BR112012007552A2 - formulações de vacina com adjuvante - Google Patents
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Abstract
FORMULAÇÕES DE VACINA COM ADJUVANTE.
A invenção refere-se a formulações de vacina com adjuvantes, em particular vacinas influenza para liberação intranasal. É provida uma formulação de vacina influenza com adjuvante, compreendendo: (i) micropartículas de peptidoglicano obtidas de uma bactéria Gram-positiva e (ii) pelo menos um antígeno de vírus influenza ou sua preparação antigênica, cujo antígeno ou preparação antigênica não está fundido ou de outro modo covalentemente ligado a uma metade ligante peptidoglicano proteica.
Description
; Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULA- ÇÕES DE VACINA COM ADJUVANTE". mr A invenção refere-se a formulações de vacina com adjuvante, em particular vacinas influenza capazes de montar uma resposta imune em mucosa, por exemplo, com liberação intranasal ou intramuscular,
Influenza sazonal ainda é uma das principais causas de mortali- dade e morbidez em todo mundo.
Vacinações anuais é a estratégia mais efetiva para prevenção e controle de infecções de influenza.
Vacinas de in- fluenza sazonais são preparadas baseadas na previsão da cepa esperada de epidemia para a estação seguinte.
Estas são vacinas injetadas parente- ralmente que não previnem a própria infecção, que podem reduzir a gravida-
= de e complicações após a infecção.
Vacinas parenterais podem induzir a . neutralização de anticorpo IgG no soro mas elas não podem induzir o anti- corpo IgA secretório que atua sobre a superfície de mucosa.
Em contraste,
vacinas intranasais (i.n.) podem induzir ambas, uma resposta imune sistêmi- ca e de mucosa.
Anticorpos IgA secretórios sobre a superfície de membrana de mucosa são altamente eficazes para prevenção de infecção porque eles reagem sobre a superfície da membrana de mucosa antes de patógenos ligarem-se à superfície de célula epitelial, que é o primeiro alvo de infecção viralinfluenza.
Além disso, anticorpos IgG de soro são menos efetivos contra cepas virais derivadas porque eles atuam mais especificamente que anticor-
pos IgA secretórios.
Anticorpos IgA secretórios têm efeitos protetores - cru- zados contra cepas variantes do vírus influenza.
O exato mecanismo dos efeitos reativos - cruzados de IgA ainda é desconhecido, mas este fenômeno é uma grande vantagem em prevenção de infecção.
Influenza mostra uma extraordinária capacidade para mudar as características antigênicas de suas duas principais proteínas de membrana, hemaglutinina (HA) e neuraminida-
se (NA). Isto ocorre através de contínua seleção afastada da resposta imune adaptativa estabelecida na população humana.
Devido à alta taxa de muta-
çãodo vírus, uma particular formulação de vacina usualmente tem efeito por cerca de somente um ano.
A World Health Organization coordena os conte-
údos da vacina cada ano para conter as cepas mais prováveis do vírus a
- atacar no ano seguinte.
Atualmente, vacinas convencionais são vacinas consistindo em três vírus influenza inativados (duas cepas A e uma B). Esta . vacina influenza trivalente é reformulada anualmente, baseado em cepas de influenza projetadas pela WHO serem predominantes na estação flu aproxi- mando-se.
Por exemplo, a vacina flu trivalente atualizada anualmente para a estação de 2007-2008 consiste em componentes de glicoproteína de super-
fície hemaglutinina (HA) de vírus influenza H3N2, HIN1,eB.
Outras vantagens de liberação i.n. de vacinas é que liberação da vacina não requer pessoal treinado de cuidados de saúde para a administra- ção de vacina, tornando este tipo de vacinas apropriado para pessoas com fobia de agulha e supera o problema de danos perfuração de agulha.
Além À disso, é reportado que o sistema imune de mucosa desenvolve-se cedo em : vida e não é afetado por envelhecimento (McElhaney JE.
Vaccine 2005 Jul 8; 23 Suppl 1:S810-25; Szewczuk MR et al.
Ann N Y Acad Sci 1983 Jun 30; 409:33344). Por isso, uma concomitante vantagem de, por exemplo, imuni- zação influenza intranasal é ela pode potencialmente prover efetiva imunida- de em todos os grupos de idade e pode ser usada para vacinação em mas- sa.
Vários conceitos para imunização contra influenza via a via nasal ou oro- faringeal e usado de antígeno influenza inativado foram explorados como alternativas sem agulha para a imunização subcutânea ou intramuscular.
Dados experimentais de suporte para abordagens sem agulha foram gera- dos em modelos animais.
Conceitos usando antígeno influenza inativado (tais como partículas de vírus inteiro quimicamente inativado, ou ainda com- ponentes virais processados como vírus dividido, ou hemaglutinina (HA) e/ou —neuraminidase (NA) antígenos de superfície purificados) para imunização via a via intranasal que são suportados por dados animais incluem tanto o uso de um adjuvante ou estimulado imune em combinação com o antígeno influ- enza inativado, ou requer vacinação múltipla.
Um adjuvante é qualquer subs- tância que aperfeiçoa a imunogenicidade de antígenos misturados com o mesmo.
Em humanos vacinação bem sucedida contra influenza via a via intranasal somente foi reportada para (a) vacinas influenza vivas (cepas a- daptadas frias) (FluMist, Medimmune Vaccines Inc), (b) vacina influenza vi-
3 rossomal com adjuvante toxina instável a calor de E. coli (NasalFlu, Berna Biotech Ltd) ou (c) uso de altas quantidades de antígeno e vacinação repeti- " da. Embora vacinas vivas sejam capazes de induzir uma satisfatória respos- ta imune, sua específica natureza de ser um vírus vivo causa adicionais con- ceitosde segurança, e é provável de induzir efeitos colaterais devido ao re- querido ciclo de replicação viral no trato respiratório superior. Também as requeridas condições de estocagem estão limitando a comercialização des- tes produtos. Uma forte associação entre o uso da vacina influenza intrana- sal com HLT de E. coli como adjuvante, e paralisia facial (Paralisia de Bell), conduziu à retirada da vacina virossomal com adjuvante HLT do mercado. Atualmente, vacinas de vírus influenza atenuado (LAIV) são co- É mercializadas para administração i.n. Vacinas LAIV foram mostradas induzi- ã rem ambas, resposta sistêmica e de mucosa. Entretanto, vacina LAIV está licenciada pela FDA somente para pessoas de 2-49 anos de idade e não parausoem populações de alto risco (idosos, crianças e pacientes doentes crônicos) (Centers for Disease Control and Prevention, http:/MWww.cdc.gov/flu/professionals/vaccination/pdf/targetpopchart.pdf; Bel- she RB et al. Vaccine 2008 Sep 12; 26 Supp! 4:D10-6). Entretanto, maioria de vacinas influenza comercializadas são vacinas inativadas que podem ser administradas seguramente via via i.n. para a população inteira. Uma des- vantagem destas vacinas é que elas mostraram ser pobremente imunogêni- cas quando administradas via esta via (Vaccine 2007 Jul 20; 25 (29):5367- 73; Eyles et al., BioDrugs 2000 Jan; 13(1):35-59).
Para aumentar a imunogenicidade, vacinas influenza inativadas requerem adjuvantes para potencializar a resposta imune quando adminis- trados via a via i.n. Vários adjuvantes estão atualmente sob desenvolvimento para imunizações i.n. tais como partículas semelhantes a vírus (Matassov D et al. Viral Immunol 2007 Sep; 20(3):441-52), ISCOMS (Sjolander S et al. Vaccin 2001 Jul 16; 19(28-29):4072-80), lípideos, ácidos nucleicos (Joseph etal Vaccine 2006 May 1; 24(18):3990-4006) e components bacterianos (Haan et al. Vaccine 2001 Apr 6; 19(20-22):2898-907: Plante et al. Vaccine Í 2001 Oct 12; 20(1-2):218-25). Entretanto, o desenvolvimento de muitos des-
tes sistemas adjuvantes é impedido por conceitos de segurança e regulação. Por exemplo, potenciais adjuvantes bacterianos como LT (toxina termo- f instável de E. coli) mostraram severos efeitos colaterais em humanos (Muts- ch et al. N Engl J Med 2004 Feb 26;350(9):896-903). A inclusão de adjuvan- tes sal de alumínio como foi sugerida para vacinas influenza não somente requer etapas extras de mistura durante fabricação, pelo que diminuindo fa- bricação total, mas inclusão destes sais está associada com vários proble- mas . Por exemplo, sua insolubilidade significa que antígenos adsorvidos depositam de suspensão, assim preparação de doses individuais a partir de vacinaem volume requer cuidado extra. Em adição, ligação de antígeno aos sais complica controle de qualidade das vacinas finais. Em particular, alguns testes de potência para vacinas influenza são baseados em ensaios imunes : in vitro que requerem antígeno não-ligado, isto é, adsorção ao adjuvante significa que estes testes não podem ser usados.
Recentemente, muita ênfase é colocada sobre o fenótipo da res- posta imune, isto é, Th1, Th2 ou resposta balanceada. Vacina subunidade administrada via a via i.n. e muitos dos adjuvantes nasais como quitosano, ISCOMS, lipídeos, e LT induzem uma resposta tipo Th1/THe mista. Entre- tanto, a resposta Th1 é considerada ser superior a resposta Th2 ou mista porque ela 1) resulta em melhor proteção de infecção; e 2)ajuda em neutrali- zação de vírus através de secreção de INF-y. Além disso, a infecção natural também induz um tipo de resposta Th1. Em adição, anticorpos IgA secretó- rios sobre a superfície de mucosa são altamente eficazes para prevenção de infecção e, importantemente, anticorpos IgA secretórios têm efeitos proteto- res cruzados contra cepas variantes do vírus influenza e o sistema imune de mucosa se desenvolve cedo em vida e não é afetado por envelhecimento.
Assim, há uma clara necessidade de um adjuvante que seja po- tente, seguro para uso humano e que possa ser facilmente aprovado pelas agências reguladoras. Preferivelmente, uma vacina capaz de induzir uma resposta imune de mucosa como anticorpos IgA secretórios e/ou uma res- posta inclinada na direção de imunidade tipo Th1 é desejável. Por isso é um objeto da invenção prover aperfeiçoadas vacinas influenza com adjuvante é (para ambos usos, pandêmico e interpandêmico), preferivelmente uma vaci- na sendo apropriada da liberação intranasal e/ou intramuscular. Ainda um . objeto é prover um processo flexível para preparação de vacina influenza que permita uma reformulação anual conveniente e de custo efetivo.
