JPS62286928A - 受胎調節用ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 本発明は、受精能力を調節するワクチンに関し、そして
とくに、少なくとも１種、好ましくはｌより大き担体へ
結合した生殖系において多数の決定因子の抗原を有する
多価ワクチンに関する。

本発明は１種または２種以上のゴナドトロピンの作用を
遮断する抗体により受精能力を調節するための能動（ａ
ｃｔｉｖｅ）免疫アプローチに関する。下垂体黄体形成
ホルモン（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　　ｌｕｔｅｉｎｉｚｉ
ｎｇ　　ｈ　ｏ　ｒｍｏ　ｎｅ）（ＬＨ）および絨毛膜
ゴナドトロピン（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ　　ｇｏｎａｄｏ
ｔ　　ｒｏｐｉｎ）（ＣＧ）は、霊長類における生殖梯
力の７Ａ節において重要な役割を演する。前者は排卵お
よびステロイド生合成のために重要であり、そして後者
は黄体の救助および胎盤移動までのステロイド生合成の
維持のために重要である。ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（
ｈＣＧ）は栄養芽層の早期の生成物であり、そして受精
の確立および維持のために必須であることが認識されて
いる。能動免疫および受動免疫のアプローチは、受精能
力の調節のために霊長類において有効であることが立証
された。こような免疫化において、究極的な人間におけ
る使用について許容されうるフロイド完全アジュ／ヘン
ト　（Ｆｒｅｕｎｄｓ　　　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　　　Ａ
ｊｕｖａｎｔ）（Ｃ，Ｆ、Ａ、）が使用された。本発明
は、Ｃ，Ｆ、Ａ、を使用しないで両者のゴナドトロピン
に対して有効である抗体の霊長類における形成を誘導す
ることができる活性な多価ワクチンに関する０本発明の
ワクチンは、αサブユニットおよびβサブユニットの両
者から成る完全な６００分子のワクチンと反応して、生
物学的の活性を中和しならびに、ある程度、ＬＨの生物
活性を減少することのできる抗体の形成に導く、このワ
クチンは体の組織との交差反応性に欠如する抗体を産生
し、そして抗体の応答は調節されかつ合理的に長い期間
続き、可逆的な免疫性を提供し、ｍ性を含まず１体の！
ｊ１１Ｐ１．に対して逆の指示与えず。

そしてまた余分の感覚過敏の問題を生じない。

本発明の抗ｈＣＧ免疫化のアプローチは、初期の研究、
とくに本発明者らのカナダ国特許第１゜０５４．９３７
号、１９７９年５月２２日発行およびまたカナダ国特許
第１．０５７．７４２号［ステプンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ
）］、１１９７９７７３３日発から知られている。しか
しながら、抗ｈＣＧワクチンのこれの２人の発明者らは
基本的に異なるアブロートを使用した１本発明者はホル
モンｈＣＧのβサブユニットを使用し、一方ステブンス
は同一サブユニットの３７アミノ酸カルボキシ末端ペプ
チド（ＣＴＰ）を使用した。この「自己」蛋白質が免疫
原とされるモードはまた異なる０本発明者は担体、例え
ば、破傷風トキソイドを使用し、一方ステブンスおよび
共同研究者らは前記蛋白質の修簿を初期に提唱したが、
引続いて担体のアプローチを選択した。

ｈＣＧはサブユニントαおよびβから構成された糖蛋白
質のホルモンである。αサブユニットは３類の他のホル
モン、ＴＳＨ，ＬＨ１およびＦＳＨに対して共通である
。各場合において、ホルモンの個体性をケえるのはβサ
ブユニットである。

こうして、抗原としてｈＣＧのβサブユニー／　トのみ
を使用すると、抗体が他の糖蛋白質のホルモン、とくに
ＴＳＨおよびＦＳＨと交差反応する機会を減少させる。

雌の免疫系は常ｙＥでｈＣＧに対して耐性であり、そし
て前記ホルモンの注射後抗体を産生ずることが期待され
ないが、免疫原性はハプテン基の取り付けるか、あるい
はそれを免疫原「担体」蛋白質に結合することにより、
分子を修飾することよって導入することができる。こう
して、前述のカナダ国特許第１．０５４５，９３７号に
おいて、βｈＣＧが化学的に破傷風トキソイドに結合さ
れているワクチンを使用して免疫化を実施している。こ
のワクチンは受精ホルモンならびに破傷風トキソイドの
両者に対して抗体を産生ずる。しかしながら、このワク
チンの効能は、抗体の応答が受精を防止するために低過
ぎるある「低い応答体」の患者に適切ではない、患者の
間の応答の著しい変動（構成的変動）はこのワクチンを
変更することを示したので、適切な抗体の応答は受容体
の全部でないにしても、大部分において誘発された。

本発明は、βｈＣＧ−ＴＴワクチンに比較して、哺乳動
物の種において実質的に高い抗ｈＣＧ抗体を誘発する改
良された免疫原を提供することを試みる。１種ようり多
い担体の使用は、所定の担体に対してして低い応答体に
おいてすぐれた抗体の応答を引き出すことがさらに提案
される。

本発明によれば、多価ワクチンを調製する方法が提供さ
れ、この方法は、工程（ａ）生殖系の少なくとも２種の
別々の抗原を準備し、第１はｈｃＧのβサブユニットの
調製物でありそして第２は精子抗原またはＬＨの異種の
種のαサブユニットまたはβサブユニットの調製物であ
り、（ｂ）少なくとも１種の患者適合性の担体の免疫学
的に純粋な調製物を準備し、（ｃ）工程（ａ）の少なく
とも２種の抗原を工程（ｂ）の少なくとも１種の担体と
接合し、前記接合は、（＋）同一担体部分へ結合した少
なくともの２つ種の別々抗原の複合接合体を形成する。

（ｉｉ）各々が少なくとも１種の担体へ結合した少なく
とも２種の別々の抗原の接合体の物理的混合物を形成す
る、（ｉ　ｉ　１）ｈＣＧのβサブユニットおよび異種
の種のαサブユニー／　トである少なくとも２種の別々
の抗原を会合してアニーリングした複合体を形成し、引
続いてアリニーリングした複合体を担体と接合する、お
よび　（ｉｖ）少なくとも１種の精子抗原および少なく
とも１種の担体の両者へ結合した少なくとも１種の抗原
の多価接合体を形成する、および（ｖ）１種より多い担
体が存在する場合、前記担体へ結合した前記抗原の１種
の接合体を形成する。から成る群より選択される工程の
少なくとも１つを実施することにより実施し、そして、
必要に応じて、（ｄ）上の工程（ｉ）〜（ｖ）からの２
種以上の接合体の生成物を組み合わせる、からなる。

他の面において、本発明は、また、単一の接合体ワクチ
ンに対する低い抗体応答性を有する哺乳動物の患者のた
めの多価ワクチンを調製する方法を提供し、この方法は
工程（ａ）生殖系の少なくとも２種の別々の抗原を準備
し、第１はβサブユニッ）　ｈＣＧの調製物であり、そ
して第２は精子抗原またはＬＨの異種の種のαサブユニ
ー／　トまたはβサブユニットの調製物であり、　（ｂ
）少なくとも２種の患者適合性の担体の免疫学的に純粋
な工程（ａ）の少なくとも２種の抗原を準備し。

（Ｃ）工程（ａ）の少なくとも２種の抗原を工程（ｂ）
の少なくとも１種の担体と接合し、前記接合は、（ｉ）
同一担体部分へ結合した少なくともの２種の別々抗原の
複合接合体を形成する。

（ｉ　ｉ）少なくとも１種の前記担体へ別々に結合した
少なくとも２種の別々の抗原の複合体の物理的混合物を
形成する。（ｉ　ｉ　１）ｈＣＧのβサブユニ、トおよ
び前記異種の種のαサブユニットである少なくとも２種
の別々の抗原を会合させてアニーリングした複合体を形
成し、引続いてアリニーリングした接合体を前記担体の
少なくとも１種と接合する、および（ｉｖ）少なくとも
１種の精子抗原および少なくとも１種の担体の両者へ結
合した少なくとも１種の抗原の多価接合体を形成する、
および（ｖ）担体に結合した前記抗原の１種の接合体を
形成する、から成る群より選択される工程の少なくとも
１つにより実施し、そして（、（）上の工程（１）〜（
ｖ）からの２種以上の接合体の生成物を組み合わせる、
からなる。

他の面において１本発明は、生殖系の少なくとも２種の
抗原、第１はｈＣＧのβサブユニー／　）の調製物であ
りそして第２は精子抗原または異種の種のαサブユニッ
トまたはβサブユニットの調製物である、および少なく
とも１種患者適合性の担体からなる多価ワクチンを提供
し、この多価ワクチンは、（ｉ）同一担体部分へ結合し
た少なくとも２種の別々の抗原の複合接合体、（ｉ　ｉ
）各々が少なくとも１種の担体へ別々に結合した少なく
とも２種の別々の抗原の接合体の混合物、（ｉ　ｉ　ｉ
）担体へ接合した、ｈＣＧのβサブユニットおよび異種
の種のαサブユニットである少なくとも２種の別々の抗
原の７ニリーングした複合体、（ｉｖ）精子抗原および
少なくとも１種の担体に結合した少なくとも１種の抗原
の多価接合体、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の少なく
とも２！！の混合物から成る群より選択される。

