JP2012502898A - 分類不能（ｎｏｎ−ｔｙｐｅａｂｌｅ）インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ワクチンおよびその使用 - Google Patents

Abstract

患者における慢性閉塞性肺疾患および喘息を治療するのに有用な分類不能インフルエンザ菌ワクチンを提供する。特定の側面において、ワクチンは単一細菌ワクチンである。本出願のワクチンで使用するための細菌株もまた提供する。

Description

本出願は、分類不能インフルエンザ菌ワクチン、ならびに慢性閉塞性肺疾患および喘息などの肺疾患の治療のためのその使用に関する。本出願はまた、慢性閉塞性肺疾患および喘息などの肺疾患を治療するのに有用なインフルエンザ菌の新規株にも関する。

主にタバコの煙の吸入による慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は罹患および死亡の主な原因であり、世界中で４番目に多い死因となっている（肺疾患データ（２００８）米国肺協会）。米国心肺血液研究所による概算によれば、２００７年に、米国におけるＣＯＰＤに関する年間コストは、直接医療費２６７０万ドルを含めて、４２６億ドルであった（肺疾患データ（２００８）米国肺協会）。転帰を実質的に改善する医学的療法の確立が失敗したことは残念なことであり、そして新たな管理戦略が必要である（ＣＯＰＤに関する国際指針（２００６）慢性閉塞性肺疾患に関する国際指針のウェブサイト上で見られうる、ＣＯＰＤの診断、管理および防止のための国際戦略）。ＣＯＰＤの根底にある病因には、末梢気道の狭窄および肺実質の破壊が含まれ、これらは少なくとも部分的に炎症プロセスの結果である転帰である。再発性急性増悪は、おそらく、これらがより激しい気管支内炎症を反映するため、気流閉塞および健康状態の悪化に関連する。この炎症反応の原因は複雑であるが、部分的に、毒性物質の吸入によって損傷を受けていた肺内気管支粘膜の細菌コロニー形成が原因に含まれる（Ｓｅｔｈｉ， ２００６， Ｃｈｅｓｔ １２９：２２３−２２４）。

急性増悪は、ＣＯＰＤの自然経過における重要な事象であり、そして重度の疾患においてはより一般的である。急性増悪は、生活の質を減少させ、肺機能のさらなる低下を加速させ、そして入院および死亡の主な決定要因である（ＣＯＰＤに関する国際指針、２００６； Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ， ２００６， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． １１９（１０ Ｓｕｐｐｌ． １）：３８−４５； ＷｅｄｚｉｃｈａおよびＳｅｅｍｕｎｇａｌ， ２００７， Ｌａｎｃｅｔ ３７０（９５８９）：７８６−９６； Ｓｅｔｈｉ， ２００６， Ｃｈｅｓｔ １２９：２２３−２２４； Ａｎｚｕｅｔｏ， ２００７， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｓｔ Ｍｅｄ． ２８（３）：６０９−１６， ｖｉｉ；ならびにＬｏｏｋら， ２００６， Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｓｏｃ． ３（６）：４８２−３）。増悪で患者が入院すると、再入院または死亡のリスクが高いままである（ＳｉｎおよびＴｕ， ２００１， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １６４（４）：５８０−４）。

ＣＯＰＤ増悪の防止が、管理の主な目的であり（ＣＯＰＤガイドラインに関する国際指針、２００２； ＣｅｌｌｉおよびＭａｃＮｅｅ， ２００４， Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． ２３（６）：９３２−４６； Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら， ２００７， Ｃａｎ． Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ． １４ Ｓｕｐｐｌ． Ｂ：５Ｂ−３２Ｂ）、増悪を防止するかまたはその回数を減少させると、疾患の長期臨床的経過および患者の生活の質に対して有益な効果があるようである（Ｂｕｒｇｅら， ２０００， ＢＭＪ ３２０（７２４５）：１２９７−３０３； Ｃａｌｖｅｒｌｅｙら， ２００３， Ｃｈｅｓｔ １２４（４）：１３５０−６； Ｖｉｎｃｋｅｎら， ２００２， Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． １９（２）：２０９−１６；およびＣａｓａｂｕｒｉら， ２００２， Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ． １９（２）：２１７−２４）。

喘息は、可逆性気道閉塞によって特徴付けられる気道の慢性炎症性状態であり、そして伝統的に、外因性（花粉およびチリダニなどの吸入アレルゲンに対するアレルギー性反応のため）または内因性（古典的なアレルギーによらない）として分類されてきており、その機構は知られていない。外因性喘息はまた「アレルギー性」喘息とも呼ばれ、一方、内因性喘息はまた、「非アレルギー性」または「特発性」喘息とも呼ばれる。

ＣＯＰＤとは対照的に、喘息は、典型的には呼吸器系に関与する慢性状態であり、喘息においては、しばしば１以上の誘因に反応して、気道がときに収縮し、炎症を生じ、そして過剰量の粘液で裏打ちされる。これらのエピソードは、アレルゲンなどの環境性刺激因子、環境性のタバコの煙、冷たいまたは温かい空気、香水、ペットのフケ、湿った空気、運動または労作、あるいは感情的なストレスへの曝露などの事象によって誘発されうる。小児においては、最も一般的な誘因は、一般的な風邪を引き起こすものなどのウイルス性疾病である。この気道狭窄によって、喘鳴、息切れ、胸苦しさ、および咳などの症状が引き起こされる。気道収縮は、気管支拡張剤に反応する。エピソードの合間、大部分の患者は問題なく感じるが、軽度の症状を有する可能性もあり、そして罹患していない個体よりも長時間、運動後の息切れが続く可能性もある。軽度のものから生命の危険を伴うものの範囲でありうる喘息の症状は、通常、薬剤および環境変化の組み合わせで制御可能である。

喘息の診断を受けた被験体に基づく最近報告された研究では、喘息は、痰中の好酸球および好中球数の相違に基づいて分類された（Ｓｉｍｐｓｏｎら， ２００６， Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ １１：５４−６１）。該研究において、被験体は、健康な対照被験体に比較したこれらの細胞種の存在に基づいて、異なる喘息サブタイプに分類された。好中球性喘息（＞６１％好中球）および好酸球性喘息（＞１．０１％好酸球）を含む、いくつかの喘息サブタイプが同定された。好中球性喘息群は、喘息総数のおよそ２０％を構成した。研究はさらに、評価前月に気道感染が報告されていた被験体はいないにもかかわらず、短期（４週間）および長期（平均５．３年間）の試料採取間隔の両方に渡って，これらの被験体の大部分で好中球増加が持続していたことも報告した。喘息の被験体は、健康な対照よりも、より高いレベルの細胞内細菌およびマクロファージを有することが見出されたが、好中球性喘息および他の喘息群の間には有意な相違は見出されなかった。実際、見出された細菌のレベルは、急性細菌感染と一致するよりも少ないことが記載され、そしてこの報告は、細菌感染が好中球性喘息の炎症プロセスを説明する証拠はないと結論づけた。

気管支炎は、肺における気管支（中程度の大きさの気道）の炎症である。慢性気管支炎（ＣＢ）は、必ずしも感染によって引き起こされず、そして一般的に、ＣＯＰＤ症候群の一部である。ＣＢは、臨床的には、痰および粘液を生じる、連続２年間で少なくとも３ヶ月持続する咳と定義される。

分類不能インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）は、慢性気管支炎（ＣＢ）に関連する最も一般的な病原性細菌である（ＳｅｔｈｉおよびＭｕｒｐｈｙ， ２００１， Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． １４：３３６−３６３）。ＮＴＨｉは、健康な患者およびＣＢの患者の上気道（例えば鼻、中耳、喉および副鼻腔）（ＳｅｔｈｉおよびＭｕｒｐｈｙ， ２００１， Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． １４：３３６−３６３）ならびに粘膜下層の間質中の粘膜上皮細胞に付着して、管腔を含む気道のいくつかの位置（Ｍｏｌｌｅｒら， １９９８， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １５７：９５０−５６）に見出されうる。非閉塞性および閉塞性ＣＢの研究によって、大部分の患者がＮＴＨｉの持続性感染を有することが観察されてきている（Ｍｕｒｐｈｙら， ２００４， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １７０：２６６−７２）。