Foi verificado que as metas acima podem ser satisfeitas através de co-formulação de antígeno com partículas de peptidoglicano inativadas que são obtidas de bactérias Gram-positivas. As partículas não são somente altamente eficazes para aperfeiçoamento de imunogenicidadede vacina de subunidade administrada intranasalmente mas também induzem IgA secre- tório emodulam a resposta a partir de uma resposta imune balanceada para uma inclinada para Th1. Liberação intranasal induziu uma comparável imu- nidade sistêmica e mesmo uma superior imunidade mediada por célula e de : mucosa quando comparada a convencional imunização intramuscular com subunidade de vírus influenza sozinha. O efeito protetor pode ser obtido a- través de simples mistura de antígeno e as partículas bacterianas.
Da mesma maneira, a invenção refere-se a uma formulação de vacina com adjuvante, compreendendo (i) micropartículas de peptidoglicano obtidas de uma bactéria Gram - positiva e (ii) pelo menos um antígeno ou sua preparação antigênica, cujo antígeno ou preparação antigênica não está fundida ou de outro modo covalentemente ligada a uma porção de ligação peptidoglicano. Qualquer antígeno(s) protetor conhecido ou ainda a ser des- coberto ou seu fragmento(s) antigênico, por exemplo, de origem viral, bacte- riana, parasítica, de fungo ou levedura, pode ser incluído.
Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno viral, tal como antígeno de superfície de hepatite B ou um antígeno de vírus influenza.
Em uma outra modalidade, a formulação compreende um antí- geno bacteriano, preferivelmente pelo menos dois antígenos proteicos bacte- rianos ou preparação antigênica dos mesmos, cujo antígeno ou preparação antigênica não está fundido ou de outro modo ligado covalentemente a uma porção ligante peptidoglicano proteica. Qualquer combinação protetora co- nhecida ou ainda a ser descoberta de dois ou mais antígenos proteicos ou seus fragmentos antigênicos pode ser incluída, tais como combinações dos
: antígenos de Streptococcus pneumoniae PpmaA, SIrA, IgA1 protease, PspA, CbpA, PdBD ou outros ou combinações de antígenos de Yersinia pestis L- * crV, F1, FIIC ou combinações de antígenos de caminhos de secreção tipo Ill como LcriV, IpaB e D, SipB e D, YopD de Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica, Shigella ou combinações de antígenos LT e ST de Escheri- Chia coli enterotóxica (ETEC) ou de outros antígenos proteicos bacterianos. Em um aspecto, a invenção provê uma formulação protetora compreenden- do PspA, CbpA e/ou PdBD. De particular interesse é uma formulação de va- cina trivalente pneumococal da invenção em que os antígenos proteicos bac- terianos são PsSpA, CbpA e PdBD. Com mistura com micropartículas de pep- tidoglicano obtidas de uma bactéria Gram - positiva, este coquetel de 3 antí- : genos foi verificado conferir uma proteção muito boa em um modelo camun- dongo de desafio intranasal de infecção de Streptococcus pneumoniae. Sur- preendentemente, a atividade protetora após mistura foi maior que quando os antígenos foram ligados às partículas via fusão a uma porção ligante pep- tidoglicano proteica (Ver Exemplo 12 e Figura 16 aqui abaixo). Também, a particular combinação de antígenos parece de relevância para a atividade protetora uma vez que uma formulação pentavalente compreendendo os antígenos PPmA, IgA1 protease, PSpA, CbpA e PsaaA foi relativamente baixa quando misturada com partículas peptidoglicano como comparada aos antí- genos sendo ligados. Ver Exemplo 13 e Figura 17.
Ainda em uma modalidade, a formulação compreende pelo me- nos um antígeno parasítico ou sua preparação antigênica, cujo antígeno ou preparação antigênica não está fundido ou de outro modo ligado covalente- mentea uma porção ligante peptidoglicano proteica. Qualquer antígeno pa- rasítico protetor conhecido ou ainda a ser descoberto ou seu fragmento anti- gênico pode ser incluído, tal! como antígeno de superfície de circunsporosoi- te ouantígeno de superfície merozoite de Plasmodium falciparum. Antígenos de fungos protetores exemplares incluem antígenos de Coccidioides ssp..
—Apropriados antígenos de leveduras são antígenos de Candida ssp. Tam- bém é provida uma formulação de vacina com adjuvante, compreendendo micropartículas de peptidoglicano obtidas de uma bactéria Gram - positiva e
. pelo menos um antígeno polissacarídeo ou sua preparação antigênica, cujo antígeno ou preparação antigênica não está fundida ou de outro modo cova- ir lentemente ligada a uma porção ligante peptidoglicano proteica. Qualquer antígeno polissacarídeo protetor conhecido ou a ser descoberto ou seu fragmento antigênico pode ser incluído, tais como polissacarídeos capsula- res de Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningi- tides, Staphylococcus aureus ou outros polissacarídeos.
Em uma modalidade preferida, a invenção provê uma formulação de vacina influenza com adjuvante, compreendendo (i) micropartículas de peptidoglicano obtidas de bactéria Gram - positiva e (ii) pelo menos um antí- geno de vírus influenza ou sua preparação antigênica, cujo antígeno ou pre- paração antigênica não está fundido ou de outro modo covalentemente liga- Ss do a uma porção ligante peptidoglicano proteica. Em uma outra modalidade, a invenção provê uma formulação de vacina de hepatite B com adjuvante, compreendendo (i) micropartículas de peptidoglicano obtidas de uma bacté- ria Gram - positiva e (ii) pelo menos um antígeno de vírus de hepatite B, por exemplo, uma proteína de envelope viral tal como antígeno de superfície de hepatite B (HBsAg), ou sua preparação antigênica, cujo antígeno ou prepa- ração antigênica não está fundido ou de outro modo covalentemente ligado a uma porção ligante peptidoglicano proteica. Ainda em uma outra modalida- de, a invenção provê uma formulação de vacina pneumococal com adjuvan- te, compreendendo (i) micropartículas de peptidoglicano obtidas de uma bactéria Gram - positiva e (ii) pelo menos um antígeno pneumococal, preferi- velmente PdBD, mais preferivelmente PspA, CbpA e PdBD, cujo antígeno não está fundido ou de outro modo covalentemente ligado a uma porção |li- gante peptidoglicano proteica.
Micropartículas de peptidoglicano para uso em uma vacina de acordo com a invenção podem ser obtidas através de processos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, WO 02/101026 e US 6 896 887 mostrando um processo para obtenção de material de parede de célula de uma bactéria Gram - positiva compreendendo tratamento do dito material de parede de célula com uma solução capaz de remover um componente de parede de
S célula tal como uma proteína, ácido (lipo)teichóico ou carboidrato do dito ma- terial de parede de célula em que o dito material de parede de célula com- r preende essencialmente micropartículas esféricas de peptidoglicano. O ma- terial de parede de célula não foi mecanicamente interrompido partido para resultar em micropartículas esféricas de peptidoglicano refletindo o tamanho e forma da bactéria Gram-positiva. As partículas não são vivas, privadas de proteínas de superfície intactas e conteúdo intracelular. A parede de célula de peptidoglicano espessa entretanto permanece intacta, e provê a rigidez estrutural para constituir as esferas de peptidoglicano conformadas bacteria- nas de cerca de 1 micrometro em tamanho, referidas como partículas aper- feiçoadoras Gram - positivas (GEM). Um principal obstáculo na área de de- À senvolvimento de adjuvante de mucosa é provar sua segurança de modo a : obter aprovação por agências reguladoras. As partículas usadas neste estu- do são de uso seguro em comparação a outros adjuvantes e outros sistemas de bactérias de ácido lático avaliados para vacinação. Durante a produção das partículas, bactérias são tratadas com ácido, o que resulta em persa de material genético. A perda de material genético é benéfica na medida em que o problema de difusão de ADN e infecção na camada de mucosa pelas bactérias é evitado. Além disso, as partículas são produzidas a partir de uma bactéria que é usada na produção de produtos laticínios e é considerada um organismo GRAS. Partículas GEM já foram testadas intranasalmente em coelhos em um estudo de toxidez GLP pré-clínico e nenhum evento adverso foi reportado. Por isso, partículas GEM podem ser consideradas como um seguro candidato a adjuvante para uso em mucosas em humanos.
Em uma modalidade, uma formulação de vacina compreende micropartículas obtidas de bactéria grau alimento, preferivelmente uma bac- téria de ácido lático. Preferivelmente, as micropartículas são obtidas da bac- téria grau alimento Lactococcus lactis, uma bactéria Gram - positiva não- colonizadora, não-patogênica. Além disso, L. lactis é aprovada para uso hu- mano por agências reguladoras e considerada um organismo GRAS (generi- camente reconhecido como seguro). Em uma modalidade, as partículas de peptidoglicano são produzidas por aquecimento de L. lactis em ácido, segui-
- do por lavagem com tampão fosfato (van Roosmalen ML et al., Methods 2006 Feb; 38(2):144-9. ie As partículas foram estudadas como carreador de antígeno para vacinação em mucosa de antígeno de parasita de malária e antígenos pneumococais devido sua aperfeiçoada capacidade para ligação com uma substância proteica compreendendo um domínio de ligação de peptidoglica- no (como um domínio de ligação de parede de célula ACmA ou seu homólo- go ou derivado funcional). Estes estudos demonstraram que antígenos liga- dos a e mostrados sobre partículas GEM induziram uma resposta imune maior que antígeno sozinho. Foi genericamente acreditado na técnica que imobilização e ótima exposição em superfície de antígeno sobre as partícu- : las carreadoras eram importantes para o efeito adjuvante.
: O presente estudo surpreendentemente mostra que, em contras- te a estudos anteriores em que antígenos goram ligados às partículas, a me- ra mistura de partículas de peptidoglicano e antígeno(s) aperfeiçoa signifi- cantemente a imunogenicidade de antígeno. O que é mais, em certos casos melhores atividades protetoras podem ser obtidas com mistura com partícu- las como comparado a ligação/imobilização sobre as partículas. A expressão "cujo antígeno ou preparação antigênica não está fundido ou de outro modo covalentemente ligado a uma porção ligante pep- tidoglicano proteica" como aqui usada é pretendida para distinguir a inven- ção da técnica anterior em que porçãos antigênicas são ligadas a micropar- tículas de peptidoglicano através de fusão ou ligação de antígeno a uma substância proteica também referida como "âncora proteína" ou "Protan" (PA), que tipicamente compreende pelo menos uma repetição, mas preferi- velmente duas ou três sequências em repetição de um domínio de ligação de parede de célula ACmA ou seu derivado funcional. Por exemplo, EP 1395648 mostra processos para ligação de fusões de âncora proteína tipo AcmA a material de parede de célula de microorganismos. WO 2007/011216 refere-se a um complexo carreador imunogênico carregado com antígeno compreendendo pelo menos um polipeptídeo bifuncional ligado a um carrea- dor imunogênico, o dito poloipeptídeo bifuncional compreendendo um domí-
Dk nio de ligação peptidoglicano (PBD) através do qual o polipeptídeo é ligado ao dito carreador, fundido a um domínio de ligação de antígeno (ABD) ao
' qual pelo menos um antígeno de interesse está ligado.
