del tracto respiratorio, genitourinario y gastrointestinal as! como por debajo del sistema ductal de las glandulas salivales, lagrimales y mamarias. El producto primario del MIS es la IgA.
La vacunacion es la aplicacion mejor conocida y mas satisfactoria de un principio inmunologico para la salud humana. Naturalmente, para su introduction y aprobacion, una vacuna debe ser eficaz y la eficacia de todas las vacunas se revisa de vez en cuando. En la eficacia de una vacuna influyen muchos factores. Por ejemplo, una vacuna normalmente se administra por via subcutanea o intramuscular. Recientemente, la via sublingual se ha usado para administracion de vacunas terapeuticas para la alergia. Una vacuna eficaz debe inducir la inmunidad apropiada en terminos de efectos cuantitativos y cualitativos y ser estable en el almacenamiento. En particular con vacunas no vivas, a menudo es necesario reforzar su inmunogenicidad con un adyuvante. Esto tambien se puede aplicar a algunas vacunas vivas, por ejemplo atenuadas. Un adyuvante es una sustancia que aumenta la respuesta inmune a un antlgeno.
Durante el trabajo en la decada de 1920 sobre la production de antisuero animal para terapia en seres humanos, se descubrio que ciertas sustancias, en particular sales de aluminio anadidas a antlgenos o emulsiones que incorporan antlgenos, aumentar en gran medida la produccion de anticuerpos, es decir, actuan como adyuvantes. El hidroxido de aluminio aun se usa ampliamente, por ejemplo, con toxoide de difteria y tetanico y la tirosina insoluble se usa con algunas vacunas para alergia. Otros adyuvantes mas solubles tambien tienen efectos deseables tales como la induction de un aumento de la respuesta inmunitaria direction de la respuesta hacia, por ejemplo, una respuesta de tipo TH1.
El monofosforil llpido A 3 des-O-acilado se conoce a partir del documento GB-A-2220211 (Ribi). Qulmicamente, puede ser una mezcla de monofosforil llpido A 3 des-O-acilado con cadenas 4, 5 o 6 aciladas y en la actualidad se fabrica en Corixa Corporation. Una forma preferente de monofosforil llpido A 3-des-O-acilado (tambien denominado en el presente documento adyuvante de MPL®) se desvela en la Solicitud de Patente Internacional N° WO92/16556.
La Publication de Patente Internacional N° WO98/44947 describio una formulacion para uso en terapia de desensibilizacion de personas que padecen alergia que comprendla un alergeno opcionalmente modificado, tirosina y monofosforil llpido A 3 des-O-acilado.
Se han realizado esfuerzos considerables para producir mejores adyuvantes, en particular para respuestas mediadas por linfocitos T, pero se deberla hacer enfasis en que muy pocos de estos adyuvantes mas recientes ya estan aceptados para uso de rutina en seres humanos. Sin embargo, el adyuvante de MPL® se ha autorizado para uso con una vacuna para Melanoma y algunas vacunas para alergia que contienen adyuvante de MPL® estan disponibles como 'Agentes Especiales' en Alemania, Italia y Espana.
El documento de patente WO00/50078 de Chiron describe una composicion que incluye bioadhesivos en combination con adyuvantes y antlgenos para administracion por via mucosal. Sin embargo, este solamente demuestra la produccion de una respuesta inmunitaria de IgG con la composicion. Ademas, el bioadhesivo es un agente que se une flsica o qulmicamente a la mucosa. Se cree que puede haber problemas de seguridad asociados con tal bioadhesion de algunas composiciones que contienen antlgenos. No se ensena la administracion sublingual; administrando ser la composicion de ensayo por via intranasal.
Chauncey et al., J. dent. res. vol 33, n.° 3, pags. 321-334 (1954), Lindquist et al., Enzyme, vol. 20, pags. 277-291 (1975), Chauncey, The Journal of the American Dental Association, vol. 44, pags. 360-367 (1961), Garren y Repta, International Journal of Pharmaceutics, vol. 48, pags. 189-194 (1988) todos muestran que la saliva humana comprende esterasas que pueden hidrolizar los adyuvantes glicolipldicos. Valdez et al., Dig. Dis., vol. 9, pags. 125-
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132 (1991) describen que tras la estimulacion aumenta la produccion de saliva y que la saliva comprende lipasas y amilasas que pueden hidrolizar glicollpidos.
Evidentemente, todavla existe una necesidad de una composicion que genere una respuesta inmunitaria mucosal y sistemica para proteger frente a bacterias, virus y otros organismos para sicarios, y que se pueda usar como una vacuna para la alergia. De forma ideal, tal composicion se deberla poder administrar mediante una via que este asociada con el buen cumplimiento del paciente, tal como la via sublingual. Tambien se ha encontrado que la administracion sublingual puede proporcionar una absorcion rapida y una buena biodisponibilidad de la sustancia que se esta administrando. La administracion sublingual tambien puede ser ventajosa con respecto a las inyecciones intermitentes en el mantenimiento de concentraciones en sangre adecuadas de la sustancia que se esta administrando. Preferentemente, la composicion deberla usar adyuvantes convenientemente disponibles.
Sumario de la Invencion
La invencion esta definida por el uso de la reivindicacion 1 y por la reivindicacion 13. La presente invencion se refiere a un sistema de administracion sublingual y tiene ventajas asociadas con este medio de administracion. Con mas detalle, los inventores han encontrado que es posible usar adyuvantes glicolipldicos, tal como el adyuvante de MPL®, con un antlgeno para producir una respuesta inmunitaria mucosal (MIR) cuando se administra por via sublingual. Los inventores entienden que son los primeros en darse cuenta que el uso de adyuvantes glicolipldicos por via sublingual puede producir una IgG sistemica as! como una respuesta mediada por la IgA mucosal. De forma sorprendente, los inventores tambien han encontrado que la MIR se puede generar en un sitio que es distal con respecto a, as! como local con respecto a, el sitio de administracion sublingual. Por ejemplo, la IgA se puede detectar en otros tejidos linfoides, tal como en el tracto intestinal, tracto respiratorio y tracto genitourinario. Esto presenta implicaciones particularmente importantes para el tratamiento, por ejemplo, de enfermedades transmitidas por via sexual, ya que es conveniente la aplicacion sublingual y por lo tanto puede conducir al buen cumplimiento por parte del paciente con cualquier regimen de dosificacion.
Parece que el efecto del adyuvante se debe principalmente a dos actividades: la concentration persistente de antlgeno en un sitio en el que los linfocitos u otras celulas competentes se exponen al mismo (el efecto de "liberation prolongada") y la induction de citoquina as, que regulan la funcion de los linfocitos. Algunos dispositivos mas nuevos tales como liposomas y complejos de estimulacion inmune (ISCOMS) pueden conseguir la misma finalidad asegurando que los antlgenos atrapados en los mismos se administren a celulas que presentan antlgenos. Se cree que algunos productos bacterianos tales como paredes celulares de micobacterias, endotoxinas, etc., actuan estimulando la formation de citoquinas. La induccion de citoquinas puede ser particularmente util en pacientes inmunocomprometidos, que a menudo fracasan en su respuesta a vacunas normales. Se espera que tal induccion de citoquinas tambien pueda ser util en la direction de la respuesta inmunitaria en la direction deseada, por ejemplo en enfermedades en las que solamente se desea la capacidad de respuesta de las celulas TH1 o TH2 (Roitt et al., "Immunology" 4a edition).
Los inventores tambien proporcionan una formulation de antlgeno, que pueda inclinar el equilibrio de TH1-TH2 a favor de una respuesta de TH1, que se pueda administrar a las mucosas, preferentemente a la boca y en particular al sitio sublingual. La formulacion es util en inmunoterapia, en particular en el campo de las vacunas. Tambien es util en el estudio de respuestas inmunes y en la produccion de anticuerpos.
Exposicion de la invencion
La presente invencion se refiere al uso de al menos un antlgeno y un adyuvante glicolipldico en la preparation de un medicamento que se puede administrar por via sublingual para producir una respuesta inmunitaria mucosal y sistemica, donde la respuesta inmunitaria mucosal se genera en un sitio tanto distal como local respecto al sitio de administracion sublingual.
La presente invencion se refiere ademas a una composicion que se puede administrar por via sublingual que comprende al menos un antlgeno y un adyuvante glicolipldico para producir una respuesta inmunitaria mucosal y sistemica, donde la respuesta inmunitaria mucosal se genera en un sitio tanto distal como local respecto al sitio de administracion sublingual.
