JPH02113A - ＧｎＲＨに対する免疫応答を刺激し、哺乳動物を免疫的に生殖不能化するための剤及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 哺乳動物において、脳下垂体を刺激してゴナドトロピン
（性腺刺激ホルモン）を放出させるゴナドトロピン放出
ホルモン（ＧｎＲＨ，またＬＨＲＨすなわち黄体形成ホ
ルモン放出ホルモンとしても知られている）の正常機能
を妨げる抗体の使用はよく知られているが、実用には至
らなかった。

この妨害によって処理哺乳動物は種々の期間生殖力を失
う。該抗体は能動免疫化によって処理された哺乳動物に
よって供給されるか、または受動免疫化によって供給さ
れてきた。後者の技術は短期間滅菌に興味があり、米国
特許４６７６９８１号に記述されている。しかしながら
典型的には外来抗体は宿主哺乳動物中でかなり限られた
半減期しか有さず、抑制された受精能状態を維持しよう
とすれば再処理が必要となる。

能動免疫化は一般に作用期間を長引かすのにより有効な
ルートとして認識されてきた。しかしながら、ＧｎＲＨ
はデカペプチドにすぎないので、哺乳動物の免疫系にそ
れが明らかに分るようにする手段が必要となる。ＧｎＲ
Ｈとアジュバントもしくは他の物質との混合物が適当な
抗体の生産を刺激することができたけれど、もつとも広
く用いられたアプローチはＧｎＲＨ分子を大きなタンパ
ク質担体分子に連結することであった。この研究の良い
概説はＤ　、Ｇ　、Ｇ　ｒｉｇｈｔｏｎ編、Ｂ　ｕｔｔ
ｅｒｗｏｒｔｈ’　ｓ発行（１９８４）のＩ　ｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔ　ｏｆ　Ｒｅｐｒ。

ｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　　Ｍａｍｍａｌｓ　（哺乳動物
の生殖の免疫的側面）の３６３〜３７７頁のＩ　、　Ａ
　、　Ｊ　ｅｆｆｃｏａｔｅ及びＢ、　　Ｊ　、　Ｋｅ
ｅｌｉｎｇによる章、“Ａ　ｃｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｉ
ｚａｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｌ　ＨＲＨｉｎ　ｔｈ
ｅ　ｆｅｍａｌｅ”　（雌のＬＨＲＨに体する能動免疫
化）に見られる。

この概説はカルボジイミド（ｌ−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド）、混合無水物
、グルタルアルデヒド及びビスジアゾ化ベンジジンをは
じめとする種々のカップリング剤を論じている。ビスジ
アゾ化カップリングルーＫｏｃｈらによる“Ｐ　ｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ
ｏｎ　　ｏｆ　　ａｎ　　Ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　　ｔｏ
　　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　　Ｇｏｎａｄｏｔｒ。

ｐｉｎ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　　（合
成ゴナドトロピン放出ホルモンに対する抗血清の生産及
び性質）に記述されているごとく、２工程操作を含むが
、ヒスチジンもしくはチロシン残基の正常に存する側鎖
への付加に基づいている。

この技術はまたへテロ二官能性カップリング剤を適当な
側鎖基を有するハプテンと一緒に用いることの価値を認
識した。１つのアプローチはスルフヒドリル基と反応す
る基及びアミノ基と反応する基を有するカップリング剤
をスルフヒドリル基を有するハプテンと共に用いること
であった。ある場合にはかかる基をもたないハプテンは
チオール化されてきた。かかるヘテロ二官能性剤を使用
する手法は英国のＰ　ｅｒｇａｍｏｎ　Ｐ　ｒｅｓｓ社
によって１９８０年に発行されたＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　
ｒ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（分子免疫学）の１７巻の７４
９〜７５６頁のＡ。

Ｃ，Ｊ、Ｌｅｅらによる“Ａ　　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｆｏｒ
　Ｐｒｅｐａｒｉｎｇｂｅｔａ−ｈＣＧ　　Ｃ０ＯＨＰ
ｅｐｔｉｄｅ−ＣａｒｒｉｅｒＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ　
ｏｆ　Ｐｒｅｄｉｃｔａｂｌｅ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ”（予想し得る組成のベーターｈＣＧ　　Ｃ０ＯＨペ
プチド−担体連結物の調製方法）に記述されている。

この手法は多くのアミノ基を有する担体タンパク質とカ
ップリング剤（例えば６−マレイミトカプロイツクアシ
ルＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルもしくはＭＣ
３）とを反応させ、ついでかくして活性化した担体をス
ルフヒドリル所持ペプチドと反応させる２工程操作を含
む。

しかしながら、この技術は商業上許容されるアジュバン
トを用いてＧｎＲＨに対して哺乳動物を能動免疫化する
技術を教示していない。既知のＧｎＲＨ−担体複合体に
ついてなされた大部分の研究は実験室外では制限された
用途しか有さないＦ　ｒｅｕｎｄの完全もしくは不完全
アジュバント等のアジュバントを用いていた。これはこ
れらのアジュバントの免疫原性が変化しやすく、ある程
度厳密にはコントロールできなかったことによるものと
考えられる。これは別の観点からいうと再現性ある複合
体（ａ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｉｏｎ　ｒｅｇｉｍｅｎ）を開発することの困難性に起
因すると思われる。