ＮＴＨｉおよび黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）はどちらも、ＣＢ患者の気道由来の気管支肺洗浄液によって得られたマスト細胞からの非ＩｇＥ仲介性および増進性ＩｇＥ仲介性ヒスタミン放出を誘導することが示されてきている。ＮＴＨｉの場合、ＩｇＥ仲介性ヒスタミン放出の増進には、内毒素が関与している可能性があることが報告されてきている（Ｃｌｅｍｅｎｔｓｅｎら， １９９０， Ａｌｌｅｒｇｙ ４５：１０−１７）。急性増悪中にＣＢ患者から単離される免疫細胞は、患者自身の細菌に対して感作されており、そしてまた活動増進性であることが示されてきている（Ｎｏｒｎら， １９９４， Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ４１， Ｓｐｅｃｉａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｉｓｓｕｅ １９９４：Ｃ２２−Ｃ２３）。いくつかの研究はまた、真菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））およびウイルス（例えば呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス（Ｗｅｌｌｉｖｅｒら， １９８２， Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０１：８８９−９６））および細菌（肺炎球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｋｊａｅｒｇａｒｄら， １９９６， ＡＰＭＩＳ １０４：６１−６７； ＴｅｅおよびＰｅｐｙｓ， １９８２， Ｃｌｉｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ １２：４３９−５０； Ｐａｕｗｅｌｓら， １９８０， Ａｌｌｅｒｇｙ １５７：６６５−９）、黄色ブドウ球菌（Ｒｈｏｄｅら， ２００４， Ｒｅｓｐｉｒ． Ｍｅｄ． ９８：８５８−６４； ＴｅｅおよびＰｅｐｙｓ， １９８２， Ｃｌｉｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ １２：４３９−５０）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｓｈｅｎら， １９８１， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ３２：９６７−６８）、および肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓｅｇｇｅｖら， １９９６， Ａｎｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７７：６７−７３）による呼吸器感染に反応して産生される特定のＩｇＥ抗体も報告してきている。ＮＴＨｉに特異的なＩｇＥ抗体はまた、ＣＢ（Ｋｊａｅｒｇａｒｄら， １９９６， ＡＰＭＩＳ １０４；６１−６７； ＴｅｅおよびＰｅｐｙｓ， １９８２， Ｃｌｉｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ １２：４３９−５０）および嚢胞性線維症（ＴｅｅおよびＰｅｐｙｓ， １９８２， Ｃｌｉｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ １２：４３９−５０）を有する患者の血清においても同定されてきている。

気管支喘息を有する患者の研究において、ＮＴＨｉに対するＩｇＥ抗体が、患者の２９％で見出された。ＮＴＨｉおよび／または肺炎球菌に対する抗体もまた、患者の２２％に存在し、他のＩｇＥ仲介性過敏性はなかった。しかし、多様な吸入抗原に対する確認可能なＩｇＥ抗体を伴う、より高いレベルのＩｇＥ細菌抗体が患者に見られた（アレルギー性表現型を示唆する）（Ｐａｕｗｅｌｓら， １９８０， Ａｌｌｅｒｇｙ １５７：６６５−９）。細菌感染は、外因性喘息の誘導および増悪に役割を果たす可能性があると仮定されてきたが、喘息の増悪は、主に、ウイルス感染によって誘発されると見なされてきた。実際、喘息治療における細菌ワクチンの臨床的効果には疑問が持たれてきており、細菌ワクチンは現代の喘息治療において役割を果たさないという国際的な世界保健機構（ＷＨＯ）提言につながってきている。

研究の大多数は療法的喘息介入および治療に重点を置いているが、現代の西洋化社会において、この状態は、深刻で、コストが掛かり、そしてますます大きくなる問題であり続けている。

本出願におけるいかなる参考文献の引用または同定も、こうした参考文献が本出願に対する先行技術として利用可能であることの承認として解釈されないものとする。

肺疾患データ（２００８）米国肺協会 ＣＯＰＤに関する国際指針（２００６）慢性閉塞性肺疾患に関する国際指針のウェブサイト上で見られうる、ＣＯＰＤの診断、管理および防止のための国際戦略 Ｓｅｔｈｉ， ２００６， Ｃｈｅｓｔ １２９：２２３−２２４ Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ， ２００６， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． １１９（１０ Ｓｕｐｐｌ． １）：３８−４５ ＷｅｄｚｉｃｈａおよびＳｅｅｍｕｎｇａｌ， ２００７， Ｌａｎｃｅｔ ３７０（９５８９）：７８６−９６ Ａｎｚｕｅｔｏ， ２００７， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｓｔ Ｍｅｄ． ２８（３）：６０９−１６， ｖｉｉ Ｌｏｏｋら， ２００６， Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｓｏｃ． ３（６）：４８２−３ ＳｉｎおよびＴｕ， ２００１， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １６４（４）：５８０−４ ＣＯＰＤガイドラインに関する国際指針、２００２ ＣｅｌｌｉおよびＭａｃＮｅｅ， ２００４， Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． ２３（６）：９３２−４６ Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら， ２００７， Ｃａｎ． Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ． １４ Ｓｕｐｐｌ． Ｂ：５Ｂ−３２Ｂ Ｂｕｒｇｅら， ２０００， ＢＭＪ ３２０（７２４５）：１２９７−３０３ Ｃａｌｖｅｒｌｅｙら， ２００３， Ｃｈｅｓｔ １２４（４）：１３５０−６ Ｖｉｎｃｋｅｎら， ２００２， Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． １９（２）：２０９−１６ Ｃａｓａｂｕｒｉら， ２００２， Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ． １９（２）：２１７−２４ Ｓｉｍｐｓｏｎら， ２００６， Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ １１：５４−６１ ＳｅｔｈｉおよびＭｕｒｐｈｙ， ２００１， Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． １４：３３６−３６３ Ｍｏｌｌｅｒら， １９９８， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １５７：９５０−５６ Ｍｕｒｐｈｙら， ２００４， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １７０：２６６−７２ Ｃｌｅｍｅｎｔｓｅｎら， １９９０， Ａｌｌｅｒｇｙ ４５：１０−１７ Ｎｏｒｎら， １９９４， Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ４１， Ｓｐｅｃｉａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｉｓｓｕｅ １９９４：Ｃ２２−Ｃ２３ Ｗｅｌｌｉｖｅｒら， １９８２， Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０１：８８９−９６ Ｋｊａｅｒｇａｒｄら， １９９６， ＡＰＭＩＳ １０４：６１−６７ ＴｅｅおよびＰｅｐｙｓ， １９８２， Ｃｌｉｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ １２：４３９−５０ Ｐａｕｗｅｌｓら， １９８０， Ａｌｌｅｒｇｙ １５７：６６５−９ Ｒｈｏｄｅら， ２００４， Ｒｅｓｐｉｒ． Ｍｅｄ． ９８：８５８−６４ Ｓｈｅｎら， １９８１， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ３２：９６７−６８ Ｓｅｇｇｅｖら， １９９６， Ａｎｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７７：６７−７３

一般的な粘膜系を刺激するため、不活性化分類不能インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）の経口投与を伴う免疫療法の新規形式が開発された。ＣＯＰＤにおける急性増悪に対する防御は、痰内のＮＴＨｉの密度の減少と関連した。これらの初期の研究は、ほとんど性質決定されていないＮＴＨｉ単離体を用いた。選択アッセイの組み合わせを用いて、広い交差防御を誘導する１つのＮＴＨｉ単離体が同定された（これは、別に示されない限り、本明細書において、交換可能に、ＮＴＨｉ１６４、ＨＩ−１６４、単離体１６４または１６４株と称される）。

本出願者らは、さらに、驚くべきことに、ＨＩ−１６４でのワクチン接種が、喘息を治療するのに有用であり、そして抗喘息療法に対する必要性を減少させることを発見した。
したがって、本出願は、下気道の粘膜系などの粘膜系のコロニー形成の急性エピソードを伴う疾患を治療するためのＨＩ−１６４およびＮＴＨｉの類似の株を含有するワクチン、ならびにその使用に関する。本出願はまた、喘息、ＣＯＰＤ、およびＣＯＰＤに関連しない慢性気管支炎などの肺疾患を治療するための、ＨＩ−１６４およびＮＴＨｉの類似の株を含有するワクチン、ならびにその使用に関する。特定の態様において、ワクチンは、１以上のＮＴＨｉ株および／またはＮＴＨｉの前記種の１以上の免疫原性分画を含む、単一細菌ワクチンである。