En su sentido mas amplio, la presente invencion se refiere al descubrimiento de que algunos glicollpidos conduciran una respuesta humoral sistemica y mucosal a antlgenos cuando una composicion que los contiene se administra por via sublingual en un ser humano o animal. Los inventores han encontrado que se puede usar cualquier excipiente administrable por via sublingual conveniente. La capacidad de un adyuvante glicolipldico para conducir IgG, IgG1 e IgG2a en suero cuando se administra con antlgeno por via sublingual muestra que la invencion se puede aplicar a vacunas profilacticas as! como a desensibilizacion de alergia. La capacidad de un adyuvante glicolipldico para conducir la IgA mucosal despues de dosificacion sublingual muestra adicionalmente que la invencion es una manera util para generar inmunidad mucosal. La generation de inmunidad mucosal es util para protection frente a patogenos transmitidos por el aire y en particular enfermedades transmitidas por via sexual.
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En terminos generales, la presente invencion se refiere una composicion que comprende (A) al menos un antlgeno y (B) un adyuvante glicolipldico y sus usos.
En particular, se describe un metodo para producir una respuesta inmunitaria mucosal y/o sistemica en un ser humano o animal con necesidad de la misma que comprende administrar una composicion que comprende al menos un antlgeno y un adyuvante glicolipldico.
Dicho de otra manera, la presente invencion se refiere al uso de al menos un antlgeno y un adyuvante glicolipldico en la preparation de un medicamento para producir una respuesta inmunitaria mucosal y/o sistemica.
Se describe un metodo para tratar una enfermedad transmitida por via mucosal que comprende administrar por via sublingual a un ser humano o animal una composicion que comprende al menos un antlgeno y un adyuvante glicolipldico.
Dicho de otra manera, la presente invencion se refiere al uso de al menos un antlgeno y un adyuvante glicolipldico
en la preparacion de un medicamento que se puede administrar por via sublingual para el tratamiento de una
enfermedad transmitida por via mucosal.
Estos metodos pueden generar una respuesta inmunitaria mediada por IgA.
Por lo tanto, tambien se describe un metodo para producir una respuesta inmunitaria de IgA en un ser humano o animal que comprende administrar por via sublingual una composicion que comprende al menos un antlgeno y un adyuvante glicolipldico.
Dicho de otra manera, la presente invencion se refiere al uso de al menos un antlgeno y un adyuvante glicolipldico
en la preparacion de un medicamento que se puede administrar por via sublingual para producir una respuesta
inmunitaria de IgA.
La composicion se deberla administrar en una cantidad eficaz. La expresion "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad no toxica pero suficiente de la composicion para proporcionar la respuesta inmunologica deseada. Una cantidad eficaz apropiada la puede determinar un experto en la materia.
Las composiciones pueden ser ya sea profilacticas (es decir, previenen infecciones) o terapeuticas (para tratar enfermedades despues de infeccion).
Preferentemente, la composicion se administra a seres humanos, mamlferos y otros primates, incluyendo primates no humanos tales como simios y monos, animales de granja tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamlferos domesticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio que incluyen roedores tales como ratones, ratas y cobayas; aves, que incluyen aves domesticas, salvajes y de caza tales como pollos, pavos y otras aves gallinaceas, patos, gansos, y similares.
El metodo tambien puede generar una respuesta inmunitaria mediada por IgG.
En la presente se describe una composicion que comprende:
(A) uno o mas antlgenos; y
(B) un adyuvante glicolipldico.
El glicollpido es un adyuvante que induce TH1.
Preferentemente la composicion util en la presente invencion comprende un diluyente, excipiente o vehlculo que se puede administrar por via sublingual que ayuda en la disponibilidad de (A) y (B) en el sitio de administration (sitio mucosal sublingual).
Preferentemente, el antlgeno deriva de una bacteria, virus, prion, neoplasia, autoantlgeno, planta, animal, u otro organismo patogeno o no patogeno, material sintetico o recombinante.
El antlgeno puede comprender porciones seleccionadas de moleculas antigenicas, o moleculas preparadas a partir de tecnologlas sinteticas o recombinantes.
Preferentemente, el antlgeno es un alergeno. Los alergenos son tipos de antlgenos, que tienen la inclination a inducir alergia. El alergeno puede comprender porciones seleccionadas de moleculas alergenicas, o moleculas preparadas a partir de tecnologlas sinteticas o recombinantes. En lo sucesivo en el presente documento los terminos antlgeno o antlgenos incluyen los terminos alergeno o alergenos respectivamente.
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Preferentemente, el antlgeno se encuentra en forma de un polipeptido, carbohidrato o llpido. Como alternativa, el antlgeno puede estar en forma de un vector que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido antigenico, y en el que dicho polinucleotido se une de forma operativa a una secuencia reguladora que regula la expresion de dicho polinucleotido.
Preferentemente, el adyuvante glicolipldico que induce TH1 es, sin caracter limitante, un adyuvante MPL®, 3D-MPL o uno de sus derivados o de sus sales.
Preferentemente, la composicion se encuentra en forma de una vacuna.
Preferentemente, la composicion se encuentra en forma de una solucion acuosa, un gel, un parche, una pastilla para chupar, capsula o un comprimido, lo mas preferentemente una solucion acuosa o gel.
La presente invencion tambien proporciona el uso de la composicion en la preparacion de una medicina para el tratamiento o la prevencion de una infeccion bacteriana o prionica vlrica u otra enfermedad tal como el cancer, autoinmunidad o alergia en un ser humano o un animal.
Ademas se describe el uso de la composicion en un metodo para producir uno o mas anticuerpos que reconocen dicho antlgeno. Los anticuerpos producidos se pueden usar en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de infecciones bacterianas o vlricas, cancer, autoinmunidad o alergia en un ser humano o animal.
Se describe un metodo para preparar una preparacion de antisuero o inmunoglobulina a partir del mismo, que comprende la inmunizacion de un ser humano o animal con una composicion de la presente invencion.
Tambien se describe un metodo para preparar una composicion de la presente invencion que comprende la mezcla de una solucion de antlgenos y el adyuvante glicolipldico con un diluyente, vehlculo o excipiente farmaceuticamente aceptable, preferentemente una solucion acuosa o un gel.
Description detallada
A continuation se describiran diversas caracterlsticas y realizaciones adicionales preferentes de la presente invencion a modo de ejemplo no limitante.
Respuesta inmune
Una respuesta inmunitaria es una respuesta selectiva organizada por el sistema inmunitario de los vertebrados en los que se producen anticuerpos y/o celulas citotoxicas frente a microorganismos invasivos, parasitos, tejido trasplantado y otras muchas sustancias que se reconocen como extranas en el organismo, es decir, antlgenos. La production de anticuerpos en circulation en la sangre se conoce como respuesta humoral; la production de celulas citotoxicas como respuesta inmunitaria mediada por celulas o celular.
Las celulas implicadas en el sistema inmunitario se organizan en tejidos y organos con el fin de realizar sus funciones de la manera mas eficaz. De forma colectiva, estas estructuras se denominan sistema linfoide. El sistema linfoide comprende linfocitos, celulas auxiliares (macrofagos y celulas que presentan antlgenos) y en algunos casos, celulas epiteliales. Este se organiza ya sea en organos encapsulados de forma discreta o acumulaciones de tejido linfoide difuso. Los organos y tejidos linfoides principales se clasifican ya sea como primarios (centrales) o secundarios (perifericos). La presente invencion se centra en los organos linfoides secundarios. Los organos linfoides secundarios incluyen tejidos asociados a mucosas, y proporcionan un entorno en el que los linfocitos pueden interactuar entre si, con celulas auxiliares y con antlgenos.
Con mas detalle, la generation de linfocitos en organos linfoides primarios (linfopoyesis) va seguida de su migration a tejidos secundarios perifericos. Los tejidos linfoides secundarios comprenden organos encapsulados bien organizados - el bazo y nodulos linfaticos - y acumulaciones no encapsuladas que se encuentran alrededor del organismo. La parte principal del tejido linfoide no organizado se encuentra en asociacion con superficies de mucosa y se denomina tejido linfoide asociado a mucosa (MALT).
El sistema mucosal protege el organismo de antlgenos que entran en el organismo directamente a traves de superficies del epitelio de la mucosa. Por lo tanto, los tejidos linfoides se encuentran asociados con superficies que revisten el tracto intestinal, el tracto respiratorio y el tracto genitourinario. La presente invencion se refiere en particular a tejidos linfoides encontrados en asociacion con superficies que revisten la region sublingual. El mecanismo efector principal en estos sitios es la IgA secretora (sIgA), secretada directamente en las superficies del epitelio de la mucosa o el tracto.