本発明は再現性があり、コントロールできる複合体をＧ
ｎＲＨ担体複合体に利用可能なヘテロ二官能性カップリ
ング剤について利用可能にする発見を含むものである。

［発明の概要］ 実用のワクチンアジュバントと組合せて使用して哺乳動
物にその生来のＧｎＲＨに対する免疫応答を開始させ、
かくして哺乳動物の受精能力を抑制することができる一
群の生産容易な剤であって、ＧｎＲＨアナログと免疫刺
激担体との複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含有する剤
が開発された。このアナログは１０の天然性アミノ酸の
１以上がより反応性の側鎖を有するアミノ酸によって置
換されたＧｎＲＨ分子である。この担体は免疫学の領域
において哺乳動物の免疫系にとって低分子量ハプテンを
観測可能にするものとして認識されている物質であれば
いかなる物質でもよく、特に大型タンパク質がよい。Ｇ
ｎＲＨアナログは好ましくは免疫担体上にいかなる有意
な程度にでも典型的に見い出される基とは実質的に異な
る反応性を有する反応基を有する側鎖を有するＧｎＲ）
（アナログである。

この担体は好ましくは免疫原としての確立された歴史を
有する高分子量タンパク質である。

哺乳動物は実質的期間これらの複合剤で免疫化すること
により生殖不能にすることができる。これらの剤は典型
的には認識されたワクチンアジュバントと共に哺乳動物
の循環系に導入される。

［発明の詳細な開示］ ＧｎＲＨアナログは天然性デカペプチドの修飾物であっ
て、そこでは正常アミノ酸の１以上がより反応性の基を
有する側鎖を有するアミノ酸で置換されている。天然分
子は１級アミノ、カルボン酸もしくはスルフヒドリル基
を有する側鎖を欠く。

この点に関し、１つの位置のグルタミン酸の懸垂カルボ
ン酸基はこのアミノ酸のα−アミノ基と環化してピロリ
ドン環を形成するので複合化のために利用できない。本
発明のアナログはこの環を単に開環すること、または開
環したグルタミン酸を宵する天然ＧｎＲＨを合成するこ
とを含まない。

好ましい反応性基はかかる反応性基があったとしても多
くを有しない多くの担体が利用できるという観点からス
ルフヒドリル基である。他のＳ保持アミノ酸であるシス
チン及びメチオニンも適当に修飾してスルフヒドリル基
を生じさせることができるが、システィンで天然性アミ
ノ酸の１つを置換することが特に好ましい。この置換は
ＧｎＲＨの１，６または１０位で行うのが特に好ましい
。

ＧｎＲＨアナログはペプチド合成の周知手法のいずれに
よっても合成できる。特に有利な手法は自動固相ペプチ
ド合成（ａｕｔｏｍａｔｅｄ　５ｏｌｉｄ　５ｔａｔｅ
ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）である。かかる
合成を行う機械はＤｕＰｏｎＬ及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂ　ｉ。

ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）から
市販されている。

担体は哺乳動物の免疫系にハプテンが認識されるように
するものとして免疫学分野で認識されている担体であれ
ばどの担体でもよい。ＧｎＲＨ及び本発明が関与するよ
り容易に複合化されるＧｎＲＨアナログは共に一般に免
疫原として作用するには小さすぎる。すなわち、抗体は
それらに結合するであろうが、それらは一般にかかる抗
体の産生を刺激することはできない。Ｌ　ａｎｄｓＬｅ
ｉｎｅｒのパイオニア的研究から４０数年の間にハプテ
ンとして知られる小分子をはるかに大きな担体分子に複
合化する（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）技術は良く確立さ
れている。これらのタンパク質は典型的にはタンパク質
であり、実質的な数のスルフヒドリル基を有さないタン
パク質が好ましい。適当なポリペプチドは好ましくは約
１５．０００ダルトンより大なる分子量を有する。好ま
しいクラスの担体は複合ＧｎＲＨアナログに対する免疫
応答（抗体力価によって測定）に等しいかそれよりも大
きな免疫応答を引き起こすことができる担体である。適
当な担体はキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙ
ｈ。

ｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）　、ブタ
チログロブリン、ウシ血清アルブミン、ウマガンマグロ
ブリン、ウマアルブミン、オポアルブミン及び破傷風ト
キソイドである。

ＧｎＲＨアナログを担体分子に結合するのに用いる複合
化剤は少なくとも２つの反応基を有する剤である。これ
らの基は担体もしくはＧｎＲＨアナログに好ましくない
影響を与えない条件下で担体分子及びＧｎＲＨアナログ
の双方上の部位と反応性であるべきである。この剤は好
ましくは異なった反応性を有する少なくとも２つの基を
有し、より好ましくは異なったパートナ−と反応する少
なくとも２つの基を有する。特に好ましくはへテロ二官
能性剤であり、最も好ましくはかかる剤はスルフヒドリ
ル基と反応性の一つの基と認識された担体上のありふれ
た（　ｃｏｍｍｏｎ）基と反応性の別の基を有する。こ
れらのありふれた基はカルボン酸及びアミノ基を包含す
る。特に好適な複合化剤はスルフヒドリル基と反応性の
基及びアミノ基と反応性の基を有するヘテロ三官能性架
橋剤である。

