JP2023518924A - 幼い哺乳動物の粘膜関連伝染性疾病を予防または治療するための血清組成物の製造方法、前記方法によって製造された血清組成物及びその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は粘膜関連伝染性病原体を成体豚及び牛に経粘膜投与して、成体豚及び牛から粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体の生産を誘導する段階を含む、粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清の製造方法、前記方法によって製造された血清を新生または幼い子豚及び子牛に投与して伝染性病原体の感染から幼い子豚及び子牛を予防または治療する方法に関するものであり、本発明の方法によって子豚及び幼い子牛を粘膜関連伝染性病原体の感染から成功的に予防及び治療することができた。【選択図】 図３
Description
本発明は幼い哺乳動物において粘膜関連伝染性疾病を予防及び治療する方法に関し、より詳しくは粘膜関連伝染性病原体を成体哺乳動物に経粘膜投与することにより、成体哺乳動物から粘膜関連伝染性病原体を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清を製造し、前記方法で製造された血清を幼い哺乳動物に投与して幼い哺乳動物を粘膜関連伝染性病原体の感染から予防または治療する方法に関する。
豚、馬、反芻類などにおいて、消化器、呼吸器、生殖器感染性疾病のような粘膜関連伝染性疾病は幼い哺乳動物の斃死及び成長阻害を誘発し、畜産業に多くの経済的損失をもたらしている。
幼い哺乳動物の伝染性疾病を防御することができる一つの方法は、伝染性病原体を防御することができる防御抗体を母体から習得することである。このような母体から伝達された受動免疫は幼い哺乳動物の免疫体系が充分に発達するまで伝染性病原体の感染から自身を防御する重要な手段になっている。
したがって、姙娠した母体から伝染性病原体に対する体液性免疫（ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を誘導して、姙娠中に胎盤を介してあるいは分娩後に初乳を介して防御抗体を幼い動物に伝達する母体ワクチン接種は幼い動物を伝染性病原体の感染から防御する効果的な方法として使われている。
例えば、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｂ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＪＥＶ）、豚熱病ウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ、ＣＳＦＶ）のような鼻粘膜関連伝染性病原体（ｎｏｎｍｕｃｏｓａ－ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎ）において筋肉または皮下を介しての母体のワクチン接種は母体から伝染性病原体の感染を防御することができる体液性免疫を誘導し、前記防御抗体を含んでいる母体の初乳を摂取した幼い哺乳動物は鼻粘膜関連伝染性病原体の感染を効果的に防御することができるというのが報告された（ｖａｎ Ｏｉｒｓｃｈｏｔ ＪＴ． ２００３． Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６：３６７－３８４； Ｆａｎ ＹＣ ｅｔ ａｌ．， ２０１３． Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １６３：２４８－２５６）。
しかし、すべての伝染性病原体に対してワクチンが開発されているものではなく、特に消化器、呼吸器または生殖器などの粘膜に疾病を引き起こす粘膜関連伝染性病原体（ｍｕｃｏｓａ－ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎ）の感染を防御するために実行される筋肉または皮下を介しての母体のワクチン接種は幼い動物の粘膜関連伝染性疾病を予防するのに制限的な効果のみを示す。例えば、腸管毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ＥＴＥＣ）、伝染性胃腸炎ウイルス（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＴＧＥＶ）、ブタ伝染性下痢ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ、ＰＥＤＶ）、グループＡ豚ロタウイルス（Ｇｒｏｕｐ Ａ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ、ＧＡＰＲＶ）、牛コロナウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＢＣｏＶ）及び牛グループＡロタウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｕｐ Ａ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ、ＢＧＡＲＶ）などのような粘膜関連伝染性病原体において、筋肉を介してワクチン接種された母体の血清はこれらの粘膜関連伝染性病原体に対して高いウイルス中和（ｖｉｒａｌ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ、ＶＮ）または細菌凝集（ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ、ＡＧ）力価を示すが、ワクチン接種された母体の初乳を摂取した子豚及び子牛をこれらの粘膜関連伝染性病原体の感染から効果的に防御していない。
これを克服するためのさらに他の方法として、卵黄来由ＩｇＹ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｙ）及び乳牛の初乳来由抗体などが子豚に、かつ粘膜関連伝染性病原体に対して過免疫された血清が子牛に試みられたが、これらも満足な結果に至ることができない実情である。
前記のような粘膜関連伝染性病原体の感染に対する効果的な予防及び治療方法の不在、これにより子豚及び子牛などにおいて高い感染率及び死亡率を伴う粘膜関連伝染病の持続的な発生、そして約１０億頭、１５億頭の豚及び牛飼育頭数（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＦＡＯ） ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ）などを考慮するとき、幼い哺乳動物の粘膜関連伝染性病原体の感染は世界畜産業に非常に大きな経済的損失をもたらす主要原因になっている。このような理由で子豚及び子牛を含む幼い哺乳動物において粘膜関連（呼吸器、消化器及び生殖器）伝染性疾病を予防及び治療することができるより効果的な方法の開発が切実に要求されている実情である。
一方、ロシア登録特許第２４３８７０９Ｃ１号には、「Ｓｅｒｕｍ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｔｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｔｉｓ， ｐａｒａｆｌｕ， ｒｏｔａ， ｃｏｒｏｎａ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａ ｄｉａｒｒｈｅａ－ｄｉｓｅａｓｅ， ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ， ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ， ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ， ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ， ｒｏｔａ， ｃｏｒｏｎａ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａ ｄｉａｒｒｈｅａ－ｄｉｓｅａｓｅ」が開示されており、ロシア登録特許第２３９６９７９Ｃ２号には、「Ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｓｅｒｕｍ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｓｓ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ」が開示されているが、本発明のように粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清に対して、そして粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清組成物の製造方法について記載されたものがない。また、前記方法で製造された血清、すなわち伝染性病原体または病原体の一部を非粘膜経路を介して成体牛に投与して製造した血清を子牛に投与したとき、このような方法で製造された血清の投与は粘膜関連伝染性病原体の感染から子牛を防御するのに効果がないことが実験結果によって確認された（Ｓｅｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９５． Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１４５４－１４５９）。
ｖａｎ Ｏｉｒｓｃｈｏｔ ＪＴ． ２００３． Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６：３６７－３８４； Ｆａｎ ＹＣ ｅｔ ａｌ．， ２０１３． Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １６３：２４８－２５
Ｓｅｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９５． Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１４５４－１４５９
本発明は前記のような要求に応えて導出されたものであり、幼い哺乳動物において粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清及び前記血清を成体哺乳動物から誘導して生産する方法を提供し、生産された血清を新生（ｎｅｗｂｏｒｎ）または幼い哺乳動物（ｙｏｕｎｇ ｍａｍｍａｌ）に投与して幼い哺乳動物を粘膜関連伝染性病原体の感染から予防または治療する方法を提供することにその目的がある。
前記の目的を達成するための手段として、本発明は、幼い哺乳動物の粘膜関連伝染性病原体を成体哺乳動物（ＰＡＭＩ血清提供者）に経粘膜投与して、成体哺乳動物から粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清を製造する方法を提供する。
本発明は粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清（ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、ＰＡＭＩ血清）であり、より具体的には粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができ、粘膜に分泌される粘膜兔疫性を有する兔疫グロブリンＡ（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ、ｓＩｇＡ）を主要防御抗体として含んでいる血清を提供する。
本発明は前記方法によって誘導生産された血清の有効量を効果的な時間に新生または幼い哺乳動物に経口または経静脈投与することにより、新生または幼い哺乳動物を粘膜関連伝染性病原体の感染から予防または治療する方法を提供する。
本発明による、子豚及び幼い子牛を粘膜関連伝染性病原体の感染から予防及び治療する方法は粘膜関連伝染性病原体の感染による子豚及び子牛の成長阻害及び斃死、国内外の豚及び牛飼育頭数などを考慮するとき、国内だけではなく世界の豚及び牛畜産業において非常に大きな経済的効果を示すことになると思われる。
本発明において、互いに異なる多数の粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清（ＰＡＭＩ血清）は互いに異なる多数の粘膜関連伝染性病原体を一個体（ＰＡＭＩ血清提供者）に投与して一個体から持続的に誘導、維持及び生産することができる。
本発明の例示で、子豚及び子牛の互いに異なる粘膜関連伝染性病原体の感染を予防及び治療することができる本発明の方法は、例示で使用した子豚及び子牛の粘膜関連伝染性病原体（ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＧＡＰＲＶ、ＢＣｏＶ、ＢＧＡＲＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ）だけでなく、消化器、呼吸器及び生殖器などで疾病を引き起こす子豚及び子牛のすべての粘膜関連漸染性ウイルス及び細菌性病原体に適用することで、これらの粘膜関連伝染性病原体の感染を予防及び治療するのに使うことができる。