La IgA secretora representa aproximadamente un 95 % de toda la Ig encontrar en secreciones y es principalmente dimerica con dos unidades monomericas unidas de forma covalente mediante una cadena J. La IgA dimerica se une a un receptor de inmunoglobulina polimerico, pIGR, en la superficie basal de las celulas del epitelio de la mucosa.
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Este complejo de IgA-pIGR experimentar endocitosis y se transporta a la superficie apical (luminal) de la celula epitelial. Durante este proceso de transporte, una pequena pieza del pIGR se extiende con el componente restante denominado ahora componente secreto. Por lo tanto, la IgA se secreta como IgA dimerica unida a un componente secretor.
La IgA secretora no activa el sistema de complemento pero reviste bacterias y virus tales como polio, coxsackie, rota y herpes, evitando de este modo su adherencia al epitelio del revestimiento mucosal. Ademas, algunos virus dentro de los epitelios superficiales se pueden neutralizar mediante la IgA internalizada con pIGR.
La generation de IgA secretora, y por lo tanto la generation de una respuesta inmunitaria mucosal (en lo sucesivo en el presente documento MIR), se puede detectar usando tecnicas convencionales en la tecnica, tales como ELISA. A modo de ejemplo solamente el ensayo de ELISA de ovoalbumina estandarizado usado en los Ejemplos 1 y 2 se describe en el Ejemplo de Preparation 1.
Una MIR a un antlgeno puede conducir a un estado de respuesta sistemica al mismo antlgeno, conocido como tolerancia mucosal u oral. Por lo tanto, la inmunizacion mucosal es una manera eficaz de estimular las respuestas inmunes tanto locales como sistemicas.
Antlgeno
Historicamente, en la tecnica, el termino "antlgeno" se uso para cualquier molecula que inducla a los linfocitos B a producir un anticuerpo especlfico. En la actualidad, sin embargo, el termino se puede usar para indicar cualquier molecula que se puede reconocer de forma especlfica por los elementos adaptativos de la respuesta inmune, es decir, por los linfocitos B o los linfocitos T, o ambos. Por lo tanto, en la tecnica se entiende que el termino "antlgeno" hace referencia a una molecula que reacciona con anticuerpo preformado y/o con diversos receptores especlficos en los linfocitos T y B. Esta definition incluye lo que tradicionalmente se conoce como "alergenos", es decir, un agente, por ejemplo polvo de polen, que causa hipersensibilidad mediada por IgE.
Una alergia (hipersensibilidad de tipo 1) es una respuesta a antlgeno ambiental (alergeno) en el que se produce el anticuerpo de IgE en cantidades relativamente grandes en sujetos alergicos en comparacion con una persona no alergica y se une mastocitos y basofilos en particular. Una reaction de hipersensibilidad inmediata se produce mediante los productos de mastocitos (histamina, etc.) cuando se liberan despues de la reaccion entre IgE en la superficie del mastocito o basofilo y alergeno causando asma, fiebre del heno, enfermedad del suero, anafilaxis sistemica o dermatitis por contacto. Existen cuatro tipos de reaccion de hipersensibilidad (Tipos I, II, III e IV). Los Tipos 11 y 111 estan mediados por anticuerpos; el cuarto esta mediado principalmente por linfocitos T y macrofagos. La invention permite a uno inmunizar con un alergeno con el fin de alejar el sesgo de una respuesta inmunitaria alergica de IgE hacia una respuesta inmunitaria no alergica.
Por lo tanto, el "antlgeno" usado en la presente invencion puede ser un "alergeno" derivado de cualquier sustancia que causa alergia, tal como polen (por ejemplo, ambrosia o polen de abedul), alimentos, veneno de insectos, moho, pelo de animal o acaro del polvo domestico (D. farinae o D. pteronyssinus).
El antigeno usado en la presente invencion es preferentemente un inmunogeno, es decir, un antlgeno que activa a las celulas inmunes para generar una respuesta inmunitaria contra si mismo.
En una realization preferente, la presente invencion se refiere a una formulation para uso como una vacuna y el antigeno es uno util en tal vacuna.
El antigeno usado en la presente invencion puede ser cualquier antigeno apropiado, que esta disponible o se convierte en disponible.
El tipo de antigeno usado en una vacuna depende de muchos factores. En general, cuantos mas antlgenos de un microbio estan retenidos en la vacuna, mejor y los organismos vivos tienden a ser mas eficaces que los muertos. Algunas excepciones a esta regla son las enfermedades en las que una toxina es responsable de cualquier efecto patogenico. En este caso, la vacuna se puede basar en la toxina o toxoide solos.
El antlgeno puede derivar de cualquier organismo vivo; organismos intactos o no vivos; fragmentos subcelulares; toxoides; antlgenos o anti-idiotipos basados en ADN recombinante o antigenos sinteticos. El antigeno puede derivar de organismos naturales o atenuados, que pueden ser viricos o bacterianos. El tipo de antigeno puede ser un polisacarido capsular, antlgeno de superficie o interno. Si se basa en ADN recombinante, el antlgeno se puede obtener a partir de un gen clonado y expresado o ADN desnudo.
El antigeno se puede modificar por reaccion, por ejemplo, con un agente de reticulation, tal como un dialdehido, mas particularmente glutaraldehido.
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Por ejemplo, algunos microorganismos frente a los cuales hay disponibilidad de vacunas o se buscan incluyen Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Yersinia, Vibrio, Aeromonas, Pasteurella, Pseudomonas, Acinetobacter, Morazella, Flavobacterium, Bordetella, Actinobacillus, Neisseria, Brucella, Haemophilus y Escherichia coli.
Algunas vacunas preferentes incluyen vaccinia (para viruela); bacilo vole (para TB); polio; sarampion, parotiditis; rubeola; fiebre amarilla; varicela zoster; BCG; rabia; gripe; hepatitis A; tifus; tosferina; fiebre tifoidea; colera; peste; neumococos; meningococos; Haemophilus influenzae; hepatitis B; hepatitis C; tetanos y difteria. Algunas vacunas basadas en toxinas incluyen Chlostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Vibrio cholerae y Clostridium perfringens.
Otras enfermedades principales para las que las vacunas pueden ser utiles incluyen: VIH, herpes, virus, adenovirus, rinovirus, estafilococo, estreptococos del grupo A, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Chlamydia, Candida, Pneumocystis, malaria, tripanosomiasis; enfermedad de Chagas; esquistosomiasis y oncoceriasis.
Algunas enfermedades transmitidas por via sexual para las que las vacunas pueden ser utiles incluyen, ademas del VIH y herpes mencionados anteriormente: Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis, Haemophilus ducreyi, Clamidia, Calymmatobacterium granulomatis y hepatitis.
La presencia de antlgenos tumorales tambien se ha demostrado, y, como resultado, ha surgido el concepto de la vacunacion frente al cancer. Ademas, en principio, la confeccion e implantacion se puede interrumpir mediante la induccion de inmunidad frente a un amplio intervalo de hormonas del embarazo y otras hormonas reproductoras.
Por lo general, el antlgeno sera un polipeptido, pero tambien se pueden usar estructuras antigenicas alternativas, tales como acidos nucleicos, carbohidratos, llpidos, organismos completos o atenuados, tales como virus, bacterias o protozoos.
El termino "polipeptido" se usa generalmente para indicar moleculas construidas a partir de una pluralidad de aminoacidos, estando los aminoacidos unidos en conjunto de forma covalente tal como a traves de enlaces peptldicos. Por lo general, polipeptido se usa de forma indistinta con "proteina" o "peptido" por que no se ve implicada diferencia alguna en el tamano o funcion. Algunos polipeptido recombinantes se pueden preparar mediante procesos bien conocidos en la tecnica tales como los que se describen en Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; 2a Ed., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989).
