JP2703574B2 - ＧｎＲＨに対する免疫応答を刺激し、哺乳動物を免疫的に生殖不能化するための剤及び方法 - Google Patents

ＧｎＲＨに対する免疫応答を刺激し、哺乳動物を免疫的に生殖不能化するための剤及び方法

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Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 哺乳動物において、脳下垂体を刺激してゴナドトロピ
ン（性腺刺激ホルモン）を放出させるゴナドトロピン放
出ホルモン（GnRH、またLHRHすなわち黄体形成ホルモン
放出ホルモンとしても知られている）の正常機能を妨げ
る抗体の使用はよく知られているが、実用には至らなか
った。この妨害によつて処理哺乳動物は種々の期間生殖
力を失う。該抗体は能動免疫化によつて処理された哺乳
動物によつて供給されるか、または受動免疫化によつて
供給されてきた。後者の技術は短期間滅菌に興味があ
り、米国特許4676981号に記述されている。しかしなが
ら典型的には外来抗体は宿主哺乳動物中でかなり限られ
た半減期しか有さず、抑制された受精能状態を維持しよ
うとすれば再処理が必要となる。
能動免疫化は一般に作用期間を長引かすのにより有効
なルートとして認識されてきた。しかしながら、GnRHは
デカペプチドにすぎないので、哺乳動物の免疫系にそれ
が明らかに分るようにする手段が必要となる。GnRHとア
ジユバントもしくは他の物質との混合物が適当な抗体の
生産を刺激することができたけれど、もつとも広く用い
られたアプローチはGnRH分子を大きなタンパク質担体分
子に連結することであつた。この研究の良い概説はD.G.
Grighton編、Butterworth′ｓ発行（1984）のImmunolog
ical Aspect of Reproduction in Mammals（哺乳動物の
生殖の免疫的側面）の363〜377頁のI.A.Jeffcoate及び
B.J.Keelingによる章、“Active immunization against
LHRH in the female"（雌のLHRHに体する能動免疫化）
に見られる。
この概説はカルボジイミド（１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、混合無水
物、グルタルアルデヒド及びビスジアゾ化ベンジジンを
はじめとする種々のカツプリング剤を論じている。ビス
ジアゾ化カツプリングルートはBiochemical and Biophy
sical Research Communications，55（３）（1973）の
Y.Kochらによる“Production and Characterization of
an Antiserum to Synthetic Gonadotropin-Releasing
Hormone"（合成ゴナドトロピン放出ホルモンに対する抗
血清の生産及び性質）に記述されているごとく、２工程
操作を含むが、ヒスチジンもしくはチロシン残基の正常
に存する側鎖への付加に基づいている。
この技術はまたヘテロ二官能性カツプリング剤を適当
な側鎖基を有するハプテンと一緒に用いることの価値を
認識した。１つのアプローチはスルフヒドリル基と反応
する基及びアミノ基と反応する基を有するカツプリング
剤をスルフヒドリル基を有するハプテンと共に用いるこ
とであつた。ある場合にはかかる基をもたないハプテン
はチオール化されてきた。かかるヘテロ二官能性剤を使
用する手法は英国のPergamon Press社によつて1980年に
発行されたMolecular Immunology（分子免疫学）の17巻
の749〜756頁のA.C.J.Leeらによる“A Method For Prep
aring beta−hCG COOH Peptide-Carrier Conjugates of
Predictable Composition"（予想し得る組成のベータ
ーhCG COOHペプチド−担体連結物の調整方法）に記述さ
れている。この手法は多くのアミノ基を有する担体タン
パク質とカツプリング剤（例えば６−マレイミドカプロ
イツクアシルＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルも
しくはMCS）とを反応させ、ついでかくして活性化した
担体をスルフヒドリル所持ペプチドと反応させる２工程
操作を含む。
しかしながら、この技術は商業上許容されるアジユバ