本発明において、子豚及び子牛に投与される血清（ＰＡＭＩ血清）の容量または伝染性病原体に対する血清の力価などを増減することにより、前記血清が投与された子豚及び幼い子牛を伝染性病原体の感染から防御する受動免疫期間を調節することができる。
本発明において、互いに異なる２種の哺乳動物（子豚及び子牛）に適用して粘膜関連伝染性病原体の感染を予防及び治療する本発明の方法は、豚及び牛だけでなく類似の免疫体系を有する馬、豚、反芻類、ヒトなどのすべての哺乳動物に適用して幼い哺乳動物の粘膜関連伝染性病原体の感染を予防及び治療するのに使うことができる。
本発明の血清を投与した子豚は母豚から早期に隔離して成長することができるので、母豚による子豚圧死、多産母豚の母乳量不足などの問題を解決して子豚の離乳頭数（Ｐｉｇｌｅｔ ｐｅｒ Ｓｏｗ ｐｅｒ Ｙｅａｒ、ＰＳＹ）を増加させることができる。
本発明の方法は、類似の免疫体系を有するすべての哺乳動物に適用して幼い哺乳動物の粘膜関連伝染性病原体の感染を防御するにあたり、既存のワクチンを代替することができるだけでなく、既存のワクチンが解決することができない粘膜関連伝染性病原体の感染を予防及び治療する方法として使うことができる。
子豚及び子牛において、主要粘膜関連伝染性病原体であるＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＧＡＰＲＶ、ＢＣｏＶ、ＢＧＡＲＶ、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉなどは子豚及び子牛に対して多様な感染率及び死亡率とともにひどい下痢を誘発する。これによる子豚及び子牛の成長阻害及び斃死は養豚及び牛畜産業に莫大な経済的損失をもたらす原因になっているが、このような粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる効果的な方法が開発されていない。
このような問題点を解決する例示として、本発明は子豚の互いに異なる粘膜関連伝染性病原体（ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＧＡＰＲＶ、ＥＴＥＣなど）を成体豚に経粘膜（経口）投与することで、前記粘膜関連伝染性病原体を防御することができる防御抗体を含む粘膜兔疫性を有する血清（ＰＡＭＩ血清）を誘導及び生産した。生産されたＰＡＭＩ血清を分娩後の早期に新生子豚に経口投与したとき、ＰＡＭＩ血清を投与した子豚は互いに異なる前記粘膜関連伝染性病原体の攻撃感染から防御することができた。また、ＰＥＤＶ発生農場で、ＰＡＭＩ血清を新生子豚に投与したとき、ＰＡＭＩ血清を投与した子豚はＰＥＤＶ感染を防御し、ＰＥＤＶ発生農場でのＰＥＤＶの拡散を成功的に終息させた。
このように粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる本発明の方法を類似の免疫体系を有する他の哺乳動物に同一に適用することができるかを調べるために、他の例示を子牛に対して実施した。互いに異なる粘膜関連伝染性病原体ＢＣｏＶ、ＢＧＡＲＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）を成体牛に経粘膜（経口）投与して、粘膜関連伝染性病原体の感染を阻むことができる防御抗体を含む血清（すなわち、ＰＡＭＩ血清）を誘導及び生産し、生産されたＰＡＭＩ血清を新生子牛に経口投与した後、粘膜関連伝染性病原体［ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）］による攻撃感染を実施したとき、ＰＡＭＩ血清を投与した子牛は互いに異なる粘膜関連伝染性病原体の感染を防御した。また、互いに異なる粘膜関連伝染性病原体［ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）］の攻撃感染によって下痢を引き起こす子牛にＰＡＭＩ血清を経静脈投与したとき、ＰＡＭＩ血清を投与した子牛の下痢は治療された。
このように粘膜関連伝染性病原体の感染を予防または治療するにあたり、本発明の方法は互いに異なる２種の哺乳動物に適用することができ、また互いに異なる多様な粘膜関連伝染性病原体に適用して幼い哺乳動物の粘膜関連伝染性病原体の感染を予防及び治療することができるというのを実験で確認することによって本発明を完成した。このような結果は、本発明の方法を粘膜関連伝染性病原体の感染を予防または治療するにあたり、例示で使用した豚及び牛だけでなく反芻類動物、馬、ヒトなどを含む類似の免疫体系を有するすべての哺乳動物に適用することができ、また例示で使用した子豚及び子牛の粘膜関連伝染性病原体だけではなく前記のすべての幼い哺乳動物の粘膜関連伝染性病原体に適用することができるというのを提示している。
本発明で、用語「血清（ｓｅｒｕｍ）」とは血漿から纎維素を除去した残りを意味するものであり、本発明による前記血清（ＰＡＭＩ血清）は、成体哺乳動物に投与した伝染性病原体による免疫反応によって誘導された粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含んでいる。
本発明による血清の製造方法において、前記粘膜関連伝染性病原体は成体豚（または牛）に対して感染性はあるが無症状または軽微な臨床症状を誘発し、子豚（または幼い子牛）にはひどい臨床症状を誘発する感染性及び病原性を有する野外株（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）または弱毒化した（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）ウイルスまたは細菌であり、子豚（または幼い子牛）の消化器、呼吸器、生殖器などに疾病を誘発する粘膜関連ウイルス及び細菌性病原体である。
本発明による血清の製造方法において、前記粘膜関連伝染性病原体の投与容量は成体豚（または牛）に感染及び免疫原性を示すが死亡率には至らない量であり、成体豚（または牛）の血清内に伝染性病原体に対する防御抗体を充分に誘導及び生産することができる容量であることができ、粘膜関連伝染性病原体の種類及び状態によって当業者が適切な容量を選択して使うことができ、血清内に有効な水準の防御抗体を誘導及び生成することができるように投与回数を調節することもできる。
また、本発明による血清の製造方法において、前記粘膜経路（ｍｕｃｏｓａｌ ｒｏｕｔｅ）投与は、好ましくは経口投与または経鼻腔投与であることができ、前記粘膜経路を介して伝染性病原体を投与するときに粘膜兔疫性を有する防御抗体が生成される。従来のワクチン組成物は免疫原を筋肉注射などの非粘膜経路を介して抗体生成を誘導したものであり、非粘膜経路投与によって誘導及び生成された防御抗体を含む血清の場合、粘膜兔疫性が欠いているので、粘膜関連伝染性病原体の感染を予防及び治療するための受動免疫原としては効果が高くない欠点がある。
本発明による血清の製造方法において、前記成体豚（または牛）は、免疫体系が充分に発達して、伝染性病原体またはそのタンパク質を投与したとき、伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清を誘導及び生産することができる哺乳動物を意味し、好ましくは豚、馬、反芻類動物（ｒｕｍｉｎａｎｔｓ）、ヒトなどを含む哺乳動物であることができる。
本発明による血清の製造方法において、互いに異なる粘膜関連伝染性病原体（ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＧＡＰＲＶ、ＢＣｏＶ、ＢＧＡＲＶ及びＥ．ｃｏｌｉ）などを防御することができるＰＡＭＩ血清を１頭の個体（豚及び牛）から誘導生産した。したがって、一個体（ＰＡＭＩ血清提供者）に互いに異なる多数の粘膜関連伝染性病原体を投与して多数の粘膜関連伝染性病原体の感染を予防及び治療することができるＰＡＭＩ血清は一個体（ＰＡＭＩ血清提供者）から誘導、維持及び生産することができるというのを意味する。
また、本発明の一具現例による血清の製造方法において、前記防御抗体は伝染性病原体またはそのタンパク質に特異的な兔疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）などを含むものであり、好ましくは粘膜関連伝染性病原体を防御することができる粘膜関連伝染性病原体に対して粘膜兔疫性を有する、粘膜に分泌される抗体（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ＩｇＡ、ｓＩｇＡ）を主要兔疫グロブリンとする防御抗体である。
また、本発明は、前記製造方法によって製造された粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清を提供する。
本明細書で、前記伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清をＰＡＭＩ血清（ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ）と名付けた。前記ＰＡＭＩ血清は伝染性病原体またはそのタンパク質の多様な部分（ｅｐｉｔｏｐｅ）を認識し、互いに異なる抗原認識部位を有する防御抗体が混合されていることが特徴である。
また、本発明のＰＡＭＩ血清は、凍結乾燥によって粉末化させる場合、長期保管が可能であり、幼い哺乳動物に投与する前に水溶性溶媒、例えば水を追加する簡単な段階によって容易に準備することができる。
本発明による前記粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清は受動免疫（ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）に使うことができ、用語「受動免疫」とは抗原刺激を受けていない個体に、抗原刺激による兔疫応答によって他の個体から作られた抗体または感作リンパ球（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を注入させることによって獲得される免疫を言う。受動免疫は、ワクチンを注射して抗体生成を誘導するような能動免疫に比べて、病原体に対して免疫力がない個体に対して短時間内に防御効果を得ることができる利点がある。
また、本発明は、前記粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清の有効量を新生（ｎｅｗｂｏｒｎ）または子豚（または幼い子牛）に投与する段階を含む、子豚（または幼い子牛）を粘膜関連伝染性病原体の感染から予防または治療する方法を提供する。
本発明による予防または治療方法において、前記子豚（または幼い子牛）（ＰＡＭＩ血清受容者）は免疫体系が充分に発達されなくて伝染性病原体の感染に対する防御抗体を生産することができないか、伝染性病原体の感染を防御することができる防御抗体の習得が必要な子豚（または幼い子牛）を意味する。
本発明による予防または治療方法において、前記粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清の好ましい投与は経口または経静脈投与であることができるが、これに限定されない。
また、前記経口投与は新生子豚（または子牛）に適用して子豚（または幼い子牛）を粘膜関連伝染性病原体の感染から予防するための目的で使うことができ、前記経口投与は新生哺乳動物の分娩後１時間以内に投与することが好ましい。前記経口投与の時間帯（ｔｉｍｅ ｗｉｎｄｏｗ）は本発明の血清が新生哺乳動物に投与されて粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる防御抗体を吸収して最も著しい受動免疫効果を示すことができる時間領域帯である。
また、前記血清の経静脈投与は新生及び幼い子豚（または子牛）を粘膜関連伝染性病原体の感染から予防及び治療のための目的で使うことができる。前記経静脈投与の効果的な時間は、幼い子豚（または子牛）において粘膜関連伝染性病原体の感染を予防または治療するために外部から粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる防御抗体を含む血清の投与が必要な時間を意味する。
本発明による血清は免疫学的有効量で投与することができる。前記「免疫学的有効量」とは伝染性病原体の感染を予防または治療することができる効果を示すことができるほどの十分な量と副作用や深刻なまたは過度な免疫反応を引き起こさないほどの量を意味し、正確な投与濃度は特定の免疫原及び病原体に対する抗体の力価によって変わり、対象個体の年齢、体重、健康、性別、投与経路、投与方法などの医学分野によく知られた要素によって当業者が容易に決定することができ、１回～数回投与することができる。
また、本発明の予防または治療方法は、前記粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清に一つ以上の免疫増強剤をさらに混合して新生または幼い哺乳動物に投与することができる。