Adyuvante glicolipidico
En terminos generales, un adyuvante es una sustancia que no aumenta de forma especlfica la respuesta inmunitaria hacia un antlgeno, es decir, es un inmunoestimulante. En terminos generales un glicollpido es una molecula lipldica de la membrana celular con una cadena de carbohidrato unida ha una cola hidrofoba. Los adyuvantes glicolipldicos preferidos de la presente invencion son lipopolisacaridos modificados. El lipopolisacarido se modifica de modo que su toxicidad se reduce en comparacion con el polisacarido de tipo silvestre correspondiente o lipopolisacarido a partir del cual deriva. Preferentemente, el adyuvante glicolipidico utilizado en la presente invencion es un lipopolisacarido enterobacteriano destoxificado o su componente de llpido A. El termino "destoxificado" se refiere a mutantes tanto completamente no toxicos como toxicos de baja capacidad residual de la toxina. Preferentemente, el adyuvante destoxificado retiene una toxicidad inferior a un 0,01 %, mas preferentemente un 0,001 %, de la toxina de tipo silvestre correspondiente. La toxicidad se puede medir en celulas CHO mediante la evaluacion de cambios morfologicos.
Preferentemente, el adyuvante glicolipidico es un adyuvante que induce TH1. Por "adyuvante que induce TH1" los inventores quieren hacer referencia a un adyuvante, que tiene propiedades que aumentan la respuesta de TH1 a un antlgeno. Sin embargo, al adyuvante tambien puede tener la tendencia a aumentar simplemente el nivel de anticuerpo o celulas especlficas de antlgeno producidas o incluso, mediante la induccion de citoquina de modulacion que causa anergia (sin capacidad de respuesta) en ciertas poblaciones celulares.
Con mas detalle, la respuesta inmunitaria al antlgeno es generalmente cualquiera mediada por linfocitos T (que puede implicar muerte celular) o humoral (produccion de anticuerpo mediante el reconocimiento de epitopos en el antigeno). El patron de produccion de citoquinas mediante los linfocitos T implicados en una respuesta inmunitaria puede influir en cual de estos tipos de respuestas predomina: por ejemplo, la inmunidad mediada por celulas (TH1) se caracteriza por una produccion elevada de IL-2 e IFNy pero baja de IL-4, mientras que en la inmunidad humoral (TH2) el patron puede ser produccion baja de IL-2 e iFNy pero elevada que IL-4, IL13, IL-5. Las respuestas normalmente estan moduladas al nivel del organo linfoide secundario o celulas, de modo que la manipulacion farmacologica de los linfocitos T especificos y antigenos que presentan patrones de citoquinas celulares pueden influir en el tipo y el alcance de la respuesta inmunitaria generada.
El equilibrio de TH1-TH2 se refiere a la interconversion o predominancia de las dos formas diferentes de linfocitos T auxiliares. Las dos formas tienen efectos a gran escala y a menudo de oposicion en el sistema inmune. Si una
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respuesta inmunitaria favorece a las celulas TH1, entonces estas celulas conduciran una respuesta celular con production de anticuerpos asociada, mientras que las celulas TH2 conduciran una respuesta dominada por anticuerpos. El isotipo de anticuerpos responsables de algunas reacciones alergicas, IgE, y respuestas inflamatorias asociadas estan inducidas por citoquinas a partir de celulas TH2.
La eficacia de un adyuvante como un adyuvante que induce TH1 se puede determinar mediante la determination del perfil de anticuerpos dirigidos frente a un antfgeno que resulta de la administration de este antfgeno en vacunas, que tambien estan formadas por varios adyuvantes.
Preferentemente, el adyuvante es un lipopolisacarido modificado. Como se describe en el documento de Patente de Estados Unidos N° 4.912.094 los lipopolisacaridos enterobacterianos (LPS) son un potente inmunoestimulante. Sin embargo, tambien pueden provocar respuestas nocivas y en ocasiones mortales. En la actualidad se sabe que las actividades endotoxicas asociadas con LPS resultan de su componente de lfpido A. Por consiguiente, la presente invention utiliza mas preferentemente un derivado destoxificado del lfpido A. Corixa Corporation produjo un derivado del lfpido A conocido originalmente como endotoxina destoxificada refinada (RDE) pero que se ha llegado a conocer como monofosforil lfpido A (adyuvante de MPL®). El adyuvante de MPL® se puede producir calentando a reflujo LPS o lfpido A obtenido de mutantes sin heptosa de bacterias gram negativas (por ejemplo, Salmonella sp.) en soluciones de acido mineral de fuerza moderada (por ejemplo, HCl 0,1 N) durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Este tratamiento da como resultado la perdida del resto fosfato en la position 1 de la glucosamina en el extremo reductor. Ademas, el nucleo de carbohidrato se puede retirar de la posicion 6' de la glucosamina no reductora durante este tratamiento con adyuvante de MPL® y monofosforil lfpido A 3-desacilado y algunos metodos para su fabrication se desvelan en el documento de Patente de Estados Unidos N° 4.436.727, y en el documento de Patente de Estados Unidos N° 4.912.094 y en el certificado de reexamen B1 4.912.094.
Preferentemente, sin embargo, se usa un LPS o lfpido A modificado en el que el lfpido A destoxificado retiene el resto nucleo unido a la posicion 6' de una glucosamina no reductora. Tales derivados de LPS y lfpido A tambien se describen en el documento de Patente de Estados Unidos N° 4.912.094. Con mas detalle, el documento de Patente de Estados Unidos N° 4.912.094 desvela un lipopolisacarido modificado que se obtiene con el metodo de retirar de forma selectiva solamente el resto de acido p-hidroximiristico de lipopolisacarido que se une mediante ester a la glucosamina con extremo reductor en la posicion 3' de dicho lipopolisacarido, que comprende someter a dicho lipopolisacarido a hidrolisis alcalina. En la presente invencion se pueden usar dicho monofosforil lfpido A des-O- acilado (adyuvante de MPL®), difosforil lfpido A (DPL) y LPS. Por lo tanto, en una realization preferente, la presente invencion usa adyuvante de MPL®, DPL o LPS en los que la posicion 3' de la glucosamina con extremo reductor esta des-O-acilada. Estos compuestos se conocen como 3D-MPL, 3D-DPL y 3D-LPS respectivamente.
En el documento de Patente de Estados Unidos N° 4.987.237, se describen derivados de adyuvante de MPL® que tienen la formula:
y en la que R1 y R2 son H, R3 es un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada formado por C, H y opcionalmente O, N y S, en el que, si hay mas de mas de un atomo, pueden ser iguales o diferentes, en la que el numero total de atomos de C no supera 60, y el tirculo representa un nucleo de MPL.
Como alternativa, el derivado de adyuvante de MPL® tiene la formula
en la que el segmento del derivado representado por
contiene de 2 a 60 atomos de C y en la que R3 es un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada formado por C, H y opcionalmente O, N y S, en el que, si hay mas de un atomo, pueden ser iguales o diferentes, y x es un minimo de 1
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y puede ser cualquier numero entero de modo que el numero total de atomos de C en todos los segmentos de x no supera 60, y en la que la estructura quimica de cada R3 puede ser igual o diferente en cada uno de tales segmentos y en la que el circulo representa un nucleo de MPL.
Un adyuvante disponible en el mercado de Corixa Corporation incluye un 2 % de Escualeno, Tween 80 al 0,2 % asi como el adyuvante de MPL®.
Otro adyuvante disponible en el mercado es el adyuvante Detox® (Corixa Corporation) que comprende adyuvante de MPL® y esqueleto de pared celular de micobacterias.
Todos estos derivados o sales de LPS o lipido A que estan o llegan a estar disponibles se pueden usar en la presente invention. Preferentemente, los derivados y sales son aquellos que son farmaceuticamente aceptables.
El adyuvante que induce TH1 se puede mezclar con los otros componentes de la composition inmediatamente antes de su administration. Como alternativa, se puede formular junto con los otros componentes durante la fabrication del producto. Como alternativa, se puede administrar en un momento diferente al de los otros componentes. La administracion puede ser mediante una serie de vias. Preferentemente, el adyuvante glicolipidico se administra en una cantidad de aproximadamente 1,0 mg a 250 mg, mas preferentemente de 25 mg a 50 mg.
Vacunas
Un aspecto se refiere a un metodo para inducir una respuesta inmunologica, preferentemente una respuesta inmunologica mucosal, en un mamifero, preferentemente seres humanos, que comprende la inoculation por via sublingual de un individuo con la composicion de la presente invencion para producir anticuerpos, preferentemente IgA, y/o una respuesta inmunitaria a linfocitos T. preferentemente, la respuesta es adecuada para proteger al dicho individuo de la infection, en particular infection bacteriana o virica. Preferentemente, la respuesta es adecuada para proteger a dicha individuo de la enfermedad, aunque esa enfermedad ya este establecida dentro del individuo o no. Por lo tanto, la respuesta inmunologica se puede usar de forma terapeutica o de forma profilactica.