本出願のワクチンにおいて有用なＮＴＨｉ株は、以下の特性のいずれかの組み合わせ（例えば２、３、４、５、６またはすべて）によって特徴付けられる：
（１）Ｂカプセル遺伝子を欠く；
（２）生物型Ｉである；
（３）ベータ−ラクタマーゼ遺伝子を欠く；
（４）好気性に増殖する；
（５）唾液中のインフルエンザ菌特異的ＩｇＡの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも１００％、または他の統計的に有意な増加によって反映されるように、粘膜インフルエンザ菌特異的ＩｇＡ反応を誘発可能である；
（６）インフルエンザ菌に対する曝露に反応して、パイエル板由来のＴ細胞によるリンホカイン産生の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも１００％、または他の統計的に有意な増加によって反映されるように、パイエル板においてインフルエンザ菌特異的Ｔ細胞を刺激可能である；
（７）ＮＴＨｉ−１６４の外膜２タンパク質と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を示す、外膜タンパク質２をコードする；
（８）ＮＴＨｉ−１６４の外膜２６タンパク質と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を示す、外膜タンパク質２６をコードする；
（９）一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動上でダブレットとして泳動する外膜タンパク質２を発現する；
（１０）９．１〜９．３のｐＩ、最も好ましくは９．２のｐＩを有する外膜タンパク質２を発現する；
（１１）全細胞抽出物の二次元ゲル上で、表１１Ａに列挙されるタンパク質の少なくとも５、少なくとも１０または少なくとも１５を顕著に発現する；
（１２）全細胞抽出物の二次元ゲル上で、表１１Ｂに列挙されるタンパク質の少なくとも２または少なくとも３を顕著に発現する；
（１３）全細胞抽出物の二次元ゲル上で、表１１Ａに列挙されるが、表１１Ｃに列挙されないタンパク質の少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも７または少なくとも１０を顕著に発現する；
（１４）全細胞抽出物の二次元ゲル上で、表１１Ａおよび表１１Ｄに列挙されるタンパク質の少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５を顕著に発現する。

本明細書において、用語「二次元ゲル上で顕著にタンパク質を発現する」は、タンパク質が、二次元ゲル上で、抽出およびＭＡＬＤＩ分析に十分なスポット中に存在することを示す。

さらに、本出願は、ＣＯＰＤ患者および喘息患者のための療法的措置を提供する。
特定の態様において、喘息のための療法的措置は、（１）患者、例えば喘息の症状を示す患者を、（ａ）唾液中の好中球レベル上昇、（ｂ）痰または唾液中の微生物の存在、および／または（ｃ）ＮＴＨｉに特異的な抗体に関して試験して、そして（２）３つのパラメーターの１つ、２つ、またはすべてに関して陽性の試験結果を示す患者に、本出願のワクチンを投与する工程を含む。特定の態様において、投与するワクチンは、１つ、２つまたはそれより多くの本出願のＮＴＨｉ株および／または本出願のＮＴＨｉ株の免疫原性分画を含む。

本出願のワクチンは、多価ワクチン、またはより好ましくは、単一細菌ワクチンであってもよい。
特定の態様において、本出願のワクチンは、錠剤の形であってもよく、前記錠剤は、前記集団または前記膜分画を含有するコア、および前記コアを取り巻く腸溶性コーティングを含む。

本出願のワクチンにおいて、コア重量は４００ｍｇ〜５００ｍｇである。
本出願のワクチンにおいて、死細菌または膜分画は、前記錠剤のコア重量の７．５％〜１５％を構成する。

本出願のワクチンにおいて、死細菌または膜分画は、前記錠剤の前記コアのおよそ１０％を構成する。
本出願のワクチンにおいて、前記サブ腸溶性コーティングは、コア重量の２％〜３％を生じる。

本出願のワクチンにおいて、前記腸溶性コーティングは、コア重量の１０％〜１２％を生じる。
本明細書内に含まれている文書、行為、材料、デバイス、論文等のいかなる考察も、本出願の背景を提供する目的のためのみである。これは、本出願の優先日前のいずれかに存在するため、これらのもののいずれかまたはすべてが先行技術の基礎の一部を形成するか、あるいは本出願に関連する分野における共通の一般的な知識であることの承認としては解釈されないものとする。

本出願の特徴および利点は、その態様の以下の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。

図１は、多様なブロス培地に関するＮＴＨｉ−１６４および参照株の増殖曲線を示す。 図２は、雄Ｄａｒｄ ＡｇｏｕｔｉラットにおけるＮＴＨｉ−１６４を用いた異なるワクチン接種措置から生じる細菌のクリアランス・データを示す。 図３Ａおよび３Ｂは、ＮＴＨｉ−１６４の多様な用量サイズで免疫したマウスにおける平均細菌レベルを示す。 図４は、ＮＴＨｉ−１６４で免疫したラット由来の腸間膜リンパ節リンパ球に関する平均増殖反応を示す。 図５Ａ〜５Ｃは、ＨＩ−１６４でのワクチン接種に反応したヒト被験体におけるリンパ球増殖を示す。図５Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの１μｇのＨＩ−１６４抗原に対する末梢血リンパ球増殖を立証する。 図５Ａ〜５Ｃは、ＨＩ−１６４でのワクチン接種に反応したヒト被験体におけるリンパ球増殖を示す。図５Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの１０μｇのＨＩ−１６４抗原に対する末梢血リンパ球増殖を示す。 図５Ａ〜５Ｃは、ＨＩ−１６４でのワクチン接種に反応したヒト被験体におけるリンパ球増殖を示す。図５Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＨＡに対する末梢血リンパ球増殖を示す。 図６は、ＨＩ−１６４でのワクチン接種後、ヒト被験体における唾液リゾチーム（平均±ＳＥＭ）を示す。 図７は、血清ＩｇＧレベルに対する、ＨＩ−１６４でのヒト被験体のワクチン接種の影響を示す。 図８は、プラセボ投薬ヒト被験体研究群の含嗽剤において単離されたＮＴＨｉの平均数を示すグラフである。 図９は、プラセボ群、および経口死菌ＮＴＨｉワクチンで免疫した治療群における、ヒト被験体中の血清ＮＴＨｉ特異的ＩｇＧレベルを示すグラフである。 図１０は、プラセボ群、および経口死菌ＮＴＨｉワクチンで免疫した治療群における、ヒト被験体中の唾液ＮＴＨｉ特異的ＩｇＧレベルを示すグラフである。 図１１は、プラセボでの免疫に比較した際のＨＩ−１６４ＯＶでの免疫後の痰における総細菌単離体の表である。 図１２は、プラセボでの免疫に比較した際のＨＩ−１６４ＯＶでの免疫後の痰における特異的細菌単離体の表である。 図１３は、製品Ｂｒｏｎｃｏｓｔａｔ^ＴＭ（ＰＣＴ出願第ＷＯ８６／０５６９１号に記載）に比較した際のＨＩ−１６４ＯＶの有効性の比較を示す。 図１４は、ＨＩ−１６４およびＨＩ−１６６の抽出物の一次元ゲル電気泳動の結果を示す。 図１５は、多様なインフルエンザ菌単離体／株の抽出物の一次元ゲルの結果を示す。 図１６Ａ〜Ｄは、多様なインフルエンザ菌単離体／株の二次元ゲル電気泳動の結果を示す。図１６Ａ。ＨＩ−１６４、プレート増殖調製物２。図１６Ｂ。ＨＩ−１６６、プレート増殖調製物１。図１６Ｃ。ＨＩ−１６７、プレート増殖調製物１。図１６Ｄ。ＨＩ−１６４、外膜タンパク質（ＯＭＰ）調製物。

本出願は、喘息およびＣＯＰＤなどの肺疾患の治療のためのＮＴＨｉに基づくワクチンを提供する。
患者は、本出願のワクチンから利益を得るために、ＮＴＨｉ感染を有する必要はない。したがって、特定の側面において、本出願のワクチンを投与される患者は、ＮＴＨｉ感染またはＮＴＨｉ感染の指標となるマーカー（例えばＮＴＨｉ特異的抗体）を持たない。他の側面において、患者はＮＴＨｉ感染に関して陽性であるか、またはＮＴＨｉ感染の指標となるマーカーを有する。

特定の態様において、本出願のワクチンは、ＮＴＨｉ以外の細菌に対する非特異的免疫反応を誘発可能であるため、患者は、ＮＴＨｉ感染以外の細菌に関して陽性であってもよいし、またはＮＴＨｉ以外の細菌による感染の指標となるマーカーを有する。特定の態様において、細菌は：黄色ブドウ球菌；分類可能なインフルエンザ菌株；肺炎球菌；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）；緑膿菌；肺炎マイコプラズマ；パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；β−溶血性連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種；α−溶血性連鎖球菌属種；シュードモナス属種；クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種；セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）；エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）；肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；およびカタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の１以上である。

本出願記載のワクチンを投与される患者は、通常、ヒトであるが、また、ワクチンを任意の適切な哺乳動物喘息モデルに投与してもよい。
本出願のワクチンを投与される患者に関するさらなるおよび別のパラメーターを以下に論じる。