本発明が含むことができる免疫増強剤は本発明の血清を投与した動物の免疫反応を増大させる物質を意味し、多数の相異なる免疫増強剤が当該技術分野の当業者に公知となっている。前記免疫増強剤はプロイント完全及び不完全免疫増強剤、ビタミンＥ、Ｑｕｉｌ Ａ、鉱油及び無鉱物油及びカーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）、油中水乳剤免疫増強剤などを含むが、これに限定されるものではない。
本発明において、互いに異なる２種の哺乳類動物である豚及び牛から粘膜関連伝染性病原体に対するＰＡＭＩ血清を誘導生産し、前記血清を用いて粘膜関連伝染性病原体感染を成功的に予防及び治療することができるという結果は、本発明の方法に適用可能な動物は類似の免疫体系を有する豚、馬、反芻類、ヒトなどに適用することができるというのを示す。
本発明の方法は互いに異なる哺乳動物及び互いに異なる多様な粘膜関連伝染性病原体に適用されて粘膜関連伝染性病原体を防御することができるというのが実施例で確認された。このような理由で、本発明の方法に適用可能な病原体は実施例で使用した病原体（ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＧＡＰＲＶ、ＢＣｏＶ、ＢＧＡＲＶ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ）だけでなく、子豚及び子牛の消化器、呼吸器及び生殖器などで疾病を引き起こすすべての粘膜関連ウイルス及び細菌性伝染性病原体などを含むことができる。これに加え、本発明の方法に適用可能な病原体は類似の免疫体系を有する豚、馬、反芻類動物、ヒトなどを含むすべての哺乳類動物の消化器、呼吸器及び生殖器などで疾病を引き起こすすべての粘膜関連ウイルス及び細菌性伝染性病原体などを含むことができる。
また、前記伝染性病原体は消化器または呼吸器疾病を誘発するウイルスまたは細菌であることができ、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、カリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）、ストレプトコッカスニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、マイコプラズマニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ヘモフィラスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、クレブシエラニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、クラミジアニューモニア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、腸管毒素原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、クロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、シゲラ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、エルシニア種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．）、豚ロタウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、伝染性胃腸炎ウイルス（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、豚流行性下痢ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ）、豚パルボウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、豚生殖器呼吸器症侯群ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ）、豚呼吸器コロナウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ）、豚インフルエンザウイルス（Ｓｗｉｎｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、豚水疱病ウイルス（Ｓｗｉｎｅ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、豚シルコウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）、ストレプトコッカススイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、パスツレラムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、豚胸膜肺炎の起因菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブラキスピラヒオディセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ヘモフィルスパラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、マイコプラズマヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、悪性カタル熱ウイルス（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃａｔａｒｒｈａｌ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、牛ロタウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、牛インフルエンザウイルス（ｂｏｖｉｎｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、牛コロナウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ）、牛ヘルペスウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）、牛パラインフルエンザウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、牛呼吸器合胞体ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、牛ウイルス性下痢ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ）、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、牛伝染性鼻気管炎ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｏｖｉｎｅ Ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、牛クロストリジウム種（Ｂｏｖｉｎｅ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、マンヘミアヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、アフリカ馬病ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｈｏｒｓｅ ｓｉｃｋｎｅｓｓ ｖｉｒｕｓ）、馬インフルエンザ（ｅｑｕｉｎｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、馬コロナウイルス（Ｅｑｕｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ストレプトコッカスエキ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ロドコッカスエキ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）などであることができるが、これらに限定されない。
また、本発明は、前記伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清を有効成分として含む、伝染性病原体の感染による疾病の予防または治療用薬学組成物を提供する。
本発明の薬学組成物は、前記血清の他に薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。また、通常の方法によって、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口型剤形及び滅菌注射用液の形態に剤形化して使うことができるが、これらに限定されるものではない。組成物に含むことができる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、水及びマグネシウムステアレートを挙げることができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使って調剤する。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが相当し、よく使われる単純希釈剤である水の他にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤が含まれる。
本発明による薬学組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与経路、抗体の半減期、抗体の力価及び反応感応性のような要因によって多様に処方することができる。
本発明の薬学組成物に含まれる有効成分の濃度は、治療目的、治療対象の状態、必要期間などを考慮して決定することができ、特定範囲の濃度に限定されない。
本発明の薬学組成物において、前記伝染性病原体の感染による疾病はこれらに限定されないが、コロナウイルス感染症、流感（インフルエンザウイルスによる急性呼吸器疾患）、アデノウイルス感染症、コロナウイルス感染症、パラインフルエンザウイルス感染症、呼吸器合胞体ウイルス感染症、ライノウイルス感染症、メタニュ－モウイルス感染症、肺炎球菌感染症、マイコプラズマ菌感染症、クラミジア菌感染症、ロタウイルス感染症、ノロウイルス感染症、腸管アデノウイルス感染症、アストルウイルス感染症、サポウイルス感染症、大膓菌感染症またはサルモネラ感染症などであることができる。
また、本発明は、前記伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清を有効成分として含む、新生または幼い哺乳動物を粘膜関連伝染性病原体の感染から予防または治療するための獣医学的組成物を提供する。
本発明による伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清は伝染性病原体に対して感染抑制及び治療効果を有するので、家畜の免疫力を高めて家畜の健康状態を維持及び改善することができる。
本発明の獣医学的組成物は、獣医学的組成物の製造に通常使用する適切な賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。
本発明による血清の獣医学的投与形態は単独で使うかまたは他の獣医学的活性化合物との結合だけではなく適当な集合で使うことができる。
本発明の血清を含む獣医学的組成物に含まれることができる賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水及びマグネシウムステアレートを挙げることができる。
本発明による血清を含む獣医学的組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香辛料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。本発明による獣医学的組成物は、動物に投与された後、活性成分を迅速に吸収し、安全性などを提供するように、当該分野によく知られた方法で剤形化することができ、剤形は、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、滅菌注射用液などの形態であることができる。
本発明による獣医学的組成物において、前記伝染性病原体は消化器、呼吸器及び生殖器に疾病を誘発するウイルスまたは細菌であり、前述したようである。
本発明において、互いに異なる哺乳動物に対して互いに異なる粘膜関連伝染性病原体を投与してこれら病原体の感染を予防及び治療することができる血清、すなわちＰＡＭＩ血清を誘導、維持、生産し、生産されたＰＡＭＩ血清を幼い哺乳動物に投与して粘膜関連伝染性病原体の感染を予防及び治療する本発明の方法は、類似の免疫体系を有するすべての哺乳動物及びこれら哺乳動物の粘膜関連伝染性病原体に適用して粘膜関連伝染性病原体を防御するにあたり、ワクチンのような既存の方法を代替するか既存の方法で解決することができない粘膜関連伝染性病原体の感染を予防または治療する新しい方法になることができるというのを提示している。