ントを用いてGnRHに対して哺乳動物を能動免疫化する技
術を教示していない。既知のGnRH−担体複合体について
なされた大部分の研究は実験室外では制限された用途し
か有さないFreundの完全もしくは不完全アジユバント等
のアジユバントを用いていた。これはこれらのアジユバ
ントの免疫原性が変化しやすく、ある程度厳密にはコン
トロールできなかつたことによるものと考えられる。こ
れは別の観点からいうと再現性ある複合体（a reproduc
ible conjugation regimen）を開発することの困難性に
起因すると思われる。
本発明は再現性があり、コントロールできる複合体を
GnRH担体複合体に利用可能なヘテロ二官能性カツプリン
グ剤について利用可能にする発見を含むものである。
［発明の概要］ 実用のワクチンアジユバントと組合せて使用して哺乳
動物にその生来のGnRHに対する免疫応答を開始させ、か
くして哺乳動物の受精能力を抑制することができる一群
の生産容易な剤であつて、GnRHアナログと免疫刺激担体
との複合体（conjugate）を含有する剤が開発された。
このアナログは10の天然性アミノ酸の１以上がより反応
性の側鎖を有するアミノ酸によつて置換されたGnRH分子
である。この担体は免疫学の領域において哺乳動物の免
疫系にとつて低分子量ハプテンを観測可能にするものと
して認識されている物質であればいかなる物質でもよ
く、特に大型タンパク質がよい。GnRHアナログは好まし
くは免疫担体上にいかなる有意な程度にでも典型的に見
い出される基とは実質的に異なる反応性を有する反応基
を有する側鎖を有するGnRHアナログである。この担体は
好ましくは免疫原としての確立された歴史を有する高分
子量タンパク質である。
哺乳動物は相当期間にこれらの複合剤で免疫化するこ
とにより生殖不能にすることができる。これらの剤は典
型的には認識されたワクチンアジユバントと共に哺乳動
物の循環系に導入される。
［発明の詳細な開示］ GnRHアナログは天然性デカペプチドの修飾物であつ
て、そこでは正常アミノ酸の１以上がより反応性の基を
有する側鎖を有するアミノ酸で置換されている。天然分
子は１級アミノ、カルボン酸もしくはスルフヒドリル基
を有する側鎖を欠く。この点に関し、１つの位置のグル
タミン酸の懸垂カルボン酸基はこのアミノ酸のα−アミ
ノ基と環化してピロリドン環を形成するので複合化のた
めに利用できない。本発明のアナログはこの環を単に開
環すること、または開環したグルタミン酸を有する天然
GnRHを合成することを含まない。好ましい反応性基はか
かる反応性基があつたとしても多くを有しない多くの担
体が利用できるという観点からスルフヒドリル基であ
る。他のＳ保持アミノ酸であるシスチン及びメチオニン
も適当に修飾してスルフヒドリル基を生じさせることが
できるが、システインで天然性アミノ酸の１つを置換す
ることが特に好ましい。この置換はGnRHの１、６または
10位で行うのが特に好ましい。
GnRHアナログはペプチド合成の周知手法のいずれによ
つても合成できる。特に有利な手法は自動固相ペプチド
合成（automated solid atate peptide synthesis）で
ある。かかる合成を行う機械はDuPont及びCambridge Re
search Biochemicals（Cambridge,英国）から市販され
ている。
担体は哺乳動物の免疫系にハプテンが認識されるよう
にするものとして免疫学分野で認識されている担体であ
ればどの担体でもよい。GnRH及び本発明が関与するより
容易に複合化されるGnRHアナログは共に一般に免疫原と
して作用するには小さすぎる。すなわち、抗体はそれら
に結合するであろうが、それらは一般にかかる抗体の産
生を刺激することはできない。Landsteinerのパイオニ
ア的研究から40数年の間にハプテンとして知られる小分
子をはるかに大きな担体分子に複合化する（conjugatin
g）技術は良く確立されている。これらのタンパク質は
典型的にはタンパク質であり、相当数のスルフヒドリル
基を有さないタンパク質が好ましい。適当なポリペプチ
ドは好ましくは約15,000ダルトンより大なる分子量を有
する。好ましいクラスの担体は複合GnRHアナログに対す
る免疫応答（抗体力価によつて測定）に等しいかそれよ
りも大きな免疫応答を引き起こすことができる担体であ
る。適当な担体はキーホールリンペツトヘモシアニン
（keyhole limpet hemocyanin）、ブタチログロブリ