喘息研究において慣用的であるように、別個の群を研究するように注意が払われてきており、そして一般的に、明確に限定される喘息（例えば古典的な外因性喘息）を有する被験体が他の群（例えば喫煙関連気道疾患を有する患者）から分離され、喘息の他の群から分離された喘息患者の限定される群に関する研究が行われるに至った。しかし、これは人工的な分類であり、そしてむしろ、スキーム１に例示するような気道疾患のスペクトルとして喘息をとらえる方がより現実的である。

スキーム１：喘息疾患のスペクトル
喘息のこれらの異なる臨床的徴候に関して、多様な異なる観察がなされてきている。簡潔には、これらは以下のように要約可能である：
・吸入抗原（例えば花粉）に対するＩｇＥ抗体の誘導は、古典的なアレルギー性喘息を引き起こし、ここで、アレルゲン特異的ＩｇＥはマスト細胞に結合して、マスト細胞の脱顆粒化およびアレルギー性症状を引き起こすヒスタミンなどの仲介因子の放出を引き起こす。

・損傷を受けた気道のコロニー形成および断続的なウイルス感染は、気管支内への好中球流動を導きうる（急性気管支炎）（通常、気管支の「炎症」に続くと考えられる喘鳴と関連する）。

・肺損傷を導く喫煙は、被験体を気道感染しやすくしうる。
しかし、臨床的に喘息と診断される多くの喘息被験体では、これらの構成要素が「混在」しており、そして喘息疾患のこのスペクトルは、異なる病因経路が喘息を導く可能性もあり、そしてこれらの経路は同時に存在しうるという認識によって、調整される可能性もあると提唱されている。特に、理論によって制限されることなく、立証可能な古典的なアレルゲン過敏性を伴わない多くの喘息患者（例えばハウスダスト、花粉等に対するＩｇＥ抗体に関して陰性試験結果である患者、および／または好酸球数が上昇している患者）における喘鳴の主な原因は、コロニー形成に対するＩｇＥ抗体が仲介する反応、および／または微生物が好中球を誘導しそして活性化する能力と連動した、反復される微生物への曝露のためであると本出願者らは考えている。特に、微生物に基づくワクチンは、末梢気道に対する対応する微生物の負荷を減少させ、そしていわゆる「内因性喘息」に対する有効な治療を提供することも可能である。

他の側面において、そしてやはり理論によって制限されることなく、本出願のワクチンによる治療を受け入れる患者の中には、細菌に対してアレルギー性であり、そしてＩｇＥ抗体を有する人もいると考えられる。また、こうした個体において、細菌、および喘息状態に寄与する他のアレルゲンに対するアレルギー状態の間の相互作用が存在しうるとも考えられる。したがって、特定の側面において、本出願のワクチンを用いて、アレルギー性喘息である患者を治療する。

より広くは、気道のコロニー形成が可能な微生物に対する曝露の指標となる１以上のパラメーター、例えば、唾液中の好中球レベル上昇（好酸球レベル上昇を伴うまたは伴わない）、例えば痰または唾液中の微生物の存在および／または微生物に特異的な抗体によって示されるような、微生物での現在の感染を示す患者、ならびに喫煙（慢性肺閉塞性疾患（ＣＯＰＤ））または慢性気管支炎（特に喘鳴を伴う患者）から生じるものなどの気道損傷を伴う患者が、本出願のワクチンからの利益を得ることも可能である。例えば、気道損傷を伴う患者は、病原性微生物による感染／コロニー形成に向かう高い傾向があることが認識される。気道に対する損傷は、古典的には喫煙後のものであるが、外因性喘息もまた気道に損傷を与えうる（したがって、後に、気道感染に関連する咳および痰の開始が伴う）。利益はまた、混合機構の喘息患者（例えば気道にコロニー形成する微生物に対するＩｇＥ抗体を持つアトピー性被験体）、ならびに微生物をターゲットとするワクチンに対する曝露から生じるＩｇＥ産生の誘導の減少または回避の結果としての喘息および喘息症状一般の治療においても生じる可能性がある。

酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または他のイムノアッセイを含む、任意の適切な慣用的に知られるアッセイプロトコルを用いて、血液、血清、血漿、痰または唾液試料において抗体レベルを測定してもよい。試験する抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＥ、ならびにＩｇＧ１および／またはＩｇＧ３などのそのサブクラスの１以上から選択されてもよい。気道にコロニー形成する微生物に特異的な総ＩｇＥおよび／またはＩｇＥ抗体は、一般的に、痰または唾液試料において測定される。また、細胞染色後の顕微鏡評価を含む、任意の適切な慣用的に知られるアッセイを用いて、唾液または痰中の好中球レベルを測定してもよい。同様に、当該技術分野に知られる任意の適切な方法を使用して、微生物数／感染レベルを決定してもよい。抗体レベル、好中球レベルおよびＮＴＨｉ数を、古典的な外因性喘息患者（例えば好酸球性および／または過敏性を示す）由来の対応する参照レベル（単数または複数）、あるいは例えば非喘息対照または他の適切な参照群に対して比較してもよい。喘息群を差別化するための統計的方法は、例えば、Ｓｉｍｐｓｏｎら， ２００６， Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ １１：５４−６１に記載される。

特定の側面において、本出願のワクチンを投与される患者は、ＣＯＰＤおよび／またはＣＯＰＤに関連する症状、例えば慢性気管支炎および肺気腫を伴ってもまたは伴わなくてもよい。

ＣＯＰＤは、肺機能が次第に喪失することによって特徴付けられる気道の緩慢な進行性疾患である。慢性気管支炎および肺気腫を含むＣＯＰＤの患者は、しばしば、緊急の治療を必要とし、そしてときに、疾患の増悪期間中の入院を必要とする。ＣＯＰＤは、ヒトが息を吐く（呼息する）際の、肺を通じた気流速度の持続性減少として定義される慢性気流閉塞につながる。気管支平滑筋攣縮、炎症、および分泌増加を逆転させることによって、気流閉塞を減少させると、喘鳴および息切れなどの症状が軽減される。

したがって、特定の側面において、本出願のワクチンを投与される患者は、以下の症状：慢性気管支炎、肺気腫、慢性の咳、過剰な痰産生、低血中酸素レベル、重度の、日常に支障を来すほどの息切れ、肺を通じた気流の減少、気管支平滑筋攣縮、気管支炎症、および気管支分泌増加（粘液栓）の１以上を有してもよい。

重度ＣＯＰＤは、一般的に、２つのステレオタイプ−−赤やせ型（ｐｉｎｋ ｐｕｆｆｅｒ）および青太り型（ｂｌｕｅ ｂｌｏａｔｅｒ）に分類される。大部分の進行したＣＯＰＤ患者は、両方のステレオタイプの特徴を有する。赤やせ型は、典型的には喘息性のがっしりした胸の肺気腫患者であり、口すぼめ呼吸を示し、そしてチアノーゼまたは浮腫を示さない。通常、こうした患者は呼吸をするのに気管外の筋肉を用い、最小限の痰を生じ、そして日常的なレベルの呼吸困難における変動をほとんど経験しない。横隔膜可動域が減少し、そして呼吸および心音の間が空く。高齢の個体は通常、肺適合性が増加しており、そしてより大きい休止期肺体積を有するため、がっしりした形状の胸は特異的ではない。青太り型は、典型的には、過体重でチアノーゼ性であり、そして浮腫性であり、そして慢性の喀痰を伴う咳を有する。青太り型は、しばしば、適切に治療しなければ迅速に死につながる肺性心を有するため、高齢の青太り型はまれである。特定の側面において、本出願のワクチンを投与される患者は、赤やせ型および／または青太り型の特性を示す。

慢性低酸素症（体全体の適切な血流にもかかわらず、体への酸素供給が減少する）、高血圧、および左心室肥大は、ＣＯＰＤの徴候であるかまたはＣＯＰＤと同時発生しうる関連状態である。したがって、特定の側面において、本出願のワクチンを投与される患者は、慢性低酸素症、高血圧および／または左心室肥大を有する。

嚢胞性線維症は、気管支拡張症および肺能力の進行性減少を生じる、閉塞性肺障害の例である。したがって、特定の側面において、本出願のワクチンを投与される患者は、嚢胞性線維症を有してもよい。

特定の側面において、患者は、ＣＯＰＤと関連する遺伝子または他のマーカーに関して陽性である（例えば、各々その全体が本明細書に援用される、ＵＳ ２００８０１０８０７９ Ａ１およびＵＳ ２００８００４４８４３ Ａ１を、それぞれ参照されたい）。１以上の遺伝子またはマーカーに関して陽性である患者は、ＣＯＰＤの症状を示してもまたは示さなくてもよく；すなわち、本出願のワクチンを、ＣＯＰＤ症状の開始前または開始後に投与してもよい。