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。ただ、下記の実施例は本発明を例示するものであるだけで、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
実施例１．材料及び方法
１－１．細胞、ウイルス、バクテリア
ベロ細胞（Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ）、豚精巣細胞（ｓｗｉｎｅ ｔｅｓｔｉｓ ｃｅｌｌ、ＳＴ ｃｅｌｌｓ）、赤毛猿胎児腎臓細胞（ｆｅｔａｌ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ （ＭＡ１０４） ｃｅｌｌｓ）を５－１０％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）またはＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を用いて３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。野外株豚流行性下痢ウイルス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ、ＰＥＤＶ－ｗｔ１）、野外株豚伝染性胃腸炎ウイルス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＴＧＥＶ－ｗｔ１）、野外株豚ロタウイルス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｇｒｏｕｐ Ａ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ１）、ワクチン株ウイルス［ＫＰＥＤＶ－９ （Ｋｏｒｅａ ＢＮＰ， Ｋｏｒｅａ）， ＰＥＤＶ－ｓｍ９８ （Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．， ＬＴＤ， Ｋｏｒｅａ）， ＴＧＥＶ（１７５Ｌ） （Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．， ＬＴＤ， Ｋｏｒｅａ） 及びＧＡＰＲＶ－ｖａｃ （Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．， ＬＴＤ， Ｋｏｒｅａ）］、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）であるＫ８８、Ｋ９９及びＦ１８菌株（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｋｏｒｅａ）、野外株牛コロナウイルス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＢＣｏＶ－ｗｔ１）、ワクチン株牛コロナウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ， ＢＣｏＶ－ｖａｃ）、野外株牛ロタウイルス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｕｐ Ａ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ， ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１）、ワクチン株牛ロタウイルス［ｂｏｖｉｎｅ グループＡ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ （Ｋｏｒｅａ， ＢＮＰ）， ＢＧＡＲＶ－ｖａｃ］などを使った。ＰＥＤＶ及びＢＣｏＶはベロ細胞にトリプシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭを使用し、ＴＧＥＶはＳＴ細胞にＤＭＥＭを使用し、ＧＡＰＲＶ及びＢＧＡＲＶはＭＡ１０４細胞にトリプシン（０．５－１．５μｇ／ｍｌ）を含むＥＭＥＭ（またはＤＭＥＭ）を使ってそれぞれ増殖した。そして、ＥＴＥＣはＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｉｎｃ． ＯＨ， ＵＳＡ）に培養した。
１－１．細胞、ウイルス、バクテリア
ベロ細胞（Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ）、豚精巣細胞（ｓｗｉｎｅ ｔｅｓｔｉｓ ｃｅｌｌ、ＳＴ ｃｅｌｌｓ）、赤毛猿胎児腎臓細胞（ｆｅｔａｌ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ （ＭＡ１０４） ｃｅｌｌｓ）を５－１０％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）またはＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を用いて３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。野外株豚流行性下痢ウイルス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ、ＰＥＤＶ－ｗｔ１）、野外株豚伝染性胃腸炎ウイルス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＴＧＥＶ－ｗｔ１）、野外株豚ロタウイルス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｇｒｏｕｐ Ａ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ１）、ワクチン株ウイルス［ＫＰＥＤＶ－９ （Ｋｏｒｅａ ＢＮＰ， Ｋｏｒｅａ）， ＰＥＤＶ－ｓｍ９８ （Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．， ＬＴＤ， Ｋｏｒｅａ）， ＴＧＥＶ（１７５Ｌ） （Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．， ＬＴＤ， Ｋｏｒｅａ） 及びＧＡＰＲＶ－ｖａｃ （Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．， ＬＴＤ， Ｋｏｒｅａ）］、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）であるＫ８８、Ｋ９９及びＦ１８菌株（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｋｏｒｅａ）、野外株牛コロナウイルス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＢＣｏＶ－ｗｔ１）、ワクチン株牛コロナウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ， ＢＣｏＶ－ｖａｃ）、野外株牛ロタウイルス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｕｐ Ａ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ， ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１）、ワクチン株牛ロタウイルス［ｂｏｖｉｎｅ グループＡ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ （Ｋｏｒｅａ， ＢＮＰ）， ＢＧＡＲＶ－ｖａｃ］などを使った。ＰＥＤＶ及びＢＣｏＶはベロ細胞にトリプシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭを使用し、ＴＧＥＶはＳＴ細胞にＤＭＥＭを使用し、ＧＡＰＲＶ及びＢＧＡＲＶはＭＡ１０４細胞にトリプシン（０．５－１．５μｇ／ｍｌ）を含むＥＭＥＭ（またはＤＭＥＭ）を使ってそれぞれ増殖した。そして、ＥＴＥＣはＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｉｎｃ． ＯＨ， ＵＳＡ）に培養した。
１－２．ウイルス野外株の分離
野外株ＴＧＥＶ（Ｚｈｅｎｈｕｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｉｓｒａｅｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７０：２２－３０）、野外株ＰＥＤＶ及びＢＣｏＶ（Ｃｈｅｎ Ｑ ｅｔ ａｌ．， ２０１４． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５２：２３４－２４３）、野外株ＧＡＰＲＶ及びＢＧＡＲＶ（Ａｒｎｏｌｄ Ｍ ｅｔ ａｌ．， ２００９． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １５：Ｕｎｉｔ １５Ｃ １３）はそれぞれのウイルスに感染された子豚及び子牛の糞便から既存の記述された方法で分離し、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１とそれぞれ名付けた。
野外株ＴＧＥＶ（Ｚｈｅｎｈｕｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｉｓｒａｅｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７０：２２－３０）、野外株ＰＥＤＶ及びＢＣｏＶ（Ｃｈｅｎ Ｑ ｅｔ ａｌ．， ２０１４． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５２：２３４－２４３）、野外株ＧＡＰＲＶ及びＢＧＡＲＶ（Ａｒｎｏｌｄ Ｍ ｅｔ ａｌ．， ２００９． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １５：Ｕｎｉｔ １５Ｃ １３）はそれぞれのウイルスに感染された子豚及び子牛の糞便から既存の記述された方法で分離し、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１とそれぞれ名付けた。
１－３．ウイルス力価測定
ウイルスの力価測定は既存の記述された方法で実行した。ＰＥＤＶ及びＢＣｏＶの力価測定（Ｔｈｏｍａｓ ＪＴ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０：ｅ０１３９２６６）のために９６ウェル培養皿で培養された８０－９０％単層ベロ細胞をＰＢＳで３回洗浄した。そして、３７℃で１時間の間にトリプシン（１０μｇ／ｍｌ）によって活性化したＰＥＤＶをＤＭＥＭで段階的に連続して希釈し、それぞれの希釈された０．１ｍｌ ＰＥＤＶ（またはＢＣｏＶ）をＰＢＳで洗浄されたベロ細胞に接種した。ウイルスで接種されたベロ細胞を３７℃で１時間の間に反応させた後、ウイルス接種液をトリプシン（１０μｇ／ｍｌ）を含む０．２ｍｌ ＤＭＥＭに置換し、ベロ細胞を３－５日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。ＴＧＥＶの力価測定（Ｈｅ Ｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１２． Ｖｉｒｏｌ Ｊ ９：１７６）のために９６ウェル培養皿で培養された８０－９０％単層ＳＴ細胞をＰＢＳで３回洗浄した。そして、ＴＧＥＶをＤＭＥＭで段階的に連続して希釈し、それぞれの希釈された０．１ｍｌ ＴＧＥＶをＰＢＳで洗浄されたＳＴ細胞に接種した。ウイルスで接種されたＳＴ細胞を３７℃で１時間反応させた後、ウイルス接種液を０．２ｍｌ ＤＭＥＭ（５％ＦＢＳ）に置換し、ＳＴ細胞を３－５日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。ＧＡＰＲＶ及びＢＧＡＲＶの力価測定（Ｏｔｔｏ ＰＨ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２３：８８－９５）のために９６ウェル培養皿で培養された８０－９０％単層ＭＡ１０４細胞をＰＢＳで３回洗浄した。そして、３７℃で１時間の間にトリプシン（１０μｇ／ｍｌ）によって活性化したＧＡＰＲＶ（またはＢＧＡＲＶ）をＥＭＥＭ（またはＤＭＥＭ）で段階的に連続して希釈し、それぞれの希釈された０．１ｍｌ ＧＡＰＲＶ（またはＢＧＡＲＶ）をＰＢＳで洗浄されたＭＡ１０４細胞に接種した。ウイルス接種されたＭＡ１０４細胞を３７℃で１時間反応させた後、ウイルス接種液をトリプシン（０．５－１．５μｇ／ｍｌ）を含む０．２ｍｌ ＥＭＥＭ（またはＤＭＥＭ）に置換し、ＭＡ１０４細胞を５－７日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。ウイルス接種による細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ、ＣＰＥ）が著しく現れたとき、ウイルス接種された細胞を３０分間１０％ホルマリンで固定した後、０．５％（ｗ／ｖ） ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔで染色した。ウイルス力価を示す５０％組職培養感染量（ｆｉｆｔｙ ｐｅｒｃｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅｓ、ＴＣＩＤ５０）はそれぞれの希釈されたウイルスによって感染された細胞でＣＰＥを示す最高ウイルス希釈倍数の逆に計算した。