他の面において、本発明は、多価ワクチンを雌の哺乳動
物に妊娠を防止するために十分な投与量および頻度で投
与することからなる多価ワクチンを使用する受胎調節法
を提供する。

こうして、本発明において、免疫原性の増大が達成され
、そして構成的変動または「低い応答体」の問題は、１
種より大きい担体へ結合した生殖系の１種より多い抗原
から成る多価ワクチンを提供することにより取り組まれ
、これは生殖系内で１より多い方法で遮断または中和を
探究する。

新規な接合体（ｃｎ　ｊｕｇａｔ　ｅ）は１種より多い
担体へ結合した少なくとも２種の抗体を用いて形感され
、抗原の１種はβｈＣＧである。これらの新規な接合体
から形成された新規なワクチンは、生殖系に対して多価
の能力を有しかつ遺伝的に異なる個体からすぐれた抗体
の応答を誘導する大きい能力を有するとして定義するこ
とができる。

好ましい実施態様において、ｈＣＧのβサブニー−ｙト
は異種の種（ｈｅｔｅｒｏｓｐｅｃｉｅＳ）のαサブユ
ニット、例えば、αｏＬＨにアニリーング（ａｎｅａｌ
）され、そしてこれはホルモンの活性のために最適な立
体配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を達成し、これ
によりその立体配置を認識する抗体を産生ずる可能性を
与え、かつ組織の受容体とホルモンとの相互作用を防止
することを促進する。異種の種のαサブユニットを使用
することば重要である。なぜなら、ｈＣＧのαサブユニ
ットは３種類の他のホルモン、ｈＴＳＨ，ｈＦＳＨおよ
びｈＬＨの対して共通であるからである。ｈＴＳＨおよ
びｈＦＳＨとの交差反応は逆に指示され（ｃｏｎｔｒａ
−ｉｎｄｉｃａｔｅｄ）、それゆえ生物活性のためにｈ
ＣＧに最適なコンフォーメーション（ｃｏｎｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ）を達成するためにホルモンのαサブユニット
（ヒト）を使用することができる。αサブユニット、例
えば、ヒツジＬＨからのαサブユニットを、βｈＣＧと
アニリーングして、ａ）最適なコンフォーメーション、
ｂ）増大した免疫原性、ｃ）ｈＴＳＨおよびｈＦＳＨと
の交差反応が生成しないという追加の利点を発生させる
ことができる。

ｈＣＧのβサブユニットは、精子抗原および／またはＬ
Ｈの異種の種の精子抗原と一緒に本発明の多価ワクチン
に包含されるので１種々の抗体が形成されてｌより多い
点において受精能力を遮断する。これらのエピトープは
、新規な多価ワクチン中に混合された接合体（ここでそ
れらの両者は同一の担体へ結合されいる）（こうして混
合接合体を形成する）を介して存在することができ、あ
るいは同一の担体の異なる分子または事実異なる担体へ
別々に結合し、これにより異なる接合体の物理的混合物
をつくることができる。それ以上の別法として、２種類
の抗原を前記担体へ接合（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）するこ
とができる、アニリーングした複合体（ｃｏｍｐｏｓ　
ｉ　ｔ　ｅ）では、異種の種のαサブユニットをβｈＣ
Ｇと会合（ａＳｓｏｃｉａｔｅ　　ｗｉｔｈ）させる、
αサブユニットは、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネズミ（ｒｏ
ｄｅｎｔ）または人間以外の他の異種の（ｈｅｔｅｒｏ
）哺乳動物種であることができる。

混合接合体および異なる接合体の物理的混合物の実施態
様では、異種の種のβサブユニー／　トをβｈＣＧに結
合する。好ましくは、異種の種１例えば、ウマ、ブタ、
ヒツジまたはネズミの黄体形成ホルモン（ＬＨ）のβサ
ブユニット、より好ましくはヒツジＬＨのβサブユニッ
トを使用する。これらの新規な接合体は主としてＬＨの
相互作用を生成し、二次的にＣＧと拮抗するように思わ
れるが、アニリーングした複合接合体は主としてＣＧと
相互作用すると同時にＬＨとそれほど妨害しないように
思われる。

アニリーングした複合体の代わりに混合接合体および異
なる接合体の物理的混合物の実施ぷ様においてβｈＣＧ
の代わりに７ニリーングした複合体を使用し、これによ
り効能が増大したワクチンを提供することができる。

さらに、２種類より多い抗原をワクチン中に含めて、生
殖系における多数の決定因子の作用の効果を促進するこ
とができる。こうして、精子抗原、例えば、ＬＤＨＣ４
を含めて精子と拮抗させ、こうして妊娠を防止すること
ができる。また、驚くべきことには、本発明によれば、
多価ワクチン中に第２の担体またはそれより多い担体を
使用すると、効能が増大し、これはとくに、構成的変動
の結果による所定の担体に対する低い応答を克服する上
で有用であることが発見された。１種より多い担体の使
用は、１種より多い観康の危険に対する免疫予防作用の
利益を発生させるという明確な利点を有する。

本発明の特定の実施態様を、−例として、添付図面を参
照してさらに説明する。

ｉ）過ヨウ素醜塩の酸化の方法において、糖蛋白質の炭
水化物の外殻、この場合においてホルモンのサブユニ・
ント、をメタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理して、アルコ
ール基を酸化してアルデヒドにし１次いでこれを担体−
この場合において破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ　
　ｔｏｘｏｉｄ）上に存在するＮＨ２基とアルカリ性条
件下に反応させてシックの塩基を形成し、これを５元剤
の添加により安定化する。この接合の設計はホルモンの
炭水化物部分のみを含み、蛋白質は未変化のままである
。この反応は担体のホモ接合体の形成を許し、そしてホ
ルモンのサブユニット間の自己結合は１反応条件、すな
わち低いｐＨのため、最小である。

ｉｉ）へテロニ官能性剤、例えば、スクシニミジル４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルホ
キシレーｈ　（ＳＭＣＣ）の使用は、ホモ−接合体の形
成を排除する。この試薬を使用すると、マレイミド基は
そのＮＨ２基の使用によりホルモンのサブユニットへ導
入される０次いで、イミダゾール基を親核基、例えば、
−５Ｈ（これは破傷風トキソイド上におだやかな条件下
に還元剤を使用することにより存在させることができる
）で敢然する。

このようにして形成した接合体は、ホルモンの存在する
一ＮＨ２基および担体の存在するーＳＨ基を利用する。

ＳＨ基が蛋白質上に存在しない場合、ＳＨは容易に導入
することができる。

１ｉｉ）Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジンルジチ
オ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）は、おだやかな条件下
に２つの蛋白質を結合する他のへテロニ官能性剤である
。接合剤は２つの結合した蛋白質の間の架橋として作用
する。ホルモンの７ミノ基は架橋剤との別の反応に参加
して究極的にスルホニル基を生じ、次いでこれを使用し
て。

同様な方法で別々に処理した破傷風トキソイドとジサル
ファイド架橋を形成する。この反応の設計はホモ接合体
の形成を最小にすることを目的とする。

ｉｖ）ホモニ官能性試薬１例えば、グルタルアルデヒド
を使用して２つの蛋白質間の接合体を生成することもで
きる。単一工程の反応において、両者の蛋白質をグルタ
ルアルデヒドと一緒に混合する。グルタルアルデヒドは
２つの蛋白質分子のＮＨ２基とシップの塩基を形成する
ことにより、２つの蛋白質を結合する。単一工程のグル
タルアルデヒドの方法は、ホモおよびヘテロの接合体の
両者を有することのできる接合体を生ずる。グルタルア
ルデヒドは２つの接合した蛋白質分子間の架橋を形成す
る。グルタルアルデヒドは、また、２工程の手順におい
て使用することもでき、こここで処理は別々に実施され
る。

Ｖ）カーポジイミドのような縮合剤を接合体の形成に使
用することもできる。ｌ−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カーポジイミド（ＥＣＤＩ）を、接合
すべき２つの蛋白質と一緒に混合する。１つの蛋白質の
アミ７基は他の蛋白質のカルボキシル基を反応して、カ
ーポジイミドの存在下にアミド結合を形成する。単一工
程において、ヘテロ接合体およびホモ接合体の両者を形
成することができる。

上に述へた接合法のすべては、ホルモンのサブユニット
と担体との接合体を調製するために使用することができ
る。しかしながら、調製法は実験の詳細とともに下に記
載する。