Em uma modalidade preferida, o antígeno é um antígeno de vií- rus influenza.
Como mostrado aqui abaixo, foi surpreendentemente verifica- do que uma vacina influenza i.n. baseada em GEM de acordo com a inven- ção elicitou uma resposta inclinada na direção de um fenótipo Th1. Foi verifi- cado que vacina de subunidade administrada intranasalmente com adjuvan- te de partículas GEM (que são simplesmente misturadas com vacina) pode ser usada em uma estratégia de vacinação de reforço - prime para indução de níveis protetores de títulos HI (> 2 log 5,3) que é considerado ser uma É importante correlação de proteção.
Além disso, a vacina influenza i.n. base- É ada em GEM é completamente protetora após desafio letal.
Em adição, os resultados de IgG em soro claramente realçam que partículas GEM aperfei- çoama imunogenicidade da vacina subunidade influenza administrada i.n.
Em adição a substanciais respostas em soro, a vacina i.n. com adjuvante GEM elicitou uma forte resposta imune de mucosa isto é,, secreção do sIgA na mucosa respiratória.
Indução de significantes níveis de sIgA em mucosa nasal mostra que partículas GEM atuam como imuno potencializadores na mucosa nasal.
O sistema imune da mucosa nasal consiste no tecido linfóide associado - nasal (NALT). No NALT, os antígenos são tomados pelas célu- las M e então apresentados para células apresentando antígeno, que por sua vez apresentam fragmentos de antígeno para as células B e T subjacen- tes.
Esta cascata de eventos é requerida para a resposta imune inata e a- daptativa inicial contra o vírus influenza.
Nossos resultados mostram que imunização i.n. com vacina de subunidade influenza misturada com partícu- las GEM induziu maiores níveis de sIgA na mucosa nasal que a imunização i.m. e i.n. com somente vacina.
A indução de anticorpos sIgA em NALT pode ser o resultado de uma interação com TLR-2 (receptor semelhante a Toll) do — peptidoglicano presente em partículas GEM, quando é conhecido que partí- culas GEM atuam como um agonista de TLR-2 em estudos in vitro.
Além disso, é conhecido que partículas GEM podem ativar a maturação das célu-
: las dendríticas e macrófagos in vitro (Audouy SA, et al. Vaccine 2007 Mar 22;25(13):2497-506). Assim, ambas, a ativação de TLR-2 e maturação das células dendríticas podem ter contribuído para a resposta imune de mucosa mais forte.
Recentemente, muita ênfase é colocada sobre o fenótipo da res- posta imune, isto é, resposta Th1, Th2 ou balanceada. A resposta Th1 é considerada ser superior a resposta Th2 ou mista porque ela 1) resulta em melhor proteção a partir de infecção; e 2) auxilia em neutralização de vírus através de seceção de INF-y. Além disso, a infecção natural também induz umtipoTh1 de resposta. Entretanto, vacina de subunidade administrada via a via i.n.e muitos dos adjuvantes nasais como quitosano, ISCOMS, lipídeos É e LT induz uma resposta tipo Th1/Th2 mista. Em contraste, i.n. de acordo com a invenção induziu uma resposta inclinada na direção de tipo Th1. As- sim, partículas GEM modulam a resposta a partir de uma resposta balance- ada para uma inclinada para Th1. Além disso, a formulação de vacina aqui apresentada é muito mais conveniente para produção comparada à maioria dos outros sistemas adjuvantes que têm de ser pré-formulados. A formula- ção usada nestes experimentos foi preparada através de adição - mistura de partículas GEM com convencional vacina de subunidade. Partículas GEM podem ser produzidas em grandes quantidades sob condições estéreis e podem ser estocadas em temperatura ambiente por um longo tempo. A faci- lidade de formulação e administração torna vacina de subunidade influenza - GEM um candidato promissor para vacinação em uma situação pandêmica assim como em uma situação epidêmica.
Como é demonstrado em Exemplos 1 a 8, os inventores mos- tram que em vacina influenza i.n. com adjuvante de partículas GEM induz uma comparável imunidade sistêmica e superior imunidade mediada por cé- lula e mucosa comparada a imunização i.m. com vacina de subunidade in- fluenza sozinha. Em particular, ela induz comparáveis níveis protetores de imunidade como medidos por títulos HI após a primeira imunização de refor- ço comparada a imunização i.m. com vacina de subunidade influenza sozi- nha. Importantemente, ela induziu maiores níveis de sIgA que são a primeira
Ss linha de defesa durante infecção influenza no trato respiratório superior.
A- lém disso, ela elicitou uma resposta imune inclinada para tipo Th1 que é à" considerada prover superior proteção.
Em adição, estas respostas imunes foram mostradas prover completa proteção de camundongos imunizados com uma vacina influenza intranasal baseada em GEM.
O exemplo 7 (Figu- ras 9 e 10) demonstra a eficácia de uma composição de vacina influenza administrada oralmente.
O Exemplo 8 (Figura 11) mostra que também vaci- nas influenza baseadas em GEM intramusculares podem ser usadas para elicitação de altos níveis de sIgA no forro de mucosa do trato respiratório ou outras camadas de mucosa.
Em adição, a via intramuscular pode ser usada para vacina influenza misturada com partículas GEM para aumentar signifi- Í cantemente a potência da vacina referência de nível intramuscular regular ou : para reduzir a quantidade de antígeno (moderação de dose de antígeno) em uma maneira significante (Figura 12). Partículas GEM podem ser vistas co- mo adjuvantes seguros e potentes para vacina influenza liberada i.n., i.m. ou oralmente.
Outros antígenos virais apropriados incluem proteínas de vírus sincícial respiratório (RSV), por exemplo, as glicoproteínas de ligação (G) e fusão (F) de RSV, suas partes relevantes ou combinações tal como uma pro- teína FG quimérica (J Virol. 1991 July; 65(7):3789-3796). Infecção RSV tem sido globalmente um problema pernicioso e de muito tempo, incluindo os Estados Unidos, Europa, Austrália e Japao.
Ela é particularmente problemá- tica em bebês prematuros, crianças novas, e os idosos,, e realmente para todos os indivíduos com um sistema imune enfraquecido.
É estimado que cerca de dois terços de crianças abaixo de idade de 1 e quase todas as cri- anças entre a idade de 1 e 4 são infectadas pelo menos uma vez com RSV, com a maioria recuperando-se sem qualquer necessidade de atenção médi- ca.
Entretanto, 5-10% têm infecção severa prolongada, um fator acreditado ser predisposição para posteriores sintomas semelhantes a asma e respira- ção ofegante na infância.
Outros antígenos interessantes para serem usados em mistura com partículas de peptidoglicano incluem proteínas de vírus de imunodeficiência humana (HIV), em particular uma glicoproteína exposta
: sobre a superfície do envelope de HIV como gp120, gp140 ou gp160. gp120 é essencial para entrada de vírus em células quando ela desempenha um f papel vital na busca de específicos receptores de superfície de célula para entrada.
Uma formulação de vacina influenza com adjuvante como aqui provida compreende pelo menos um antígeno de vírus influenza ou sua pre- paração antigênica. Por exemplo, ela compreende uma proteína influenza ou um seu fragmento e/ou uma proteína de fusão compreendendo uma proteína influenza ou seu fragmento contanto que ele não esteja fundido a um domí- —niode ligação de peptidoglicano. Uma proteína heteróloga da invenção pode compreender qualquer antígeno influenza de interesse, incluindo antígeno Y hemaglutinina (HA), antígeno neuramidase (NA) ou uma combinação dos Ê mesmos. Preferivelmente, o antígeno influenza é um antígeno de superfície , isto é, não um antígeno estrutural tal como um ectodomínio de proteína nde matriz influenza 2 (M2e). Em uma modalidade, o antígeno influenza é outro que não M2e. Em um aspecto específico, a formulação de vacina influenza contem HÁ e/ou NA como antígenos influenza. Sequências de aminoácidos de uma variedade de diferentes proteínas HA e NA de influenza (por exem- plo, de diferentes subtipos, ou cepas ou isolados) são conhecidas na técnica e;são disponíveisem bases de dados públicas tal como GenBank. Preferi- velmente, uma formulação de vacina compreende pelo menos um subtipo HA. Cepas de vírus influenza para uso em vacinas mudam de esta- ção para estação. No atual período inter-pandêmico, vacinas tipicamente incluem duas cepas de influenza A (H1N1 e H3N2) e uma cepa de influenza B, e vacina trivalentes são típicas. A invenção também pode usar vírus de cepas pandêmicas tais como a nova flu suína' ou flu Mexicana' H1 ou ou- tras cepas pandêmicas (isto é, cepas para as quais o receptor de vacina e a população humana em geral são imunologicamente naturais), tais como ce- pas subtipo H2, H5, H7 ou H9 (em particular de vírus influenza A), e vacinas influenza para cepas pandêmicas podem ser monovalentes ou podem ser baseadas em uma vacina trivalente normal suplementada por uma cepa
: pandêmica. Dependendo da estação e da natureza do antígeno incluído na vacina, entretanto, a invenção pode proteger contra um ou mais de subtipos x H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16 de HA. Por exemplo, em uma modalidade a formulação de vacina i.n. con- tementre1a15ugdeHaA por cepa de influenza.
Em um aspecto específico, uma formulação de vacina compre- endendo um antígeno influenza ou sua preparação antigênica a partir de pelo menos duas cepas de vírus influenza, pelo menos uma cepa sendo as- sociada com um surto pandêmico ou tendo o potencial para ser associada comum surto pandêmico. A quantidade de partículas de peptidoglicano presentes em uma í formulação de vacina é preferivelmente suficiente para induzir níveis proteto- é res de inibição de títulos de hemaglutinina (HI) emuma estratégia de vacina- ção de reforço - prime. Por exemplo, uma formulação de vacina de acordo coma invenção pode compreender 0,001 a 1 mg, preferivelmente 0,01 a 0,1 mg, de micropartículas (peso seco) por micrograma de antígeno de vírus influenza. Formulações de vacina i.n. exemplares para uso humano incluem o seguinte: 0,3-2,5 mg GEMs (peso seco), HA trivalente (ovo, célula, recom- binante) 3x1-15 ug ou HA monovalente (pandêmica) 0,1-15 ug, 0,05-0,15 M PBSpH6-+8.