ウイルスの力価測定は既存の記述された方法で実行した。ＰＥＤＶ及びＢＣｏＶの力価測定（Ｔｈｏｍａｓ ＪＴ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０：ｅ０１３９２６６）のために９６ウェル培養皿で培養された８０－９０％単層ベロ細胞をＰＢＳで３回洗浄した。そして、３７℃で１時間の間にトリプシン（１０μｇ／ｍｌ）によって活性化したＰＥＤＶをＤＭＥＭで段階的に連続して希釈し、それぞれの希釈された０．１ｍｌ ＰＥＤＶ（またはＢＣｏＶ）をＰＢＳで洗浄されたベロ細胞に接種した。ウイルスで接種されたベロ細胞を３７℃で１時間の間に反応させた後、ウイルス接種液をトリプシン（１０μｇ／ｍｌ）を含む０．２ｍｌ ＤＭＥＭに置換し、ベロ細胞を３－５日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。ＴＧＥＶの力価測定（Ｈｅ Ｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１２． Ｖｉｒｏｌ Ｊ ９：１７６）のために９６ウェル培養皿で培養された８０－９０％単層ＳＴ細胞をＰＢＳで３回洗浄した。そして、ＴＧＥＶをＤＭＥＭで段階的に連続して希釈し、それぞれの希釈された０．１ｍｌ ＴＧＥＶをＰＢＳで洗浄されたＳＴ細胞に接種した。ウイルスで接種されたＳＴ細胞を３７℃で１時間反応させた後、ウイルス接種液を０．２ｍｌ ＤＭＥＭ（５％ＦＢＳ）に置換し、ＳＴ細胞を３－５日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。ＧＡＰＲＶ及びＢＧＡＲＶの力価測定（Ｏｔｔｏ ＰＨ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２３：８８－９５）のために９６ウェル培養皿で培養された８０－９０％単層ＭＡ１０４細胞をＰＢＳで３回洗浄した。そして、３７℃で１時間の間にトリプシン（１０μｇ／ｍｌ）によって活性化したＧＡＰＲＶ（またはＢＧＡＲＶ）をＥＭＥＭ（またはＤＭＥＭ）で段階的に連続して希釈し、それぞれの希釈された０．１ｍｌ ＧＡＰＲＶ（またはＢＧＡＲＶ）をＰＢＳで洗浄されたＭＡ１０４細胞に接種した。ウイルス接種されたＭＡ１０４細胞を３７℃で１時間反応させた後、ウイルス接種液をトリプシン（０．５－１．５μｇ／ｍｌ）を含む０．２ｍｌ ＥＭＥＭ（またはＤＭＥＭ）に置換し、ＭＡ１０４細胞を５－７日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。ウイルス接種による細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ、ＣＰＥ）が著しく現れたとき、ウイルス接種された細胞を３０分間１０％ホルマリンで固定した後、０．５％（ｗ／ｖ） ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔで染色した。ウイルス力価を示す５０％組職培養感染量（ｆｉｆｔｙ ｐｅｒｃｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅｓ、ＴＣＩＤ５０）はそれぞれの希釈されたウイルスによって感染された細胞でＣＰＥを示す最高ウイルス希釈倍数の逆に計算した。
１－４．実験動物及び伝染性病原体の接種
農場で購入した５頭の姙娠した初産豚（母豚１、母豚２、母豚３、母豚４、母豚５）はそれぞれ分離された場所で飼育した。豚において、伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清、すなわちＰＡＭＩ血清を誘導生産するために、４頭の成豚、すなわち２頭の雌豚（ｆｅｍａｌｅ ｐｉｇｓ）と２頭の去勢された雄豚（ｃａｓｔｒａｔｅｄ ｍａｌｅ ｐｉｇｓ）を一場所で飼育した。そして、４０ｍｌの各ウイルス（１×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）［ＴＧＥＶ（１７５Ｌ）、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＰＥＤＶ－ｓｍ９８、ＫＰＥＤＶ－９、ＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｖａｃ及びＧＡＰＲＶ－ｗｔ１］及び１８時間培養した４００ｍｌの各Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８、Ｋ９９及びＦ１８）を豚飼料と混合して４頭の成豚に２６週間にわたって毎週投与した。ワクチン株によって接種された豚の血清（ワクチン対照血清）を生産するために、ワクチン株（ＫＰＥＤＶ－９及びＰＥＤＶ－ｓｍ９８）を製造会社の用法にしたがって筋肉経路を介して２週の間隔で２回にかけて１頭の成豚に接種した。そして、最後接種の後、２週の間隔で２回の追加接種を実施した。
農場で購入した５頭の姙娠した初産豚（母豚１、母豚２、母豚３、母豚４、母豚５）はそれぞれ分離された場所で飼育した。豚において、伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清、すなわちＰＡＭＩ血清を誘導生産するために、４頭の成豚、すなわち２頭の雌豚（ｆｅｍａｌｅ ｐｉｇｓ）と２頭の去勢された雄豚（ｃａｓｔｒａｔｅｄ ｍａｌｅ ｐｉｇｓ）を一場所で飼育した。そして、４０ｍｌの各ウイルス（１×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）［ＴＧＥＶ（１７５Ｌ）、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＰＥＤＶ－ｓｍ９８、ＫＰＥＤＶ－９、ＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｖａｃ及びＧＡＰＲＶ－ｗｔ１］及び１８時間培養した４００ｍｌの各Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８、Ｋ９９及びＦ１８）を豚飼料と混合して４頭の成豚に２６週間にわたって毎週投与した。ワクチン株によって接種された豚の血清（ワクチン対照血清）を生産するために、ワクチン株（ＫＰＥＤＶ－９及びＰＥＤＶ－ｓｍ９８）を製造会社の用法にしたがって筋肉経路を介して２週の間隔で２回にかけて１頭の成豚に接種した。そして、最後接種の後、２週の間隔で２回の追加接種を実施した。
牛において、粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清、すなわちＰＡＭＩ血清を誘導生産するために、１頭の１５月齢の成体雌牛を使った。４０ｍｌの各ウイルス（１×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）［ＢＣｏＶ－ｖａｃ、ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｖａｃ及びＢＧＡＲＶ－ｗｔ１］及び１８時間培養された１００ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）を成体雌牛に１２週間にわたって毎週経口投与した。
１－５．血清及び力価測定
４頭の初産豚（母豚１、母豚２、母豚３、母豚４）から、分娩前の血清及び分娩後の血清、伝染性病原体（ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＧＡＰＲＶ及びＥ．ｃｏｌｉ）投与前の４頭の成豚の血清（対照血清）及び伝染性病原体投与２６週後の成豚の血清（ＰＡＭＩ血清）、そしてワクチン株（ＫＰＥＤＶ－９及びＰＥＤＶ－ｓｍ９８）接種前の豚血清、及びワクチン株（ＫＰＥＤＶ－９及びＰＥＤＶ－ｓｍ９８）接種後の豚血清（ワクチン対照血清）などを乳静脈（ｍｉｌｋ ｖｅｉｎ）または頸動脈（ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ）を介してそれぞれ収集した。また、牛において、ＢＣｏＶ－ｖａｃ、ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｖａｃ、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）による感染前及び感染１２週後の成体雌牛の血清を頸静脈（ｊｕｇｕｌａｒ ｖｅｉｎ）を介して収集した。収集されたすべての豚血清に対してＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ及びＧＡＰＲＶに対するＶＮ力価、及びＥ．ｃｏｌｉに対するＡＧ力価をそれぞれ測定した。そして、収集された牛血清に対してＢＣｏＶ－ｖａｃ、ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｖａｃ及びＢＧＡＲＶ－ｗｔ１に対するＶＮ力価及びＥ．ｃｏｌｉに対するＡＧ力価をそれぞれ測定した。
４頭の初産豚（母豚１、母豚２、母豚３、母豚４）から、分娩前の血清及び分娩後の血清、伝染性病原体（ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＧＡＰＲＶ及びＥ．ｃｏｌｉ）投与前の４頭の成豚の血清（対照血清）及び伝染性病原体投与２６週後の成豚の血清（ＰＡＭＩ血清）、そしてワクチン株（ＫＰＥＤＶ－９及びＰＥＤＶ－ｓｍ９８）接種前の豚血清、及びワクチン株（ＫＰＥＤＶ－９及びＰＥＤＶ－ｓｍ９８）接種後の豚血清（ワクチン対照血清）などを乳静脈（ｍｉｌｋ ｖｅｉｎ）または頸動脈（ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ）を介してそれぞれ収集した。また、牛において、ＢＣｏＶ－ｖａｃ、ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｖａｃ、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）による感染前及び感染１２週後の成体雌牛の血清を頸静脈（ｊｕｇｕｌａｒ ｖｅｉｎ）を介して収集した。収集されたすべての豚血清に対してＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ及びＧＡＰＲＶに対するＶＮ力価、及びＥ．ｃｏｌｉに対するＡＧ力価をそれぞれ測定した。そして、収集された牛血清に対してＢＣｏＶ－ｖａｃ、ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｖａｃ及びＢＧＡＲＶ－ｗｔ１に対するＶＮ力価及びＥ．ｃｏｌｉに対するＡＧ力価をそれぞれ測定した。
ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＧＡＰＲＶ、ＢＣｏＶ及びＢＧＡＲＶに対する血清のＶＮ力価は既存の発表された方法によって遂行した（Ａｒｎｏｌｄ Ｍ ｅｔ ａｌ， ２００９． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １５：Ｕｎｉｔ １５Ｃ １３； Ｗｏｏｄｓ ＲＤ ｅｔ ａｌ．， １９８８． Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ ４９：３００－３０４； Ｓｏｎｇ ＤＳ ｅｔ ａｌ．， ２００７． Ｒｅｓ Ｖｅｔ Ｓｃｉ ８２：１３４－１４０）。簡単に、各血清を５６℃で３０分間熱処理し、丸い底のマイクロタイター９５ウェルプレート（ｒｏｕｎｄ－ｂｏｔｔｏｍｅｄ ｍｉｃｒｏ－ｔｉｔｅｒ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）でＤＭＥＭ（またはＥＭＥＭ）を使って２倍数に連続して希釈した。５０μｌのウイルス（２００ ＴＣＩＤ５０／５０μｌ）と５０μｌの希釈された血清を混合して３７℃で３０分間反応させた。１００μｌのＰＥＤＶ／血清（またはＢＣｏＶ／血清）混合物は９６ウェル培養皿で培養された単層ベロ細胞に、１００μｌのＴＧＥＶ／血清混合物は９６ウェル培養皿で培養された単層ＳＴ細胞に、１００μｌのＧＡＰＲＶ／血清（またはＢＧＡＲＶ／血清）混合物は９６ウェル培養皿で培養された単層ＭＡ１０４細胞にそれぞれ加えた後、３７℃で２時間反応させた。ウイルス吸着の後、ＴＧＥＶ／血清混合物は５％ＦＢＳを含む０．２ｍｌ ＤＭＥＭに、ＰＥＤＶ／血清（またはＢＣｏＶ／血清）混合物は１０μｇ／ｍｌのトリプシンを含む０．２ｍｌ ＤＭＥＭに、ＧＡＰＲＶ／血清（またはＢＧＡＲＶ／血清）混合物は０．５－１．５μｇ／ｍｌのトリプシンを含む０．２ｍｌ ＥＭＥＭ（またはＤＭＥＭ）にそれぞれ置換した。そして、ウイルス感染された９６ウェル培養皿の細胞を３７℃のＣＯ２インキュベーターで３－７日間培養した。ウイルスによって感染された細胞で著しいＣＰＥ現象が現れるとき、ウイルス接種された９６ウェル培養皿の細胞を室温で３０分間１０％ホルマリンで固定した後、０．５％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）で染色した。ウイルスに対する血清のＶＮ力価はウイルス／血清混合物が接種された単層細胞でＣＰＥを示さない血清の最高希釈倍数の逆に表現した。