ン、ウシ血清アルブミン、ウマガンマグロブリン、ウマ
アルブミン、オボアルブミン及び破傷風トキソイドであ
る。
GnRHアナログを担体分子に結合するのに用いる複合化
剤は少なくとも２つの反応基を有する剤である。これら
の基は担体もしくはGnRHアナログに好ましくない影響を
与えない条件下で担体分子及びGnRHアナログの双方上の
部位と反応性であるべきである。この剤は好ましくは異
なった反応性を有する少なくとも２つの基を有し、より
好ましくは異なったパートナーと反応する少なくとも２
つの基を有する。特に好ましくはヘテロ二官能性剤であ
り、最も好ましくはかかる剤はスルフヒドリル基と反応
性の一つの基と認識された担体上のありふれた（commo
n）基と反応性の別の基を有する。これらのありふれた
基はカルボン酸及びアミノ基を包含する。特に好適な複
合化剤はスルフヒドリル基と反応性の基及びアミノ基と
反応性の基を有するヘテロ二官能性架橋剤である。好適
な剤はｍ−マレイミド−ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサ
クシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイルスル
ホサクシンイミドエステル、Ｎ−サクシンイミジル−
（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、サクシン
イミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサ
ン−１−カルボキシレート、サクシンイミジル−４−
（ｐ−マレイミドフエニル）ブチレート、Ｎ−サクシン
イミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト、スルホサクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）
アミノベンゾエート、スルホサクシンイミジル−４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート、Ｎ−サクシンイミジルブロモアセテート及
びスルホサクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフエ
ニル）ブチレートを包含する。特に好ましいヘテロ二官
能性架橋剤はマレイミド基もしくはサクシンイミジルカ
ルボキシレート基を有するものであり、最も好ましくは
その両方の基を有する剤である。すべての範囲の好適な
剤はRockford,Illinoisのthe Pierce Chemical Company
を通して国際的に入手可能であり、この会社の一般に配
布されたGeneral Catalogは適当な剤の構造及び活性の
開示を含んでいる。
GnRHアナログは主として実用的考慮によつて制約され
る比の広い範囲で担体に複合することができる。1:1よ
り小さい複合比は非複合GnRHアナログが免疫的に不活性
で免疫原として機能しないので実用的意義がない。高い
複合比は複合体の水溶性を損う傾向がある。担体105ダ
ルトンあたり約２〜16のGnRHの連結比が都合よく好まし
いが、免疫応答は実質上複合比によつて影響を受けない
ようである。
現実に得られる複合比は複合されるGnRHアナログ中に
標識を入れることによつて求めることができ便利であ
る。アナログのアミノ酸の１つ、例えばグリシン中への
炭素14の導入が有利であることが分った。複合操作が完
結した後、非複合GnRHアナログの、典型的には大型タン
パク質である担体分子からの分離は標準的カラムクロマ
トグラフイー技術によつて容易に行うことができる。か
かる技術中好ましいのは分子篩分画である。典型的には
これらの大型タンパク質を表わす溶出容量もしくは溶出
時間を確立する標準（a standard）を用いる。次いで分
離したタンパク物質中の炭素14の活性を用いて複合物の
GnRHアナログ含量を求める。
特に好ましい複合技術はアミノ基及びスルフヒドリル
基と反応するヘテロ二官能性複合剤、及びシステイン残
基を有するGnRHアナログを用いる２段階工程操作を包含
する。かかる剤中特に好ましいクラスはマレイミド基及
びサクシンイミジルカルボキシレート基の両方を有する
ものである。この複合剤は適当な担体分子と反応させ、
ついで未反応剤を標準カラムクトマトグラフイーで代表
される分子サイズ分画によつて担体から分離する。次い
でGnRHアナログを活性化した担体に加える。GnRHアナロ