最初のモル比：　　βｈＣＧ：ＴＴ ｌＯ：　１ １）１５ｍｇのβｈＣＧ重量による、を新しく蒸留した
水、合計の体積＝０．９ｍｌ、中に溶解する。

２）０．１のメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を新しく蒸
留した水中でつくる。１ｍｌの水中の２１３ｍｇ。

３）このβｈＣＧ溶液に、０．１ｍｌの０．１モルのメ
タ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）溶液を滴々添加
する。この反応を室温（２５−３０℃）において４０分
間一定のおだやかな攪拌のもとに実施する。

４）次いで、Ｎａｌ０ａで処理したβｈＣＧを１リンド
ルのｌＯミリモルの酢酸ナトリウムの緩衝液、ｐＨ４，
４に対して４℃において一夜２回交換して透析する。

５）破傷風トキソイド（２３５および２８０ｎｍにおけ
る吸収値により蛋白質濃度を決定する）を、０．０１モ
ルの炭酸塩緩衝液、ＰＨ９，５に対して透析して、この
ＰＨにおいてトキソイドをモ衡化する。

６）２０〜４０ｕＬｌの０．５モルの炭酸塩緩衝液、ｐ
Ｈ９，５を透析したβｈＣＧ溶液に添加してｐＨを９．
５にする。ｐ）Ｉの増分を注意して監視する。

７）βｈＣＧおよびＴＴ溶液の両者がいったんｐＨ９，
５になったとき、それらを−緒に混合し、そして室温（
２５〜３０℃）において一定の攪拌のもとに２〜３時間
放置する。

８）０．１ｍｌの新しくつくったホウ水素化ナトリウム
溶液（４ｍｇ／ｍｌの蒸留水）をβｈｃＧおよびＴＴの
反応混合物の１ｍｌにつき添加する。この反応を４１℃
で２時間実施する。

９）この−元した反応混合物をリン＃塩緩衝液化生理的
食塩水（０、Ｏ１モル、ＰＨ７，２゜０．９％のＮ−ａ
ｃｌ）に対して４℃で一夜２回交換して透析する。

１０）この反応混合物をセファクリル（Ｓｅｐｈａｃ　
ｒｙ　ｌ＠）Ｓ−３００を充填したカラムチ分画する。

０．２モルのリン酸ｋＭ緩衝液、ｐＨ７、２，０、１５
モ／Ｉ／（７）Ｎ　ａＣｌで溶離を実施する。２ｍｌの
分画を集め、蛋白質の存在について監視する。高分子量
の範囲においてＴＴおよびβｈＣＧの両者を含有するベ
ークをプールする。

この方法により得られる接合体は、Ｓ−３００カラム（
８５Ｘ２．５ｃｍ）に流すと、異なる時点でつくったと
き、同様な蛋白質のプロフィルを示し、そして免疫学的
に同一量の存在する成分を有する。

（ｉ　ｉ）麿倉Ω互ｙ旦旦Ｂ Ｘ菖鍔二 １）１５ｍｇのβｈＣＧを０．９ｍｌの０．１モルのリ
ン酸塩緩衝化生理的食塩水、ＰＨ６，９中に溶解する。

２）６．６ｍｇのスクシニミジル４−　（Ｎ−’レイミ
ド°メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（
ＳＭＣＣ）を、１ｍｌのジメチルホルムアミド中に溶解
して２０ミリモルの濃度の溶液を生成する。　１ｏｏ、
ｔのこのＳＭＣＣ溶液を滴々添加し、その間βｈＣＧ溶
液を振盪する。この反応を室温（２５−３０℃）におい
て６０分間進行させる。

３）ＳＭＣＣを含むβｈＣＧ溶液をセファデックス（Ｓ
ｅｐｈ＆ｄｅＸ・）Ｇ−２５カラム（２ＯＸ１．５Ｃｍ
）（０，１モルのリン酸塩緩衝化生理的食塩水、ｐＨ６
，９および５ミリモルのエチレンジアミ四酢５（ＥＤＴ
Ａ）で平衡化した）に装入し、そして完全に窒素でガス
化する。活性化βｈＣＧを含有する第１ピークをプール
し、そして直ちに凍結する。

４）０．５　　ＰＢＳ　　０．１モル、ｐＨ６、０中に
含有される９、８ｍｇ（蛋白質含量）精製破傷風トキソ
イドに、１００μｍの５０ミリモルのメルカプトエタノ
ールを添加し、そしてこののを３７°Ｃで４５分間実施
する。

５）メルカプトエタノール処理ＴＴをセファデックス（
Ｓｅｐｈａｄｅｘ・）Ｇ−２５カラム（２０Ｘ１．５ｃ
ｍ）［酢酸ナトリウム緩衝化生理的食塩水０．０１モル
、ｐＨ４，７（５ミリモルのＥＤＴＡを含有する）で平
衡化されている］に装入し、そして窒素でよくガス化す
る。

６）次いで、メルカプトエタノールで尻した１丁および
ＳＭＣＣを含むβｈＣＧを混合し、冷蔵庫（４℃）内に
３６〜４８時間放置する。

７）この接合体を最後にセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ・）Ｓ−３００カラム（８５Ｘ２゜５ｃｍ）で、リ
ン酸塩緩衝液０．２モルｐＨ７。

２および０．１５モルのい塩化ナトリウムを使用して分
画化する。２ｍｌの分画を集め、そして蛋白質のピーク
をβｈＣＧおよびＴＴについてい検査する。βｈＣＧお
よびＴＴの両者を有する高分子量のピークをプールする
。

初期のモル比：βｏＬＨ＋βｈＣＧ：ＴＴ１７：１ １６ｍｇ　：　６ｍｇ １、等しい比率で混合した１　６ｍｇのβｏＬＨおよび
βｈＣＧを、塩化ナトリウム（０，１モル）と−緒にリ
ン酸ナトリウム緩衝液（０，１モル、ｐＨ７，５）中に
溶解する。

２、ｉ）エタノール中に溶解した５ＰＤＰをゴナドトロ
ピン溶液に添加して、ゴナドトロピンの１モルにつき２
．５モルの最Ｍｅ度を生成する。

この混合物を２５分間室温において反応させる。

ｉｉ）エタノール中に溶解した２００モルの５ＰＤＰを
Ｆａ、湯風トキソイド（６ｍｇのリン酸塩緩衝液０．１
モル、ｐＨ７，５、ＮａＣ１０゜１モル）の１モルにつ
き混合し、そしてこの混合物を室温において一定のおだ
やかな攪拌の下に２時間反応させる。

３、活性化ゴナドトロピンおよびＴＴ含有過剰の５ＰＤ
Ｐの両者を、セファデックス（Ｓｅｐｈａ　ｄ、ｅ　ｘ
・）Ｇ−２５カラム（２０Ｘ１．５ｃｍ）に通して試薬
を除去する。リン酸ナトリウム緩衝液（０，１モル、ｐ
Ｈ７，５、塩化ナトリウム０．１モル）で平衡化したカ
ラムにゴナドトロピンを通す、これに対して破傷風トキ
ソイドは酢酸ナトリウム緩衝液（０，１モル、ｐＨ４，
５、塩化ナトリウム０．１モル）で平衡化したカラムに
通す。

４、ＴＴをジチオ−スレイトールを５０ミリモルの最終
濃度の添加することにより還元する。この反応は酢酸緩
衝液ｐＨ４，５，０，１モル、塩化ナトリウム０．１モ
ル中で室温において３０分間実施する。

５．３０分後、還元されたＴＴをセファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ・）Ｇ−２５カラム（リン酸塩緩衝液、０
．１モル、ｐＨ７，５、塩化ナトリウム、０．１モルで
平衡化した）に通過させることによって、過剰の還元剤
およびピリジン２−千オンから分離する。

６．２−ピリジルジサルファイドが導入されているゴナ
ドトロピンを還元されたＴＴと混合し。

そしてこの混合物を４℃に４８時間放置する。

この反応を分光光度測定的に監視するため、２成分の混
合直後および反応の完結後にアリコートを取り、そして
吸収を３４３ｎｍにおいて読む。

（３４３ｎｍにおけるピリジン２−チオンのモル吸光係
数＝８．０８Ｘ１０３モル−’ｃｍ−’）。

開放されるピリジン２−千オンの濃度は、破傷風トキソ
イドに結合したゴナドトロピンのサブユニットの数に等
しい。

７、この接合体を、他の方法において詳述したように、
セフ７クリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ・）Ｓ−３００カラ
ムのクロマトグラフィーにかける。

αｏＬＨおよびβｈＣＧを、ｌＯミリモルのナトリウム
アジドを含有する酢酸ナトリウム緩衝液０．５モル、ｐ
Ｈ６，０中で２：ｌの比で混合した。このサブユニット
を含有する溶液を、室温（２５℃）において１５〜１８
時間一定のおだやかな攪拌のもとに保持する。