Ｅ．ｃｏｌｉに対する血清のＡＧ力価を調査するために、ＡＧ ａｓｓａｙを実施した（Ｔｏ ＳＣ ｅｔ ａｌ．， １９８４． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ４３：１－５）。Ｅ．ｃｏｌｉはＬＢ ｂｒｏｔｈで３７℃で１８時間培養した後、１％ホルマリンで１２時間処理した。ホルマリン処理されたＥ．ｃｏｌｉをＰＢＳで３回洗浄した後、ＯＤ６０００．７の値でＰＢＳに希釈して、血清のＡＧ力価測定のためのＥ．ｃｏｌｉ抗原として使った。９６Ｕ字形プレート上で２倍数に連続して希釈された１００μｌ血清と１００μｌ Ｅ．ｃｏｌｉ抗原を混合した後、３７℃で３時間反応させた。Ｅ．ｃｏｌｉに対する血清のＡＧ力価はＥ．ｃｏｌｉ抗原と反応して著しい凝集を示す血清の最高希釈倍数の逆に表現した。
Ｅ．ｃｏｌｉに対する血清のＡＧ力価を調査するために、ＡＧ ａｓｓａｙを実施した（Ｔｏ ＳＣ ｅｔ ａｌ．， １９８４． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ４３：１－５）。Ｅ．ｃｏｌｉはＬＢ ｂｒｏｔｈで３７℃で１８時間培養した後、１％ホルマリンで１２時間処理した。ホルマリン処理されたＥ．ｃｏｌｉをＰＢＳで３回洗浄した後、ＯＤ６０００．７の値でＰＢＳに希釈して、血清のＡＧ力価測定のためのＥ．ｃｏｌｉ抗原として使った。９６Ｕ字形プレート上で２倍数に連続して希釈された１００μｌ血清と１００μｌ Ｅ．ｃｏｌｉ抗原を混合した後、３７℃で３時間反応させた。Ｅ．ｃｏｌｉに対する血清のＡＧ力価はＥ．ｃｏｌｉ抗原と反応して著しい凝集を示す血清の最高希釈倍数の逆に表現した。
１－６．粘膜関連伝染性病原体攻撃感染及び血清治療
ＰＡＭＩ血清が投与された子豚が伝染性病原体の感染を防御することができるかを調査するために、伝染性病原体攻撃感染を４頭（母豚１、母豚２、母豚３及び母豚４）の初産豚から生まれた子豚に実施した。母豚１から生まれたグループＡの子豚［対照血清投与子豚（ｎ＝７）及びＰＡＭＩ血清投与子豚（ｎ＝３）］はＴＧＥＶ－ｗｔ１感染実験のために、母豚２から生まれたグループＢの子豚［対照血清投与子豚（ｎ＝８）及びＰＡＭＩ血清投与子豚（ｎ＝３）］はＰＥＤＶ－ｗｔ１感染実験のために、母豚３から生まれたグループＣの子豚［対照血清投与子豚（ｎ＝７）及びＰＡＭＩ血清投与子豚（ｎ＝３）］はＧＡＰＲＶ－ｗｔ１感染実験のために、母豚４から生まれたグループＤの子豚［対照血清投与子豚（ｎ＝８）及びＰＡＭＩ血清投与子豚（ｎ＝３）］はＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）感染実験のためにそれぞれ使った。１０ｍｌのＰＡＭＩ血清はＰＡＭＩ血清投与子豚に、１０ｍｌの対照血清は対照血清投与子豚に、分娩後１時間内にそれぞれの子豚に経口投与した。分娩２日後、各グループの子豚（グループＡの子豚、グループＢの子豚、グループＣの子豚及びグループＤの子豚）を母豚からそれぞれ分離し、隔離された場所で実験が終わるまで代用乳（ｍｉｌｋ ｒｅｐｌａｃｅｒ、Ｐｕｒｉｎａ）を供給して飼育し、分娩３日後、グループＡの子豚はＴＧＥＶ－ｗｔ１（１×１０６ＴＣＩＤ５０／子豚）で、グループＢの子豚はＰＥＤＶ－ｗｔ１（１×１０６ＴＣＩＤ５０／子豚）で、グループＣの子豚はＧＡＰＲＶ－ｗｔ１（１×１０６ＴＣＩＤ５０／子豚）で、グループＤの子豚はＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）（１×１０８ＣＦＵ／子豚）でそれぞれ経口感染させた後、伝染性病原体に感染された子豚の臨床症状を４週間観察した。
ＰＡＭＩ血清が投与された子豚が伝染性病原体の感染を防御することができるかを調査するために、伝染性病原体攻撃感染を４頭（母豚１、母豚２、母豚３及び母豚４）の初産豚から生まれた子豚に実施した。母豚１から生まれたグループＡの子豚［対照血清投与子豚（ｎ＝７）及びＰＡＭＩ血清投与子豚（ｎ＝３）］はＴＧＥＶ－ｗｔ１感染実験のために、母豚２から生まれたグループＢの子豚［対照血清投与子豚（ｎ＝８）及びＰＡＭＩ血清投与子豚（ｎ＝３）］はＰＥＤＶ－ｗｔ１感染実験のために、母豚３から生まれたグループＣの子豚［対照血清投与子豚（ｎ＝７）及びＰＡＭＩ血清投与子豚（ｎ＝３）］はＧＡＰＲＶ－ｗｔ１感染実験のために、母豚４から生まれたグループＤの子豚［対照血清投与子豚（ｎ＝８）及びＰＡＭＩ血清投与子豚（ｎ＝３）］はＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）感染実験のためにそれぞれ使った。１０ｍｌのＰＡＭＩ血清はＰＡＭＩ血清投与子豚に、１０ｍｌの対照血清は対照血清投与子豚に、分娩後１時間内にそれぞれの子豚に経口投与した。分娩２日後、各グループの子豚（グループＡの子豚、グループＢの子豚、グループＣの子豚及びグループＤの子豚）を母豚からそれぞれ分離し、隔離された場所で実験が終わるまで代用乳（ｍｉｌｋ ｒｅｐｌａｃｅｒ、Ｐｕｒｉｎａ）を供給して飼育し、分娩３日後、グループＡの子豚はＴＧＥＶ－ｗｔ１（１×１０６ＴＣＩＤ５０／子豚）で、グループＢの子豚はＰＥＤＶ－ｗｔ１（１×１０６ＴＣＩＤ５０／子豚）で、グループＣの子豚はＧＡＰＲＶ－ｗｔ１（１×１０６ＴＣＩＤ５０／子豚）で、グループＤの子豚はＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）（１×１０８ＣＦＵ／子豚）でそれぞれ経口感染させた後、伝染性病原体に感染された子豚の臨床症状を４週間観察した。
新生子豚にＰＡＭＩ血清を投与した時間と伝染性病原体の感染に対する子豚の防御能との関係を調べるために、同じ腹からの子豚に対して伝染性病原体の感染実験を実施した。母豚５から生まれたグループＥの子豚はそれぞれ３グループ［０時間グループ（ｎ＝３）、１２時間グループ（ｎ＝３）及び１８時間グループ（ｎ＝３）］に分けた。そして、１０ｍｌ ＰＡＭＩ血清を分娩後１時間以内（０時間グループ）に、分娩後１２時間以内（１２時間グループ）に、分娩後１８時間以内（１８時間グループ）にそれぞれ子豚に経口投与し、ＰＡＭＩ血清が投与されたすべての子豚を分娩３日後にＰＥＤＶ－ｗｔ１（１×１０６ＴＣＩＤ５０／子豚）で経口感染させた後、ＰＥＤＶ－ｗｔ１で感染された子豚の臨床症状を４週間観察した。
また、ＰＡＭＩ血清を投与した子牛を伝染性病原体の感染から防御することができるかを確認するために伝染性病原体感染実験を子牛に実施した。子牛は、ＢＣｏＶ－ｗｔ１感染実験のための子牛グループＡ［対照血清投与子牛（ｎ＝３）及びＰＡＭＩ血清投与子牛（ｎ＝３）］、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１感染実験のための子牛グループＢ［対照血清投与子牛（ｎ＝３）及びＰＡＭＩ血清（ｎ＝３）］、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）実験感染のための子牛グループＣ［対照血清投与子牛（ｎ＝３）及びＰＡＭＩ血清投与子牛（ｎ＝３）］などにそれぞれ分けた。２００ｍｌのＰＡＭＩ血清はＰＡＭＩ血清投与子牛に、２００ｍｌの対照血清は対照血清投与子牛に、分娩後１時間以内にそれぞれ経口投与した。分娩３日後、子牛グループＡ、Ｂ及びＣをＢＣｏＶ－ｗｔ１（１×１０６ＴＣＩＤ５０／子牛）、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１（１×１０６ＴＣＩＤ５０／子牛）及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）（１×１０８ＣＦＵ／子牛）によってそれぞれ経口感染させ、伝染性病原体に感染された子牛の臨床症状を５日間観察した。
ＢｏＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１またはＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）の感染によって下痢をする子牛をＰＡＭＩ血清の投与によって治療することができるかを調べるために、前記伝染性病原体によって下痢症状を示す子牛にＰＡＭＩ血清を投与した。それぞれの子牛グループは、ＢＣｏＶ－ｗｔ１（１×１０６ＴＣＩＤ５０／子牛）の攻撃感染によって下痢を現す子牛グループＤ［対照血清投与子牛グループ（ｎ＝３）及びＰＡＭＩ血清投与子牛グループ（ｎ＝３）］、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１攻撃感染（１×１０６ＴＣＩＤ５０／子牛）によって下痢を現す子牛グループＥ［対照血清投与子牛グループ（ｎ＝３）及びＰＡＭＩ血清投与グループ（ｎ＝３）］、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）（１×１０８ＣＦＵ／子牛）攻撃感染によって下痢を現す子牛グループＦ［対照血清投与子牛グループ（ｎ＝３）及びＰＡＭＩ血清投与子牛グループ（ｎ＝３）］などにそれぞれ分けた。そして、２００ｍｌのＰＡＭＩ血清はＰＡＭＩ血清投与子牛グループに、かつ２００ｍｌの対照血清は対照血清投与子牛グループに、下痢症状を示す子牛にそれぞれ経静脈投与し、投与後５日まで子牛の臨床症状を観察した。
１－７．ＰＥＤＶ発生農場でＰＡＭＩ血清の使用
ＰＡＭＩ血清が野外でも粘膜関連伝染性病原体の感染を予防することができるかを調べるために、ＰＥＤＶ発生農場（母豚２００頭の規模）でＰＡＭＩ血清を新生子豚に経口投与した後、ＰＡＭＩ血清が投与された子豚の臨床症状を４週間観察した。伝染性病原体に感染された４頭の成豚から収集した１０ｍｌ ＰＡＭＩ血清はＰＡＭＩ血清投与子豚（ｎ＝２８０）に、ＰＥＤＶにワクチン接種された成豚から収集した１０ｍｌワクチン対照血清をワクチン対照血清投与子豚（ｎ＝９）に分娩後１時間以内にそれぞれ経口投与した。そして、ＰＡＭＩ血清及びワクチン対照血清が投与された子豚の臨床症状を４週間観察した。
ＰＡＭＩ血清が野外でも粘膜関連伝染性病原体の感染を予防することができるかを調べるために、ＰＥＤＶ発生農場（母豚２００頭の規模）でＰＡＭＩ血清を新生子豚に経口投与した後、ＰＡＭＩ血清が投与された子豚の臨床症状を４週間観察した。伝染性病原体に感染された４頭の成豚から収集した１０ｍｌ ＰＡＭＩ血清はＰＡＭＩ血清投与子豚（ｎ＝２８０）に、ＰＥＤＶにワクチン接種された成豚から収集した１０ｍｌワクチン対照血清をワクチン対照血清投与子豚（ｎ＝９）に分娩後１時間以内にそれぞれ経口投与した。そして、ＰＡＭＩ血清及びワクチン対照血清が投与された子豚の臨床症状を４週間観察した。
実施例２．粘膜関連伝染性病原体によって経口感染された成体豚及び牛の血清に対するＶＮ及びＡＧ力価分析
伝染性病原体の感染に対する抗体の防御能力を決定する重要な一要素は伝染性病原体に対する抗体の中和能力である。したがって、伝染性病原体（ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＧＡＰＲＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ）によって経口感染された成豚から収集した血清及び伝染性病原体（ＢＣｏＶ、ＢＧＡＲＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ）によって経口感染された成体牛の血清が伝染性病原体の感染に対して防御能力を有するかを調べるために、それぞれの伝染性病原体に対する血清のＶＮ及びＡＧ力価を調査した。
伝染性病原体の感染に対する抗体の防御能力を決定する重要な一要素は伝染性病原体に対する抗体の中和能力である。したがって、伝染性病原体（ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＧＡＰＲＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ）によって経口感染された成豚から収集した血清及び伝染性病原体（ＢＣｏＶ、ＢＧＡＲＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ）によって経口感染された成体牛の血清が伝染性病原体の感染に対して防御能力を有するかを調べるために、それぞれの伝染性病原体に対する血清のＶＮ及びＡＧ力価を調査した。