グは乾燥物として加えるのが特に有利であることが分っ
た。かかる操作によるカツプリングもしくは複合効率は
ほぼ100％であることが分った。
この複合操作の非常に高い効率は再現性ある結果を得
るのを容易にする。かくして特に周到なプロトコルによ
つて達成される複合比が一旦確立されると、引き続き繰
り返す際ほぼ同じ比を得ることがあてにできる。
システイン置換を用いる複合の信頼性及び効率はシス
テインのスルフヒドリル基のみがGnRHアナログの反応性
を増加するよう確保することによつて高められる。かく
して、もしシステインがGnRH中に正常に存在する末端ア
ミノ酸のいずれかを置換するならば、システインの遊離
アミノもしくはカルボキシ基をブロツクするべきであ
る。例えば置換を１位で行うなら遊離アミノ基をＮ−ア
シル基で誘導化できるし、置換を10位で行うなら遊離カ
ルボキシル基をアミド化によつて誘導かできる。当然な
がら他の位置例えば６位での置換はかかる配慮を必要と
しない。システインのアミノ及びカルボキシル基はペプ
チド分子中への結合で消費される。
GnRH複合体はアジユバントと組み合わせて免疫作用を
増大させることができる。これらの複合体は生理食塩水
において投与する場合も免疫的に活性であるが、他の免
疫原と同様、哺乳動物の抗体生産を刺激する活性もしく
は有効性アジユバントとの製剤化によつて高められるこ
とができる。好適なアジユバントは許容し難い有害反応
を引き起こすことなしに、免疫原に対する哺乳動物の免
疫応答を高めるものとして当分野で認識された物質であ
ればいずれのものでもよい。例えばフロインド完全アジ
ユバント非常に有効なエンハンサーであるが、痛み、膿
瘍形成及び使用に伴う発熱ゆえに適当なアジユバントで
はない。適当なアジユバントはアルヒドロゲル（alhydr
ogel）（水酸化アルミニウムゲル）等のアルミニウム化
合物、フロインド不完全アジユバント等の油中水エマル
ジヨン、グリセロールで乳化した落花生もしくはゴマ
油、スクアレン等の適当な媒体中のＮ−アセチルムラミ
ル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン−ｎ−ブチルエステ
ル等のムラミルジペプチド、リポソーム、ジメチルジオ
クタデシルアンモニウムクロライド等の親油性４級化合
物、カルボポール（carbopol）（アリルスクロースで架
橋したアクリル酸）等のアクリル酸ポリマー、モノホス
ホリルリピッドＡ、及びデポ効果を演じ、すなわち哺乳
動物の循環系に免疫原を徐々に放出し、非経口投与に際
し合理的に良好な許容性を示す他の物質を包含する。適
当な架橋化アクリル酸アジユバントは米国特許第391941
1号、同第3869586号及び同第3790665号に教示されてい
る。再構成コラーゲンベースアジユバントは米国特許第
3639577号に教示されている。特に興味深いアジユバン
トはアルヒドロゼル、ジメチルジオクタデシルアンモニ
ウムブロマイド、硫酸デキストラン、アリルスクロース
で架橋し乳化剤及び油で製剤化したアクリル酸、リポソ
ーム、スクアレン中のトレオニルムラミルジペプチド、
Esopher、単独及び油中Regressin、架橋化アクリル酸製
剤とリポソームの組合せ、Regressinとアルヒドロゲル
の組合せを包含する。
GnRH担体複合体のアジユバントとの製剤化はアジユバ
ントについての通常の推奨方法に従つて行う。一般に、
複合体は他の免疫原と同様の製剤形態で用いられる。製
剤はさらにアジユバントもしくは他のエンハンサーの添
加によつて効率を高めることができる。アジユバントの
古典的定義はデポ（depot）効果を有する物質である。
上記にアジユバントとして論じた物質のいくつかは免疫
原の放出延長をもたらさず、この意味でエンハンサーと
考えるべきかも知れない。例えばムラミルジペプチドは
免疫原によつて刺激される応答を増幅するがデポ効果は
有しない。かかるエンハンサーはデポ効果を発揮する物
質と組み合わせることが有利である。この観点からムラ
ミルジペプチドはスクアレン等の油もしくはアルヒドロ
ゲルと組み合わせるのが有利である。
抗体応答は投与される精密な投与量に感受性でない。
陽性効果がGnRH担体複合体の10μｇという低い用量で得
られた。有意な免疫応答が、適当な担体に複合体したGn
RHアナログの0.9μｇすなわち0.8ナノモルという低さで
得られた。マウス等の小動物への適当な用量は複合体の
約10〜200μｇであり、より大きな動物では複合体の用