Las vacunas se pueden preparar a partir de la composicion de la presente invencion. Un experto en la materia conoce la preparation de vacunas que contienen un antigeno como el principio activo. Por lo general, tales vacunas se preparan ya sea como soluciones o suspensiones liquidas; tambien se pueden preparar formas solidas adecuadas para solution en, o suspension en, Kquido antes de su administracion. La preparacion tambien se puede producir en un gel, emulsionado, o la composicion encapsulada en liposomas. Algunos excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, fosfato de amonio, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos.
Las composiciones incluyen excipientes usados normalmente tales como, por ejemplo, calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pildoras, capsulas, formulaciones de liberation sostenida o polvos y contienen de un 10 % a un 95 % de principio activo, preferentemente de un 25 % a un 70 %. Cuando la composicion de vacuna esta liofilizada, el material liofilizado se puede reconstituir antes de su administracion, por ejemplo en forma de una suspension. La reconstitution se realiza preferentemente en tampon.
Ademas, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulgentes, agentes de tamponamiento del pH y/o adyuvantes adicionales, que aumentan la eficacia de la vacuna.
La proportion de antigeno y adyuvante puede variar en una amplia gama siempre y cuando ambos esten presentes en cantidades eficaces. Por lo general, las vacunas se formulan para que contengan una concentration final de antigeno en el intervalo de 0,2 pg/ml a 200 pg/ml, preferentemente de 5 pg/ml a 50 pg/ml, lo mas preferentemente aproximadamente 15 pg/ml. La formulation preferente se puede determinar a traves de protocolo de intervalo de dosificacion conocido y se hace referencia al "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Mack Publishing Company, 19a Edn, 1995.
Despues de la formulacion, la vacuna se puede incorporar en un envase que puede ser esteril y que a continuation se puede cerrar hermeticamente y almacenar a baja temperatura, por ejemplo 4 °C, se puede liofilizar. La liofilizacion permite el almacenamiento a largo plazo en una forma estabilizada.
Los antigenos usados en la invencion se pueden formular como formas neutras o de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con grupos amino libres del peptido) and y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorhidrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico y maleico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien pueden derivar de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o ferricos, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina y procaina.
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La composition se puede presentar como un comprimido, capsula u otra formulation conveniente con los excipientes necesarios para preparar tal formulation.
Preparation de anticuerpos usando la composition de la invention
Las composiciones de acuerdo con la invention se pueden usar directamente como inmunogenos mediante las vlas de administration que se describen en el presente documento, sin el uso de adyuvantes adicionales para generar antisueros, inmunoglobulinas especlficas o anticuerpos monoclonales.
Se describe un metodo para inducir la production de inmunoglobulina especlfica de antlgeno que comprende las etapas de:
a) inmunizar un animal con una composition de acuerdo con la presente invention; y
b) recuperar inmunoglobulina especlfica para una region del antlgeno de la composition a partir del suero del animal.
c) Seleccionar clones de celulas que producen anticuerpos monoclonales.
Algunas tecnicas para generar anticuerpos se ensenan en Kohler y Milstein, Nature (1975) 256: 495-497.
Los animales usados para production de anticuerpos pueden ser cualquier animal usado normalmente para la finalidad, en particular mamlferos. Son especialmente indicados ratones, ratas, cobayas y conejos. Los animales se trataran con las formulaciones que se describen en el presente documento.
Mas particularmente, la formulation que comprendera antlgeno se puede usar para producir anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales. Si se desean anticuerpos policlonales, se inmuniza un mamlfero seleccionado (por ejemplo, raton, conejo, cabra, caballo, etc.). El suero del animal inmunizado se recoge y se trata de acuerdo con procedimientos conocidos. Si el suero contiene anticuerpos policlonales para otros antlgenos, los anticuerpos policlonales requeridos se pueden purificar mediante cromatografla de inmunoafinidad. En la tecnica se conocen algunas tecnicas para producir y procesar antisueros policlonales.
Un experto en la materia tambien puede producir facilmente los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a antlgenos usados en la invention. La metodologla general para preparar anticuerpos monoclonales mediante hibridomas se conoce bien. Se pueden crear llneas celulares que producen anticuerpos inmortales mediante fusion celular, y tambien con otras tecnicas tales como transformation directa de linfocitos B con ADN oncogenico, o transfection con virus de Epstein-Barr. Algunos paneles de anticuerpos monoclonales producidos frente a antlgenos se pueden identificar sistematicamente para diversas propiedades; es decir, para afinidad de isotipo y epltopo.
Una tecnica alternativa implica la identification sistematica de bibliotecas de presentation de fagos en las que, por ejemplo, el fago expresa fragmentos de scFv en la superficie de su revestimiento con una gran diversidad de regiones que determinan la complementariedad (CDR). Esta tecnica se conoce bien en la tecnica.
Los anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales, que se dirigen frente a antlgenos son particularmente utiles en diagnostico, y los que se neutralizan son utiles en inmunoterapia pasiva. Los anticuerpos monoclonales, en particular, se pueden usar para aumentar los anticuerpos anti-idiotipo. Los anticuerpos anti-idiotipo son inmunoglobulinas que portan una "imagen interna" del antlgeno del agente infeccioso frente al que se desea proteccion.
En la tecnica se conocen algunas tecnicas para aumentar los anticuerpos anti-idiotipo. Estos anticuerpos anti-idiotipo tambien pueden ser utiles para tratamiento, as! como para una explication de las regiones inmunogenica es de los antlgenos. Para los fines de la presente invention, el termino "anticuerpo", a menos que se especifique de otro modo, incluye fragmentos de anticuerpos completos que retienen su actividad de union para un antlgeno diana. Tales fragmentos incluyen fragmentos de Fv, F(ab') y F(ab')2, as! como anticuerpos de cadena individual (scFv). Ademas, los anticuados y fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados, por ejemplo como se describe en el documento de patente EP-A-239400.
Preparation de Composition
La composition se puede preparar mezclando una disolucion acuosa del antlgeno con el adyuvante glicolipldico, y anadiendo el diluyente, excipiente o vehlculo que se puede administrar por via mucosal, ya sea antes o despues de la mezcla mencionada anteriormente. Como alternativa, el adyuvante glicolipldico se puede co-precipitar con el antlgeno. Ademas de ser mezclado o co-precipitado con los otros componentes de la composition antes de su administration, el adyuvante glicolipldico se puede administrar en un sitio y/o momento diferente con los otros componentes. La mezcla de adyuvante glicolipldico y antlgeno tambien se puede incorporar en geles, capsulas, pastillas para chupar, etc., o tambien se puede presentar en diversos dispositivos tales como parches que pueden ser bi- o preferentemente unidireccionales.
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El MPL (u otro adyuvante que induce TH1) que se ha disuelto mediante sonicacion u otro medio (que se describe posteriormente en Preparacion de una solucion de adyuvante de MPL®), se puede diluir con diversos medios antes de su adicion a antlgenos. La preparacion de MPL se realiza inicialmente a una concentracion por lo general entre 0,5 mg por ml y 4 mg por ml, por ejemplo 1 mg por ml. A continuacion se puede diluir hasta una concentracion entre 500 pg/ml y 20 pg/ml, preferiblemente 100 pg/ml. Esta dilucion se puede realizar en agua pura o en otros disolventes tales en una solucion acuosa de glicerol que contiene entre un 1 % y un 50 % de glicerol.
Algunos vehlculos y diluyentes fisiologicamente aceptables adecuados incluyen agua esteril o solucion acuosa de dextrosa al 5 %. Las composiciones son para uso en seres humanos y veterinario y se formulan para administracion mucosal, preferentemente sublingual.
Formulacion, Dosificacion y Administracion de Composiciones
La composicion de la presente invencion se puede formular de forma conveniente con un diluyente, vehlculo o excipiente farmaceuticamente aceptable adecuado para administracion sublingual. Algunos detalles de excipientes farmaceuticos se pueden encontrar en "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2a Ed. (1994), The Pharmaceutical Press, London, Editors: Wade & Weller.
Los inventores han encontrado que un aspecto importante de la presente invencion es la administracion sublingual de la composicion de la presente invencion. Se puede esperar que un gel u otra formulacion viscosa sea precedente debido al aumento del contacto del antlgeno con la superficie sublingual. Sin embargo, tambien se pueden conseguir resultados con otras formulaciones tales como una solucion acuosa. En ratones, se encontro que una solucion sencilla daba resultados similares a los de una formulacion de gel. No es necesario ni deseable que la formulacion se una por via flsica o por via qulmica al tejido mucosal.