成体豚の血清において、伝染性病原体［ＴＧＥＶ（Ｌ７５）、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＰＥＤＶ－ｓｍ９８、ＫＰＥＤＶ－９、ＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｖａｃ、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ１、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８、Ｋ９９、Ｆ１８）］によって感染される前、成豚から収集した血清（対照血清）は伝染性病原体［ＴＧＥＶ（Ｌ７５）、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＰＥＤＶ－ｓｍ９８、ＫＰＥＤＶ－９、ＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｖａｃ、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ１］に対して陰性のＶＮ力価をそれぞれ示し（図１Ａ及び１Ｂ、レーン１、３、５、７、９、１１及び１３）、またＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８、Ｋ９９及びＦ１８）に対して陰性のＡＧ力価をそれぞれ示した（図１Ａ及び１Ｂ、レーン１５、１７及び１９）。しかし、伝染性病原体［ＴＧＥＶ（Ｌ７５）、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＰＥＤＶ－ｓｍ９８、ＫＰＥＤＶ－９、ＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｖａｃ、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ１、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８、Ｋ９９、Ｆ１８）］の感染２６週後に成豚から収集した血清（ＰＡＭＩ血清）はＴＧＥＶ（Ｌ７５）、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＰＥＤＶ－ｓｍ９８、ＫＰＥＤＶ－９、ＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｖａｃ、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ１に対して１０２４以上のＶＮ力価をそれぞれ示し（図１Ａ及び１Ｂ、レーン２、４、６、８、１０、１２及び１４）、またＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｆ１８）に対して６４以上のＡＧ力価をそれぞれ示した（図１Ａ及び１Ｂ、レーン１６、１８及び２０）。また、ＰＥＤＶ－ｓｍ９８及びＫＰＥＤＶ－９ワクチンで接種された成豚から収集した血清（ワクチン対照血清）はＰＥＤＶ－ｓｍ９８、ＫＰＥＤＶ－９、ＰＥＤＶ－ｗｔ１に対して１０２４以上の高いＶＮ力価をそれぞれ示した（図１Ｃ、レーン２、４及び６）。しかし、ワクチン接種前の成豚血清（対照血清）はＰＥＤＶ－ｓｍ９８、ＫＰＥＤＶ－９、ＰＥＤＶ－ｗｔ１に対して陰性ＶＮ力価をそれぞれ示した（図１Ｃ、レーン１、３及び５）。
成体牛の血清において、伝染性病原体［ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＣｏＶ－ｖａｃ、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｖａｃ及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）］による感染前の成体牛から収集した対照血清は病原体ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＣｏＶ－ｖａｃ、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｖａｃに対して陰性のＶＮ力価をそれぞれ示し（図２、レーン１、３、５及び７）、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）に対して陰性のＡＧ力価を示した（図２、レーン９）。しかし、伝染性病原体［ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＣｏＶ－ｖａｃ、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｖａｃ及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）］によって感染された１２週後の成体牛から収集した血清はＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＣｏＶ－ｖａｃ、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１及びＢＧＡＲＶ－ｖａｃに対して２５６以上のＶＮ力価をそれぞれ示し（図２、レーン２、４、６及び８）、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）に対して６４以上のＡＧ力価をそれぞれ示した（図２、レーン１０）。
一般的に、伝染性病原体に対する血清の力価は伝染性病原体の感染に対する防御能を測定する一つの方法である。したがって、成豚及び成体牛から収集したＰＡＭＩ血清が粘膜関連伝染性ウイルスに対して高いＶＮ力価を示し、Ｅ．ｃｏｌｉに対して高いＡＧ力価を示す前記実験結果は成豚及び成体牛から収集した血清、すなわちＰＡＭＩ血清を子豚及び子牛に投与したとき、ＰＡＭＩ血清を投与した幼い子豚及び子牛はＰＡＭＩ血清の防御抗体を習得して粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができるという可能性を提示している。
実施例３．ＰＡＭＩ血清を経口投与した子豚及び子牛の病原体攻撃感染に対する防御能の分析
伝染性病原体（ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＧＡＰＲＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して高いＶＮ力価及び高いＡＧ力価を示す成豚から誘導生産したＰＡＭＩ血清がＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）による感染から子豚を防御することができるか、かつ伝染性病原体［ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）］に対して中和及び凝集能を有する成体牛から誘導生産したＰＡＭＩ血清がＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）による感染から子牛を防御することができるかを調査するために、伝染性病原体の攻撃感染実験を子豚及び子牛にそれぞれ実施した。
伝染性病原体（ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＧＡＰＲＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して高いＶＮ力価及び高いＡＧ力価を示す成豚から誘導生産したＰＡＭＩ血清がＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）による感染から子豚を防御することができるか、かつ伝染性病原体［ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）］に対して中和及び凝集能を有する成体牛から誘導生産したＰＡＭＩ血清がＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）による感染から子牛を防御することができるかを調査するために、伝染性病原体の攻撃感染実験を子豚及び子牛にそれぞれ実施した。
グループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの子豚において、ＰＡＭＩ血清はＰＡＭＩ血清投与子豚に、対照血清は対照血清投与子豚に、分娩直後１時間内にそれぞれ経口投与した。そして、生後２日齢の子豚を母豚から分離して飼育し、生後３日齢に、グループＡの子豚はＴＧＥＶ－ｗｔ１で、グループＢの子豚はＰＥＤＶ－ｗｔ１で、グループＣの子豚はＧＡＰＲＶ－ｗｔ１で、グループＤの子豚はＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）でそれぞれ経口感染させた後、子豚の臨床症状を生後２８日齢まで観察した。
その結果、ＴＧＥＶ－ｗｔ１によって攻撃感染されたグループＡの子豚において、ＰＡＭＩ血清を投与した子豚は０％の斃死率（図３Ａ、レーン１）及び３３％の下痢発生率（図３Ｂ、レーン１）を示し、対照血清を投与した子豚は１００％斃死率（図３Ａ、レーン２）及び１００％の下痢発生率（図３Ｂ、レーン２）をそれぞれ示した。ＰＥＤＶ－ｗｔ１によって攻撃感染されたグループＢの子豚において、ＰＡＭＩ血清を投与した子豚は０％の斃死率（図３Ａ、レーン３）及び３３％の下痢発生率（図３Ｂ、レーン３）を示し、対照血清を投与した子豚は１００％の斃死率（図３Ａ、レーン４）及び１００％の下痢発生率（図３Ｂ、レーン４）をそれぞれ示した。ＧＡＰＲＶ－ｗｔ１によって攻撃感染されたグループＣの子豚において、ＰＡＭＩ血清を投与した子豚は０％の斃死率（図２Ａ、レーン５）及び０％の下痢発生率（図３Ｂ、レーン５）を示し、対照血清を投与した子豚は２９％の斃死率（図３Ａ、レーン６）及び１００％の下痢発生率（図３Ｂ、レーン６）をそれぞれ示した。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）によって攻撃感染されたグループＤの子豚において、ＰＡＭＩ血清を投与した子豚は０％の斃死率（図３Ａ、レーン７）及び３３％の下痢発生率（図３Ｂ、レーン７）を示し、対照血清を投与した子豚は２５％の斃死率（図３Ａ、レーン８）及び１００％の下痢発生率（図３Ｂ、レーン８）をそれぞれ示した。
ＰＡＭＩ血清を投与した子豚が伝染性病原体の［ＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ１、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）］攻撃感染を防御したというのは分娩前の母豚が伝染性病原体［ＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ１、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）］に感染されて母豚に防御抗体が形成されたことがあり得るという可能性を提示している。このような可能性を排除するために、分娩の前後に母豚血清の伝染性病原体に対するＶＮ及びＡＧ力価を調査した。分娩の前後の母豚の血清は伝染性病原体［ＴＧＥＶ（Ｌ７５）、ＴＧＥＶ－ｗｔ１、ＰＥＤＶ－ｓｍ９８、ＫＰＥＤＶ－９、ＰＥＤＶ－ｗｔ１、ＧＡＰＲＶ－ｖａｃ、ＧＡＰＲＶ－ｗｔ１］に対して陰性ＶＮ力価（図４Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ、レーン１－１４）を、伝染性病原体Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ８８）、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｆ１８）に対しては陰性ＡＧ力価（図４Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ、レーン１５－２０）をそれぞれ示した。
子豚において粘膜関連伝染性病原体に対する防御能を示す本発明の方法を他の哺乳動物である牛に適用することができるかを調査した。子牛グループＡ、Ｂ、Ｃに対して、伝染性病原体［ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）］に対して中和及び凝集能を有するＰＡＭＩ血清をＰＡＭＩ血清投与子牛に、対照血清を対照血清投与子牛に、分娩直後にそれぞれ経口投与し、生後３日齢に、グループＡの子牛はＢＣｏＶ－ｗｔ１で、グループＢの子牛はＢＧＡＲＶ－ｗｔ１で、グループＣの子牛はＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）でそれぞれ経口感染させ、臨床症状を観察した。ＢＣｏＶ－ｗｔ１によって攻撃感染されたグループＡの子牛において、対照血清を投与した子牛は、病原体投与後１、３、５日までそれぞれ０％、３３％及び１００％の下痢発生率をそれぞれ示し（図５、レーン１、７、１３）、ＰＡＭＩ血清を投与した子牛は、病原体投与後１、３、５日までいずれも０％の下痢発生率を示した（図５、レーン２、８、１４）。ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１によって攻撃感染されたグループＢの子牛において、対照血清を投与した子牛は、病原体投与後１、３、５日まで０％、３３％及び１００％の下痢発生率をそれぞれ示し（図５、レーン３、９、１５）、ＰＡＭＩ血清を投与した子牛は、病原体投与後１、３、５日までいずれも０％の下痢発生率を示した（図５、レーン４、１０、１６）。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）によって攻撃感染されたグループＣの子牛において、対照血清を投与した子牛は、病原体投与後１、３、５日まで０％、６７％及び１００％の下痢発生率をそれぞれ示し（図５、レーン５、１１、１７）、ＰＡＭＩ血清を投与した子牛は、病原体投与後１、３、５日までいずれも０％の下痢発生率を示した（図５、レーン６、１２、１８）。