量は好ましくは約100〜700μｇ、特に好ましくは約200
〜600μｇである。
該複合体は一時的な生殖不能を得ようとする哺乳動物
の免疫応答を刺激するために用いることができる。この
複合体はシヨウ動物、コンパニオン（companion）動物
及び食料動物を免疫的に生殖不能にするために使用する
のが好ましい。この技術は馬、犬、猫、羊及び牛に用い
るのが特に好ましい。
複合体の投与ルートは厳密でない。しかしながら哺乳
動物の循環系ひいては体液免疫系に複合体を徐放するル
ートを用いるのが好ましい。皮下もしくは筋肉内注射が
静脈注射に優る。胃腸管を通る往路を含む投与ルート
は、複合体の劣化が起こる可能性が高く、また循環系へ
の吸収が困難である可能性があるので好ましくない。
投与方法（administration regimen）もまた厳密でな
くてもよい。しかしながら、すぐ前の投与から得られる
免疫応答より強い免疫応答を得るには第２及びその後の
投与を十分遅らせることが好ましい。この応答はGnRHに
対する処理動物の抗体の力価によつて測定するのが便利
である。効能剤のある投与後力価が有意に上がらず、一
方最初の投与後免疫応答が認められたのであれば、効能
剤は恐らくもつとも有利な結果を得るには早く投与され
すぎたのである。また、前の投与に対する応答が十分展
開しないうちに効能促進剤を投与すると最適結果を下回
ることになろう。最初の注射から約３週間後の効能促進
剤の投与が有利で、さらに３週間後の効能促進剤の投与
が有利である。
投与容量は厳密でなくてよいが、実用的配慮からコン
トロールされる。他方、余りに高い容量は処理される哺
乳動物の大きさ及び野性（pacificity）によつて投与す
るのに不便もしくは困難であるかもしれない。また最小
容量が望まれる粘度を得るのに必要かも知れない。フロ
インド完全アジユバントを用いる製剤等ある製剤は皮下
注射針を通るに十分な低い粘度を達成するための最小量
の希釈も必要とする。マウスやラツト等の小実験動物に
ついては約250μｌの投与容量が手頃であり、牛や羊等
のより大きな哺乳動物については1ml程度の投与容量が
典型的である。犬や猫等の中間サイズ哺乳動物について
は投与あたり、多数部位１で1mlの投与容量が適当であ
ることが分った。
GnRH担体連結物の投与によつて刺激される免疫応答は
抗体力価若しくは生理作用によつて便利に測定すること
ができるるラジオイムノアツセイ（RIA）または酵素結
合抗体免疫吸着アツセイ（ELISA）をはじめとする、与
えられた抗原に対する抗体のレベルを求めるためのよく
確立された技術のいずれも用い得る。ヨウ素125に基づ
くRIA法の使用が好適であることが判明した。放射性ト
レーサーヨウ素は修正クロラミン−Ｔ法により天然性Gn
RHに容易に結合させることができ、非結合ヨウ素は親和
性クロマトグラフイーで除去することができる。この標
識されたGnRHは液体もしくは固体第１結合アツセイにお
いて、または拮抗阻害アツセイ（competitive inhibiti
on assys）において用いることができる。かかる分析の
有用な基準（benchmark）は放射性ヨウ素のカウント
が、加えられたすべてのトレーサーが抗体に結合したと
きに得られる総カウントの10％である点での力価もしく
は血清希釈度である。
有効な担体分子は典型的にはそれらが連結しているGn
RHアナログより強力な抗体応答を刺激することが観察さ
れた。通常、抗担体の力価は抗GnRHアナログ抗体の力価
より少なくとも約１つの位ほど大である（応答は少なく
とも１つの位大きな希釈度で検出される）。
生理作用は組織学及び性ホルモンレベルをはじめとす
る多くの技術によつて評価することができる。GnRHアナ
ログ担体複合体による成功的免疫化は処理された哺乳動
物の精巣または卵巣の減少した重量もしくは大きさによ
つて検出可能である。陽性応答はまたこれらの器官の減
少しもしくは抑圧された機能によつても検出可能であ
る。例えば処理された哺乳動物の精巣における精子形成
は著しく抑制されほとんど抑圧されており、副こう丸は
生殖体から離れており、雌の場合には排卵が抑圧され
る。別の指標はテストステロンもしくはプロゲステロン
レベルの減少である。
［実施例］ 本発明をさらに以下の非限定的実施例によつて説明す
る。実施例中すべての部及びパーセントは注記ない限り
重量による。
実施例１ 担体/GnRHアナログ複合体の生産 １、６または10番目の正常に存するアミノ酸がシステ
インによつて置換され、末端置換の場合には遊離末端基