アニリーングの効率を監視するために、この混合物のア
リコー）　（ｌｏＩＬｌ）を開始峙に取り。

そして１ｍｌの４０１Ｌ１（７）８−アニリノ−１−ナ
フタレンスルホン酸、マグネシウム４（ＡＮＳ）と混合
し、そして蛍光を次の波長において測定する： （Ｅｘｃ）励起波長　３６０ｎｍ （Ｅｍｍ）放射波長　４８０ｎｍ 解離したサブユニットでは蛍光は得られないが、会合し
たホルモンでは得られる。

蛍光を精確に同様な方法で４時間の間隔で７リコートを
、蛍光の増加が記録されなくなるまで。

を取ることによって観測する。いったん蛍光が安定化す
ると、最高の７ニリーングが達成される。

次いで、アニリーングされた物質をセファデックス（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ・）Ｇ−７５カラムに通過させ、そして
高分子量の蛋白質のピークを集め、そしてゴナドトロピ
ンの活性について検査する。

使用する溶離用緩衝液は、０．１５モルの塩化ナトリウ
ンムを含有するリン酸塩緩衝液０．２モル、ｐＨ７，２
である。

所望の担体への７ニリーングした複合体の接合は、既知
の方法で実施することができる。とくに、アニリーング
した生成物を破傷風トキソイドへ、βｈＣＧと同一の方
法で、５ＰＤＰを使用して接合する。

βｈＣＧとコレラ毒素Ｂ−釦との接合 １．１．０ｍｌの蒸留水中の１０．５ｍｇのβｈＣＧを
、蒸留水中の０．１モルのメタ化ヨウ素酸ナトリウムの
０．６ｍｌで、４℃において１７時間時々攪拌しながら
処理した。

２、この混合物を１．０ミリモルの酢酸ナトリウム、ｐ
Ｈ４，４に対して４℃において透析した。６時間の間隔
で５００ｍ１の酢酸ナトリウムアジドを使用して３回交
換を行った。

３、この混合物のｐＨを０．０２ｍ１の０．２モルの炭
酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム、ＰＨ９，５の添加に
より９　、０−９　、５に上昇させた。

４．１ｍｌの０．０１モルの炭酸ナトリウム／重炭酸ナ
トリウム、ｐＨ９，５中の３．４２２ｍｇのコレラ毒素
Ｂ−ｆｆｉを直ちに上の混合物に水浴中で添加し、攪拌
し、そして４℃に１７時間保持した。

５、次いで、この反応混合物に０．１ｍｌの新しく調製
したホウ木素化ナトリウム（蒸留水中４ｍ　ｇ　／　ｍ
　ｌ　）を添加し、４℃に２時間保持した。

６．２．５ｍｌのロフトで接合した物質を接合しない物
質から、セファロース（Ｓｅｐｈａｒ。

ｓｅ・）６−Ｂカラム（４２Ｘ１．５ｃｍ）により分離
した。

接合した物質をカラムの空隙体積中で溶離した。ピーク
の下降する半分は未分割の成分を示した。いくつかの分
画をプールし、そして同一カラムで再度クロマトグラフ
ィーにかけた。プールした分画の再クロマトグラフィー
は均質な対称のピークを与えた。

典型的な調製物において、空隙体積中で溶離された物質
はすべての３つのピークにおいて溶離された合計の物質
の約５１％であった。再クロマトグラフィーにかけると
、回収された精ｔＪＣＨＢ−βｈＣＧ接合体は合計の物
質の３６％の程度であった。

受精能力が証明された雌のボンネットサル（ｂｏｎｎｅ
ｔ　　ｍｏｎｋｅｙ）ＣマカカＯラジアタ（Ｍａｃａｃ
ａ　　ｒａｄｉａｔａ）］　　（子を支持するかあるい
は供給時に乳汁分泌する）を、β０ＬＨ−ＴＴ、βｏＬ
Ｈ−ＴＴ−βｈＣＧ、βｈｃＧ−ＴＴ＋βｏＬＨ−ＴＴ
、（ｃ　ｏ　ＬＨ、βｈｃＧ）−ＴＴ　（すべて明ばん
上に吸収されている）で免疫化した。１月の間隔で５０
ｇｇのゴナドトロピン当量を含有する３回の注射を対何
の部位において筋肉内に与えた。第１回の注射において
、わずかに１ｍｇの５ＰＤＰを添加する。低い力価をも
つ動物にそれぞれの抗原で第１４５日に促進注射を無毒
の代謝可鋤な脂質乳濁液、レイラス（Ｌｅ　ｉ　ｒａＳ
）基本アジュバント［レイラ・フタマキ（Ｌｅ　ｉ　ｒ
ａ　　Ｈｕｈｔ　ａｍａｋｉ）、ｙインランド、ツルク
］と一緒にを与えた。

体重２００〜３００ｇの成体の雌のラットを、（αｏＬ
Ｈ，βｈＣＧ）　−ＴＴおよびβｈＣＧ−ＴＴ接合体（
１０ｐｇのゴナドトロピン）でまた免疫化した。第１回
の注射を明ばん上への吸収後に５ＰＤＰで与え、次いで
明ばんのみで行った。

血清を間隔を置いて集め、そして−２０℃において使用
するまで貯蔵した。抗血清のｈＣＧ結合容量は、ジャス
トリ（ＳｈａＳｔｒｉ）ら、コントラセプシ鵞ン（Ｃｏ
ｎｔ　ｒａｃｅｐｔ　１ｏｎ）１８．２３（１９７８）
に記載される方法で決定した。

βｏＬＨを担体の破傷風トキソイド（ＴＴ）との接合体
として注射すると、フロイント完全アジュバント（ＦＣ
Ａ）を使用しないで、抗体の応答がサルにおいてβｏＬ
Ｈで発生した。第１図は明ばん上に吸着されたβｏＬＨ
−ＴＴの５０ｙＬｇで免疫化した５匹のボンネットサル
における応答の動力学を与え、１ｍｇの解毒した非バイ
ロゲンの５ＰＬＰＳを第１回の注射で加えた。５匹のサ
ルのうち３匹は、ｈＣＧ結合容量として表わして、２０
０〜３２０ｎｇ／ｍｌの力価を有した。

広範な既知の研究は、βｏＬＨで免疫化したサルの血清
のそれぞれｈＬＩ（およびｈＣＧの事実上の同一性を示
した。２匹のサルは比較的低い応答体であり、ここで１
次免疫化は４０〜６０　ｎ　ｇ　／　ｍｌの最適な力価
への上昇を与えた。これらに第４回の促進注射を第１４
５日に与え、これは力価をそれぞれ６０ｎｇ／ｍｌおよ
び９００ｎｇ／ｍｌに増加させた。

しかしながら、βｏＬＨおよびβｈＣＧを共通の担体の
ＴＴへ付加して混合接合体のβｏＬＨ−ＴＴ−βｈＣＧ
を形成したものを使用して免疫化を実施したとき、かな
り改良された抗体応答が達成された。同一投与量の抗原
（５０ＪＬｇの当量のゴナドトロピン）の注射は、７５
０〜１３００ｎｇ／ｍＩのピークの力価を３匹のサルに
与えた（第２図）、この応答は２匹のサルにおいてほぼ
１年間維持されかつｌ１００ｎ／ｍ１以上であった。６
０ｎｇ／ｍｌの抗ｈＣＧ力価が効能のカットオフ点（ｃ
ｕｔ　　ｏｆｆ　　ｐａｉｎｔ）であると仮定すると、
混合した接合体を用いる累積抗体応答は、共通の投与量
および免疫化のスケジュールを用いると、同一の担体上
のβｏＬＨを使用したときより約１３倍高かった。この
応答が出現する期間は、βｈＣＧ−ＴＴの場合よりも、
βｏＬＨ−ＴＴ−βｈＣＧの場合において２倍長かった
。同一の投与量および時間のスケジュールに従いβｈＣ
Ｇ−ＴＴで免疫化したサルは、３回の１次注射後、７〜
５００ｎｇ／ｍｌの範囲のピーク力価を生成し、第４回
の促進注射は力価を７０〜８００ｎｇ／ｍｌに上昇させ
た０番号９３のサルは、免疫化後下痢のために、第１７
１日に死んだ、剖検は免疫化に関連する病気を立証しな
かった。

混合配合物は共通の担体へ付加された２つのタイプのサ
ブユニット（βｏＬＨ−ＴＴ−βｈＣＧ）から成ること
ができるが、別法として、それらの１つを個々の担体へ
結合しそして物理的混合物（βｏＬＨ−ＴＴおよびβｈ
ＣＧ−ＴＴ）として使用することができるであろう、第
４図は実験の結果を要約し、ここで２５μｇのβｏＬＨ
−ＴＴおよびβｈＣＧ−ＴＴの各々をサルに与えた。

サル１１０および１１１の２匹は、それぞれ３２００　
ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌおよび３５００ｎｇ／ｍｌのピーク
力価を有した。抗体の特性はβｏＬＨ−ＴＴ−βｈＣＧ
により発生されたものに類似した。