Uma composição de vacina nasal da presente invenção pode ser formulada como uma composição de tipo pulverizada ou líquida, particular mente, aerossóis, gotas, inalador ou insuflação de acordo com os processos de administração, e pulverizados ou microesferas são preferidos. Uma com- posição para gotas nasais pode incluir um ou mais excipientes aceitáveis tais como antissépticos, reguladores de viscosidade, reguladores osmóticos e tampões. Entretanto, a invenção não é limitada a formulações de vacina nasais. Foi surpreendentemente verificado que a adição de GEMs potencia- lizou a eficácia para uma vacina HA i.m. Isto pode conduzir a estratégias de “moderação de dose. Ver Exemplos 8 e 9, Figura 12.
Da mesma maneira, a invenção também provê uma composição compreendendo micropartículas de peptidoglicano e uma preparação de va-
: cina HA intramuscular (convencional). Além disso, HA influenza misturada com GEMs resultou com administração oral em títulos de HI em soro prote- r tores (Exemplo 7, Figuras 9 e 10).
Ainda um aspecto da invenção refere-se a um recipiente com- preendendo uma formulação de vacina aqui descrita. Em uma modalidade, ele é um dispositivo de dispensamento intranasal, tal como um dispositivo na forma de um aerossol ou um sistema de liberação de gotas (espargimento intranasal), opcionalmente provido com instruções para uso.
Ainda, a invenção provê um processo para profilaxia de infecção ou doença influenza em um sujeito, cujo processo compreende administra- ção ao sujeito de uma formulação de vacina como aqui descrita acima. De- í vido sua segurança, a formulação de vacina é particularmente apropriada : para uso em uma população humana em alto risco . Por exemplo, a presente invenção provê um processo conveniente, seguro e confiável para profilaxia de infecção ou doença influenza nos idosos, em crianças até 2 anos de ida- de, ou em pacientes doentes crônicos. O processo profilático pode compre- ender liberação intranasal, oral ou intramuscular da formulação de vacina, preferivelmente liberação intranasal. É muito conveniente usar um dispositi- vo de dispensamento, por exemplo, um dispositivo de dispensamento na formade um aerossol ou um sistema de liberação de gotas.
A quantidade de administração de uma vacina é determinada como a quantidade que é capaz de induzir efetivamente uma resposta imu- ne. Por exemplo, a frequência mde administração de uma vacina para hu- mano é uma a várias vezes por dia e a dosagem é de 1-250 ug e preferivel- mente2-50y4g.
Vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser usa- das para tratar ambos, crianças e adultos. Vacinas influenza são atualmente recomendadas para uso em imunização pediátrica e adulta, a partir da idade de 6 meses. Assim, o paciente pode ser de menos que 1 ano de idade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 15-55 anos de idade, ou pelo menos 55 anos de idade. Pacientes preferidos para recepção de vacinas são idosos (por exemplo, 2 50 anos de idade, 2 60 anos de idade, e preferivelmente >
À 65 anos), os jovens (por exemplo, < 5 anos de idade), pacientes hospitaliza- dos, trabalhadores de saúde, serviço armado e pessoal militar, mulheres is: grávidas, o doente crônico, pacientes imunodeficientes, pacientes que têm de tomar um composto antiviral (por exemplo, um composto oseltamivir ou zanamiívir, tal como fosfato de oseltamíivir, ver abaixo) nos 7 dias antes de receber a vacina, pessoas com alergias a ovo e/ou pessoas viajando para fora. Como será entendido, as vacinas não são apropriadas somente para estes grupos, entretanto, e podem ser usadas mais genericamente em uma população. Para cepas pandêmicas, administração a todos os grupos de idadeé preferida.
Também abrangido no escopo da presente invenção é um pro- É cesso para provimento de uma formulação de vacina influenza, compreen- : dendo as etapas de (a) provimento de micropartículas de peptidoglicano ob- tidas de uma bactéria Gram - positiva; (b) provikmento de pelo menos um antígeno influenza ou sua preparação antigênica; e (c) mistura de micropar- tículas e o antígeno(s). Ambas etapas (a) e (b) podem ser realizadas usando metodologia que é conhecida per se na técnica. Uma vez que a etapa (b) não requer a fusão ou ligação de antígeno a um domínio de ligação de pep- tidoglicano como Protan, um processo da invenção é muito mais convenien- tee economicamente atraente que processos da técnica anterior em que antígeno tem de ser primeiro modificado (por exemplo, através de fusão a uma porção ligadora proteica) para o mesmo ligar-se a micropartículas de peptidoglicano. Em contraste, a presente invenção pode ser praticada usan- do vacinas subunidades convencionais como tais.
Da mesma maneira, a invenção também refere-se ao uso de mi- cropartículas de peptidoglicano obtidas a partir de uma bactéria Gram - posi- tiva como adjuvante em uma formulação de vacina influenza, a dita formula- ção compreendendo um antígeno de vírus influenza que não está fundido ou de outro modo ligado covalentemente a uma porção ligante de peptidoglica- noproteica.
Legendas das Figuras Figura 1: IgG em soro total específico antígeno HA (HIN1
: A/Beijing) expresso em ug/mlL em camundongos imunizados três vezes com PBS ou HÁ + diferente quantidade de partículas GEM (expressa em mg de f peso seco). As barras de erros indicam o erro padrão de média (SEM). Figura 2: Análise comparativa de títulos de diluição de IgG em sorototal específico antígeno HA (H1N1 A/Beijing) em diferentes grupos HA, isto é, em HA + GEM ou HA i.m. em 14, 28 e 42 dias após a primeira imuni- zação (1º, 2º e 3º imunização, respectivamente). As barras de erros indicam o SEM. Figura 3: títulos de HI específicos de antígeno HA (H3N2 AMisconsin) em soros de camundongos imunizados três vezes. A. Análise comparativa de títulos HI em diferent4es grupos HA,isto é, i.m., i.n. e i.n. + ' GEM em O, 28 e 42 dias após a primeira imunização. B. Análise comparativa . de títulos HI entre três grupos HA, isto é, i.m,, i.n., i.n. + GEM em 42 dias após a primeira imunização. Os números acima de colunas indicam o núme- roderespondedores por grupo. As barras de erro indicam o SEM. Figura 4: títulos de sIgA específico de antígeno HA (H3N2 A/Misconsin) em lavagens nasais (A) e de pulmão (B) de camundongos i- munizados com HA i.m., i.n., ou i.n. + GEM. Os números acima de colunas indicam o número de respondedores por grupo. As barras de erro indicam o
SEM Figura 5: títulos de subtipo IgG específico de antígeno HA (H3N2 A/MWisconsin) em soros de camundongos imunizados com HA i.m,, i.n., ou i.n. + GEMOs títulos de I9G1 (A), IgG2a (B), e IgG2b (C) foram determina- dos. Os asteriscos significam um valor-P < 0,05 para a comparação indica- da Asbarras de erro indicam o SEM. Figura 6: resposta imune mediada por célula foi determinada a- través de determinação de perfil de liberação de citocina, isto é, IL4 (A), IFN, (B) em camundongos imunizados com HA i.m., i.n. ou i.n. + GEM. O asterisco significa um valor-P < 0,05 para a comparação indica. As barras de erroindicamo SEM. Figura 7: Sobrevivência após desafio (%). Animais foram vacina- dos com 5 ug HA por dose e vacinas contendo GEM foram suplementadas
: com 0,3 mg de GEM por dose. Animais foram desafiados 3 semanas após a última imunização de reforço e acompanhados por 14 dias. Análise compa- 7 rativa entre os cinco grupos de vacina. Figura 8: Títulos virais (A/Porto Rico/8/34[PR8], TCIDso [dose in- fecciosa em cultura de tecido]) nos puimões após desafio (por grama de te- cido de pulmão). Pulmões foram isolados n4 dias após desafio. Análise comparativa entre cinco grupos. Erro padrão da média (SEM) é indicado pe- las barras de erro.
Figura 9: Títulos de HI de soro específicos para antígeno subuni- dade (A/Hiroshima [H3N2]) em camundongos imunizados com vacina influ- enza HA ou HA + GEM. Camundongos foram imunizados três vezes com 20 À ug HA por dose. Vacinas GEM contiveram 0,3 mg de GEM por dose. * indica P < 0,05. Títulos acima de 2log5,3 são protetores. Erro padrão da média (SEM) é indicado pelas barras de erro.
Figura 10: títulos de sIgA específico de antígeno de subunidade (A/Hiroshima [H3N2]) em lavagens intestinais (barras cinzas) e nasais (bar- ras negras) de camundongos imunizados com vacina influenza HA oral ou HA + GEM oral. Os números acima de colunas indicam o número de res- pondedores por número de animais analisados. Erro padrão da média (SEM) éindicado pelas barras de erro.
Figura 11: títulos de IgA específico HA em lavagens nasais e va- ginais de camundongos fêmeas que foram vacinadas três vezes (intervalo de 14 dias) intranasalmente (painel A) ou intramuscularmente (painel B) com uma quantidade fixa de HA (5 ug B/Shangdong/7/97), com ou sem 0,3 mg deGEMs. Amostras de lavagens foram tomadas duas semanas após a últi- ma imunização. Erro padrão da média (SEM) é indicado pelas barras de er- ro.
Figura 12: títulos virais de pulmão de camundongos vacinados duas vezes com PBS (falso), 1 uh HA (A/PuertoRico/8/34) sem GEMs ou com0,04yugHA (25 vezesmenos antígeno) formulado com GEM. Duas se- manas após administração da dose final, camundongos foram desafiados com A/PuertoRico/8/34 adaptado a camundongo. Cinco dias após o desafio,
: os animais foram sacrificados, pulmões foram isolados e homogeneizados e títulos virais foram determinados através de titulação de ponto final sobre F células MDCK. Erro padrão da média (SEM) é indicado pelas barras de erro. Figura 13: títulos de diluição de IgG específico antígeno HBsAg em ;sorosde camundongos C57BL6 imunizados três vezes com HBsAg so- zinho (i.n.), + GEM (i.n.) ou VaxPro (i.m.). As barras de erro indicam o SEM.
Figura 14: títulos de sIgA específicos antigeno HBsAg em lava- gens nasais e vacinais de camundongos C57BL6 imunizados três vezes com HBsAg + GEM (i.n.) ou VaxPro (i.m.). As barras de erro indicam o SEM.