が不活性化された以外天然性GnRHと同じ構造を有する３
つのGnRHアナログを固相ペプチド合成によつて製造し
た。１位置換のアナログは必然的に正常に存するグルタ
ミン酸に関するピロリドン基の損失を含み、 10位置換アナログは最初は末端グリシンに関するアミド
基を最初は有していなかった。前者の場合には遊離アミ
ノ基はＮ−アセチル化されており、後者の場合には遊離
カルボキシル基はアミド化された。10位置換の場合には
炭素14標識を６位グリシンに入れ、１及び６位置換の場
合にはこの標識は10位グリシンに入れた。
キーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpet
hemocyanin）（KLH）の担体分子はｍ−マレイミドベン
ゾイルスルホサクシンイミドエステル（SMBS）での活性
化による複合化のために製造した。担体分子10mgを、Na
Cl8.77g、Na2HPO413.8g及び蒸留水800mlを混合し、1N H
ClでpH7.5とし、蒸留水で１として得たバツフアー2ml
に溶解した。乾燥SMBS11/4mgをこの溶液に加え、ゆるや
かに混合し、室温で１時間反応させた。過剰のSMBSを、
セフアテツクスG25PD-10フアーマシアカラム上の分画に
よつて３〜5.5mlで溶出する高分子量ピークを回収する
ことによつて活性化担体から分離した。
複合化はこの活性化担体溶液を乾燥GnRHアナログ1mg
に加えることによつて行なった。10位置換の場合はアナ
ログをまずエタノール200μｌに溶解し、ついで担体溶
液に加えた。両方の場合において添加後、室温で２時間
ゆるやかに混合した。反応浴をPD-10カラム上で分画
し、３〜6mlの間で溶出する高分子量ピークを集めるこ
とにより、複合化されなかつたアナログからの分離を行
った。
複合体のタンパク質含量はクーマシーブルータンパク
質アツセイによつて求めた。標準曲線は、該バツフアー
中のウシ血清アルブミン（BSA）強度を変化させた溶液
を用い、Bioradタンパク質試薬をかかる溶液200μｌに
加え、ちょっとの間撹拌し、595nmでの光学密度を読む
ことによつて作成した。複合体溶液の容積は200μｌに
調整し、Bioradタンパク質試薬200μｌと混合した。595
nmでの光学密度を標準曲線と比較してタンパク質含量を
得た。
複合体のGnRHアナログ含量は炭素14標識についての分
あたりカウント（CPM）から求めた。サンプル100μｌを
New England Nuclear社のAqua Solシンチレーシヨンカ
クテル5mlに加え、Beckmanシンチレーシヨンカウンター
で１分間計測した。
複合体は担体105ダルトンあたり7.7アナログ単位のア
ナログ担体比を有することが分った。
複合効率はほぼ100％であつた。３〜6mlの間で溶出し
た６位置換アナログベース複合体を回収プールすること
に代え、PD-10カラムのずべての実際の溶出域（１〜18m
l）に亘つて各1mlを回収した。各画分をタンパク質含量
及びアナログ含量の双方についてクーマシーブルータン
パク質アツセイ及び炭素14CPMでそれぞれ分析した。ス
ケール（目盛り）を適当に調整することによつて、共に
溶出容量に対するタンパク含量のグラフとアナログ含量
のグラフを重ね合わすことができた。このことは担体タ
ンパク質とアナログが同じ溶出パターンを有し、同じ分
子の部分であることを示している。
実施例２ 担体/GnRHアナログのワクチン化 実施例１に従つて調製したKLHと６位置換アナログ
（連結比7.9）に基づく複合体を5Balb/cマウスを処理す
るのに用いた。各哺乳動物に生理食塩水200μｌ中複合
体50μｇの最初の腹腔内注射を与え、14日後同一製剤の
同一投与量を同じルートでブースター（効能促進剤）注
射した。21日後マウスの目窩下静脈穿刺により採血し、
血清の抗GnRH抗体を液相−次結合アツセイによつて調べ
た。特に血清サンプルもしくは適当な一連の希釈液100
μｌをヨウ素125標識化GnRH100μｌと共に４℃で一夜イ
ンキユベートしたところ、PBSゲル溶液100μｌの存在下
100μｌあたり20,000CPMを示した。冷エタノール１μｌ
での沈澱及び４℃、1200gでの10分間の遠心分離により
タンパク質結合放射性標識化GnRHを単離した。デカント
した沈澱をMicromedic自動ガンマカウンターで計測し
た。結果はこのデカントした沈澱によつて示された合計
カウントのパーセントとして計算した。すなわち最初の
300μｌのインキユベートサンプルは20,000CPMを含んで