第６図は、（αｏＬＨ，βｈＣＧ）−ＴＴ接合体で免疫
化した５匹のサルの群における抗体力価を記載する。５
匹のサルのうち３匹は高い抗体の力価を生成した（　１
５００　ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌ　〜５２００ｎｇ／ｍｌ）
、抗体は第１回の注射後第３３日に出現しはじめ、第７
５日で最高に到達し、次いである水準に傾斜し、この水
準は５〜１０月の間多少維持された。同様な注射のスケ
ジュールおよび同等の投’Ｊ４１を用いると、既知のワ
クチンβｈｃＧ−ＴＴを用いる抗体の応答は明確に低か
った（第３図）、抗体力価の潜在的期間は４５日であっ
た。３回の１次の注射（ｐｒｉｍａｒｙ　　１ｎｊｅｃ
ｔｉｏｎ）に到達した力価は７〜５００ｎｇ／ｍｌであ
り、減少する傾向はかなり急速であり、第１４５日に追
加の促進注射を必要とした。第４回の注射後の抗体力価
は７０ｎｇ／ｍｌ〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲であった。

こうして。

接合体中のｏＬＨヘアニリーングしたβｈＣＧの使用は
、無毒のアジュバントを使用して、免疫の応答の水準を
上昇する上で明確に有益である。妊娠に対する保護の正
常の限界が６０ｎｇ／ｍｌのｈＣＧ結合容量であると仮
定すると、２種類の処方についてのすぐれた応答体にお
けるこの水準を越える抗体の応答およびそれが続く期間
を表１ａに記載する。６０ｎｇ／ｍｌの限界値に固定す
ることは仮の基準であることを指摘することができる。

なぜなら１種々の処方を用いる試験下のコロニー中の大
部分のサルは５０　ｎ　ｇ　／　ｍ　１以下の力価で妊
娠するようになったからである。しかしながら、無妊娠
を維持するために１４０ｎｇ／ｍ１以上の力価を必要と
した場合がわずかに存在した。抗ｈＣＧ抗体とサル絨毛
膜ゴナドトロピン（ｍＣＧ）との交差反応性の程度は、
低く、抗体をレイズ（ｒａｉｓｅ）させる決定因子に依
存して動物毎に変化した。

７）２回の注射の養生法を６週の間隔で与えた。第１回
の注射後、（αｏＬＨ，βｈＣＧ）−ＴＴで免疫化した
６匹のラットのうち５匹は循環する抗体を有した（６〜
７２０ｎｇ／ｍｌ）が。

βｈＣＧ−ＴＴで免疫化したものにおいて、わずかに２
匹のみが抗体を有した（２〜５１　ｇ　／　ｍｌ）、第
２回の注射後、βｈＣＧ−ＴＴで免疫化した６匹のラッ
トのうち５匹は第６４日に３ｎｇ／ｍｍ１−１３０ｎ／
ｍｌの範囲の抗体の力価を有した。他方において、（α
ｏＬＨ，βｈＣＧ）−ＴＴの場合において、６匹のラッ
トのうち６匹はこの時循環中に抗体を有し、それらの力
価は１３０　ＮＮ１８７０ｎ／ｍｌであった。

扱代０竺性ゴ旦 ｈＣＧと結合するための抗体の化合定数（Ｋａ）は、混
合接合体処方およびβｏＬＨ−ＴＴについて表２に記載
する。両者の抗原は高い親和性の抗体を誘導した。２種
類の抗原により発生した抗体と種々の黄体形成ホルモン
との交差反応性を表３に記載する。ｈＦｓｌ（およびｈ
ＴＳＨとの交差反応性はいずれの場合においてもａ測さ
れなかった０両者の処方はｈＣＧおよびｈＬＨと反応す
る抗体を産生した。βｏＬＨ−ＴＴが発生したある血清
はｈＣＧおよびｈＬＨとほぼ同程度に交差反応し、βｏ
ＬＨ−ＴＴ−βｈＣＧが発生したものはｈＣＧとわずか
に大きい交差反応性を有した。

新規な組成物（（Ｘ　ＯＬＨ、βｈＣＧ）　−ＴＴが誘
導した抗体の会合定数（Ｋ　ａ）は、ｈＣＧとの結合に
ついてｌＸ１０９〜２Ｘ１０１０モル−１であった（表
２ａ）、会合したサブユニットとしてαｏＬＨの存在は
、ヒト胸腺刺激ホルモンｈＴＳＨおよび卵胞刺激ホルモ
ン（ｈＦＳＨ）に対する交差反応性抗体に導かなかった
（表３ａ）、ヒトＭ体形成ホルモン（ｈＬＨ）との交差
反応性は、４４〜８０％程度であった（表３ａ）、最近
の研究は、超高免疫化の５年後、ＬＨと交差反応性の抗
体の危険の欠如を立証した。ＬＨとの交差反応性は、事
実有益であり、そして受精の調節に寄与した。［サラ（
Ｔｈａｕ）、Ｒ，Ｂ、、サンダラム（Ｓｕｎｄａｒａｍ
）、に、、ソーントン（Ｔｈｏｒｎｔ　ｏｎ）　、Ｙ、
Ｓ、およびセイドマン（Ｓｅｉｃｉｍａｎ）、Ｌ、Ｓ、
（１９７９）°“ファーティリティ・アンド書ステリテ
ィ　（Ｆｅｒｔｉｌ、ａｎｄ　　５ｔｒｅｒｉｌ）、３
１゜２００−２０４３　。

幻−１１ 免疫化されたサルを雄と連続的の交尾させた。

これらの処方の抗受精作用および妊娠を防止する力価を
表４に記載する。しかしながら１表５に示す動物は、抗
原の力価が低かったとき、妊娠するようになった。

βｏＬＨ−ＴＴ−βｈｃＧｆ免疫化したサル９２および
９４を、受精能力が証明された雄と、それぞれ７および
５回交尾させた。これらのうち６および３サイクルはプ
ロゲステロン推定により排卵したことが確証された。こ
のコロニーにおいて、雄とともにボンネット雌サルを連
続的にかごに入れると、動物の７０％は第１月に妊娠し
、そして残りの３０％は引続く月において妊娠した。

これらの免疫化したサルは、こうして明らかに妊娠する
ようになることから保護された。この期間の間の抗体の
力価は、これらのサルにおいて８０〜８００ｎｇ／ｍｌ
の範囲であった。サルＮｏ。

８８および８９は、抗体力価がそれぞれ３５および４ｎ
ｇ／ｍｌであったとき、妊娠するようになった。これら
の観察は、受精能力が低い抗体力価で霊長類において回
復されることがＮ１察される他のものおよびわれわれ自
身のものと一致した。

βｏＬＨ−ＴＴで免疫化した動物において、サルＮｏ、
１０６を６回交尾させ、そしてすべての６サイクルは排
卵した。雌ははらまなかった。このサルにおいて存在す
る抗体力価は６０〜２００ｎｇ／ｍａであった。サルＮ
ｏ、ＬＯ４は、抗体力価が１２０〜１５０ｎｇ／ｍｌで
あった期間の間に実施した３回の交尾において保護され
た。サルＮｏ、１０５．１０７および１０８は、抗体力
価がそれぞれ１２０．３０およびｌＯｎｇ／ｍｌであっ
た時点において妊娠するようになった。記載する力価は
ｈＣＧに対してであり、ボンネットＣＧとのそれらの交
差反応性は未知であることを述べることができる。抗ｈ
ＣＧ抗体と霊長類ＣＧとの交差反応性は通常低い桁であ
る：ヒヒにおいて、それは２〜１０％であると記載され
た。霊長類において、動物毎の妊娠の間に産生されるＣ
Ｇの量の広い変動は、また、報告された（１０〜５０Ｉ
Ｕ／ｍｌ）。

本発明のより免疫原性の接合体（αｏＬＨ，βｈＣＧ）
−ＴＴを使用する免疫化は、常態で排卵を保持した５匹
のサルのうち４匹のサルにおける生殖機能を混乱させな
かった。サルＮ’ｏ、１０２は排卵抑止サイクルを発現
した。しかしながら。

それは免疫化に関連しないことを示す低い抗体力価を有
した。かごに入れられたままのいく匹かの未処置のサル
は、排卵抑止性となった。最初に生殖能力をもつことが
証明されたサルのうち２匹（Ｎｏ、９６および１０１）
は、コロニーにおいて子孫をつくる雄との反復交尾（６
および３）にかかわらず妊娠するようにならなかった。

この期間の間の抗体力価は、これらのサルにおいて４０
０〜２６００ｎｇ／ｍｌの範囲であった。このコロニー
における未処置のサルの間の受精率は、それらを不連続
に（サイクルのうち９〜１４日）交尾させるかあるいは
連続的に交尾させるかに依存して５０〜７０％である。