Figura 15: resposta em soro específica de antígeno HBsAg me- dida como mil/mL de ratos Wistar imunizados três vezes com HBsAg sozi- nho (i.n.), + GEM (i.n.) ou VaxPro (i.m.). Um nível de = 10 mil/mL é conside- é rado ser protetor. As barras de erro indicam o SEM. Figura 16: tempos de sobrevivência em dias após desafio. Os materiais de testes de todos os grupos foram aplicados intranasalmente (i.n.). camundongos forram imunizados com PBS (imunização falsa), com as proteínas P3 pneumococais (PspA, CbpA, PdBD) misturadas com GEM (GEM+P3) ou com proteínas P3 ligadas a GEM (GEM-P3). Ambas vacinas contiveram 5 ug de cada antígeno. Cada símbolo representa 1 animal. A linha horizontal indica a média.
Figura 17: status de saúde de camundongos 40 horas após de- safio intranasal com a cepa D39 (sorotipo 2) virulenta de S. pneumonia que foram imunizados com PBS (imunização falsa), GEM misturada com as pro- teinas P5 (GEM + P5) ou GEM sem proteínas P5 ligadas (GEM-P5). Vacinas contiveram 0,5 ug IgA1prt, 3 ug Psaa, 1,5 UG cBPa, 2 UG Ppm, 2 ug PspA e 0,3 mg GEM. O status de saúde 40 horas após desafio é uma medida para a capacidade de proteção das vacinas.
Seção Experimental Materiais e Processos Vacina de subunidade monovalente de influenza de cepa A/MWisconsin (H3N2) derivada de ovos e vacina de vírus partido A/Beijing (H1N1) derivada de ovos foram usadas neste estudo. A concentração da
' hemaglutinina (HA) na vacina foi determinada usando o ensaio de imuno difusão radial simples. ft HBsAg recombinante (ad/ay) isolado de Hansenula polymorpha foi usado neste estudo. HBVaxPro de Sanofi Pasteur/MSD foi usada como a vacina HBsAg padrão (40 pug/mL). Partículas GEM foram produzidas como descrito anteriormente (Van Roosmalen et al, Methods 2006, Feb; 38(2):144-9).
1.1 Imunizações e Desafios Experimentos animais foram avaliados e aprovados de acordo comas diretrizes providas por Dutch Animal Protection Act. Camundongos C57BL6, Balb/c (6-8 semanas) e ratos Wistar Unilever (10 semanas) foram É adquiridos de Harlan, The Netherlands. Camundongos CD1 foram adquiridos : de Charles River, Germany. Os camundongos foram agrupados em 5-10 animais cada. Os grupos de ratos consistiram em 4 animais cada. Todos os grupos de camundongos foram imunizados com vacinação prime no dia 0 e duas vacinações de reforço no dia 14 e 28 com 5 ug de HA ou no dia 0 e duas vacinações de reforço nos dias 10 e 20 com 5 ug de HBsAg. Imuniza- ções intranasais de camundongos foram feitas com 10 ul de vacina dividi- dos em ambas narinas sob anestesia de inalação (Isoflurano/O>). Grupos de ratos foram imunizados com vacinação prime no dia O e duas vacinações de reforço no dia 10 e 20 com 25 ug de HBsAg. Imunizações intranasais de ra- tos foram feitas em maneira similar como para camundongos com 30 ul de vacina. Grupos de camundongos intramusculares foram injetados com 50 ul. de vacina em músculos de coxa posterior sob anestesia de inalação (Isoflu- rano/O>). Grupos de ratos intramusculares foram injetados com 200 ul de vacina divididos sobre ambos músculos de perna traseira. Os camundongos e ratos foram sacrificados duas semanas após a segunda vacinação de re- forço. Após os animais serem sacrificados, os baços dos camundongos Balb/c foram colhidos e subsequentemente estocados em meio Glutamax —IMDM suplementado com FCS 5%, penicilina/streptomicina 1% e 8-mercapto etanol 50 uM a 4ºC. Administrações orais em camundongos foram feitas 3 vezes, isto é, no dia 0, 14 e 28. Em resumo, 20 ug de vacina de subunidade ã com ou sem 0,3 mg de partículas GEM foram administrados intragastrica- mente em 200 microlitros de solução de bicarbonato de sódio (3,2% pe- so/volume). A administração oral foi realizada sem anestesia usando uma agulha de alimentação de aço inoxidável.
Em experimentos desafios, ca- —mundongos imunizados com vacinas HA de influenza foram desafiados in- tranasalmente (40 microlitros) 3 semanas após a última imunização de refor- ço com 100 unidades formadoras de placa (PFU) de cepa A/PuertoRico/8/34 (dose alta, 9 animais por grupo) ou 66 PFU de cepa A/Puerto Rico/8/34 (do- se baixa, 4 animais por grupo). Administração intranasal de vírus desafio foi conduzida sob anestesia leve do animal através de aspiração de Oyz/isoflurano.
Os animais que receberam a dose baixa foram sacrificados em 4 após desafio e os pulmões foram isolados para determinação de carga : viral nos pulmões através de uso de um ensaio baseado em célula in vitro.
Em resumo, células MDCK junto com as diluições virais foram incubadas por 1 hora em uma incubadora (37ºC, 5% CO») e lavadas subsequentemente uma vez com PBS.
Meio fresco contendo tripsina (100 microlitros de meio com 7,5 ugiml. de TPCK tripsina) foi adicionado às cavidades.
As células foram incubadas por 72 horas em uma incubadora (37ºC, 5% CO) após o que os sobrenadantes foram transferidos para placas de fundo redondo (Costar) junto com 50 microlitros de eritrócitos de porquinho da Índia (lava- dos) 1%. A mistura foi incubada por 2 horas em temperatura ambiente e a hemoglutinação lida.
Os animais que receberam a dose alta foram seguidos para sinais clínicos até dia 14 após desafio e sacrificados a menos que ani- mais tenham sido sacrificados antes devido a sofrimento inaceitável (ponto final humano: 10% de perda de peso em um único dia ou 15% em múltiplos dias combinado com letargia, pêlo encrespado e moribundo). Para imunizações pneumococais camundongos CD1 receberam intranasalmente uma dose de 0,01 mL (10 microlitros) em dias 0, 14 e 28. Os grupos intramusculares receberam uma dose de 0,04 mL (40 microlitros) nosdias0,14e28 injetados no músculo da coxa dos membros posteriores (alternando esquerda, direita e esquerda). Três semanas após as imuniza- ções de reforço finais, camundongos foram desafiados com 1x10º CFU de S.
: pneumoniae cepa TIGR4. Pneumococos foram introduzidos intranasalmente em um inoculum de 50 microlitros enquanto camundongos foram levemente Fr anestesiados através de inalação de anestesia (isoflurano). Camundongos foram monitorados frequentemente seguindo infecção e classificados de a- cordo com a sua condição baseado em status de saúde, peso de corpo e temperatura de corpo.
As contagens bacterianas no sangue foram determi- nadas em 40 horas após desafio, e camundongos que foram adoentados e necessitaram ser sacrificados (ponto final humano) foram sacrificados assim como camundongos que tiveram mais que 5,4x10º CFU/mL em seu sangue.
Camundongos restantes foram sacrificados quando eles foram adoentados ou no fim do estudo (14 dias após desafio). É 1.2 Coleta de soros e lavagens de mucosas
. Amostras de sangue foram retiradas três vezes durante os expe- rimentos antes de cada administração de vacina e uma sangria final foi to- mada no término de 14 dias após a última administração de reforço.
Soros foram obtidos por centrifugação de sangue em 1200 x g por 5 minutos e as amostras foram subsequentemente estocadas a -20ºC até ainda análises.
Lavagens nasais foram obtidas através de lavagem de nasofa- ringe com 1 mL de PBS (suplementado com coquetel de inibidores de prote- ase). Lavagens vaginais foram obtidas através de lavagem de vagina com 100 microlitros de PBS (suplementado com coquetel de inibidores de protea- se). A alíquota de 100 microlitros foi retirada e reintroduzida nove vezes a- través do uso de uma pipeta com uma ponta de 200 microlitros amarela liga- da.
A lavagem foi transferida para um frasco limpo e estocada a 20ºC.
Lava- gens intestinais foram realizadas através de intubação de duodenum via uma incisão posterior para o estômago usando uma agulha de alimentação de teflon flexível de 1,2 mmx38 mm com ponta de silicone.
Antes de lava- gem, o jejuno foi fechado anterior do ileo com uma ligadura.
A seguir, uma seringa de 1 mL foi ligada à agulha de alimentação e a lavagem foi realizada através de repetida lavagem de duodeno/jejuno com 1 mL de PBS.
Imedia- tamente após cada coleta de amostra, a lavagem foi misturada com 10 mL de solução estoque (suplementada com coquetel de inibidores de protease)
. e lavagens foram mantidas sobre gelo até ainda preparação. Amostras de lavagens foram centrifugadas a 11000xg por 15 minutos, e sobrenadantes foram coletados e estocados a 4ºC até ainda análises.