Algunas formulaciones adecuadas para administracion sublingual incluyen soluciones esteriles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostaticas y solutos que convierten a la formulacion en isotonica con el fluido corporal, preferentemente la mucosa, del individuo; las suspensiones esteriles acuosas y no acuosas pueden incluir agentes de suspension o agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en envases de una sola dosis o de multiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales cerrados hermeticamente y se pueden almacenar en una condicion liofilizada que requiere solamente la adicion del vehlculo llquido esteril inmediatamente antes de su uso.
Preferentemente, un vehlculo tambien esta presente en la composicion de acuerdo con la invencion. El vehlculo puede ser una emulsion de aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidroxido de aluminio.
Las emulsiones de aceite en agua no toxicas contienen preferentemente un aceite no toxico, por ejemplo, escualano o escualeno, un agente emulgente, por ejemplo Tween 80, en un vehlculo acuoso. El vehlculo acuoso puede ser, por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato.
Se describe una composicion de vacuna polivalente que comprende una formulacion de vacuna de la invencion en combinacion con otros antlgenos, en particular antlgenos utiles para el tratamiento de canceres, enfermedades autoinmunes y afecciones relacionadas.
En general, los vehlculos pueden incluir, pero no se limitan a, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.
Tambien se describen envases y kits farmaceuticos que comprenden uno o mas envases rellenos con uno o mas de los ingredientes de las composiciones mencionadas anteriormente.
La administracion estas composiciones puede estar en forma de pomadas, pastas, geles, soluciones, polvos y similares. los geles se pueden formular convenientemente usando carbopol tambien conocido como carbomero - un pollmero de carboxivinilo, o un agente espesante basado en celulosa tal como hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa o hidroxipropil metilcelulosa, carboximetilcelulosa calcica, carboximetilcelulosa sodica, etil celulosa, metilcelulosa. Los geles tambien se pueden formular de forma conveniente usando: goma arabiga, acido alglnico, bentonita, alcohol cetoestearllico, gelatina, goma de guar, silicato de magnesio y aluminio, maltodextrina, alcohol polivinllico, carbonato de propileno, alginato de propilenglicol, dioxido de silicio coloidal, alginato sodico, tragacanto, y/o , de xantano. Son particularmente preferentes el carbopol y los agentes basados en celulosa.
Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulacion de dosificacion, y en una cantidad de modo que sea profilactica y/o terapeuticamente eficaz. La cantidad administrada, que esta generalmente en el intervalo de 0,5 pg a 250 pg de antlgeno por dosis, depende del sujeto a tratar, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar anticuerpos, y el grado de proteccion deseada. Un intervalo preferente es de aproximadamente 2 pg a aproximadamente 40 pg por dosis. En algunos casos, el paciente se tratara con una serie de administraciones que incluiran un aumento del regimen de accion del antlgeno.
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Un volumen de dosis adecuado es aproximadamente 0,1 ml, pero dentro de un regimen, este puede comenzar a un volumen inferior y acabar en un volumen superior. Las cantidades precisas de principio activo administrado pueden depender del criterio del profesional y puede ser caracterlstico para cada sujeto individual.
La composicion se puede proporcionar en un programa de una sola dosis, o preferentemente en un programa de multiples dosis. Un programa de multiples dosis es uno en el que transcurso primario de la vacunacion puede ser con 1 a 10 dosis separadas, seguido de otras dosis proporcionadas a intervalos de tiempo posteriores necesarios para mantener y/o reforzar la respuesta inmune, por ejemplo, de 1 a 4 meses para una segunda dosis, y si fuera necesario, una dosis(s) posteriores despues de varios meses. Cuando el producto se esta usando para el tratamiento de alergia, los reglmenes de administration incluiran una dosificacion mas frecuente. El regimen de dosificacion tambien se determinara, al menos en parte, mediante las necesidades del individuo y dependera del criterio del profesional.
Ademas, la composicion que contiene el antlgeno o antlgenos se puede administrar en conjunto con otros agentes inmunoreguladores, por ejemplo, inmunoglobulinas. La invention se describira con referencia a los siguientes ejemplos que solamente pretenden ser ilustrativos y no limitantes.
Ejemplos
Preparation de una solution de adyuvante de MPL®
Se preparo una solucion de 4 mg/ml de 1,2-dipalmitoil-SN-glicero-3-fosfo colina (DPPC) en etanol absoluto. Por cada 1,0 mg de sal de MPL-TEA (trietilamina) a solubilizar, se anadieron 27 pl de DPPC para disolver el MPL. El MPL se puede preparar como se ha descrito anteriormente. El etanol se retiro soplando una corriente de N2 suavemente en el vial. A continuation se anadio 1,0 ml de agua sin pirogenos para inyeccion por cada mg de MPL en la mezcla de MPL/DPPC seco. La solucion se sonico en un bano sonicador a 60-70 °C hasta que era transparente. A continuacion, la solucion de MPL/DPPC se esterilizo por filtration mediante filtration a traves de un filtro de 0,2 pm SFCA 290-4520 de Nalgene. La solucion de MPL/DPPC se distribuyo de forma aseptica a 1,0 mg/ml en viales despirogenados, etiquetados MPL-AF (MPL solubilizado en el tensioactivo DPPC), y se almacenaron a 4 °C.
Formulation de adyuvante de Ovoalbumina (XOA)/MPL®/Gel Sublingual.
La actividad de induction de TH1 en ratones se puede equiparar con la production de anticuerpos IgG2a e IgG2b especlficos y la actividad de induccion de TH2 con la produccion de anticuerpos IgG1 y anticuerpos IgE especlficos. Los anticuerpos de IgA secretores especlficos pueden identificar si se ha producido una respuesta mucosal, si esta puede ser local (anticuerpo salivar) o distal (anticuerpo vaginal) despues de inmunizacion sublingual. Sin embargo, el potencial inmunogenico de una formulacion se puede investigar midiendo unicamente la respuesta especlfica de IgG en suero.
Por lo tanto, como un ejemplo, se realizo un experimento en ratones para demostrar los perfiles de los anticuerpos especlficos de alergeno con respecto a un ejemplar, ovoalbumina (XOA) que se acepta como un modelo de antlgeno y tambien es un alergeno bien conocido derivado de huevos de pollo.
Materiales de reserva.
1. Reserva de Carbopol TR-1 NF (0,83 %)
A. 100 mg de carbopol TR-1 NF en 20 ml de WFI (agua para inyeccion) = 0,9 % en p/v de gel.
B. Se anadieron 0,8 ml de TEOA (trietanolamina) al 10 % en v/v a A = .0,8 % en p/v de gel.
11 MPL AF glicerol (20 mg/ml)
A.
MPL DPPC Glicerol WFI cs
40 mg 4,32 mg 800 pl 40 ml
Sonicado hasta tamano de partlcula aprox. = 80 nm
B. Liofilizado
C. Reconstituido con 1,2 ml de WFI - 20 mg/ml de MPL.
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Reserva de 111 Ovoalbumina (33 mg/ml)
Ovoalbumina 33 mg
WFI 1,0 ml
Formulacion Para Inyeccion
Reserva de Carbopol 1920 pl
Reserva de Ovoalbumina 480 pl
Glicerol 480 pl
WFI 720 pl
glicerol MPL 400 pl
1. Carbopol, XOA, glicerol y WFI se anadieron en un vial de 5 ml y se mezclaron mediante agitacion vorticial.
2. El glicerol MPL se anadio a lo mencionado anteriormente y se realizo agitacion vorticial adicional.
Inmunizacion de ratones
Se anestesiaron 5 grupos de ratones Balb/C hembra de ocho semanas de edad con Ketamina. Cuando los ratones estaban inconscientes, se pusieron 20 pl del gen apropiado que contenla diversas cantidades de XOA debajo de la lengua durante 5 minutos. Los geles se retiraron de la boca aclarando despues de 5 minutos con 1,0 ml de solucion salina al 0,9 % usando una jeringa y una aguja para sonda. Tres semanas mas tarde, los ratones se trataron de forma identica a la del primer tratamiento.
Se extrajo sangre de los ratones 2 semanas despues del segundo tratamiento y se recogieron los sueros. Estos se sometieron a ensayo para anticuerpos IgG especlficos de XOA usando un ensayo de ELISA.