サルＮｏ　、９９は３０ｎ　ｇ／ｍ　ｌの抗体力価にお
いて妊娠した。サルＮｏ、１００は受精能力が証明され
た雄との２回の交尾で妊娠するようにならず、この期間
の間の抗体力価は２００〜３６０ｎｇ／ｍｌであった。

抗体力価が１４０ｎｇ／ｍｌであるとき、それは妊娠す
るようになった。記載する力価はｈＣＧに対するもので
あり、ｍｃＧに対するものでない０ｍＣＧに対する力価
はボンネットサルＣＧの入手不可能性のために決定する
ことができなかった。

器官、代謝機能および組織自己抗体 すべての接合体はよく許容された０局所的反応は注射部
位において認められた。急性および亜急性の毒素学の研
究は副作用を明らかにしなかった６代謝機能および器官
の機能における有意の異常性は、１５か月間にわたる３
か月の間隔で決定した血液学および臨床化学のパラメー
ターにおいて観測されなかった。抗体は平滑筋、壁細胞
、甲状腺、ミクロソーム、甲状腺グロブリン、杭抜因子
、抗ミトコンドリア、抗ＤＮＡ、Ｃ−反応性蛋白質、リ
ウマチ様の因子および抗小島細胞の反応をもっていなか
った。

低い応答体の場合 各処方において、２〜３匹のサルは比較的低い応答体で
あった。同一接合体をもちいる追加の促進注射は応答性
をある程度改良した。（第１図、第２図および第５図）
、別の担体のコレラ毒素Ｂ−鎖を利用して、このような
サルの応答性を改良できるかどうかについて明らかにし
た。第５図は、βｏＬＨ−ＴＴとβｈＣＧ−ＴＴとの物
理的混合物で免疫化した２匹のサルの結果を示す、サル
１１３および１１２において１次免疫化後のピーク力価
はそれぞれ１０ｎｇ／ｍｌおよび４５ｎｇ／ｍｌであっ
た。同一接合体を使用する第１４５日における促進は、
力価を６０　ｎ　ｇ　／　ｍ　１および２５０ｎｇ／ｍ
ｌに増加した０次いで、それらを第４３１日および第４
７９日においてコレラ毒素Ｂ−ｆｉに接合したβｈＣＧ
で免疫化し、これは力価を１３４０　ｎ　ｇ　／　ｍ　
ｌおよび２８００ｎｇ／ｍ１．ｈｃＧ結合容量に促進し
た。同様な観測をβｏＬＨ−ＴＴに対する２匹の低い応
答体について実施した。サル１０７および１０８におけ
る３回の注射後のビーク力価は６０および４０ｎｇ／　
ｍ　１であった。同一接合体を使用する第１４５日にお
ける促進は、それぞれ力価を９００ｎｇ／ｍｌおよび６
０　ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌに増加した。それらを第４３１
日および第４７９日にコレラ毒素Ｂ−釦に接合したβｈ
ＣＧで免疫化し、これは力価を４０００および２１３０
ｎｇ／ｍ１ｈｃＧ結合容量に促進した。

サルＮｏ　、９９は（αｏＬＨ，βｈＣＧ）−ＴＴに対
する低い応答体であった。担体が移動性へルバー「ＴＪ
ＭＪｉ胞の機能であろうことが与えられると、この動物
における低い力価はＴＴに対する低い応答性のためであ
りうることを仮定することができる。しかしながら、免
疫原が別の担体のコレラ毒素のＢ−鎖（ＣＨＢ）へ接合
されると、抗ｈＣＧの応答における促進が認められた。

この動物は最初の３回の１次注射後に８０ｎｇ／ｍｌの
ピーク力価を有し、同一担体をもちいる追加の促進は抗
体力価を１８０ｎｇ／ｍｌに上昇した′（第８図）、担
体としてＣＨＢを使用して免疫化すると、力価は１７０
０ｎｇ／ｍｌに到達した。同様な観測を、βｈＣＧ−Ｔ
Ｔで免疫化したサルの間の低い応答体について実施した
（第８図）。

βｏＬＨにより発生した抗体を使用する受精の調節の可
能性は、類人猿を包含する種々の動物において立証され
た。しかしながら、応用した手順はフロイントの完全ア
ジュバント（ＣＦＡ）＋７１使用を必要とした。ＣＦＡ
はヒトの使用において許容されない。この抗原に基づく
究極的な産児調節用ワクチンは、ＣＦＡを使用しないで
十分な抗体の形成に導きうるアプローチを必要とするで
あろう、βｏＬＨの破傷風トキソイド（Ｔ　Ｔ）への結
合は、簡単な許容可能なアジュバントの水酸化アルミニ
ウムでサルにおいてそれを免疫原性とした。解毒したサ
ルモネラリポ多糖のナトリウムフタリル誘導体（ＳＰＬ
ＰＳ）は、最初の注射においてのみ使用した。５ＰＬＰ
Ｓは臨床的実験において悪い作用なしに使用された［ニ
リン（Ｅ　１　ｉｎ）、Ｒ，Ｊ、、ウォルフ（Ｗｏｌｆ
ｆ）、Ｓ。

Ｍｌ、？　ツタアダム（ＭｃＡｄａｍ）、に、Ｐ。

Ｗ、Ｊ、、チェディト（Ｃｈｅｄｉｄ）、Ｌ、アラディ
バート（Ａｕｄｉｂｅｒｔ）、Ｆ、、パーナート（Ｂｅ
ｒｎａｒｄ）、Ｃ，およびオーバーリング（Ｏｂｅｒｌ
ｉｎｇ）、Ｆ、：ヒトにおける参照Ｅ、ｃｏｌｉ、エン
ドトキシンおよびその１］。抗体の応答はすぐれた応答
体においてかなり長い期間（１年にわたる）をもった、
高い力価のサルは、受精能力が証明された雄との反復交
尾の間に、妊娠に対して保護された。妊娠は低い力価で
回復した。抗体はｈＣＧおよびｈＬＨの両者と反応した
が、ｈＴＳＨおよびｈＦＳＨと反応しなかった。

ｈＣＧの糖蛋白質ホルモンは２つのサブユニットαおよ
びβで構成されている。２つのサブユニットの会合は、
雄および雌のステロイドホルモン産生細胞上の受容体に
最適に適合するコンフォメーションを発生する。解離は
刺激ステロイド生合成の効力の４００倍減少のフンフォ
メーションに導くが、ｈＣＧのβサブユニットは受容体
にそれほどよく結合せずかつホルモンの応答を刺激する
残留形態を保持する［ラマクリシュナン（Ｒａｍａｋ　
ｒ　ｉ　ｓ　ｈｎａｎ）　、Ｓ　、、ダス（Ｄａｓ）、
Ｃ，およびタルワール（Ｔａｌｗａｒ）。

Ｇ、Ｐ、（１９７８）バイオケミカル・ジャーナル（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｊｏｕｒｎａｌ）、１７６．
５９９−６０２］　、ホルモンの生物学的に有効な最適
なコンフォメーションがαサブユニットとのその会合を
生ずるだけであることは、こうして明らかである。この
コンフォメーションは、このホルモンの生物学的活性を
中和するという最適な効力をもつ抗体を誘発するために
重要である。

βｈＣＧのαｏＬＨへの７ニリーングという考えは、組
織の受容体中へ最適に適合するコンフォメーションを発
生するということであり、これはホルモン−標的組織と
の相互作用を妨害するコンフォメーションの抗体を有望
に誘発できた。同一種のαサブユニットはｈＦＳＨおよ
びｈＴＳＨ（それらの両者は共通のαサブユニットを含
有する）と交差反応性の抗体を誘発することに導いての
で推奨されなかった。他方において、ｏＬＨのαサブユ
ニー／　）はヒトホルモンに対する交差反応性の抗体を
与えなかった。驚くべきことには、βｈＣＧをαｏＬＨ
に７ニリーングすると、ヒトホルモンサブユニットの同
一種の組み合わせよりも２倍高い受容体結合効力および
３倍高いステロイド生合成能力を生ずる。

（ＱＯＬＨ，βｈＣＧ）−ＴＴは、ネズミ（ｒｏｄｅｎ
ｔ）およびボンネットサルの両者においてβｈＣＧ−Ｔ
Ｔよりも明確にすぐれた免疫原である。新規な接合体組
成物の使用により抗ｈＣＧビーク力価の増分（幾何平均
）は、ネズミおよびサルにおいてそれぞれ１８倍および
１０倍程度であった。これは、制限された受精１莞力の
研究により判定して、妊娠に対する保護のために適切で
あると思われる。ｈＣＧの分泌は、生体外受精卵への最
近の報告により示されるように、移植前の期間において
開始する。受精後２１６時間に胚により分泌されたｈＣ
Ｇは、移植前の段階で遮断を実施した場合、３．８ｍＩ
　Ｕ／ｍ　ｌであり、０．４ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌのｈＣ
Ｇ結合容量を必要とした。移植後の早い段階において、
ＬＭＰ後４−４．５週で特異的βｈＣＧ放射免疫アッセ
イにより決定したｈＣＧは３５３±８９ｍＩＵ／ｍｌで
あると報告され、３５〜６０ｎｇ／ｍｌの抗ｈＣＧ抗体
を必要とする。（αｏＬＨ，βｈＣＧ）−ＴＴで免疫化
しかつ高い抗体力価を有するサルは、３０〜１４０ｎｇ
／ｍｌ−の抗ｈＣＧ抗体に規定される受精能力をもつ排
卵を保持した。ｈＣＧ抗体の霊長類ＣＧとの低い交差反
応性に注意すべきである。