好適な剤はｍ−マレイミド−ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル
スルホサクシンイミドエステル、Ｎ−サクシンイミジル
−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、サクシ
ンイミジルー４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボキシレート、サクシンイミジルー４−
（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−サクシン
イミジルー３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
、スルホサクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）ア
ミノベンゾエート、スルホサクシンイミシル−４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−■−カルボキシ
レート、Ｎ−サクシンイミジルブロモアセテート及びス
ルホサクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル
）ブチレートを包含する。特に好ましいヘテロ二官能性
架橋剤はマレイミド基もしくはサクシンイミジルカルボ
キシレート基を有するものであり、最も好ましくはその
両方の基を有する剤である。すべての範囲の好適な剤は
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　　Ｉ　ｌ１ｉｎｏｉｓのｔｈｅＰ
ｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙを通し
て国際的に入手可能であり、この会社の一般に配布され
たＧ　ｅｎｅｒａｌＣａｔａｌｏｇは適当な剤の構造及
び活性の開示を含んでいる。

ＧｎＲＨアナログは主として実用的考慮によって制約さ
れる比の広い範囲で担体に複合することができる。ｌ：
ｌより小さい複合比は非複合ＧｎＲＨアナログが免疫的
に不活性で免疫原として機能しないので実用的意義がな
い。高い複合比は複合体の水溶性を損う傾向がある。担
体１０５ダルトンあたり約２〜１６のＧｎＲＨの連結比
が都合よく好ましいが、免疫応答は実質上複合比によっ
て影響を受けないようである。

現実に得られる複合比は複合されるＧｎＲＨアナログ中
に標識を入れることによって求めることができ便利であ
る。アナログのアミノ酸の１つ、例えばグリシン中への
炭素１４の導入が有利であることが分った。複合操作が
完結した後、非複合ＧｎＲＨアナログの、典型的には大
型タンパク質である担体分子からの分離は標準的カラム
クロマトグラフィー技術によって容易に行うことができ
る。かかる技術中好ましいのは分子篩分画である。

典型的にはこれらの大型タンパク質を表わす溶出容量も
しくは溶出時間を確立する標準（ａ　５ｔａｎｄａｒｄ
）を用いる。次いで分離したタンパク物質中の炭素１４
の活性を用いて複合物のＧｎＲＨアナログ含量を求める
。

特に好ましい複合技術はアミノ基及びスルフヒドリル基
と反応するヘテロ二官能性複合剤、及びシスティン残基
を有するＧｎＲＨアナログを用いる２段階工程操作を包
含する。かかる剤中特に好ましいクラスはマレイミド基
及びサクシンイミジルカルポキシレート基の両方を有す
るものである。

この複合剤は適当な担体分子と反応させ、ついで未反応
剤を標準カラムクロマトグラフィーで代表される分子サ
イズ分画によって担体から分離する。

次いでＧｎＲＨアナログを活性化した担体に加える。Ｇ
ｎＲＨアナログは乾燥物として加えるのが特に有利であ
ることが分った。かかる操作によるカップリングもしく
は複合効率はほぼ１００％であることが分った。

この複合操作の非常に高い効率は再現性ある結果を得る
のを容易にする。かくして特に周到なプロトコルによっ
て達成される複合比が一旦確立されると、引き続き繰り
返す際はぼ同じ比を得ることがあてにできる。

システィン置換を用いる複合の信頼性及び効率はシステ
ィンのスルフヒドリル基のみがＧｎＲＨアナログの反応
性を増加するよう確保することによって高められる。か
くして、もしシスティンがＧｎＲＨ中に正常に存在する
末端アミノ酸のいずれかを置換するならば、システィン
の遊離アミノもしくはカルボキシ基をブロックするべき
である。

例えば置換を１位で行うなら遊離アミノ基をＮ−アシル
基で誘導化できるし、置換を１０位で行うなら遊離カル
ボキシル基をアミド化によって誘導かできる。当然なが
ら他の位置例えば６位での置換はかかる配慮を必要とし
ない。システィンのアミノ及びカルボキシル基はペプチ
ド分子中への結合で消費される。