このような伝染性病原体攻撃感染結果は、粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含むＰＡＭＩ血清を成豚及び成体牛（ＰＡＭＩ血清提供者）から誘導生産することができ、このように誘導生産されたＰＡＭＩ血清を新生子豚または新生子牛に早期に経口投与したとき、ＰＡＭＩ血清の粘膜兔疫性を有する防御抗体は受動免疫で子豚または子牛に伝達されて子豚及び子牛を粘膜関連伝染性病原体の感染からそれぞれ防御することができるというのを明らかに示している。
実施例４．伝染性病原体に対する子豚防御能に及ぶＰＡＭＩ血清の投与時間（ｔｉｍｅ ｗｉｎｄｏｗ）分析
分娩後に母体の初乳を介して受動免疫を習得する馬、豚、反芻類などの動物において初乳摂取時間は子の受動免疫の程度に影響を与える要素である。したがって、ＰＡＭＩ血清を新生哺乳動物に経口投与する時間と伝染性病原体の感染に対する幼い哺乳動物の防御効果との連関性を調べるために、子豚に対して次の実験を実施した。
分娩後に母体の初乳を介して受動免疫を習得する馬、豚、反芻類などの動物において初乳摂取時間は子の受動免疫の程度に影響を与える要素である。したがって、ＰＡＭＩ血清を新生哺乳動物に経口投与する時間と伝染性病原体の感染に対する幼い哺乳動物の防御効果との連関性を調べるために、子豚に対して次の実験を実施した。
グループＥの子豚において、ＰＡＭＩ血清を分娩後１時間内に（「０」）、１２時間内に（「１２」）、１８時間内に（「１８」）子豚にそれぞれ経口投与した。そして、分娩後３日齢にＰＡＭＩ血清を投与したすべての子豚はＰＥＤＶ－ｗｔ１によって攻撃感染され、臨床症状を２８日齢まで観察した。その結果、分娩後１時間内にＰＡＭＩ血清を投与した子豚は斃死または下痢の発生などの何の臨床症状も現れなかった（図６、レーン１及び２）。しかし、分娩後１２時間内にＰＡＭＩ血清を投与した子豚は６６％斃死率及び１００％の下痢発生率をそれぞれ示し（図６、レーン３及び４）、ＰＡＭＩ血清を分娩後１８時間内に投与した子豚は１００％斃死率及び１００％下痢発生率をそれぞれ示した（図６、レーン５及び６）。
前記結果は、子豚において伝染性病原体感染の効果的な防御は新生子豚にＰＡＭＩ血清を早期に経口投与することによって達成することができるというのを示している。また、ＰＡＭＩ血清を幼い動物に早期に経口投与して幼い動物を伝染性病原体の感染から防御する方法は子豚だけでなく、母体の抗体が初乳を介して伝達される馬、反芻類などの幼い動物にも適用可能であるというのを提示している。
実施例５．ＢＣｏＶ－ｗｔ１、ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）の感染によって発生した子牛の下痢症状に対するＰＡＭＩ血清の治療効果
粘膜関連伝染性病原体の感染に対する幼い子豚及び子牛の防御をＰＡＭＩ血清の経口投与だけではなく経静脈投与によってもなすことができるかを調べるための実験を子牛に実施した。ＢＣｏＶ、ＢＧＡＲＶ及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）によって下痢を引き起こす子牛にＰＡＭＩ血清を経静脈投与したとき、ＰＡＭＩ血清を投与した子牛の臨床症状を観察した。
粘膜関連伝染性病原体の感染に対する幼い子豚及び子牛の防御をＰＡＭＩ血清の経口投与だけではなく経静脈投与によってもなすことができるかを調べるための実験を子牛に実施した。ＢＣｏＶ、ＢＧＡＲＶ及びＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）によって下痢を引き起こす子牛にＰＡＭＩ血清を経静脈投与したとき、ＰＡＭＩ血清を投与した子牛の臨床症状を観察した。
ＢＣｏＶ－ｗｔ１の攻撃感染によって下痢を引き起こすグループＤの子牛において対照血清を投与した対照血清投与子牛グループの子牛の下痢症状は血清投与後１、３、５日にいずれも０％の回復率を示した（図７、レーン１、７、１３）。しかし、ＰＡＭＩ血清を投与したＰＡＭＩ血清投与子牛グループの子牛の下痢症状は血清投与後１、３、５日に０％、６７％及び１００％の回復率をそれぞれ示した（図７、レーン２、８、１４）。ＢＧＡＲＶ－ｗｔ１の攻撃感染によって下痢を引き起こすグループＥの子牛において対照血清を投与した対照血清投与子牛グループの子牛の下痢症状は血清投与後１、３、５日にいずれも０％の回復率を示した（図７、レーン３、９、１５）。しかし、ＰＡＭＩ血清を投与したＰＡＭＩ血清投与子牛グループの子牛の下痢症状は血清投与後１、３、５日に０％、６７％及び１００％の回復率をそれぞれ示した（図７、レーン４、１０、１６）。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ９９）の攻撃感染によって下痢を引き起こすグループＥの子牛において対照血清を投与した対照血清投与子牛グループの子牛の下痢症状は血清投与後１、３、５日にいずれも０％の回復率を示した（図７、レーン５、１１、１７）。しかし、ＰＡＭＩ血清を投与したＰＡＭＩ血清投与子牛グループの子牛の下痢症状は血清投与後１、３、５日に０％、３３％及び１００％の回復率をそれぞれ示した（図７、レーン６、１２、１８）。
このように、ＰＡＭＩ血清の防御抗体を静脈を介して幼い動物に伝達する方法は、新生動物の腸管閉鎖（ｇｕｔ ｃｌｏｓｕｒｅ）と投与時間とに影響される経口投与とは違い、必要時に幼い動物に適用することができるので、伝染性病原体の感染を予防するだけでなく、治療のための目的で使うことができるというのを示している。
実施例６．ＰＥＤＶ発生農場でのＰＡＭＩ血清のＰＥＤＶ感染防御能分析
本発明のＰＡＭＩ血清が野外でも伝染性病原体の感染を効果的に防御することができるかを調査するために、ＰＥＤＶ発生農場（２００ ｓｏｗ ｕｎｉｔｓ）で新生子豚にＰＡＭＩ血清を経口投与した後、血清の効果を評価した。ＰＡＭＩ血清はＰＡＭＩ血清投与子豚グループの子豚（ｎ＝２８０）に、ワクチン対照血清はワクチン対照投与子豚グループの子豚（ｎ＝９）にそれぞれ経口投与した。そして、ＰＡＭＩ血清及びワクチン対照血清を投与した子豚の臨床症状を生後２８日まで観察した。ＰＡＭＩ血清を投与したすべての子豚は生後２８日まで斃死（図８Ａ、レーン１、３、５、７及び９）及び下痢症状（図８Ｂ、レーン１、３、５、７及び９）を示さなかった。しかし、筋肉を介してワクチン接種された成豚から収集したワクチン対照血清を投与した子豚は生後７日齢に４４％（図８Ａ、レーン４）、１４日齢に８９％（図８Ａ、レーン６）、２１日齢に１００％（図８Ａ、レーン８）の斃死率をそれぞれ示した。また、ワクチン対照血清を投与した子豚は生後３日齢に３３％下痢症状（図８Ｂ、レーン２）、７日齢に１００％下痢症状（図８Ｂ、レーン４）、１４日齢に１００％下痢症状（図８Ｂ、レーン６）をそれぞれ示した。
本発明のＰＡＭＩ血清が野外でも伝染性病原体の感染を効果的に防御することができるかを調査するために、ＰＥＤＶ発生農場（２００ ｓｏｗ ｕｎｉｔｓ）で新生子豚にＰＡＭＩ血清を経口投与した後、血清の効果を評価した。ＰＡＭＩ血清はＰＡＭＩ血清投与子豚グループの子豚（ｎ＝２８０）に、ワクチン対照血清はワクチン対照投与子豚グループの子豚（ｎ＝９）にそれぞれ経口投与した。そして、ＰＡＭＩ血清及びワクチン対照血清を投与した子豚の臨床症状を生後２８日まで観察した。ＰＡＭＩ血清を投与したすべての子豚は生後２８日まで斃死（図８Ａ、レーン１、３、５、７及び９）及び下痢症状（図８Ｂ、レーン１、３、５、７及び９）を示さなかった。しかし、筋肉を介してワクチン接種された成豚から収集したワクチン対照血清を投与した子豚は生後７日齢に４４％（図８Ａ、レーン４）、１４日齢に８９％（図８Ａ、レーン６）、２１日齢に１００％（図８Ａ、レーン８）の斃死率をそれぞれ示した。また、ワクチン対照血清を投与した子豚は生後３日齢に３３％下痢症状（図８Ｂ、レーン２）、７日齢に１００％下痢症状（図８Ｂ、レーン４）、１４日齢に１００％下痢症状（図８Ｂ、レーン６）をそれぞれ示した。
このような結果は、本発明の方法が伝染性病原体の攻撃感染実験だけではなく伝染病が発生した農場でも幼い哺乳動物を粘膜関連伝染性病原体の感染から効果的に防御することができるというのを示し、粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる防御抗体を含むＰＡＭＩ血清はＰＡＭＩ血清提供者の性別に関係なく誘導及び生産することができるというのを示している。また、粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清、すなわちＰＡＭＩ血清は、粘膜関連伝染性病原体が非粘膜経路（皮下、皮内、筋肉内など）を介して投与されるものではなく、必ず粘膜経路（経口、経鼻腔）を介してＰＡＭＩ血清提供者に投与されるときに粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清をＰＡＭＩ血清提供者から誘導生産することができるというのを示している。
また、本発明の方法による実施例で、互いに異なる種の幼い哺乳動物を互いに異なる多様な粘膜関連伝染性病原体の感染から予防及び治療することができたというのは、伝染性病原体の感染を予防及び治療する本発明の方法を実施例で使用した豚及び牛だけでなく類似の免疫体系を有するすべての哺乳動物に適用することができ、そして実施例で使用した粘膜関連伝染性病原体だけでなく、幼い哺乳動物の消化器、呼吸器、生殖器などで疾病を引き起こすすべての粘膜関連伝染性病原体に適用することができるというのを示している。
Claims (10)
- 粘膜関連伝染性病原体を成体哺乳動物に経口または経鼻腔投与して、成体哺乳動物から粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体の生産を誘導する段階を含む、粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清の製造方法。
- 前記哺乳動物は、豚、馬、反芻類またはヒトであることを特徴とする、請求項１に記載の血清の製造方法。
- 前記粘膜関連伝染性病原体は、幼い哺乳動物の呼吸器、消化器または生殖器に疾病を引き起こす粘膜関連ウイルスまたは細菌性病原体であることを特徴とする、請求項１に記載の血清の製造方法。
- 前記幼い哺乳動物の呼吸器、消化器または生殖器に疾病を引き起こす粘膜関連ウイルスまたは細菌性病原体は、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）または腸管毒素原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とする、請求項３に記載の血清の製造方法。
- 前記粘膜兔疫性を有する防御抗体は粘膜に分泌されて粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる分泌型兔疫グロブリンＡ（ｓｅｃｒｅｔａｒｙ ＩｇＡ）が主要防御抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の血清の製造方法。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の方法によって製造された粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清。
- 請求項６に記載の粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清の有効量を新生または幼い哺乳動物に投与する段階を含む、新生または幼い哺乳動物を粘膜関連伝染性病原体の感染から予防または治療する方法。
- 前記血清を投与する段階は、粘膜関連伝染性病原体の感染の予防のためには新生哺乳動物の分娩後１時間以内に経口投与し、粘膜関連伝染性病原体の感染の予防及び治療のためには幼い哺乳動物に経静脈投与することを特徴とする、請求項７に記載の新生または幼い哺乳動物を粘膜関連伝染性病原体の感染から予防または治療する方法。
- 請求項６に記載の粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清を有効成分として含む、新生または幼い哺乳動物を粘膜関連伝染性病原体の感染から予防または治療するための獣医学的組成物。
- 請求項６に記載の粘膜関連伝染性病原体の感染を防御することができる粘膜兔疫性を有する防御抗体を含む血清を有効成分として含む、伝染性病原体の感染による疾病の予防または治療用薬学組成物。
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