特定の側面において、本出願のワクチンを投与される患者は喘息ではない。特定の態様において、患者は外因性喘息ではない。別の特定の態様において、患者は内因性喘息ではない。

本出願にしたがって、喘息の治療は、任意の臨床段階または徴候の喘息の任意の型を有するとすでに診断されている患者の治療；喘息の症状または徴候の開始または発展または悪化または増悪の遅延；夜間および／または昼間の喘息発作の防止および／またはその重症度の減少；肺能力の改善；喘息患者の肺能力の減少の防止；不都合な増悪の防止または制限；喘息症状による入院の防止または制限；ならびに／あるいは抗生物質、ステロイド、気管支拡張剤または他の薬剤の必要性の減少または制限を含む。

都合よくは、本出願の１以上の態様にしたがったワクチンの投与は、患者におけるＩｇＥ抗体の減少および／または喘息（例えば内因性または好中球性喘息）の症状または重症度の減少を導きうる。

本出願にしたがって、ＣＯＰＤの治療は、任意の臨床段階または徴候のＣＯＰＤの任意の型を有するとすでに診断されている患者の治療；ＣＯＰＤの症状または徴候の開始または発展または悪化または増悪の遅延；喘鳴および／または息切れのエピソードの防止および／またはその重症度の減少；肺能力の改善；患者の肺能力の減少の防止；不都合な増悪の防止または制限；ＣＯＰＤ症状による入院の防止または制限；ならびに／あるいは抗生物質、ステロイド、気管支拡張剤または他の薬剤の必要性の減少または制限を含む。

微生物感染に対して有効な免疫反応を生じるのに適した任意の措置にしたがって、ワクチンを投与してもよい。単回用量として本出願のワクチンを投与してもよいし、あるいは望ましいかまたは必要である場合、最初の用量後、数日、数週、または数ヶ月または数年で、最初の用量にブースターが続いてもよい。

例示的な態様において、冬になる前、年一度、ワクチンの単回用量を投与してもよい。場合によって、数週間かまたは数ヶ月の間隔で、ワクチンの１以上の「ブースター」用量もまた投与してもよい。あるいは、ＮＴＨｉなどの、気道にコロニー形成することが可能な微生物による感染および／またはコロニー形成に対する有効な免疫反応を生成するため、ワクチンの数回の用量を、数週間の経過に渡って投与してもよい。

患者に投与する各投薬量は、１単位用量（以下に記載するとおり）、あるいはそれより多くまたは少ない用量からなってもよい。療法的使用に有効な特異的投薬量（ｍｏｕｎｔ）は、例えば、ワクチンの免疫原性構成要素（以下に記載する通り）、患者の体重および全身健康状態、処方する医師の判断、ならびにワクチンの提唱される送達様式およびワクチンの性質（例えば、カプセル、粉末、液体、エアロゾル送達、錠剤、腸溶性コーティング錠剤など）に応じるであろう。

限定されるわけではないが、例えば皮下、静脈内、筋内または皮内を含む、任意の所望の投与経路を用いて、本出願のワクチンを投与してもよいが、粘膜投与が好ましい。粘膜投与経路には、限定されるわけではないが、経口、直腸および鼻投与が含まれる。粘膜投与のための調製は、以下に記載するような多様な配合に適している。投与経路は、治療経過中、多様であってもよい。

本出願の方法で利用されるワクチンは、典型的には、本出願にしたがった、全死菌または不活性化（例えば弱毒化）ＮＴＨｉ単離体（単数または複数）（例えばホルマリンで殺したもの）を含有するであろう。しかし、微生物の細胞外膜および／または表面抗原を含むかまたはこれらからなる可溶性または粒子状抗原を、全死菌ＮＴＨｉとともに、またはその代わりに利用可能である。

可溶性および／または粒子状抗原は、死菌または生存選択ＮＴＨｉ単離体（単数または複数）を破壊することによって調製可能である。次いで、遠心分離、ろ過および／または当該技術分野に知られる他の適切な技術によって、ワクチンで使用するための分画を調製してもよい。超音波処理または適切な界面活性剤および攪拌を利用した溶解、ならびにこうした技術の組み合わせを含めて、必要なレベルの細胞破壊を達成する任意の方法を使用してもよい。超音波処理を使用する場合、必要な度合いの細胞破壊、あるいは特定のサイズまたはサイズ範囲の可溶性および／または粒子状物質の生成を得るため、単離体をいくつかの超音波処理工程に供してもよい。

特定の態様において、免疫原性構成要素は、本出願のＮＴＨｉ種の死細胞および／または免疫原性分画である。
ベータ−ラクタマーゼ遺伝子の欠如は、本出願のＮＴＨｉ株の、場合による特徴である。ベータ−ラクタマーゼは、いくつかの細菌によって産生される酵素であり、そしてペニシリン、セファロスポリン、セファマイシン、エルタペネムおよびカルバペネムのようなベータ−ラクタム抗生物質に対する耐性の原因となる。ベータ−ラクタム抗生物質は、典型的には、広い範囲のグラム陽性およびグラム陰性細菌を治療するのに用いられる。ベータ−ラクタマーゼ発現は、抗生物質耐性を生じうるため、ベータ−ラクタマーゼ遺伝子の存在は、ＮＴＨｉなどの死菌病原体の製造および投与中には、一般的に好ましくない。製造または患者における不都合な事象中に必要となった場合に、ベータ−ラクタマーゼ遺伝子が欠如していると、生物をベータ−ラクタム抗生物質で制御することが可能になる。

ブダペスト条約の条件の下にオーストラリア・メルボルンの国立計量研究所に２００８年８月１３日に寄託され、そして寄託番号第Ｖ０８／０２１００２号を割り当てられている分類不能インフルエンザ菌単離体ＨＩ−１６４は、本出願のワクチンで使用するのに特に適している。別の適切な株は、ブダペスト条約の条件の下にオーストラリア・メルボルンの国立計量研究所に２００８年８月１３日に寄託され、そして寄託番号第Ｖ０８／０２１００３号を割り当てられている分類不能インフルエンザ菌単離体ＨＩ−１６７である。

１以上の態様において、選択したＮＴＨｉ株（単数または複数）の細胞外膜分画または膜タンパク質（単数または複数）を、本出願のワクチンの免疫原性構成要素として利用する。

ＮＴＨｉの免疫原性タンパク質およびペプチドが記載されてきている。特定の態様において、ＮＴＨｉ外膜タンパク質（「ＯＭＰ」）分画またはＯＭＰタンパク質が、本出願のワクチンの免疫原性構成要素として用いられる。ＮＴＨｉ ＯＭＰには、ヒト細菌抗体のターゲットであり、そしてヒトおよび動物モデルの両方において防御を誘導する、非常に保存される１６ｋＤａリポタンパク質であるＯＭＰ Ｐ６（Ｎｅｌｓｏｎら， １９８８， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ５６：１２８−１３４）が含まれる。慢性肺閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）において、ＯＭＰ Ｐ６は、ＮＴＨｉ感染からの相対的防御に関連するリンパ球増殖反応を誘発することが示されてきている（Ａｂｅら， ２００２， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １６５：９６７−７１）。したがって、ＯＭＰ Ｐ６または任意の他の適切な外膜ＮＴＨｉタンパク質、ポリペプチド（例えば、Ｐ２、Ｐ４およびＰ２６）またはこうしたタンパク質の抗原性ペプチドは、単離型および精製型において、またはＯＭＰ分画などの細胞分画の構成要素としてのいずれかで、本出願のワクチンの免疫原性構成要素として使用するのに適している可能性もある。

特定の側面において、免疫原性タンパク質またはペプチドは、ＯＭＰ Ｐ２６またはその免疫原性断片である。別の側面において、免疫原性タンパク質またはペプチドは、ＯＭＰ Ｐ２またはその免疫原性断片である。特定の態様において、ワクチンは、（１）ＯＭＰ Ｐ２６タンパク質、あるいはＮＴＨｉ−１６４のＯＭＰ Ｐ２６タンパク質と少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するその免疫原性断片、および／または（２）ＯＭＰ Ｐ２タンパク質、あるいはＮＴＨｉ−１６４のＯＭＰ Ｐ２タンパク質と少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するその免疫原性断片を含む。