ＧｎＲＨ複合体はアジュバントと組み合わせて免疫作用
を増大させることができる。これらの複合体は生理食塩
水において投与する場合も免疫的に活性であるが、他の
免疫原と同様、哺乳動物の抗体生産を刺激する活性もし
くは有効性はアジュバントとの製剤化によって高められ
ることができる。好適なアジュバントは許容し難い有害
反応を引き起こすことなしに、免疫原に対する哺乳動物
の免疫応答を高めるものとして当分野で認識された物質
であればいずれのものでもよい。例えば７０インド完全
アジユバント非常に有効なエンハンサ−であるが、痛み
、膿瘍形成及び使用に伴う発熱ゆえに適当なアジュバン
トではない。適当なアジュバントはアルヒドロゲル（ａ
ｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）　　（水り化アルミニウムゲル）
等のアルミニウム化合物、７０インド不完全アジユバン
ト等の油中水エマルジョン、グリセロールで乳化した落
花生もしくはゴマ油、スクアレン等の適当な媒体中のＮ
−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン−
ｎ−ブチルエステル等のムラミルジペプチド、リポソー
ム、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロライド等
の親油性４級化合物、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ
）　　（アリルスクロースで架橋したアクリル酸）等の
アクリル酸ポリマー、モノホスホリルリビツドＡ１及び
デポ効果を演じ、すなわち哺乳動物の循環系に免疫原を
徐々に放出し、非経口投与に際し合理的に良好な許容性
を示す他の物質を包含する。適当な架橋化アクリル酸ア
ジュバントは米国特許第３９１９４１１号、同第３８６
９５８６号及び同第３７９０６６５号に教示されている
。再構成コラーゲンベースアジュバントは米国特許第３
６３９５７７号に教示されている。特に興味深いアジュ
バントはアルヒドロゲル、ジメチルジオクタデシルアン
モニウムブロマイド、硫酸デキストラン、アリルスクロ
ースで架橋し乳化剤及び油で製剤化したアクリル酸、リ
ポソーム、スクアレン中のトレオニルムラミルジベプチ
ド、Ｅ　５ｏｐｈｅｒ、単独及び油中Ｒｅｇｒｅｓｓｉ
ｎ、架橋化アクリル酸製剤とリポソームの組合せ、Ｒｅ
ｇｒｅｓｓｉｎとアルヒドロゲルの組合せを包含する。

ＧｎＲＨ担体複合体のアジュバントとの製剤化はアジュ
バントについての通常の推奨方法に従って行う。一般に
、複合体は他の免疫原と同様の製剤形態で用いられる。

製剤はさらにアジュバントモジくは他のエンハンサ−の
添加によって効率を高めることができる。アジュバント
の古典的定義はデポ（ｄｅｐｏｔ）効果を有する物質で
ある。上記にアジュバントとして論じた物質のいくつか
は免疫原の放出延長をもたらさず、この意味でエンハン
サ−と考えるべきかも知れない。例えばムラミルジペプ
チドは免疫原によって刺激される応答を増幅するがデポ
効果は有しない。かかるエンハンサ−はデポ効果を発揮
する物質と組み合わせることが有利である。この観点か
らムラミルジペプチドはスクアレン等の油もしくはアル
ヒドロゲルと組み合わせるのが有利である。

抗体応答は投与される精密な投与量に感受性でない。陽
性効果がＧｎＲＨ担体複合体の１０μ２という低い用量
で得られた。有意な免疫応答が、適当な担体に複合体し
たＧｎＲＨアナログの０゜９μ２すなわち０．８ナノモ
ルという低さで得られた。マウス等の小動物への適当な
用量は複合体の約１０〜２００μ２であり、より大きな
動物での複合体の用量は好ましくは約１００〜７００μ
２、特に好ましくは約２００〜６００μ２である。

該複合体は一時的な生殖不能を得ようとする哺乳動物の
免疫応答を刺激するために用いることができる。この複
合体はショウ動物、コンパニオン（ｃｏｍｐａｎ　１ｏ
ｎ）動物及び食料動物を免疫的に生殖不能にするために
使用するのが好ましい。この技術は馬、犬、猫、羊及び
牛に用いるのが特に好ましい。

複合体の投与ルートは厳密でない。しかしながら哺乳動
物の循環系ひいては体液免疫系に複合体を徐放するルー
トを用いるのが好ましい。皮下もしくは筋肉内注射が静
脈注射に優る。胃腸管を通る往路を含む投与ルートは、
複合体の劣化が起こる可能性が高く、また循環系への吸
収が困難である可能性があるので好ましくない。

投与方法（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｒｅｇｉｍ
ｅｎ）もまた厳密でなくてもよい。しかしながら、すぐ
前の投与から得られる免疫応答より強い免疫応答を得る
には第２及びその後の投与を十分遅らせることが好まし
い。この応答はＧｎＲＨに対する処理動物の抗体の力価
によって測定するのが便利である。効能剤のある投与後
方価が有意に上がらず、一方最初の投与後免疫応答が認
められたのであれば、効能剤は恐らくもつとも有利な結
果を得るには早く投与されすぎたのである。また、前の
投与に対する応答が十分展開しないうちに効能促進剤を
投与すると最適結果を下回ることになろう。最初の注射
から約３週間後の効能促進剤の投与が有利で、さらに３
週間後の効能促進剤の投与が有利である。

投与容量は厳密でなくてよいが、実用的配慮からコント
ロールされる。他方、余りに高い容量は処理される哺乳
動物の大きさ及び野生（ｐａｃｉｆｉｃｉｔｙ）によっ
て投与するのに不便もしくは困難であるかもしれない。