Resultados
Respuestas de IgG anti-Ovoalbumina en Ratones Administrados ya sea con 83,2 pg o 3,4 pg de Ovoalbumina y 33,6 pg de MPL en 20 pl de Gel de Carbopol a traves de la Via Sublingual, Estimulados despues de 3 Semanas y con Extraccion de Sangre 2 Semanas mas tarde. (Valores de DO (densidad optica) media de 5 Ratones por Grupo)
Valores de DO a Diferentes Diluciones de Suero
- 1/10 1/30 1/90 1/270 1/610
- Grupo 1 Dosis de 83,2 pg de XOA
- 1,1 1,0 0,75 0,5 0,3
- Grupo 2 Dosis de 3,4 pg de XOA
- 0,6 0,5 0,35 0,15 0,05
- Grupo 3 solo Carbopol
- 0,15 0,1 0,05 0,05 0,05
Ejemplo 2
Preparacion de Materiales para Inmunizacion de Ratones
Las dosis de inmunizacion de XOA/NMPL en carbopol o como alternativa en el diluyente (formulacion acuosa) sin MPL se prepararon como se describe en el Ejemplo 1 excepto por el uso de diferentes dosis.
Inmunizacion de Ratones
1. Cada raton se anestesio antes de la administracion.
2. Se pusieron 20 pl del material apropiado debajo de la lengua durante 5 minutos. Por lo tanto, a cada uno de los grupos de ratones se le administraron las siguientes cantidades de sustancias en 20 pl.
- Grupo
- Antlgeno MPL Excipiente
- 1
- 80 pg de ovoalbumina 20 pg de MPL Carbopol
- 2
- 80 pg de ovoalbumina 0 pg de MPL Carbopol
- 3
- 0 pg de ovoalbumina 160 pg de MPL Carbopol
- 4
- 80 pg de ovoalbumina 40 pg de MPL Diluyente
3. El material se retiro de la boca aclarando despues de 5 minutos con 1,0 ml de solucion salina al 0,9 %.
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4. Tres semanas despues de la primera vacunacion y de nuevo despues de dos semanas despues de esto, los ratones se volvieron a tratar.
5. Se extrajo sangre a los ratones 2 semanas despues de la tercera aplicacion y los sueros se almacenaron hasta su uso a -20 °C. Se realizaron lavados nasales y pulmonares y se almacenaron en las mismas condiciones.
6. Los sueros y los lavados se sometieron a ensayo para anticuerpos especlficos de ovoalbumina tal como se realizo anteriormente.
RESULTADOS
Anticuerpos de IgG en suero especlficos para log(2) del Tltulo de XOA/(log)2 del tltulo de referencia (DT)
- GRUPO
- IgG1 en Suero IgG2a en Suero IgG en Suero
- 1
- 0,625 (0,375) 0,35 (0,4) 0,6 (0,3)
- 2
- 0 0 0,2 (0,05)
- 3
- 0 0 0,25 (0,02)
- 4
- 0,95 (0,01) 0,85 (0,2) 1,0 (0,05)
Media geometrica de anticuerpos de IgA Anti XOA en diferentes fluidos (DT)
- GRUPO
- SUERO LAVADO NASAL LAVADO PULMONAR
- 1
- 0 73,6 (154,2) 238,5 (533,4)
- 2
- 0 0 0
- 3
- 0 0 0
- 4
- 2,291,3 (2,577,1) 568,5 (395,4) 2,518,4 (3,403,1)
La fuerte respuesta de IgG en suelo con respecto a XOA requiere la adicion de MPL, que tambien parece que ha estimulado una respuesta de tipo TH1 indicada por la respuesta del anticuerpo IgG2a.
Un nuevo e inesperado hallazgo fue la fuerte induction de una respuesta de IgA especlfica de XOA cuando se uso MPL como un adyuvante:
En ratones no habla ninguna ventaja significativa por el uso del carbopol como un excipiente. De hecho, se produjo una fuerte evidencia de que la formulation acuosa de XOA y MPL era mas inmunogenica para la induccion tanto de IgO como de IgA sin carbopol. Esto inclula en IgA suero, solamente observado en ausencia de carbopol. Sin embargo, es necesario el uso de excipientes en la formulacion de vacunas y el carbopol puede ser una formulacion de excipiente util y conveniente para uso en seres humanos y animales.
Ejemplo de Preparation 1 - ELISA PARA OVOALBUMINA
1. Se someten a ensayos sueros (diluidos a 1:2 en tampon de borato) de cada uno de los cinco ratones en cada grupo en un ensayo de ELISA para determinarlos tltulos de anticuerpos de IgG o IgA anti-ovoalbumina.
2. Para realizar el ELISA, se requieren el siguiente equipo y suministros:
A. Placa de Immulon 2, 96 pocillos, fondo plano, DYNATECH LABORATORIES N° de catalogo 011-010-3455. Tres placas por lote de producto sometidas a ensayo (suficiente para someter a ensayos sueros de 10 ratones por duplicado).
B. Ovoalbumina (nuevo de pollo), Calidad 5 de Sigma. Solution de reserva (1 mg/ml en Agua para Inyeccion) recien preparada cada vez que se realiza en ensayo.
C. Puntas de pipeta limpias (en autoclave)
D. Pipeteadores de 20, 100, 200, 1000 pl
B. Pipeteador de 8 canales; tamano de 200 pl
F. Tubos de ensayo de 13 mm limpios (nuevos) o crioviales de 2 ml y rejilla
G. Parafilm o Envoltura Saran
H. H2SO4 1 N
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I. Anticuerpo secundario anti-IgG o anti-IgA marcado con peroxidasa de rabano picante (Usado a 1:5.000). Southern Biotechnology Associates, Inc.
J. kit de OPD: comprimidos de o-Fenilendiamina, uno por placa y diluyente. Ensayo N° 7181E de Labs Abbott in vitro. A menudo disponible en las instalaciones.
K. Sueros de raton a someter a ensayo. Los sueros se deberlan haber diluido a 1:2 en Tampon de Borato para almacenamiento a largo plazo.
L. Tampon de Borato (bB):
Disolver lo siguiente en 4 l de WFI esteril:
12,4 g de Acido Borico, Fisher Scientific N° A73-500 0,764 g de Borato Sodico (Borax), Fisher Scientific N° S248-500 17,53 g de Cloruro Sodico, Fisher Scientific N° S271-500 Almacenar a temperatura ambiente, caduca a los seis meses
M. Tampon de Borato + Tween 20 al 0,1 % (BB-T20):
Anadir 1 ml de Tween-20 (Sigma N° P-1379) a 1 litro de BB, mezclar minuciosamente. Nacional a temperatura ambiente, caduca a los seis meses.
N. Tampon de Borato-Tween-20-BSA al 1 % (BB-BSA):
Disolver 1,90 g de EDTA (tetrasodico, Fisher Scientific N° BP 121-500) y 10 g de BSA (Fraccion V, sin proteasa, Boehringer Mannheim N° 100-350) en 1 litro de BB-T20.
O. Solucion tampon de carbonato/bicarbonato 0,05 M:
Disolver 4,2 g de NaHCO3 y 5,3 g de Na2CO3 en 1 litro de agua RO o Agua esteril para Irrigacion y ajustar el pH a 9,6. Almacenar a 4 °C, caduca en tres meses. Calentar a temperatura ambiente antes de su uso.
P. Pipeteador automatico
Q. Mezclador vorticial
R. Rejillas de microcentrlfuga
S. Lector de placas, capaz de tomar lecturas de D.O. a 490 nm
T. Incubadora ajustada a 37 °C
U. Pipetas serologicas de 25 ml (Fisher Scientific)
V. Tubos conicos de propileno de 15 ml (Fisher Scientific)
W. Cubetas de reactivo para pipeteador multicanal
X. Lavador de placas automatico
3. Procedimiento para la realizacion del ELISA A. UNION DEL ANTIGENO DE ENSAYO
I. La concentration de antlgeno para union a placas usadas en el ensayo de adyuvante es 50 pg/ml:
2,5 ml de la solucion de ovoalbumina de 1 mg/ml de reserva se anade a 47,5 ml de solucion de carbonato/bicarbonato 0,05 M. Esta cantidad es suficiente para revestir cuatro placas de 96 pocillos a 100 pl por pocillo.
II. A continuation, la placa se cubre con Envoltura Saran y se deja equilibrar y sin alterar a 4 °C en la oscuridad durante una noche.
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B. DILUCIONES DE SUERO: Brevemente agitar vorticialmente cada muestra de suero antes de dilucion y cada muestra diluida antes de su adicion a la placa. Se deberia usar una nueva punta de pipeta para retirar el suelo de los tubos de reserva cuando se hacen las diluciones.