いたので、このサンプルのデカント沈澱について観測さ
れたCPMをこの数で割ることによりパーセントを与え
る。適当な基準として任意に10％レベルを選んだ。
マウス中３匹は10:1血清希釈度で少なくとも10％の結
合標識を示し、２匹は100:1血清希釈度で少なくとも10
％の結合標識を示した。かくのごとくこの複合体によつ
て有意の免疫応答が刺激された。
実施例３ アジユパント化した複合体を用いるワクチン化 １位及び６位置換GnRHアナログベースの複合体のアジ
ユバント化製剤の免疫応答に対する複合比の効果を求め
た。これらの複合体は複合の第２工程でアナログの変化
する量を用いる以外実施例１の手法に従つて製造した。
１位置換についての複合比は3.5、6.3及び10.6であり、
６位置換についての複合比は3.7、7.3及び14.6であり、
それぞれ担体KLHの105ダルトンあたりの値である。
複合物を米国特許3919411号の実施例IIIによつて教示
されたと非常に類似のアジユバントと組み合わせた。リ
ン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中の複合体50μｇを、水
と綿実油の50:45容量混合物（このものはさらにソルビ
タンモノラウレート2.5容量％とエトキシル化ソルビタ
ンモノオレエート（エチレンオキシド20モル）2.5容量
％を含有する）中の約２重量％Carbopol934p（ポリアリ
ルスクロースで架橋したポリアクリル酸）のエマルジヨ
ンと混合した。処方は複合物溶液９容量部とエマルジヨ
ン１容量部でなされた。
アジユバント化製剤200μｌを14日間隔で２回Babb/c
マウス30匹に腹腔内投与した。すなわち６つの複合体
（各GnRHアナログについて３つの複合比）の各々をマウ
ス５匹に投与した。
30匹のマウスの本質的にすべてが21日後天然GnRHに対
する抗体を生産した。特に血清の10:1希釈剤はすべての
マウスについて、すべてのヨウ素125標識化GnRHが結合
可能でかつ抗体と結合したとした場合の合計カウントの
少なくとも10％のヨウ素125カウントを示した。16匹の
マウスの血清が100:1希釈でこのミニマムを満たすかま
たはこれを越え、３匹の血清は1000:1希釈度でもそうで
あつた。GnRHアナログベースもしくは複合比と抗体生産
との間に明瞭な相互関係はなかつた。
実施例４ アジユバント化複合体に関する用量の効果 7.7:105ダルトン比でKLHに連結した６位置換アナログ
ベースのアジユバント化製剤の４用量レベルの抗体生産
に対する効果を調べた。複合体の10、50、100及び200μ
ｇの用量レベルを用いた。５匹のBalb/cマウスに零日、
14日目に各用量を200μｌ注射で与え、抗体生産を21日
目に評価した。処方及びアジユバントは複合体含量を変
えた以外実施例におけると同じであつた。
抗体応答はヨウ素125標識化GnRHの結合によつて実施
例１〜３と同様にして評価した。マウス各５匹の４群の
間に統計的に有意な差は認められなかった。すなわち４
つの用量レベルとも同じ応答を刺激したものと思われ
た。１匹を除くすべてのマウスが1:10血清希釈で合計カ
ウントの10％の基準をみたし、20匹中９匹は1:100希釈
で基準をみたし、20匹中４匹は1:1000希釈でも基準をみ
たした。
実施例５ アジユバント化製剤の担体の効果 ６位置換GnRHアナログ及び５つの異なる担体を用いて
５つの複合体を製造した。複合体を製剤し、実施例３に
記述した方法で投与した。すなわち複合体をポリアクリ
ル酸ベースアジユバントと混合し、複合体当り5Balb/c
マウスに複合体50μｇを200μｌ容量で零日及び14日目
に腹腔内投与した。刺激された抗体生産を実施例２に記
述したごとくヨウ素125標識化したGnRHと結合して21日
目に評価した。担体、担体105ダルトン当りの連結比、
及び合計カウントの10％に対する投影力価（実施例３に
定義）を表１に記録した。投影力価は10-1、10-2、10-3
及び10-4の希釈度での結果から外挿した。
EGGはMann-Whitneyテスト（ｐ＜0.05）によつて統計
的にKLHと一緒の、またはBSA及びTGBの両者と一緒のグ
ループに分けられる。BAS及びTTは他の３つの担体より
劣る結果を与えるものとして統計的にグループ分けされ
る。
実施例６ Balb/cマウス10匹を１位置換GnRHアナログとKLHの複
合体（105ダルトンあたり連結比10.6）のアジユバント
化製剤を用い、実施例３のプロトコルに従つて処理し、