また最小容量が望まれる粘度を得るのに必要かも知れな
い。７０インド完全アジユバントを用いる製剤等ある製
剤は皮下注射針を通るに十分な低い粘度を達成するため
の最小量の希釈を必要とする。マウスやラット等の小実
験動物については約２５０μｇの投与容量が手頃であり
、牛や羊等のより大きな哺乳動物については１ｍＱ程度
の投与容量が典型的である。犬や猫等の中間サイズ哺乳
動物については投与あたり、多数部位で１ｍＱの投与容
量が適当であることが分った。

ＧｎＲＨ担体連結物の投与によって刺激される免疫応答
は抗体力価若しくは生理作用によって便利に測定するこ
とができるるラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）または
酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）をはじめ
とする、与えられた抗原に対する抗体のレベルを求める
ためのよく確立された技術のいずれも用い得る。ヨウ素
１２５に基づ＜ＲＩＡ法の使用が好適であることが判明
した。放射性トレーサーヨウ素は修正クロラミン−Ｔ法
により天然性ＧｎＲＨに容易に結合させることができ、
非結合ヨウ素は親和性クロマトグラフィーで除去するこ
とができる。この標識されたＧ　ｎ　ＲＨは液体もしく
は固体第１結合アッセイにおいて、または拮抗阻害アッ
セイ（ｃｏｍｐｅ　ｔ　ｉ　ｔ　１ｖｅｉｎｈｉｂｉｔ
ｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ）において用いることができる。

かかる分析の有用な基準（ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）は放射
性ヨウ素のカウントが、加えられたすべてのトレーサー
が抗体に結合したときに得られる総カウントの１０％で
ある点での力価もしくは血清希釈度である。

有効な担体分子は典型的にはそれらが連結しているＧｎ
ＲＨアナログより強力な抗体応答を刺激することが観察
された。通常、抗拒体の力価は抗ＧｎＲＨアナログ抗体
の力価より少なくとも約１つの位はど大である（応答は
少なくとも１つの位大きな希釈度で検出される）。

生理作用は組織学及び性ホルモンレベルをはじめとする
多くの技術によって評価することができる。ＧｎＲＨア
ナログ担体複合体による成功的免疫化は処理された哺乳
動物の精巣または卵巣の減少した重量もしくは大きさに
よって検出可能である。陽性応答はまたこれらの器官の
減少しもしくは抑圧された機能によっても検出可能であ
る。例えは処理された哺乳動物の精巣における精子形成
は著しく抑制されほとんど抑圧されており、副こう丸は
生殖体から離れており、雌の場合には排卵が抑圧される
。別の指標はテストステロンもしくはプロゲステロンレ
ベルの減少である。

［実施例］ 本発明をさらに以下の非限定的実施例によって説明する
。実施例中すべての部及びパーセントは注記ない限り重
量による。

実施例１ 担体／　Ｇ　ｎ　ＲＨアナログ複合体の生産１１．６ま
たは１０番目の正常に存するアミノ酸がシスティンによ
って置換され、末端置換の場合には遊離末端基が不活性
化された以外天然性ＧｎＲＨと同じ構造を有する３つの
ＧｎＲＨアナログを固相ペプチド合成によって製造した
。１位置換のアナログは必然的に正常に存するグルタミ
ン酸に関するピロリドン基の損失を含み、 １０位置換アナログは最初は末端グリシンに関するアミ
ド基を最初は有していなかった。前者の場合には遊離ア
ミノ基はＮ−アセチル化されており、後者の場合には遊
離カルボキシル基はアミド化された。１０位置換の場合
には炭素１４標識を６位グリシンに入れ、ｌ及び６位置
換の場合にはこの標識は１０位グリシンに入れた。

キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅｌ
ｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）　　（Ｋ　Ｌ　Ｈ
）の担体分子はｍ−マレイミドベンゾイルスルホサクシ
ンイミドエステル（ＳＭＢＳ）での活性化による複合化
のために製造した。担体分子１０ｍ、？を、ＮａＣ１８
，７７、？　、Ｎａ２ＨＰ０，１３．８．？及び蒸留水
８００ｍ１２を混合し、ＩＮ　　ＭＣＩでｐＨ７−５と
し、蒸留水で１４として得たバッファー２ｍ＋２に溶解
した。乾燥Ｓ　Ｍ　Ｂ　Ｓ　１３Ａｍ７をこの溶液に加
え、ゆるやかに混合し、室温で１時間反応させた。過剰
の５ＭＢ５を、セファデックスＧ２５ＰＤ−１Ｏフアー
マシアカラム上の分画によって３〜５．５ｍ４で溶出す
る高分子量ピークを回収することによって活性化担体か
ら分離した。

複合化はこの活性化担体溶液を乾燥ＧｎＲＨアナログ１
ｍＬｊに加えることによって行なった。

１０位置換の場合はアナログをまずエタノール２００μ
ａに溶解し、ついで担体溶液に加えた。

両方の場合において添加後、室温で２時間ゆるやかに混
合した。反応浴をＰＤ−１０カラム上で分画し、３〜６
１ＴＩＱの間で溶出する高分子量ピークを集めることに
より、複合化されなかったアナログからの分離を行った
。