1. La dilucion de partida para los sueros obtenidos de ratones inmunizados con adyuvante y ovoalbumina es de 1:6.
C. BLOQUEO DE LA PLACA
I. Cuando todas las muestras de suero estan diluidas, preparar la placa agitando vigorosamente el tampon de revestimiento en un recipiente.
II. Golpetear la placa rapidamente en una almohadilla de toalla de papel para retirar el exceso de solucion. Lavar la placa tres veces con solucion de lavado BB-T20 usando el lavador de placas automatico programado para lavar con 350 pl y esperar 5 segundos entre cada lavado.
III. Usando el pipeteador multicanal, anadir 250 pl de BB-BSA por pocillo. Cubrir y cerrar hermeticamente con envoltura Saran e incubar a 37 °C durante 30 minutos.
D. CARGA DE LA PLACA
I. Agitar vigorosamente el tampon de bloqueo en un recipiente y golpetear la placa rapidamente en una almohadilla de toalla de papel para retirar el exceso de solucion.
II. Anadir 100 pl de BB-BSA a todos los pocillos en cada placa. Anadir 100 pl de las muestras de suero diluidas apropiadamente a los pocillos apropiados en la columna N° 1. Cada muestra de suero se deberia someter a ensayo por duplicado.
III. Usando el pipeteador multicanal, pipetear 100 pl arriba y abajo ocho veces en la columna N° 1 para mezclar la muestra, y a continuacion transferir 100 pl a la columna N° 2. De nuevo, pipetear arriba y abajo ocho veces para mezclar y transferir 100 pl a la columna N° 3. Repetir las diluciones en serie a traves de la columna N° 12. Descartar los 100 pl en las puntas despues de haber mezclado la columna 12. Ahora deberia haber 100 pl en cada pocillo de la placa.
E. INCUBACION
Cubrir y cerrar hermeticamente las placas con Envoltura Saran o Parafilm. Incubar las placas durante 1 hora a 37 °C. Retirar el anticuerpo sin unir con el procedimiento que se ha resaltado en la etapa 3a, lavando de nuevo la placa tres veces con BB-T20.
F. CONJUGAR
I. Preparar el conjugado de anticuerpo secundario anti IgG marcado con peroxidasa diluyendolo a 1:5.000 en BB- BSA (10 pl de anticuerpo en 50 ml de BB-BSA en un tubo conico de 50 ml). Voltear el tubo > 20 veces y agitar de forma vorticial durante 30 segundos para mezclar minuciosamente. Verter el anticuerpo diluido en un recipiente limpio para reactivo. El conjugado anti IgA se puede preparar de una manera correspondiente.
II. Anadir 100 pl de solucion de conjugado a cada pocillo de la placa, incluyendo pocillos de blanco.
III. Cubrir e incubar la placa durante 1 hora a 37 °C.
IV. Retirar la solucion de conjugado y lavar la placa tres veces como en la etapa 3a.
G. DESARROLLO DEL COLOR:
I. Preparar el sustrato/reactivo colorimetrico 10-15 minutos antes de su uso (para darle tiempo a disolverse completamente) mediante disolucion de 3 comprimidos de desarrollo de densidad optica en 30,4 ml de Tampon de Sustrato en un tubo conico de polipropileno de 50 ml cubierto con papel de aluminio.
II. Usando el pipeteador multicanal, anadir 100 pl de reactivo a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
III. Detener la reaccion despues de 15 minutos mediante la adicion de 50 pl de acido sulfurico 1 M a cada pocillo con el pipeteador multicanal.
H. LECTURA DE LA PLACA
I. Las placas se deberlan "detener" de una manera secuencial, con 1-2 minutos entre cada placa, de modo que el tiempo desde la "parada" hasta la "lectura" sea coherente entre las placas (despues de detener la reaccion en la ultima placa, leer la primera placa en el lector de placas apropiado a 490 nm. Leer la segunda placa 1-2 minutos despues, en la tercera placa 1-2 minutos despues de eso).
5
I. DETERMINACION DEL TITULO DE INMUNOGLOBULINA
El tltulo de cada una de las muestras de suero se define como el reclproco de la primera dilucion en serie dos veces que tiene un valor de DO que es mayor o igual a dos veces el valor del fondo. Los valores de DO para los animales 10 de control se calculan como promedio en cada dilucion y se determina el tltulo medio para el grupo.
Claims (22)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. El uso de al menos un antlgeno y un adyuvante glicolipidico para preparar un medicamento que se puede administrar por via sublingual para producir una respuesta inmunitaria mucosal y sistemica, donde la respuesta inmunitaria mucosal se genera en un sitio tanto distal como local respecto al sitio de administracion sublingual.
- 2. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el metodo produce una respuesta inmunitaria de IgA.
- 3. El uso de acuerdo con cualquiera reivindicacion precedente, en la que el metodo produce una respuesta inmunitaria de IgG.
- 4. El uso de acuerdo con cualquiera reivindicacion precedente para tratar una infeccion bacteriana o vlrica, cancer, autoinmunidad o alergia en un ser humano o un animal.
- 5. El uso de acuerdo con cualquiera reivindicacion precedente, en la que el adyuvante glicolipidico es un adyuvante que induce TH1.
- 6. El uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que el adyuvante glicolipidico es monofosforil lipido A 3 des-O- acilado (MPL®) o uno de sus derivados o sales.
- 7. Uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente en la que el antigeno deriva de una bacteria, virus, prion, neoplasia, autoantigeno, animal, planta, material recombinante o sintetico.
- 8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la que el antigeno esta en forma de un polipeptido.
- 9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la que el antigeno es un alergeno.
- 10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la que el antigeno esta en forma de un vector que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido antigenico, y en el que dicho polinucleotido se une de forma operativa a una secuencia reguladora que regula la expresion de dicho polinucleotido.
- 11. El uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en las que el antigeno o antigenos y el adyuvante glicolipidico estan presentes en una composicion unica.
- 12. Uso de acuerdo con la reivindicacion 11 en la que la composicion esta en forma de una solucion acuosa, un gel, una capsula, una pastilla para chupar o un comprimido.
- 13. Una composicion que se puede administrar por via sublingual que comprende al menos un antigeno y un adyuvante glicolipidico para producir una respuesta inmunitaria mucosal y sistemica, en la que la respuesta inmunitaria mucosal se genera en un sitio tanto distal como local respecto al sitio de administracion sublingual.
- 14. La composicion que se puede administrar por via sublingual de acuerdo con la reivindicacion 13, para su uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en la que la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria de IgA.
- 15. La composicion que se puede administrar por via sublingual de acuerdo con la reivindicacion 13, para su uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en la que la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria de IgG.
- 16. La composicion que se puede administrar por via sublingual de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, para tratar una infeccion bacteriana o virica, cancer, autoinmunidad o alergia en un ser humano o un animal.
- 17. La composicion que se puede administrar por via sublingual de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en la que el adyuvante glicolipidico es un adyuvante que induce TH1.
- 18. La composicion que se puede administrar por via sublingual de la reivindicacion 17, para su uso de acuerdo con la reivindicacion 17, en la que el adyuvante glicolipidico es monofosforil lipido A 3 des-O-acilado (MPL®) o uno de sus derivados o sales.
- 19. La composicion que se puede administrar por via sublingual de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-18, para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-18, en la que el antigeno deriva de una bacteria, virus, prion, neoplasia, autoantigeno, animal, planta, material recombinante o sintetico.
- 20. La composicion que se puede administrar por via sublingual de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-18, para su uso de acuerdo con cualquiera las reivindicaciones 13-18, en la que el antigeno esta en forma de un polipeptido.
- 21. La composicion que se puede administrar por via sublingual de acuerdo con cualquiera las reivindicaciones 1318, para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-18, en la que el antlgeno es un alergeno.5 22. La composicion que se puede administrar por via sublingual de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones13-18, para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-18, en la que el antlgeno esta en forma de un vector que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido antigenico, y en el que dicho polinucleotido se une de forma operativa con una secuencia reguladora que regula la expresion de dicho polinucleotido.10 23. La composicion que se puede administrar por via sublingual de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones13-22, para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-22, en las que el antlgeno o antlgenos y el adyuvante glicolipldico estan presentes en una composicion unica.
- 24. La composicion que se puede administrar por via sublingual de la reivindicacion 23, para su uso de acuerdo con 15 la reivindicacion 23, en forma de una solucion acuosa, un gel, una capsula, una pastilla para chupar o un comprimido.
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