1.3 ELISA A resposta de anticorpo para antígeno HA foi determinada usan- do ensaios ELISA para determinar títulos de diluição de IgG, I9G1, IgG2a e IgG2b, sIgA secretado em mucosa ou para determinar a quantidade de IgG específico-HA. Para os títulos de diluição, as placas foram incubadas com 200 ng de HA/cavidade. Após incubação por toda noite com HA, as placas foram bloqueadas com albumina de soro bovino 3% (Sigma-Aldrich, Nether- lands). Então placas foram lavadas e incubadas com soros e amostras de É mucosa em diluição serial por 1,5 horas a 37ºC. A seguir, as placas foram é lavadas e incubadas com anticorpos cabra conjugados com peroxidase de raiz forte direcionados contra IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgA (Southern Bio- tech, Birmingham, AL, USA). Finalmente, a solução substrato (0,02%, diclo- ridrato de 1,2-fenileno diamina em tampão fosfato 50 mM pH 5,6, , contendo H2O,2 0,006%) foi adicionada e as placas foram incubadas no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de H2SO, 2 M e absorbância em 490 nm foi lida com um leitor Benchmark Mi- croplate (BioRad, Hercules, CA).Títulos reportados são a recíproca da dilui- ção de amostra calculada correspondendo com uma A490 >= 0,2 após corre- ção de fundo. Para determinar a quantidade de IgG em soro específico - HA,as placas de microtitulação foram revestidas com 200 ng/100 ul /cavidade de H1N1 A/Beijing e com IgG anti-camundongo para a curva de calibração. Após incubação por toda noite a 4ºC, as placas foram lavadas 2 vezes com tampão de revestimento (carbonato - bicarbonato 0,5 M, pH 9,6- 9,8). Bloqueio foi realizado com Protifar Plus (2,5% em tampão de revesti- mento) por 45 minutos a 4ºC. Após lavagem de placas com tampão de re- vestimento e PBS/0,05% Tween20 por quatro vezes, os soros e a curva de calibração (I9G1 camundongo) foram incubados por 1,5 horas a 4ºC. Sub- sequentemente, placas foram lavadas por três vezes com PBS/Tween 20. Imunoglobulina conjugada com peroxidase de raiz forte (ITK, Southern Bio-
ã tech), diluição 1:5000 em PBS/Tween20, foi adicionada às cavidades e incu- bada por 1 hora a 4ºC. Após lavagem de placas três vezes com E PBS/Tween20 e uma vez com água, as placas foram manchadas por 30 mi- nutos usando a solução substrato (dicloridrato de 1,2-fenileno diamina 0,02% emtampão fosfato 50 MM pH 5,6, contendo HzO,2 0,006%). A reação de cor foi interrompida com H2SO, 2 M. Medições foram realizadas em 493 nm. A resposta de anticorpo de soro para antígeno HBsAg foi determinada usando ensaios ELISA para determinar títulos de diluição de IgG. Para este propósi- to, placas ELISA revestidas com 2 ugiml de HBsAg em PBS, 50 ulf/cavidade foram adicionados e incubados por 1 hora a 37ºC. Amostras de soro foram diluídas serialmente em tampão de bloqueio e 50 ul/cavidade É foram adicionados e incubados por 1 hora a 37ºC. Placas foram lavadas 6x - com tampão de lavagem. IgG anti-rato cabra conjugado com fosfatase alca- lina (Southern Biotech) foi usado como anticorpo secundário (diluído 1:3000 em tampão de bloqueio) e 50 ul /cavidade foram adicionados e incubados por 1 hora a 37ºC. Placas foram lavadas 6x com tampão de lavagem (PBS/Tween20 1%). Sal di-sódio de fosfato de p-nitro fenila (Calbiochem) em tampão substrato (dietanol amina 10 mMM/MgCl, 0,5 mM pH 9,5) foi usa- do para detecção e medições foram feitas em 405 nm. Títulos são expressos como títulos de diluição, definidos como a diluição que mostra duas vezes a OD de um padrão pré-imune.
SIgA secretado em mucosa específico - HbsAg foi determinado usando ensaios ELISA para determinar títulos de diluição de IgG. Para este propósito, placas ELISA foram revestidas, lavadas e bloqueadas como an- tes. Lavagens de mucosa foram diluídas serialmente em tampão de bloquei- o. 50 ul/cavidade foram adicionados e incubados por 1 hora a 37ºC. Placas foram lavadas 6x com tampão de lavagem. IgA anti-rato cabra conjugado a peroxidase de raiz forte (Nordic Immunology) diluído 1:1000 em tampão de bloqueio foi usado como anticorpo secundário e 50 ul /cavidade foram adi- cionados e incubados por 1 hora a 37ºC. Placas foram lavadas 6x com tam- pão de lavagem (PBS/0,1% tween20). TMB (3,3',5,5'-tetra metil benzidina, Sigma, Lote 055K8208) foi dissolvida em 1 mL de DMSO e 9 mL de tampão fosfato - citrato 0,05 M, pH 5,0 foi usado para detecção. 2 microlitros de pe- róxido de hidrogênio 30% foram adicionados por 10 mL de solução de tam- f pão substrato, imediatamente antes de uso. A reação de cor foi interrompida com ácido sulfúrico 2 M e medições foram feitas em 450 nm. Títulos são ex- pressos como títulos de diluição, definidos como a diluição que mostra três vezes a OD do fundo (revestimento HBsAg incubado com tampão de blo- queio).
1.4 Ensaio de inibição de hemaglutinação (HI Títulos de HI em soro foram determinados como descrito previ- amente [35]. Em resumo, soro foi inativado a 56ºC por 30 minutos. De modo a reduzir hemaglutinação não-específica, suspensão 25% de caolin foi adi- É cionada a soros inativados. Após centrifugação a 1200 x g, 50 microlitros do S sobrenadante foram transferidos em duplicata para placa de fundo redondo de 96 cavidades (Greiner, Alphen a/d Rijn, Netherlands) e diluídos serial- mente duas vezes em PBS. Então 4 unidades de hemaglutinação (HAU) de vírus inativado influenza AMVisconsin foram adicionadas a cada cavidade e as placas foram incubadas por 40 minutos em temperatura ambiente. Final- mente, 50 microlitros de células vermelhas do sangue de porquinho da Índia 1% foram adicionados a cada cavidade e incubados por 2 horas em tempe- ratura ambiente. A mais alta diluição capaz de prevenir hemaglutinação foi classificada como título-HI.
1.5 Determinação de título de Ig específico-HBsAg com o sistema Abbott AxSYM Determinação quantitativa de anticorpo contra HBsAg expressa em milímL foi feita sobre um sistema Abbott AxSYM, através de ensaio AXxSYM AUSUB. Este ensaio é uma micropartícula EIA usando HBsAg re- combinante (ad/ay) sobre micropartículas como a fase sólida e biotina aco- plada a HBsAg recombinante como o conjugado. Na etapa seguinte, anti- biotina conjugada a fosftase alcalina é ligada ao sanduíche antígeno. A mis- tura de reação é transferida para uma matriz de fibra de vidro inerte à qual as micropartículas se ligam irreversivelmente. Fosfato de metil umbeliferona é usado como um substrato, e a fluorescência do produto final, metil umbeli-
: ferona, é lida pelo instrumento.
1.6 Elispot O ensaio Elispot foi realizado como descrito anteriormente (Amo- rij JP et al. Vaccine 2007 Dec 21; 26(1):67-76). Em resumo, placas de micro- titulação de 96 cavidades (Greiner, Alphen a/d Rijn, Netherlands) foram in- cubadas por toda noite a 4ºC com interferon-y anti-camundongo (IFN-y) e interleucina-4 (IL-4) (BD, Pharmingen, Erembodegem, Belgium). Após lava- gem de placas três vezes com PBS/Tween (Sigma-Aldrich, Netherlands) e- las foram bloqueadas (PBS + BSA 4%) por 1 hora a 37ºC, células de baço foram adicionadas às placas em concentração de 1x10º células/cavidade com ou sem vacina subunidade como um peptídeo de estimulação. Após E incubação por toda noite a 37ºC, CO, 5%, as células foram lisadas com á- : gua fria. A seguir, as placas foram lavadas cinco vezes com PBS/Tween e incubadas com anticorpos IL-4 e IFN-y anticcamundongo biotinilado (BD Pharmingen) em concentração de 0,125 ug/ml. em PBS + BSA 2%. Após lavagem as placas foram incubadas com streptavidina fosfatase alcalina (BD Pharmingen) por 1 hora a 37ºC. Finalmente, após lavagem três vezes com PBS/Tween e duas vezes com PBS, os pontos foram desenvolvidos usando a solução substrato consistindo em 1 mg/mL de fosfato de 5-bromo-4-cloro- 3-indolila, 2-amino-2-metil-1-propanol 0,92% peso/volume, 0,08 ul/ml de Triton X-405, MgCl2 1 M e 6 mg/mL de agarose. Os pontos foram contados usando um leitor Elispot (A.EL. VIS Elispot reader).
1.7 Análises estatísticas Análises estatísticas foram realizadas usando o teste-t de Stu- dentouum teste ANOVA não-paramétrico com p < 0,05 como o nível míni- mo de significância. Os resultados são apresentados como média +/- erro padrão de média (SEM) a menos que indicado de outro modo. Exemplo 1: Efeito adjuvante de GEMs em vacinas HA intranasais O aperfeiçoamento de resposta de anticorpo em soro sistêmica —na direção de HA intranasal (5 ug HIN1 A/Beijing) foi avaliado no modelo de camundongo intranasal através de adição de várias quantidades de partícu- las GEM (0, 0,03, 0,1 e 0,3 mg de peso seco) à HA. Camundongos recebe-
; ram três doses de vacina, cada uma com intervalos de duas semanas e du- as semanas após as últimas imunizações de reforço, amostras de soro fo- - ram analisadas. A Figura 1 mostra que HA sem adjuvante elícita somente um baixo nível de anticorpos IgG sistêmicos (5,0 ug/mL) através de via intra- nasal de administração. Adição de uma pequena quantidade de partículas GEM (0,03 mg) já aumenta este nível por um fator 4. O melhor aperfeiçoa- mento foi verificado com a adição de 0,1 mg de partículas GEM para apro- ximadamente 67 ug de IgG específico HA por mL, que ainda não aumenta através de adição de mais partículas GEM. Estes resultados mostram clara- mente que mistura de partículas GEM com HA influenza aperfeiçoa a res- posta imune específica de antígeno em uma maneira dependente de dose. Exemplo 2: GEM intranasal misturada com HA comparado com HA intra- : muscular Foi feita uma comparação entre uma vacina HA + GEM intrana- sale as vacinas HA de modo tradicional são administradas, isto é, HA sem adjuvante administrado através de via intramuscular. Camundongos recebe- ram três doses de HA i.n. (5 ug HIN1 A/Beijing) + GEM (0,15 mg peso seco) ou HA i.m. (5 ug) com intervalos de duas semanas entre as doses. O título de IgG em soro específico - HA foi determinado sobre amostras tomadas duassemanas após cada imunização de modo a comparar a magnitude e as cinéticas da resposta imune das vacinas intranasal e intramuscular. A Figura 2 demonstra claramente que ambas, a magnitude e as cinéticas das vacinas HA + GEM i.n. são similares àquelas da vacina HA i.m.. Não existem dife- renças significantes entre as respostas das vacinas i.n. e im. após cada administração (cada valor-p > 0,05).
Exemplo 3: GEM intranasal misturado com HA elícita respostas protetoras A capacidade protetora de vacinas influenza é determinada atra- vés de medição de títulos de HI. Os títulos de HI foram determinados para todos os camundongos após a 1º e 2º imunização de reforço com HA i.n. (5 ug H3N2 AMWisconsin), HA + GEM (0,3 mg de peso seco), HA i.m. A Figura 3 mostra que ambas vacinas, i.n. com adjuvante GEM e a i.m. convencional atingiram títulos HI comparáveis acima de 2log 6 após a 1º imunização de
À reforço (p = 0,2062). Estes títulos aumentam em ambos os casos para valo- res entre 2log7 e 2log8 sem diferenças significantes entre os dois tratamen- tos (p = 0,7611). Imunização i.n. com a vacina subunidade sozinha induziu baixos títulos HI, mesmo após duas imunizações de reforço. Além disso, somente 50% dos animais responderam após imunização com vacina subu- nidade i.n., enquanto todos os animais responderam nos dois outros grupos de vacina. Uma vez que título HI acima de 2log5,3 é considerado ser prote- tor em seres humanos, estes resultados indicam que um único reforço é su- ficiente para vacinas influenza com adjuvante GEM atingirem imunidade pro- tetora, É evidente a partir dos resultados que formulação de vacina subuni- dade com partículas GEM induziu uma forte resposta imune sistêmica com- É parada a ambas, imunização i.n. e i.m. com vacina subunidade sozinha. - Exemplo 4: Resposta imune em mucosa de GEM intranasal mistura com HA Foi reportado previamente que imunização i.n. pode induzir imu- —nidade de mucosa local no trato respiratório, isto é, a porta de entrada de vírus influenza. A ativação da imunidade de mucosa inicia as células B e T subjacentes e resulta em secreção de sIgA em sítios de mucosa. Conse- quentemente, os títulos de sIgA específico de influenza foram determinados em lavagens nasal e de pulmão dos camundongos (Figura 4).