複合体のタンパク質含量はクーマシーブルータンパク質
アッセイによって求めた。標準曲線は、該バッファー中
のウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）強度を変化させた
溶液を用い、Ｂ　１ｏｒａｄタンパク質試薬をかかる溶
液２００μＣに加え、ちょっとの間撹拌し、５９５ｎｍ
での光学密度を読むことによって作成した。複合体溶液
の容積は２００μαに調整し、Ｂ　１ｏｒａｄタンパク
質試薬２００μＱと混合した。５９５ｎｍでの光学密度
を標準曲線と比較してタンパク質含量を得た。

複合体のＧ　ｎ　ＲＨアナログ含量は炭素１４標識につ
いての分あたりカウント（ＣＰＭ）から求めた。サンプ
ル１００／Ｊ（２をＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌ
ｅａｒ社のＡｑｕａ　Ｓｏｌ　シンチレーションカクテ
ル５ｍＱに加え、Ｂｅｃｋｍａｎシンチレーションカウ
ンターで１分間計測した。

複合体は担体１０ゝダルトンあたり７．７アナログ単位
のアナログ担体比を有することが分った。

複合効率はほぼ１００％であった。３〜６ｍ１２の間で
溶出した６位置換アナログベース複合体を回収プールす
ることに代え、ＰＤ−１ｏカラムのすべての実際の溶出
域（１〜１８ｎ＋＋２）に亘って各ＩｍＱを回収した。

各両分をタンパク質含量及びアナログ含量の双方につい
てクーマシーブルータンパク質アッセイ及び炭素１４ｃ
ＰＭでそれぞれ分析した。スケール（目盛り）を適当に
調整することによって、共に溶出容量に対するタンパク
含量のグラフとアナログ含量のグラフを重ね合わすこと
ができた。このことは担体タンパク質とアナログが同じ
溶出パターンを有し、同じ分子の部分であることを示し
ている。

実施例２ 担体／　Ｇ　ｎ　ＲＨアナログのワクチン化実施例１に
従って調製したＫＬＨと６位置換アナログ（連結比７．
９）に基づく複合体を５８ａｌｂ／ｃマウスを処理する
のに用いた。各哺乳動物に生理食塩水２００μａ中複合
体５ＯＮ、？の最初の腹腔内注射を与え、１４日後同−
製剤の同一投与量を同じルートでブースター（効能促進
剤）注射した。２１日後マウスの眼窩下静脈穿刺により
採血し、血清の抗ＧｎＲＨ抗体を液相−次結合アツセイ
によって調べた。特に血清サンプルもしくは適当な一連
の希釈液１００μＱをヨウ素１２５標識化ＧｎＲＨ１０
０μＱと共に４℃で一夜インキュベートしたところ、Ｐ
ＢＳゲル溶液１００ＰＱの存在下１００／ＪＩ２あた’
＋２０．ＯＯＯＣＰＭを示した。冷エタノールｌμａで
の沈澱及び４℃、ｌ　２０　ｉでの１０分間の遠心分離
によりタンパク質結合放射性標識化ＧｎＲＨを単離した
。

デカントした沈澱をＭｉｃｒｏｍｅｄｉｃ自動ガンマカ
ウンターで計測した。結果はこのデカントした沈澱によ
って示された合計カウントのパーセントとして計算した
。すなわち最初の３００μａのインキュベートサンプル
は２０．ＯＯＯＣＰＭを含んでいたので、このサンプル
のデカント沈澱について観測されたＣＰＭをこの数で割
ることによりパーセントを与える。適当な基準として任
意に１０％レベルを選んだ。

１９１９３匹はｌｏ：１血清希釈度で少なくとも１０％
の結合標識を示し、２匹は１００：ｌ血清希釈度で少な
くとも１０％の結合標識を示した。

かくのごとくこの複合体によって有意の免疫応答が刺激
された。

実施例３ アジュバント化した複合体を用いるワクチン化１位及び
６位置換ＧｎＲＨアナログベースの複合体のアジュバン
ト化製剤の免疫応答に対する複合比の効果を求めた。こ
れらの複合体は複合の第２工程でアナログの変化する量
を用いる以外実施例１の手法に従って製造した。１位置
換についての複合比は３．５．６．３及びｌ０１６であ
り、６位置換についての複合比は３．７．７．３及び１
４゜６であり、それぞれ担体ＫＬＨの１０５ダルトンあ
たりの値である。

複合物を米国特許３９１９４１１号の実施例■によって
教示されたと非常に類似のアジュバントと組み合わせた
。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の複合体５０μ
２を、水と綿実油の５０＝４５容量混合物（このものは
さらにソルビタンモノラウレート２．５容量％とエトキ
シル化ソルビタンモノオレエート（エチレンオキシド２
０モル）２．５容量％を含有する）中の約２重量％Ｃａ
ｒｂｏｐｏ＋９３４ｐ（ポリアリルスクロースで架橋し
たポリアクリル酸）のエマルジョンと混合した。処方は
複合的溶液９容量部とエマルジョンｌ容量部でなされた
。

アジュバント化製剤２００μＱを１４日間隔で２回Ｂａ
ｂｂ／ｃマウス３０匹に腹腔的投与した。すなわち６つ
の複合体（各ＧｎＲＨアナログについて３つの複合比）
の各々をマウス５匹に投与した。