７日目及び21日目の抗体応答を実施例２に記述したアツ
セイに従つて評価した。処方及びアジユバントは実施例
３と同様であつた。結果を表２に記録した。「投影した
10％力価」は10-1、10-2、10-3及び10-4の希釈度での結
果から外挿する。
実施例７ 牛のワクチン化 ２種のGnRHアナログ−KLH複合体をベースとし、種々
のアジユバントを含有するワクチン製剤の効果を求め
た。複合体は等しい量の１及び10倍システイン置換アナ
ログから７及び10の間の複合比で実施例１の手法に従つ
て製造した。６つの製剤をアルヒドロゲル容量あたりRe
gressin20、100及び200μｇと共のアルヒドロゲル、エ
ソホール（esophor）及び油中レグレツシン（regressi
n）を用いて製造した。製剤は複合体500μｇの用量で零
及び35日目に投与した。すべての製剤をIM注射により雄
牛５頭及び去勢牛（steer）５頭に投与した。各群の雄
牛中２頭及び去勢牛３頭は以前の不成功の試行に巻き込
まれており、ワクチン化にいくぶんより敏感であつた。
効果はGnRHに対する抗体力価及びテストステロン生産
の抑圧により評価した。いくつかのアジユバント製剤し
か有意の力価を示さなかつたが、すべての製剤はテスト
した雄牛のテストステロンレベルを有意に減少させた。
以前に処理された２頭の雄牛を含め７頭の雄牛が1:10希
釈で可能なヨウ素125カウントの10％のカウントを示す
ことができなかった。エソホール製剤は以前に処理され
た２頭の雄牛と以前に処理された去勢牛を含む非応答者
（10中８）のもつとも高い比率を有していた。
フロントページの続き (72)発明者 ルーベン・ジエイ・メイプルトフト カナダ国エス７エイチ４アール２・サス カチエワン・サスカトウーン・ゲルプク レセント 409 (72)発明者 ビクラム・ミスラ カナダ国エス７エヌ１イー６・サスカチ エワン・サスカトウーン・アルバートア ベニユー 119 (72)発明者 アン・フランシス・アレン カナダ国エス７エイチ０エイ７・サスカ チエワン・サスカトウーン・フオーテイ ーンスストリート イースト 1308 (56)参考文献 欧州公開181236（ＥＰ，Ａ１)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ） 天然のGnRHデカペプチドにおける
    １位、６位又は10位のアミノ酸が１個のシステイン残基
    で置換され、かつ１位が置換されている場合にはシステ
    インの遊離アミノ基が、10位が置換されている場合には
    システインの遊離カルボキシル基がそれぞれブロツクさ
    れたGnRH分子と、 （ｂ） 免疫刺激性タンパク質担体分子 との複合体からなる哺乳動物の免疫系を刺激して哺乳動
    物生来のGnRHに結合する抗体を生産することができる哺
    乳動物の生殖能力を抑制するための製剤。
  2. 【請求項２】タンパク質担体分子が15kdを超える分子量
    を有する請求項１記載の製剤。
  3. 【請求項３】複合体がヘテロ二官能性結合を有する請求
    項１又は２記載の製剤。
  4. 【請求項４】タンパク質担体分子に対する前記GnRH分子
    の比が105ダルトンの担体当り２〜16GnRH分子である請
    求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
  5. 【請求項５】請求項１の製剤とアジユバントとからなる
    哺乳動物の生殖能力を抑制するためのワクチン。
  6. 【請求項６】アジユバントが水酸化アルミニウムゲル、
    油中水エマルジヨン及びムラミルジペプチドからなる群
    より選ばれる請求項５記載のワクチン。
  7. 【請求項７】免疫原が請求項１記載の製剤であるワクチ
    ンをヒト以外の哺乳動物に投与する工程からなる、該動
    物の免疫系を刺激して該動物生来のGnRHに結合する抗体
    を生産することによって該動物の生殖能力を抑制するた
    めの方法。
  8. 【請求項８】ワクチンがヒト以外の哺乳動物へ非経口的
    に投与される請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】ワクチンが少なくとも１週間間隔で少なく
    とも２回ヒト以外の哺乳動物に投与される請求項７又は
    ８記載の方法。
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