Imunizações i.m. elicitaram níveis de slgA em lavagens nasais e de pulmões abaixo de limites de detecção na maioria dos camundongos (somente um de oito camundongos mostrou uma resposta na lavagem na- sal). Similarmente, as imunizações i.n. com vacina subunidade sozinha ren- deram baixos títulos de sIgA em lavagens de pulmões e nasais (3/8 respon- —dedores) Em contraste, imunização i.n. com HA + GEM induziu uma forte resposta imune em mucosa em ambos, o trato respiratório superior e inferior. Exemplo 5: Fenótipo de resposta imune de GEM intranasal misturada com
HA De modo a avaliar o fenótipo da resposta, isto é, a razão de T- auxiliar 1/T-auxiliar 2 (Th1i/Th2), sub-tipos IgG, respostas IFN-y e I1L-4 foram determinadas.
Obtenção de perfil de sub-tipo de IgG (Figura 5) mostrou que i-
munização i.n. com vacina subunidade sozinha induziu baixas respostas de 19G1, IgG2a e IgG2b.
Como reportado anteriormente [35, 36] imunização . im. com vacina subunidade induziu altas resposta IIG1 mas pequenas IgG2a e IgG2b, indicando uma resposta imune inclinada para direção de resposta Th2. Em comparação a imunização i.m., imunização i.n. com HA + GEM induziu resposta de IgG2a (p=0,042) e IgG2b (p=0,030) significante- mente maiores e menor resposta de I9G1 (p=0,0135). Estes resultados indi- cam que as respostas de anticorpos geradas por vacina HA + GEM é signifi- cantemente mais inclinada para um fenótipo Thi que a vacina i.m. conven- cional.
O tipo de resposta imune (Figura 6) foi ainda avaliado através de f determinação de esplenócitos produzindo IL e IFN-y específicos de antí- S geno dos camundongos imunizados.
Imunização i.m. com vacina subunida- de resultou em um maior número de células produzindo IL-4 que células produzindo IFN-y, novamente indicando uma resposta Th2 predominante.
Imunização i.n. com vacina subunidade resultou em menores números de células produzindo 1LA4 mas números substancialmente maiores de células produzindo IFN-y (Figura 6), resultando em uma resposta Thi/Th2 balance- ada.
O aumento em células T produzindo IFN-y foi mesmo significantemente (p=0,0373) mais pronunciado após imunização i.n. com HA + GEM, indican- do um desvio da resposta imune a partir de Th1/Th2 balanceada para uma resposta Th1i predominante.
Exemplo 6: Proteção de GEM intranasal misturadas com HA em modelo de desafio letal A capacidade protetora das respostas imunes geradas com HA + GEM i.n. foi avaliada em um modelo de desafio letal.
Camundongos foram imunizados i.n. com PBS (imunização falsa) ou com HA sozinho (2 vezes), HA + GEM (2 vezes) ou como HA + GEM (3 vezes). Foi feita uma compara- ção com a vacina padrão HA aplicada intramuscularmente.
A HA neste ex- — perimento foi derivada de cepa PR8 (H1N1). A dose foi de 5 ug HA por dose e 0,3 mg de GEM por dose no caso de GEM ter sido adicionada à vacina.
Vacinas foram administradas com intervalos de 2 semanas.
Desafio letal foi ã feito 3 semanas após a última imunização de reforço com uma dose letal de PR8. Proteção contra desafio foi observada para os animais de grupo HA + GEM (2 vezes i.n.; 9/9 sobreviventes), HA + GEM (3 vezes i.n.; 9/9 sobrevi- ventes) e controle padrão HA (i.m.; 9/9 sobreviventes) [Figura 7]. Todos os animais dentro destes grupos não mostraram sinais clínicos após desafio (nenhuma letargia, pêlo amarrotado ou postura de corcunda) e sobreviveram até dia 14 até o final do experimento.
Proteção correlacionou com a ausên- cia de perda de peso de corpo (não mostrado). Em contraste, maioria dos animais dentro de grupo HA i.n. e PBS (imunização falsa, controle negativo) mostrou severa perda de peso de dia 3 e 4 em diante, respectivamente e sofreram eutanásia no dia 5 a 8 após desafio devido a severos sintomas clínicos (peso < 85%, letargia, pêlo amar- : rotado, corcunda). Determinação dos títulos virais nos pulmões 4 dias após desafio demonstrou que vacinações i.n. com HA + GEM (2 ou 3 vezes) conduziu a uma redução de aproximadamente 1000 a 10 000 vezes em título viral nos pulmões 4 dias após desafio comparado ao grupo controle negativo PBS (Figura 8). Uma redução em título viral muito limitada (redução de 4 vezes) com desafio foi observada quando HA foi aplicada sozinha i.n., demonstran- doqueas propriedades adjuvantes de GEM são requeridas para provimento de proteção.
Vacinação com HA + GEM (2 e 3 vezes) conduziu a um aper- feiçoamento de aproximadamente 20 a 100 vezes em título viral nos pul- mões comparado ao grupo controle positivo padrão (HA, i.m.). Redução de títulos virais pode resultar em reduzida propagação dos vírus e é considera- do serum importante fator no provimento de proteção de rebanho.
A pre- sença de IgA local nos forros de mucosa do trato respiratório e/ou o melhor tipo Th1/Th2 balanceado da resposta imune gerada pelas vacinas HA + GEM i.n. como demonstrado em Exemplos 4 e 5 pode explicar a observada superioridade da proteção comparada à vacina padrão i.m.
Exemplo7:HA oralmisturada com GEM elícita respostas protetoras A via oral de administração é atraente para vacinas devido sua conveniência, mas frequentemente carece de efetividade porque antígenos são inativados ou degradados.
Administração oral de HA sem adjuvantes é conhecida ser inadequada para elicitar respostas de HI em soro protetoras . e/ou respostas de IgA em mucosa.
O efeito de adição de GEM a HA em i- munizações orogástricas foi analisado em um modelo de camundongo.
HA antigeno subunidade H3N2 A/Hiroshima (20 pg/dose) foi usada.
As vacinas HA + GEM contiveram em adição 0,3 mg de GEM por dose.
Camundongos foram imunizados três vezes com intervalos de duas semanas e amostras de duas semanas após imunização final foram analisadas.
Títulos de HI em so- ro foram determinados para comparar a capacidade protetora das imuniza- ções.
Como mostrado na Figura 9, a imunização oral com a vacina HA + GEM induziu títulos de HI significantemente maiores (p<0,05) que imuniza- O ção oral sem partículas GEM.
No grupo HA+GEM oral títulos foram atingidos : acima de 2log7 que está bem acima de nível de corte protetor de 2l0g5,3. Em adição, HA+GEM oral foi capaz de elevar níveis considerá- veisdelgA de mucosa no trato gastrointestinal (Figura 10). Surpreendente- mente, também uma robusta resposta IgA local no trato respiratório foi elici- tada na maioria dos animais.
Estes resultados demonstram que também vacinas HA influenza oral misturadas com GEM elicitaram respostas imunes sistêmicas protetoras eem adição elicitam potentes respostas de mucosa incluindo no trato respi- ratório.
Exemplo 8: HA intramuscular misturada com GEM elícita respostas locais em superfícies de mucosas Vacinas parenterais usualmente não elicitam a produção de IgA secretado em mucosa.
Na análise de amostras de mucosa de camundongos imunizados intramuscularmente nós surpreendentemente verificamos que camundongos que receberam HA+GEM secretaram IgA em vários tecidos de mucosa como o nariz, pulmões e vagina.
Camundongos fêmeas foram vacinados três vezes (intervalo de 14 dias) intranasalmente ou intramuscu- larmente com uma quantidade fixa de HA (5 ug B/Shangdong/7/97), com ou sem 0,3 mg de GEMs.
Duas semanas após a última imunização, lavagens de nariz e vagina foram realizadas e “titulos de IgA foram determinados atra-
. vés de específico ensaio ELISA. - Os dados na Figura 11 mostram que administração intranasal de . HA+GEM induziu eficientemente respostas IgA locais, evidenciadas como títulos de IgA nas lavagens de nariz.
Títulos de IgA também foram induzidos distantemente, evidenciado pelo aparecimento de títulos de IgA em lavagens vaginais.
Como esperado administração de HA sozinha não induz relevantes respostas locais de IgA.
Surpreendentemente, administração intramuscular de HA+GEM induziu relevantes títulos de IgA, no nariz e vagina com eficiên- cias abordando aquelas atingidas após administração intranasal.
Por isso, administração intramuscular de HA+GEM pode ser usada para induzir uma resposta imune em mucosa. : Exemplo 9: Administração intramuscular de HA misturada com GEM suporta significante economia de dose De modo a determinar se as respostas imunes elicitadas por GEM+HA intramuscular permitem economia de antígeno HA de influenza, camundongos foram vacinados duas vezes com PBS (tratamento falso), 1 ug de HA (A/PuertoRico/8/34) sem GEMs ou com 0,04 ug HA (25 menos antígeno) formulada com GEM (0,3 mg por dose). Duas semanas após ad- ministração da dose final, camundongos foram desafiados com A/PuertoRico/8/34 adaptado a camundongo . Cinco dias após desafio, os animais foram sacrificados, pulmões foram isolados e homogeneizados e títulos virais foram determinados através de titulação de ponto final sobre células MDCK.
A Figura 12, painel A, mostra que vacinação intramuscular de a- —nimaiscom 1 4ug HA provê redução de carga viral nos pulmões de animais infectados de mais que um log como comparado aos animais tratados falso.
Entretanto, HA+GEM provê completa proteção contra replicação de vírus influenza nos pulmões de animais infectados, como evidenciado por comple- ta ausência de títulos nos pulmões.
Estes resultados demonstram a superio- ridade da vacina HA+GEM i.m. comparada ao padrão HA i.m.