本出願のワクチンは、典型的には、ワクチン組成物の約０．１％〜１００％ｗ／ｗの量、より好ましくはワクチン組成物の１％〜５０％ｗ／ｗの量の選択された免疫原性構成要素（すなわちＮＴＨｉ単離体（単数または複数）および／または細胞分画および／または単離または精製タンパク質および／またはペプチド）の細胞を含むであろう。

全細胞死菌ワクチンに関しては、単位用量は、典型的には、約１０^９〜約１０^１２死細胞、より好ましくは約１０^９〜約１０^１１死細胞、そして最も好ましくは約１０^１０〜約１０^１１死細胞の範囲であろう。

ＮＴＨｉの細胞分画で作製されるワクチンに関しては、単位用量は、約１０^９〜約１０^１４細胞から分画され、より好ましくは約１０^１０〜約１０^１３細胞から分画され、そして最も好ましくは約１０^１０〜約１０^１２細胞から分画されるであろう。

単離または精製タンパク質およびペプチド断片を含有するワクチンに関しては、単位用量は、一般的に、５０〜７５ｍｇ、７５〜１００ｍｇ、１００〜１２５ｍｇ、１２５〜１５０ｍｇ、１５０〜１７５ｍｇ、１７５〜２００ｍｇ以上、またはそれより多い。

各群の動物を微生物に続いて感染させる前に、試験哺乳動物の異なる群に異なる投薬量を投与して、そして病原体の満足なクリアランスを達成するのに必要な投薬量レベルを決定することによって、ワクチンの最適投薬量を決定してもよい。

本出願のワクチンはまた、１以上の薬学的に許容されうるキャリアーおよび／またはアジュバントも含んでもよい。用いてもよい例示的なアジュバントを以下にさらに記載する。典型的には、排他的ではないが、好ましい経口ワクチン配合物はアジュバント化されていない。

本出願のワクチン配合物を調製するための実際の方法は、当業者に知られるかまたは明らかであり、そしてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， 第１５版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ペンシルバニア州イーストン（１９８０）などの刊行物に、より詳細に記載される。

本出願のワクチンは、一般的に、薬学的に許容されうるキャリアーを含む組成物中で提供される。多様な薬学的に許容されうるキャリアーが当該技術分野に周知である。本明細書において、「薬学的に許容されうるキャリアー」には、組成物の活性成分と組み合わせた際に、成分が生物学的活性を保持することを可能にし、そして好ましくは、被験体の免疫系との破壊的反応を生じない任意の物質が含まれる。

一般的に、顆粒、錠剤、丸剤、座薬、カプセル（例えば経口送達に適応したもの）、マイクロビーズ、微小球体、リポソーム、懸濁物、軟膏、ローション等の多様な型でワクチンを調製してもよい。ワクチン自体は、生理学的に許容されうる緩衝剤または液体を利用して再構成された凍結乾燥ワクチンであってもよい。ワクチンはまた、１以上の、抗固化剤、チメロサールまたはそうでなければ投与の提唱される様式に適したものなどの保存剤、アミノ酸および糖部分などの安定化剤、スクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤、表面活性剤、水酸化ナトリウム、塩酸、リン酸一ナトリウムおよび／またはリン酸二ナトリウムなどのｐＨ緩衝剤およびｐＨ修飾剤、生理食塩水などの薬学的に許容されうるキャリアー、溶媒および分散媒体および等張性調製物も含有してもよい。

例えば凍結乾燥被包型または錠剤型で、経口投与のため、ワクチンを好適に提示する。本出願のワクチンの免疫原性構成要素は、経口投与される場合、好ましくは消化から保護されると認識される。これは、適切に耐性であるキャリアー中、例えばリポソーム中で、または腸溶性コーティング内で、免疫原性構成要素を混合するかまたはパッケージングするかいずれかによって達成可能である。また、徐放型または緩慢放出型で、調製物を提供してもよい。

好ましくは、経口配合物は、カプセルまたは錠剤の形である。例えば、Ｅｕｄｒａｇａｔｅ「Ｓ」（商標）、Ｅｕｄｒａｇａｔｅ「Ｌ」（商標）、酢酸セルロース、フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶性コーティングとともに、こうしたカプセルおよび錠剤を提供してもよい。カプセルまたは錠剤を配合するのに適した他のキャリアーには、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）が含まれる。当該技術分野に周知の方法によって、錠剤をコーティングしてもよい。経口投与のための調製物を適切に配合して、免疫原性構成要素の徐放を生じてもよい。

これらのカプセルおよび錠剤をそのようなものとして用いてもよいし、または投与前に、例えば懸濁物として、凍結乾燥物質を再構成してもよい。
カプセルおよび錠剤の代替物として、経口ワクチンは、液体型、例えば、溶液、シロップまたは懸濁物であってもよいし、あるいは水または他の適切なビヒクルで使用前に再構成するための薬剤製品として提示されてもよい。懸濁剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、または分画化植物油）；および保存剤（例えばメチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容されうる添加剤を用いた慣用的手段によって、こうした液体調製物を調製してもよい。

胃酸性からワクチンの免疫原性構成要素を保護するため、ワクチンの各投与前に、重炭酸ナトリウム調製物を好適に投与してもよい。
また、ワクチンを吸入または注射による投与のために配合してもよい。

任意の慣用的媒体または剤が、本出願のワクチンの免疫原性構成要素または提唱される投与様式と適合しない場合を除いて、本出願によって具象化される方法によって使用可能なワクチンとの使用が特に含まれる。

例えばプロバイオティック微生物、その分画および生物学的産物、ならびに適切なサイトカインを含む、免疫反応をブーストするための補充活性剤もまた、ワクチンに含まれてもよい。

本出願のワクチンは、場合によって、１以上のアジュバントを含む。適切なアジュバントの例を本明細書において以下に提示する。
適切なアジュバントには、無機塩アジュバントまたは無機塩ゲルアジュバントが含まれる。こうした無機塩および無機塩ゲルアジュバントには、限定されるわけではないが、水酸化アルミニウム（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ、ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ）、リン酸アルミニウムゲル、ヒドロキシリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵ−ＰＨＯＳ）、およびリン酸カルシウムが含まれる。他の適切なアジュバントには、免疫刺激性アジュバントが含まれる。こうしたアジュバントクラスには、限定されるわけではないが、サイトカイン（例えばインターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、およびＩＬ−１（３ペプチドまたはＳｃｌａｖｏペプチド））、サイトカイン含有リポソーム、トリテルペノイドグリコシドまたはサポニン（例えばＱｕｉＡおよびＱＳ−２１、商標ＳＴＩＭＵＬＯＮ、ＩＳＣＯＰＲＥＰの下で販売もされている）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、例えばＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（スレオニル−ＭＤＰ、商標ＴＥＲＭＵＲＴＩＤＥの下で販売されている）、ＧＭＤＰ、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン、ムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、例えば細菌ＤＮＡおよびその断片、ＬＰＳ、モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＬＡ、商標ＭＰＬの下で販売されている）、およびポリホスファゼンが含まれる。さらに他の適切なアジュバントには、粒子状アジュバントが含まれ、限定されるわけではないが、エマルジョン、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、スクアレンまたはスクアレン水中油アジュバント配合物、例えばＳＡＦおよびＭＦ５９、例えばブロックコポリマーで調製されるもの、例えば商標ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ−１２１の下に販売されているＬ−１２１（ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレン）、リポソーム、ビロソーム、コクリエート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、および商標ＩＳＣＯＭの下に販売されている免疫刺激複合体が含まれる。さらに他の適切なアジュバントは、限定されるわけではないが、生体分解性および生体適合性ポリエステル、乳酸（ＰＬＡ）およびグリコール酸（ＰＧＡ）のホモおよびコポリマー、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）微小粒子、自己会合して粒子となるポリマー（ポロキサマー粒子）、可溶性ポリマー（ポリホスファゼン）、およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）、例えば組換えタンパク質粒子、例えばＢ型肝炎表面抗原（ＨｂｓＡｇ）などの微小粒子アジュバントである。

好ましいアジュバントのクラスは、粘膜アジュバントであり、限定されるわけではないが、大腸菌由来の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ・ホロ毒素（ＣＴ）およびコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、突然変異体毒素（例えばＬＴＫ６３およびＬＴＲ７２）、微小粒子、ならびに重合リポソームが含まれる。

特定の側面において、アジュバントは、Ｔｈ１免疫反応を活性化するアジュバントである。好ましくは、アジュバントはＴｈ２免疫反応を活性化しないが、Ｔｈ２免疫反応を活性化するアジュバントは本出願の範囲内である。