３０匹のマウスの本質的にすべてが２１日後天然ＧｎＲ
Ｈに対する抗体を生産した。特に血清の１０：ｌ希釈剤
はすべてのマウスについて、すべてのヨウ素１２５標識
化ＧｎＲＨが結合可能でかつ抗体と結合したとした場合
の合計カウントの少なくとも１０％のヨウ素１２５カウ
ントを示した。

１６匹のマウスの血清が１００：ｌ希釈でこのミニマム
を満たすかまたはこれを越え、３匹の血清は１０００：
ｌ希釈度でもそうであった。ＧｎＲＨアナログベースも
しくは複合比と抗体生産との間に明瞭な相互関係はなか
った。

実施例４ アジュバント化複合体に関する用量の効果７．７　：　
１０５ダルトン比でＫＬＨに連結した６位置換アナログ
ベースのアジュバント化製剤の４用量レベルの抗体生産
に対する効果を調べた。複合体の１Ｏ１５０，１００及
び２００μ２の用量レベルを用いた。５匹のＢａ１ｂ／
ｃマウスに零日、１４日目に各用量を２００μａ注射で
与え、抗体生産を２１日目に評価した。処方及びアジュ
バントは複合体含量を変えた以外実施例におけると同じ
であった。

抗体応答はヨウ素１２５標識化ＧｎＲＨの結合によって
実施例１〜３と同様にして評価した。マウス６５匹の４
群の間に統計的に有意な差は認められなかった。すなわ
ち４つの用量レベルとも同じ応答を刺激したものと思わ
れた。１匹を除くすべてのマウスが１：１０血清希釈で
合計カウントの１０％の基準をみたし、２０匹中９匹は
ｌ：１００希釈で基準をみたし、２０匹中４匹は１：１
０００希釈でも基準をみたした。

実施例５ アジュバント化製剤の担体の効果 体を用いて５つの複合体を製造した。複合体を製剤し、
実施例３に記述した方法で投与した。すなわち複合体を
ポリアクリル酸ペースアジュバントと混合し、複合体当
り５Ｂａｌｂ／Ｃマウスに複合体５０μ２を２００μａ
容量で零日及び１４日目に腹腔的投与した。刺激された
抗体生産を実施例２に記述したごとくヨウ素１２５標識
化したＧｎＲＨと結合して２１日目に評価した。担体、
担体１０５ダルトン当りの連結比、及び合計カウントの
１０％に対する投影力価（実施例３に定義）を表１に記
録した。投影力価はｔｏ−’　　１０−”　　ｔｏ−３
及び１Ｏ−４の希釈度での結果から外挿した。

Ｌ」 ６位置換ＧｎＲＨアナログ及び５つの異なる担ｌｌ　　
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）７．７ 流側３と同様であった。結果を表２に記録した。

「投影した１０％力価」は１０−’　　ｔｏ−”　　１
０及び１Ｏ−４の希釈度での結果から外挿する。

表　　２ ２５　　　　ＬＬ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０ＥＧＧはＭａｎｎ−
Ｗｈｉｔｎｅｙテスト（ｐ＜０．０５）によって統計的
にＫＬＨと一緒の、またはＢＳＡ及びＴＧＢの両者と一
緒のグループに分けられる。

ＢＳＡ及びＴＴは他の３つの担体より劣る結果を与える
ものとして統計的にグループ分けされる。

実施例６ Ｂａｌｂ／ｃマウスｌＯ匹を１位置換ＧｎＲＨアナログ
とＫＬＨの複合体（１０５ダルトンあたり連結比１０．
６）のアジュバント化製剤を用い、実施例３のプロトコ
ルに従って処理し、７日目及び２１日目の抗体応答を実
施例２に記述したアッセイに従って評価した。九方及び
アジュバントは実実施例７ 牛のワクチン化 ２種のＧｎＲＨアナログ−ＫＬＨ複合体をベースとし、
種々のアジュバントを含有するワクチン製剤の効果を求
めた。複合体は等しい量の１及び１０倍システィン置換
アナログから７及び１０の間の複合比で実施例１の手法
に従って製造した。

６つの製剤をアルヒドロゲル容量あたりＲｅｇｒｅｓｓ
　１ｎ２０．１００及び２００μ２と共のアルヒドロゲ
ル、エソホール（ｅｓｏｐｈｏｒ）及び油中レグレツシ
ン（ｒｅｇｒｅｓｓｉｎ）を用いて製造した。製剤は複
合体５００μ２の用量で零及び３５日目に投与した。す
べての製剤をＩＭ注射により雄牛５頭及び去勢牛（５ｔ
ｅｅｒ）　５頭に投与した。各群の雄牛中２頭及び去勢
牛３頭は以前の不成功の試行に巻き込まれており、ワク
チン化にいくぶんより敏感であった。