O mesmo ní- vel de proteção como para o padrão HA i.m. foi obtido na formulação HA+GEM contendo somente 0,04 ug de HA (25 vezes menos antígeno) co-
ã mo mostrado no painel B de Figura 12, indicando que significante economia - de antígeno pode ser obtida através de formulação de vacinas influenza in- : tramusculares com GEMs.
Exemplo 10: Vacinas intranasais para hepatite B baseadas em GEM elicitam fortes respostas IgA local e IgG sistêmica em camundongos Camundongos C57BL6 adultos foram imunizados com vacinas de hepatite B baseadas em GEM contendo o antígeno HBsAg.
Neste caso HBsAg [5 ug] foi misturado com partículas GEM [0,15 mg peso seco]. Uma igual quantidade de HBsAg sem GEM também foi usada para comparação.
As vacinas foram administradas através da via intranasal.
A va- cina HepB comercial VaxPro, que tem adjuvante alúmen, foi administrada É subcutaneamente como a vacina padrão.
IgG de soro foi medido após inteira O imunização (3 doses, dadas com intervalos de 10 dias). A Figura 13 mostra claramente o efeito adjuvante das partículas DEM na vacina intranasal.
Ne- nhuma resposta IgG em soro específico HBsAg foi mensurável quando HB- sAg sozinha foi administrada intranasalmente.
Em contraste, HBsAg+ GEM elicitou uma vigorosa resposta IgG em soro específica HBsAg com um título de diluição de 4,2. A vacina GEM-HBsAg intranasal elicitou similar IgG espe- cífico HBsAg como a vacina padrão dada através de via subcutânea (p=0,2290). A ativação da imunidade de mucosa resulta em secreção de sIgA em sítios de mucosa.
Neste experimento a secreção local de SIgA es- pecífico-HBsAg foi medida em lavagens dos sítios de vacinação (nasal) e em lavagens em um sítio de mucosa distal (vaginal). A Figura 14 mostra clara- mente que respostas de sIigA são somente geradas usando a vacina HBsAg +GEMin e não com a vacina VaxPro i.m.. A vacina HBsAg + GEM gera mesmo secreção de slgA em um sítio de mucosa distante tal como aquela da vagina.
Exemplo 11: Vacina para hepatite B GEM-HBsAg intranasal em um modleo rato elícita níveis protetores de anticorpos em soro Vacinas para hepatite B com adjuvante foram fabricadas através de mistura de antígeno HBsAg (25 ug) com GEMs (0,4 mg). Para compara- ção, antigeno HBsAg sozinho (25 ug) e uma vacina padrão (VaxPro) que
. contem o mesmo antígeno formulado com alúmen. Imunização completa - consistiu em três administrações de vacina dadas com intervalos de 10 dias. f Os soros finais foram coletados 14 dias após o último reforço. GEM-HBsAg e HBsAg foram dados intranasalmente. VaxPro foi dado através de via intra- —muscular.Para vacinas de hepatite Bas correlações de proteção sãoconheci- das. Níveis de anticorpos maiores que 10 mil/ml de soro de sangue são considerados serem protetores e são aceitos como um marcador substituto para proteção Os soros de sangue dos ratos inteiramente imunizados (4 ratos Wistarpor grupo) foram analisados para os níveis de anticorpos específicos- HBsAg expressos em mili Unidade Internacionais por mililitro (mil/mL). A Fi- : gura 15 resume os resultados. HBsAg intranasal não elícita nenhuma res- O posta. Um nível alt e protetor de resposta de anticorpos (mil/mL 2 10) é obti- do através de via intranasal quando HBsAg é formulada com as microparti- —culasde peptidoglicano. O nível de proteção é similar com a vacina padrão VaxPro dada através de via intramuscular (p=7715).
Os resultados de Exemplos 10 e 11 demonstram consistente- mente que fortes respostas de anticorpos locais e sistêmicas são evocadas em vacinas HBsAg hepatite B baseadas em GEM intranasais, a despeito do fatodeque antígeno não está ativamente ligado às partículas GEM. Exemplo 12: Capacidade de proteção de vacinas GEM baseadas em proteí- na pneumococal Foi feita uma comparação entre vacinas baseadas em proteína pneumococal intranasal formuladas com GEMs tanto misturadas como liga- dasãàs proteínas. Três proteinas pneumococais conservadas (PspA, CbpA, PdBD) foram usadas em vacinas trivalentes, GEM+P3 (misturada) e GEM- P3 (ligada). Camundongos foram imunizados três vezes com estas vacinas ou com PBS como controle negativo (imunização falsa) com intervalos de 10 dias entre as doses. Cada vacina baseada em GEM conteve por ,dose 5 ug de cada antígeno e 0,3 mg de GEM. Três semanas após a última imuniza- ção de reforço camundongos foram desafiados intranasalmente com uma dose letal de S.pneumonia TIGRA4 (sorotipo 4). Camundongos não-
protegidos morrem dentro de 72 horas após desafio. Camundongos foram - acompanhados por 14 dias após desafio. Camundongos sofreram eutanásia baseado em pontos finais humanos (>5,4x10º? unidades formadoras de colô- nia (cfu) por mL de sangue 48 horas após desafio, peso < 85%, letargia, pêlo —embolado, corcunda) ou no fim do estudo. Nenhum dos camundongos imu- nizados falsos sobreviveu. Foi surpreendentemente verificado que o grupo imunizado com a vacina GEM+P3 (misturada) mostrou uma sobrevivência melhor (50%) que o grupo imunizado com a vacina GEM-P3 (ligada) (20%) (ver Figura 16). Estes resultados mostram claramente que uma vacina GEM comas proteinas P3 é mais efetiva quando estas proteínas são misturadas às partículas GEM.
Exemplo 13: Capacidade de proteção de vacinas GEM baseadas em proteí- na pneumococal pentavalente Foi feita uma comparação entre vacinas baseadas em proteína —pneumococal intranasal formuladas com GEMs tanto misturadas como liga- das às proteínas. Cinco proteinas pneumococais conservadas (PspA, PsaaA, CbpA, PpmA, IgA1prt) foram foram usadas em vacinas pentavalentes, GEM+P5 (misturadas) e GEM-P5 (ligadas). Camundongos foram imunizados três vezes com estas vacinas ou com PBS como controle negativo (imuniza- çãofalsa)com 10 dias de intervalo entre as doses. Cada vacina baseada em GEM conteve por dose 0,5 ug de IgA1prt, 3 ug PsaA, 1,5 ug CbpA, 2 ug PpmaA, 2 ug PspA e 0,3 mg GEM. Três semanas após a última imunização de reforço camundongos foram desafiados intranasalmente com uma dose letal de S.pneumonia D39 (sorotipo 2). Camundongos não-protegidos mor- rem dentro de 72 horas após desafio. O status de saúde após desafio foi feito escore baseado em sintomas clínicos (letargia, pêlo embolado, corcun- da) e foram tomados como ponto final para medir a capacidade protetora das vacinas. A Figura 17 mostra que no grupo imunizado com a vacina GEM-P5 (ligada) 8 de 10 camundongos permaneceram completamente sau- — dáveis, enquanto isto foi menos para a vacina GEM+P5 (misturada) (5/10) e menor para o controle, negativo (1/10). Estes resultados mostram claramen- te que uma vacina GEM com as proteínas P5 é mais efetiva quando estas proteínas são ligadas às partículas GEM.
Claims (17)
- S; REIVINDICAÇÕES - 1. Formulação de vacina influenza com adjuvante, compreen- f dendo (i) micropartículas de peptidoglicano obtidas de uma bactéria Gram- positiva e (ii) pelo menos um antígeno de vírus influenza ou sua preparação antigênica, cujo antígeno ou preparação antigênica não está fundida ou de outro modo covalentemente ligada a uma porção ligante peptidoglicano pro- teica.
- 2. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 1, com- preendendo antígeno hemaglutinina (HA), antígeno neuramidase (NA) ou uma combinação dos mesmos.
- 3. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, compreendendo um antígeno influenza ou uma sua preparação antigênica a S partir de pelo menos duas cepas de vírus influenza, pelo menos uma cepa sendo associada com uma deflagração pandêmica ou tendo o potencial para serassociado a uma deflagração pandêmica.
- 4. Formulação de vacina de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, em que a dita formulação de vacina contém entre 1 a 15 microgramas de HA por cepa influenza.
- 5. Formulação de vacina pneumococal com adjuvante, compre- endendo (i) micropartículas de peptidoglicano obtidas de uma bactéria Gram-positiva e (ii) pelo menos um antígeno pneumococal ou sua prepara- ção antigênica, cujo antígeno ou preparação antigênica não está fundido ou de outro modo ligado covalentemente a uma porção ligante peptidoglicano proteica.
- 6. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 5, com- preendendo PspA, CbpA, e/ou PdBD.
- 7. Formulação de vacina de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, em que as ditas micropartículas são obtidas de bactéria grau alimento, preferivelmente uma bactéria de ácido lático, mais preferivelmente L./actis.
- 8. Formulação de vacina de acordo com qualquer uma das rei-
- vindicações precedentes, compreendendo 0,01 a 0,1 miligrama de micropar- tículas (peso seco) por micrograma de antígeno. - 9. Dispositivo de dispensamento intranasal compreendendo uma formulação de vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a Ss 8
- 10. Dispositivo de dispensamento de acordo com a reivindicação 9 na forma de um aerossol ou um sistema de liberação de gotas.
- 11. Uso de micropartículas de peptidoglicano obtido de uma bac- téria Gram-positiva como adjuvante na fabricação de uma formulação de vacina influenza, a dita formulação compreendendo um antígeno de vírus influenza que não está fundido de outro modo covalentemente ligado a uma T porção ligante peptidoglicano proteica. O
- 12. Uso de acordo com a reivindicação 11, em uma formulação de vacina intranasal, intramuscular ou oral.
- 13. Uso de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que a for- mulação de vacina é formulada para uso em uma população humana de alto risco.
- 14. Uso de acordo com a reivindicação 13, em que a vacina é formulada para uso nos idosos, em crianças até 2 anos de idade e/ou em pacientes cronicamente doentes.
- 15. Processo para profilaxia de infecção ou doença influenza em um sujeito cujo processo compreende administração ao sujeito de uma vaci- na como definida nas reivindicações 1-4.
- 16. Processo de acordo com a reivindicação 15, no qual a libe- ração de vacina é intranasal ou intramuscular.
- 17. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que a vaci- na é liberada intranasalmente através de um dispositivo de dispensamento, preferivelmente em que o dispositivo de dispensamento está na forma de um aerossol ou um sistema de liberação de gotas.
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