任意の適切な方式で、本出願のワクチンを配合してもよい。一般的に、本出願のワクチンを、添加されたキャリアーを伴いまたは伴わずに、経口、鼻、鼻咽頭、非経口、腸内、胃、局所、経皮、皮下、筋内、錠剤中、固形、粉末、液体、エアロゾル型、局部または全身投与してもよい。

本出願のワクチンをカプセルまたは錠剤として、乾燥粉末として、または液体型で投与してもよい。投与は、例えば、注射によって（例えば皮下または静脈内）、投薬単位型によるなど経口で（例えば錠剤、カプセルまたは投薬液体型）、または吸入によって達成してもよい。

特定の側面において、免疫原性構成要素がリンパ組織、より好ましくは二次リンパ組織、そして最も好ましくは粘膜関連リンパ組織に到達することを可能にする方式で、本出願のワクチンを投与する。特定の態様において、粘膜関連リンパ組織は、ＢＡＬＴ（気管支関連リンパ組織）、ＮＡＬＴ（鼻関連リンパ組織）、ＬＡＬＴ（喉頭関連リンパ組織）またはＧＡＬＴ（腸関連リンパ組織）である。最も好ましくは、回腸の最下部部分で主に見られるリンパ組織の集合であるパイエル板、および患者腸中の他の腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）に対するワクチンの免疫原性構成要素の送達を可能にする腸溶性コーティング錠剤によって投与される。

以下に記載するのは、本出願のワクチンを利用可能な併用法である。本出願の併用法は、患者に対する少なくとも２つの剤の投与を伴い、剤の第一のものは、本出願にしたがった微生物をターゲットとするワクチンであり、そして第二のものは第二の療法剤である。

本出願の併用療法は、付加的効果より大きい効果を生じることも可能であり、ワクチンまたは第二の療法剤のいずれもが喘息治療に単独で有効な量で投与されなくても、療法的利益を提供しうる。

本方法において、ワクチンおよび第二の療法剤を同時にまたは連続して投与してもよい。本明細書において、ワクチンおよび第二の療法剤は、同じ日に、例えば同時に、あるいは１、２、３、４、５、６、７または８時間離れて患者に投与される場合に、同時に投与されると言われる。対照的に、ワクチンおよび第二の療法剤は、異なる日に患者に投与される場合に連続して投与されると言われ、例えばワクチンおよび第二の療法剤を１日、２日または３日、１週間、２週間あるいは毎月の間隔で投与してもよい。本出願の方法において、ワクチンの投与は、第二の療法剤の投与に先行してもまたは続いてもよい。

限定されない例として、ワクチンおよび第二の療法剤を同時にある期間投与し、その後、ワクチンおよび第二の療法剤を交互に投与する第二の期間が続いてもよい。
ワクチンおよび第二の療法剤を投与する潜在的に相乗性の効果があるため、こうした剤を、一方または両方の剤を投与した際に、喘息またはＣＯＰＤを治療するのに有効でない量で投与してもよい。

持続性喘息を持つ大部分の人は、ハンドヘルド吸入装置で摂取する長期制御薬剤および迅速軽減薬剤を併用する。花粉またはペットのフケなどの風媒性アレルゲンによって誘発される喘息の症状もまた、アレルギー薬剤で治療される。

したがって、適切な第二の療法剤には、長期制御薬剤、迅速軽減薬剤、およびアレルギー薬剤が含まれる。
長期制御薬剤の例には、限定されるわけではないが、（１）吸入コルチコステロイド、例えばフルチカゾン（例えばＦｌｏｖｅｎｔ Ｄｉｓｋｕｓ^ＴＭ）、ブデソニド（例えばＰｕｌｍｉｃｏｒｔ^ＴＭ）、トリアムシノロン（例えばＡｚｍａｃｏｒｔ^ＴＭ）、フルニソリド（例えばＡｅｒｏｂｉｄ^ＴＭ）、およびベクロメタゾン（例えばＱｖａｒ^ＴＭ）；（２）長期作用ベータ−２アゴニスト（ＬＡＢＡ）、例えばサルメテロール（例えばＳｅｒｅｖｅｎｔ Ｄｉｓｋｕｓ^ＴＭ）およびホルモテロール（例えばＦｏｒａｄｉｌ Ａｅｒｏｌｉｚｅｒ^ＴＭ、Ｏｘｉｓ^ＴＭ、Ｐｅｒｆｏｒｍｉｓｔ^ＴＭおよびＢｒｏｖａｎａ^ＴＭ）；（３）長期作用ムスカリン性アンタゴニスト、例えばチオトロピウム（例えばＳｐｉｒｉｖａ^ＴＭ）およびイプラトロピウム（例えばＡｔｒｏｖｅｎｔ^ＴＭ）；（４）ロイコトリエン修飾剤、例えばモンテルカスト（例えばＳｉｎｇｕｌａｉｒ^ＴＭ）、ザフィルルカスト（例えばＡｃｃｏｌａｔｅ^ＴＭ）およびジロートン（例えばＺｙｆｌｏ ＣＲ^ＴＭ）；（５）マスト細胞阻害剤、例えばクロモリン（例えばＩｎｔａｌ^ＴＭ）およびネドクロミル（例えばＴｉｌａｄｅ^ＴＭ）；（７）テオフィリンが含まれる。

迅速軽減薬剤の例には、（１）短期作用ベータ−２アゴニスト（ＳＡＢＡ）、例えばアルブテロールまたは硫酸アルブテロール（例えば商品名Ｘｏｐｅｎｅｘ^ＴＭおよびＶｅｎｔｏｌｉｎ^ＴＭの下で販売されるようなもの）、（２）短期作用ムスカリン性アンタゴニスト、ならびに（３）経口および静脈内コルチコステロイド、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フロ酸モメタゾン（例えば商品名Ａｓｍａｎｅｘ^ＴＭの下で販売されるようなもの）およびシクレゾニド（例えばＡｅｒｏｂｉｄ^ＴＭ／Ａｌｖｅｓｃｏ^ＴＭ）が含まれる。

アレルギー薬剤の例には、（１）免疫療法、（２）抗ヒスタミン剤（例えばＣｌａｒｉｔｉｎ^ＴＭおよびＺｙｒｔｅｃ^ＴＭ）および（３）抗ＩｇＥモノクローナル抗体、例えばオマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ^ＴＭ）が含まれる。粘液溶解剤の例には、限定されるわけではないが、Ｂｒｏｎｃｈｉｔｏｌ^ＴＭ（マンニトール吸入剤）およびＭｕｃｏｍｙｓｔ^ＴＭ（アセチルシステイン吸入剤）が含まれる。

特定の側面において、第二の療法剤自体が併用製品、すなわち１より多い活性成分を含有する製品である。適切な併用製品の例には、Ｓｙｍｂｉｃｏｒｔ^ＴＭ（ホルモテロールおよびブデソニドの併用）；Ｃｏｍｂｉｖｅｎｔ^ＴＭ（アトロベントおよびアルブテロールの併用）；およびＡｄｖａｉｒ^ＴＭまたはＳｅｒｅｔｉｄｅ^ＴＭ（サルメテロールおよびフルチカゾンの併用）；長期作用ベータ−アドレナリン受容体アゴニスト、例えばインダカテロールとモメタゾンの併用；および長期作用ベータ−２アゴニスト、例えばホルモテロールとモメタゾンの併用が含まれる。

気管支拡張剤−−気道を開くのを補助する薬剤が、ＣＯＰＤ治療の主力である。気管支拡張剤は、最も一般的には、定量吸入装置（ＭＤＩ）、乾燥粉末吸入装置（ＤＰＩ）、またはネブライザーを用いて、吸入型で投与される。口ではなく、肺に、正しい用量の薬剤を送達するように、吸入装置を適切に使用することが重要である。任意の上記気管支拡張剤を、ＣＯＰＤの治療のため、本出願のＮＴＨｉワクチンと併用してもよい。

ワクチン−−特定の側面において、第二の療法剤は、特定のタイプの肺炎の防止を補助する肺炎球菌ワクチン、または一般的にはインフルエンザの季節より前、一般的には晩秋または初冬に投与されるインフルエンザワクチンなどのワクチンである。

抗ウイルス剤：インフルエンザに罹患したＣＯＰＤ患者には、抗ウイルス薬剤が処方されうる。抗ウイルス薬剤はまた、インフルエンザワクチンを接種されておらず、そしてインフルエンザに罹患するリスクがあるＣＯＰＤ患者に関しても推奨されうる。したがって、特定の側面において、第二の療法剤は抗ウイルス剤である。

抗生物質−−抗生物質は、悪化するＣＯＰＤ症状を有する、細菌呼吸器感染患者においてある程度の利益がある。医師は、痰分析（肺中の痰から）を命じて、特定の状況において抗生物質が必要かどうか決定してもよい。したがって、特定の側面において、第二の療法剤は抗生物質である。