効果はＧｎＲＨに対する抗体力価及びテストステロン生
産の抑圧により評価した。いくつかのアジュバント製剤
しか有意の力価を示さなかったが、すべての製剤はテス
トした雄牛のテストステロンレベルを有意に減少させた
。以前に処理された２頭の雄牛を含め７頭の雄牛が１：
１０希釈で可能なヨウ素１２５カウントの１０％のカウ
ントを示すことができなかった。エソホール製剤は以前
に処理された２頭の雄牛と以前に処理された去勢牛を含
む非応答者（１０中８）のもつとも高い比率を有してい
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）１０の天然性アミノ酸の１又はそれ以上がより
   反応性の側鎖を有する別のアミノ酸で置換されたＧｎＲ
   Ｈ分子、及び ｂ）免疫刺激性担体分子の複合体を含有してなる、 哺乳動物の免疫系を刺激して哺乳動物生来のＧｎＲＨに
   結合する抗体を生産することができる剤。 ２、置換アミノ酸の側鎖上の反応性基が該刺激性担体分
   子上にいかなる有意な程度において見い出される基とは
   実質上異なる反応性を有する特許請求の範囲第１項記載
   の剤。 ３、担体分子が高分子量タンパク質である特許請求の範
   囲第１項記載の剤。 ４、該複合体は担体分子と反応性の１つの基及び置換ア
   ミノ酸の側鎖の反応性基と反応性の別の基を有するヘテ
   ロ二官能性試薬を用いて形成されている特許請求の範囲
   第２項記載の剤。 ５、該側鎖反応基がスルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒ
   ｙｌ）基である特許請求の範囲第２項記載の剤。 ６、該置換アミノ酸が１個のシステインである特許請求
   の範囲第５項記載の剤。 ７、該システインがＧｎＲＨの１、６または１０位のア
   ミノ酸に置換している特許請求の範囲第６項記載の剤。 ８、担体分子に対する修飾ＧｎＲＨ分子の比が担体１０
   ＾５ダルトン当り約２〜１６のＧｎＲＨ分子である特許
   請求の範囲第２項記載の剤。 ９、複合体を、担体分子と反応性の１つの基及び置換ア
   ミノ酸の側鎖の反応性基と反応性の別の基を有するヘテ
   ロ二官能性試薬を用いて形成されている特許請求の範囲
   第２項記載の剤。 １０、修飾ＧｎＲＨが、１つの正常に存在するアミノ酸
   がシステインによつて置換されていることによつて天然
   ＧｎＲＨと異なる特許請求の範囲第９項記載の剤。 １１、ａ）ｉ）１０の天然性アミノ酸の１以上がより反
   応性の基を有する側鎖を有する別のアミノ酸で置換され
   たＧｎＲＨ分子、及び ｉ）免疫刺激性担体分子 の複合体を含有してなる、哺乳動物の免疫系を刺激して
   哺乳動物生来のＧｎＲＨに結合する抗体を生産すること
   ができる剤、及び ｂ）該剤の刺激作用を増幅するアジュバントを含有して
   なる、哺乳動物の生殖能力を抑制するためのワクチン。 １２、アジュバントが哺乳動物のワクチンにおいて効能
   を有するものとして歴史的に認識されたアジュバントか
   ら選択される特許請求の範囲第１１項記載のワクチン。 １３、免疫系を刺激して哺乳動物の生来のＧｎＲＨに結
   合する抗体を生成させることによつて哺乳動物の生殖能
   力を刺激する方法であつて、 ａ）１０の天然性アミノ酸の１以上がより反応性の基を
   有する側鎖を有する別のアミノ酸で置換されたＧｎＲＨ
   分子、及び ｂ）免疫刺激性担体分子 を複合することによつて得られる刺激剤を用いることを
   特徴とする方法。 １４、刺激を該刺激性剤を含有するワクチンを哺乳動物
   の一般的循環系に存在させることによつて行う特許請求
   の範囲第１３項記載の方法。 １５、哺乳動物を少なくとも１週間間隔をあけて少なく
   とも２回ワクチン化する特許請求の範囲第１４項記載の
   方法。 １６、免疫系を刺激して哺乳動物の生来のＧｎＲＨに結
   合する抗体を生成させることによつて哺乳動物の生殖能
   力を刺激する方法であつて、その免疫原が ａ）１０の天然性アミノ酸の１以上がより反応性の基を
   有する側鎖を有する別のアミノ酸で置換されたＧｎＲＨ
   分子と ｂ）免疫刺激性担体分子 との複合体であるワクチンを哺乳動物にワクチン投与す
   ることを特徴とする方法。 １７、１０の天然性アミノ酸の１つがシステインによつ
   て置換されたＧｎＲＨよりなる、タンパク質担体分子と
   の免疫刺激複合体を生産するのに有用な修飾ＧｎＲＨ。 １８、置換を１、６または７位で行う特許請求の範囲第
   １７項記載の修飾ＧｎＲＨ。 １９、抑制が恒久的である特許請求の範囲第１１項記載
   のワクチン。 ２０、抑制が一時的である特許請求の範囲第１１項記載
   のワクチン。 ２１、抑制が恒久的である特許請求の範囲第１３または
   １６項記載の方法。 ２２、抑制が一時的である特許請求の範囲第１５または
   １６項記載の方法。