混合担体の使用は、所定の担体に対して劣った応答体で
ある患者において優れた応答を発生する上で１１益であ
る。ＣＨＢはＴＴに対して優れた補助因子である。他の
担体１例えば、Ｂ型肝炎およびＰ、７ｒルシパルム（ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）の種虫外皮蛋白質（ｓｐｏｒｏｚ
ｏｉｔｅ　　ｃ。

ａｔ　　ｐｒｏｔｅｉｎ）は、また、有益であると信じ
られる。免疫予防の潜在性をもつ担体の使用は、βｈＣ
Ｇ−ＴＴワクチンの設計における本来の概念に従い、こ
こで生殖ホルモンに対する応答を免疫要望の利益と整合
されるための試みがなされる。

受精に対する免疫化は、また、表６に示すように担体、
例えば、βｈＣＧに結合した担体として、あるいは担体
１例えば、破傷風トキソイドと一緒に使用して、精子抗
原（例えば、ＬＤＨ−Ｃａ）を包含する多価ワクチンで
あることもできる。表６は、βｈＣＧへ結合したＬＤＨ
−Ｃ４のワクチンで免疫化したときの、雌のマウスにお
ける受精能力の減少を示す。

゛・１１、 表　　１　　： 平均士ＳＥＭ　　　　　　　　１００８±３００　　２
２±７平均士ＳＥＮ　　　　　　　１３７Ｂ６±４２６
９　４３±７表１α： ８４　　βｈＣＧ−ＴＴ　　　４　　　３８５０　　３
０平均±ＳＥＮ　　　　　　　　　　　５５９０±２８
５　２７±１平均士ＳＥＮ　　　　　　　　　　２６７
５２±６０７８４６±５表２： ８８　　　βｏＬＨ−ＴＴ−βｈＣＧ　　　　７．０８
９　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０９２
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２６．９１０４
　　　　βｏＬＨ−ＴＴ　　　　　　　３１．０１０５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２．８１０６
　　　　　　　　　　　　　　　　　　９．０１０７　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．３免疫化の
開始後１８２日または２００日に血清を分析した。

表２α： ９６　　　　　　　　　　　　２．０ ９９　　　　　　　　　　　　　１．１１００　　　　
　　　　　　　１２．８１０１　　　　　　　　　　　
２０．８１０２　　　　　　　　　　　　７．７免疫化
開始後２００日に血清を分析した。

表３： 抗ゴナドトロピンの血清とｈＬＨ，ＦＳＩＩおよびｈＴ
ｓＨとの反応性 サル １０５　　βｏＬＨ−ＴＴ　　　１９　　１ｓ　　　’
ｏ　　　。

会針の計数 表３ＩＬ： αｏＬＨ，βｈＣＧ−ＴＴにより産生じた抗んＣＧ−サ
ル 平均±ＳＥＮ　　　　　３６±７２２±５　０　　０１
次免疫化後６７日のブリードを試験した。放射性ヨード
化ホルモンとの直接結合性は、１：２００の最終希釈の
血清試料を用いて決定した。

表４： 妊娠を防１ヒする抗ｈＣＧ力価 ９２　βんＣＧ−ＴＴ−βＤＬＲ６８０−６００９４β
ｈｃＧ−ＴＴ−βｏＬＨ５１１０−８００９６（αｏＬ
Ｈ，βｈｃＧＩ−ＴＴ　　６　　４００−２６００１０
１　（αｏＬＨ，βｈＣＧ）−ＴＴ　　３　　６５０−
９００表５： 妊娠を防止しない抗ｈＣＧ力価 ８８　βｈＣＧ−ＴＴ−βｏＬＨ３５ ８９βｈＣＧ−ＴＴ−βｏＬＨ５ ９９（αｏＬＨ，βｈＣＧ）−ＴＴ　　　　　　３０１
００　　（αｏＬＨ，βんＣＧ）−ＴＴ　　　　　　１
４０１１０　βんＣＧ−ＴＴ＋βｏＬＨ−ＴＴ　　　　
　４５１１１　βｈｃＧ−ＴＴ＋βｏＬＨ−ＴＴ　　　
１１０１１３　βｈＣＧ−ＴＴ＋βｏＬＨ−ＴＴ　　　
　　５表　６　　： ネ受性能力が明らかにされた非免疫化相手との交尾。

【図面の簡単な説明】

第１図は、βｏＬＨ−ＴＴで免疫化した５匹ボンネット
サル（ｂｏｎｎｅｔ　　ｍｏｎｋｙ）における抗体の応
答を示し、解毒したサルモネラリポ多糖のナトリウムフ
タリル誘導体（ＳＰＬＰＳ）は第１回の注射のみで加え
た０時間の目盛に沿った矢印は注射をした時を示す。 第２図は、βｏＬＨ−ＴＴ−βｈＣＧ混合接合体で免疫
化した５匹のボンネットサルにおける抗体の応答を示す
。 第３図は、βｈＣＧ−ＴＴで免疫化した５匹のボンネッ
トサルにおける抗体の応答を示す、すべてのサルには第
４の促進注射をした。 第４図は、βｏＬＨ−ＴＴ＋βｈＣＧ−ＴＴの物理的混
合物、すなわち、βｏＬＨ−ＴＴとβｈＣＧ−ＴＴとの
等しい混合物（ゴナドトロピンのサブユニットに基づく
）で免疫化した５匹のボンネットサルにおける抗体の応
答を示す。 第５図は、βｈＣＧ−ＴＴ＋βｏＬＨ−ＴＴ（サルの番
号１１２．１１３）またはβｏＬＨ−ＴＴ（サルの番号
ＩＱ７−１０８）に対して低い応答体であったボンネッ
トサルにおける抗体の応答への、変更した担体を用いる
免疫化の効果を示す、コレラ毒素Ｂ−鎖に結合した５０
．ｇのβｈＣＧを第４３１および４７９日に注射した。 第６図は、（ａ　ｏ　ＬＨ、βｈＣＧ）−ＴＴアニリー
ングした複合接合体で免疫化した５匹のボンネットサル
における応答を示す。 第７図は、（ａｏＬＨ，βｈＣＧ）−ＴＴまたはβｈＣ
Ｇ−ＴＴで免疫化した後のラットにおける抗体の応答を
示す、動物に２回の注射（１０゜ｇのゴナドトロピン）
を第０および４１日にした。免疫化の開始後第４１．５
０および６４日に力価を決定した０点は個々の力価を与
え、そして棒は幾何平均を与える。 第８図は、担体としてＴＴで低い力価を抗体を生成する
サルにおいて、担体としてコレラ毒素Ｂ−３１（ＣＨＢ
）を用いるサルの免疫化の効果を示す、サル８２はβｈ
ＣＧ−ＴＴで、後にβｈＣＧ−ＣＨＢで免疫化し、サル
９９は初め（αｏＬＨ０βｈＣＧ）−ＴＴで、後にＣＨ
Ｂに結合したαｏＬＨ，βｈＣＧで免疫化した。 第９図は、ＬＤＨＣａ−βｈＣＧ−ＴＴ接合体で免疫化
した５匹のボンネットサルにおける抗ｈＣＧの応答を示
す、矢印は隔月で与えた３つの一次の注射および引続く
第１５８日における促進薬の注射を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程 （ａ）生殖系の少なくとも２種の別々の抗原を準備し、
   第１はｈＣＧのβサブユニットの調製物でありそして第
   ２は精子抗原の調製物であるかまたはＬＨの異種の種の
   αサブユニットまたはβサブユニットの調製物であり、 （ｂ）少なくとも１種の患者適合性の担体の免疫学的に
   純粋な調製物を準備し、 （ｃ）工程（ａ）の少なくとも２種の抗原を工程（ｂ）
   の少なくとも１種の担体と接合し、前記接合は、 （ｉ）同一担体部分へ結合した少なくとも２種の別々の
   抗原の複合接合体を形成すること、（ｉｉ）各々が少な
   くとも１種の担体へ結合した少なくとも２種の別々の抗
   原の接合体の物理的混合物を形成すること、 （ｉｉｉ）ｈＣＧのβサブユニットおよび異種の種のα
   サブユニットである少なくとも２種の別々の抗原を会合
   してアニーリングした複合体を形成し、引続いてアリニ
   ーリングした複合体を担体と接合すること、および （ｉｖ）少なくとも１種の精子抗原および少なくとも１
   種の担体の両者へ結合した少なくとも１種の抗原の多価
   接合体を形成すること、および （ｖ）１種より多い担体が存在する場合、前記担体へ結
   合した前記抗原の１種の接合体を形成すること、 より成る群から選択される工程の少なくとも１つを実施
   することによって実施し、 そして、必要に応じて、 （ｄ）上記の工程（ｉ）〜（ｖ）からの２種以上の接合
   体の生成物を組み合わせる、 からなることを特徴とする多価ワクチンを調製する方法
   。 ２、工程（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖ）において、前記
   βｈＣＧは異種の種のαサブユニットとアニリーングし
   た複合体として存在する特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３、前記抗原の１種は精子抗原である特許請求の範囲第
   １または２項記載の方法。 ４、１種より多い患者適合性の担体を使用する特許請求
   の範囲第１、２または３項記載の方法。 ５、少なくとも２種の別々の抗原はホルモンのサブユニ
   ットまたはその断片である特許請求の範囲第１、２また
   は３項記載の方法。 ６、前記少なくとも２種の別々の抗原はβｏＬＨおよび
   βｈＣＧである特許請求の範囲第１、２または３項記載
   の方法。 ７、２種の患者適合性の担体が存在する特許請求の範囲
   第１、２または３項記載の方法。 ８、前記患者適合性の担体は、破傷風トキソイド、コレ
   ラ毒素Ｂ−鎖、Ｂ型肝炎表面蛋白質、マラリア蛋白質、
   ジフテリアトキソイドおよび￥Ｐ．￥￥ファルシパルム
   ￥（￥ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ￥）の種虫外皮蛋白質から
   成る群より選択される１種または２種以上の構成員であ
   る特許請求の範囲第１、２または３項記載の方法。 ９、破傷風トキソイドおよびコレラ毒素Ｂ−鎖が担体と
   して存在する特許請求の範囲第１、２または３項記載の
   方法。 １０、前記多価ワクチンを明ばん、解毒したサルモネラ
   リポ多糖のナトリウムフタリル誘導体（ＳＰＬＰＳ）お
   よび６−Ｏ−ジパルミトイル−グリセリル−スクシニル
   （ＭＤＰ）から成る群より選択されるアジュバントと混
   合する特許請求の範囲第１、２または３項記載の方法。 １１、工程 （ａ）生殖系の少なくとも２種の別々の抗原を準備し、
   第１はβサブユニットｈＣＧの調製物であり、そして第
   ２は精子抗原の調整物であるかまたはＬＨの異種の種の
   αサブユニットまたはβサブユニットの調製物であり、 （ｂ）少なくとも２種の患者適合性の担体の免疫学的に
   純粋な調製物を準備し、 （ｃ）工程（ａ）の少なくとも２種の抗原を工程（ｂ）
   の少なくとも１種の担体と接合し、前記接合は、 （ｉ）同一担体部分へ結合した少なくともの２種の別々
   抗原の複合接合体を形成すること、（ｉｉ）少なくとも
   １種の前記担体へ別々に結合した少なくとも２種の別々
   の抗原の複合体の物理的混合物を形成すること、 （ｉｉｉ）ｈＣＧのβサブユニットおよび前記異種の種
   のαサブユニットである少なくとも２種の別々の抗原を
   会合させてアニーリングした複合体を形成し、引続いて
   アリニーリングした接合体を前記担体の少なくとも１種
   と接合すること、および （ｉｖ）少なくとも１種の精子抗原および少なくとも１
   種の担体の両者へ結合した少なくとも１種の抗原の多価
   接合体を形成すること、および （ｖ）担体に結合した前記抗原の１種の接合体を形成す
   ること、 から成る群より選択される工程の少なくとも１つの工程
   により実施し、そして （ｄ）上記の工程（ｉ）〜（ｖ）からの２種以上の接合
   体の生成物を組み合わせる、 からなることを特徴とする単一の接合体ワクチンに対す
   る低い抗体応答性を有する哺乳動物の患者のための多価
   ワクチンを調製する方法。 １２、生殖系の少なくとも２種の抗原、ただし同一種の
   抗原の場合において、抗原は生殖系に対して特異的であ
   る、および少なくとも１種の患者適合性の担体を含有し
   てなる多価ワクチンであって、前記多価ワクチンは、 （ｉ）同一担体部分へ結合した少なくとも２種の別々の
   抗原の複合接合体、 （ｉｉ）各々が少なくとも１種の担体へ別々に結合した
   少なくとも２種の別々の抗原の接合体の混合物、 （ｉｉｉ）担体へ接合した、ｈＣＧのβサブユニットお
   よび異種の種のαサブユニットである少なくとも２種の
   別々の抗原のアニリーングした複合体、 （ｉｖ）精子抗原および少なくとも１種の担体に結合し
   た少なくとも１種の抗原の多価接合体、および （ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも２種の混合物、 から成る群より選択されることを特徴とする多価ワクチ
   ン。 １３、生殖系の少なくとも２種の抗原、第１はｈＣＧの
   βサブユニットの調製物から由来しそして第２は精子抗
   原の調製物であるかまたはＬＨの異種の種のαサブユニ
   ットまたはβサブユニットの調製物である、および少な
   くとも１種患者適合性の担体からなる多価ワクチンであ
   って、前記多価ワクチンは、 （ｉ）同一担体部分へ結合した少なくとも２種の別々の
   抗原の複合接合体、 （ｉｉ）各々が少なくとも１種の担体へ別々に結合した
   少なくとも２種の別々の抗原の接合体の混合物、 （ｉｉｉ）担体へ接合した、ｈＣＧのβサブユニットお
   よび異種の種のαサブユニットである少なくとも２種の
   別々の抗原のアニリーングした複合体、 （ｉｖ）精子抗原および少なくとも１種の担体に結合し
   た少なくとも１種の抗原の多価接合体、および （ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも２種の混合物、 から成る群より選択されることを特徴とする多価ワクチ
   ン。 １４、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖ）において、前記β
   ｈＣＧは異種の種のαサブユニットとアニリーングした
   複合体として存在する特許請求の範囲第１３項記載の多
   価ワクチン。 １５、前記抗原の１種は精子抗原である特許請求の範囲
   第１３項記載の多価ワクチン。 １６、１種より多い患者適合性の担体を含有する特許請
   求の範囲第１３項記載の多価ワクチン。 １７、少なくとも２種の別々の抗原はホルモンのサブユ
   ニットまたはその断片である特許請求の範囲第１３項記
   載の多価ワクチン。 １８、前記少なくとも２種の別々の抗原はβｏＬＨおよ
   びβｈＣＧである特許請求の範囲第１３項記載の多価ワ
   クチン。 １９、２種の患者適合性の担体が存在する特許請求の範
   囲第１３項記載の多価ワクチン。 ２０、前記患者適合性の担体は破傷風トキソイド、コレ
   ラ毒素Ｂ−鎖、Ｂ型肝炎表面蛋白質、マラリア蛋白質、
   ジフテリアトキソイドおよび￥Ｐ．￥￥ファルシパルム
   ￥（￥ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ￥）の種虫外皮蛋白質から
   成る群より選択される１種または２種以上の構成員であ
   る特許請求の範囲第１３項記載の多価ワクチン。 ２１、破傷風トキソイドおよびコレラ毒素Ｂ−鎖が担体
   として存在する特許請求の範囲第１３項記載の多価ワク
   チン。 ２２、明ばん、解毒したサルモネラリポ多糖のタトリウ
   ムフタリル誘導体（ＳＰＬＰＳ）および６−Ｏ−ジパル
   ミトイル−グリセリル−スクシニル（ＭＤＰ）から成る
   群より選択されるアジュバントと混合された特許請求の
   範囲第１３項記載の多価ワクチン。 ２３、αｏＬＨ．βｈＣＧ−ＴＴおよびαｏＬＨ．βｈ
   ＣＧ−ＣＧＨＢの少なくとも１種と精子抗原−ＣＨＢお
   よび精子抗原−ＴＴの少なくとも１種との混合物からな
   る特許請求の範囲第１３項記載の多価ワクチン。 ２４、特許請求の範囲第１２または１３項記載の多価ワ
   クチンを雌の哺乳動物に妊娠を終結まで防止するために
   十分な投与量および頻度で投与することを特徴とする特
   許請求の範囲第１２または１３項記載の多価ワクチンを
   使用する受胎調節法。 ２５、特許請求の範囲第１２または１３項記載の多価ワ
   クチンを雌の哺乳動物に抗体力価を少なくとも６０ｎｇ
   ／ｍｌの前記ワクチンに維持するために十分な投与量お
   よび頻度で投与することを特徴とする特許請求の範囲第
   １２または１３項記載の多価ワクチンを使用する受胎調
   節法。