酸素−−進行したＣＯＰＤの患者は、血中で低酸素レベルを有しうる。低酸素症として知られるこの状態は、患者が息切れを感じず、また他の症状がなくても起こりうる。指に取り付けたデバイス（パルス酸素濃度計）で、または血液検査（動脈血液ガス）で、酸素レベルを測定してもよい。低酸素症患者に酸素療法を行ってもよく、該療法は、血中酸素レベルが減少した度合いに応じて、生存および生活の質を改善しうる。したがって、特定の側面において、第二の療法剤は酸素である。

重度のアルファ−１−抗トリプシン不全に関する増大療法−−ＣＯＰＤに対する寄与因子としてアルファ−１−抗トリプシン不全を有する患者を、献血されプールされた血液から調製された精製アルファ−１−抗トリプシンで治療してもよい。したがって、特定の側面において、第二の療法剤はアルファ−１−抗トリプシンである。

他の療法−ＣＯＰＤの特定の患者は：息切れを減少させるため、非侵襲性換気補助（症状を改善するための特別なマスクおよび人工呼吸器の使用）、抗不安または抗抑鬱薬剤、あるいはモルヒネ様薬剤を含む、他の治療を与えられてもよい。こうした療法は、本出願の第二の療法剤を構成しうる。

実施例１：分類不能インフルエンザ菌ＨＩ−１６４株の選択
１．１ 背景
株ＩＤ１６４、１６５、１６７および１６８を含むいくつかのＮＴＨｉ単離体を、オーストラリア・ニューカッスルのＪｏｈｎ Ｈｕｎｔｅｒ病院の呼吸器クリニックに通う２０人の患者から収集した。該単離体および別の研究単離体（ＮＴＨｉ−１６６株）を、増殖条件、生物型、血清型、Ｂカプセル遺伝子の存在およびベータ・ラクタマーゼ遺伝子の存在に関して性質決定した。結果を以下の表１に示す：
表１：異なるＮＴＨｉ単離体の増殖特性

急性呼吸器感染のげっ歯類モデルにおいて、経口ワクチンの活性構成要素としての有用性に関して、単離体を試験した。また、ヒト血液リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激してＩＦＮγを分泌させる能力に関しても、単離体を試験した。これらの試験に基づいて、単離体ＮＴＨｉ−１６４は、Ｈｕｎｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ ＨＩ−１６４ＯＶ経口ワクチンにおいて使用するためのＮＴＨｉ株として選択されている。この単離体は、インフルエンザ菌感染に対する防御を提供する経口ワクチンにおいて使用するための理想的な選択となる特性を有する。

実施例および明細書の残りの両方において、用語「ＨＩ−１６４ＯＶ」は、ＨＩ−１６４を含むワクチン錠剤、すなわちホルマリンで殺した凍結乾燥ＮＴＨｉ−１６４活性物質を指す。

１．２ ＮＴＨｉ−１６４特性の要約
１．２．１ 微生物学的同定
インフルエンザ菌同定：増殖にはＸおよびＶ因子が必要である。分類不能同定であり（すなわちいかなるタイプのカプセルも持たない）、Ｂカプセルの発現がなく、そしてＢカプセルの遺伝子がなく、β−ラクタマーゼがない。

１．２．２ 増殖特性
ヘモフィルス試験（ＨＴＭ）補充剤を補充したＯｘｏｉｄ^ＴＭトリプトン大豆ブロス（ＴＳＢ）中でよく増殖する。ＨＴＭ補充剤を含むＯｘｉｏｉｄ^ＴＭ ｖｅｇｇｉｔｏｎｅブロス中でもよく増殖する。

多様な培地がインフルエンザ菌ＮＴＨｉ−１６４およびＡＴＣＣ１９４１８を増殖させる能力を調べ、そして結果を比較した。インフルエンザ菌ＮＴＨｉ−１６４およびインフルエンザ菌ＡＴＣＣ１９４１８を：
・トリプトン大豆ブロス（コードＣＭ１２９。ロットＢ：３０１３７７）
・トリプトン大豆ブロス（コードＣＭ１２９。ロットＢ：３０１３７７）に加えて酵母エキス（ＯｘｏｉｄコードＬ２１、ロットＣｈ−Ｂ：８５６１０８）
・Ｖｅｇｇｉｔｏｎｅ野菜ペプトン（ＯｘｏｉｄコードＶＧ０１００、ロット３３５９１８）
・Ｖｅｇｇｉｔｏｎｅ野菜ペプトン（ＯｘｏｉｄコードＶＧ０１００、ロット３３５９１８）に加えて酵母エキス（ＯｘｏｉｄコードＬ２１、ロットＣｈ−Ｂ：８５６１０８）
のいずれか１００ｍＬを含有する２５０ｍＬコニカルフラスコ中でインキュベーションした。

各培地に、ヘモフィルス試験補充剤（ＨＴＭ）、ＯｘｏｉｄコードＳＲ１５８Ｅ、ロットＢ：３１２１４１を補充した。増殖は、周囲空気中、３７℃で、１秒あたり、ほぼフラスコ２回転で行った。インキュベーションおよそ１１時間後に、静止期に到達した。

用いたすべての培地が、インフルエンザ菌の両方の株の増殖を補助し、より栄養が豊富なＴＳＢに酵母エキスおよびＨＴＭ補充剤を加えたものが好ましい配合物であった。動物に基づく培地（ＴＳＢ）および野菜に基づく培地（野菜ペプトン）は、２つの単離体に関する増殖特性ではほぼ同等であった。

好ましい培地配合物（酵母エキスおよびＨＴＭ補充剤を含むＴＳＢ）を用いると、長期に渡るインフルエンザ菌株ＮＴＨｉ−１６４およびＡＴＣＣ１９４１８の光学密度プロットはほぼ同等であり、インフルエンザ菌ＮＴＨｉ−１６４およびＡＴＣＣ１９４１８を１１時間インキュベーションした５９５ｎｍのＯＤは、それぞれ、０．５９０および０．５２５であった。他の培地が類似のまたはよりよい増殖結果を生じうることに注目されたい。ＮＴＨｉ−１６４およびＡＴＣＣ１９４１８の増殖曲線を図１に示す。

大規模産生のため、ＮＴＨｉ−１６４を、３０±０．３ｇ／Ｌトリプトン大豆ブロス；５±０．０５ｇ／Ｌ酵母エキス；および０．２０±０．０１ｇ／Ｌ消泡剤を含有し、そして１５ｍｇ／ｍｌのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）および１５ｍｇ／ｍｌのヘマチンを補充した培地中で、ＮＴＨｉ−１６４を増殖させてもよい。１Ｌあたり４ｍＬまでの体積で補充剤を添加する。

１．３ 感染のげっ歯類モデルにおける防御誘導能力
これらのデータによって、死菌ＮＴＨｉ−１６４が防御性免疫反応を刺激する能力を有することが立証される。本出願者らは、この能力が、細菌抗原の発現パターンおよび／または天然アジュバントの存在、および／またはパイエル板内に取り込まれる能力（粒子サイズ、そしてまたおそらく接着タンパク質に関連するようである）に関連すると考えている。

１．４ ＨＩ−１６４は、ラットにおける急性呼吸器感染に対して防御する
第０日に、腸管腔に直接送達される単回用量の３ｘ１０^７、３ｘ１０^８、または３ｘ１０^９のホルマリンで殺したＮＴＨｉ−１６４（本明細書においてＨＩ−１６４と称する）、またはその後、第１４日の１回の経口用量または第１４日および第２１日の２回の経口用量によって、ラットを免疫した（すなわち、ラットは１回、２回または３回の用量を投与された）。第２８日、気管内への滴下によって、ブースト用量（腸用量をブーストする能力を持つが、それ自体に対する防御免疫を提供する能力を持たない）を肺に送達した。各免疫措置に関する対照ラットをプラセボ（ＰＢＳ）で免疫した。第３５日、５ｘ１０^８生菌ＮＴＨｉ−１６４の気管内滴下によってラットを感染させた。４時間後、サンプル採取のため、ラットを屠殺した。肺を洗浄して、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を提供し、そして肺をＰＢＳ中でホモジナイズして肺ホモジネート（ＬＨ）を提供した。ＢＡＬおよびＬＨの連続希釈を調製し、そして各希釈の試料をチョコレート寒天プレート上にプレーティングした。５％ＣＯ_２の大気中、３７℃でプレートを一晩培養した。プレート上のコロニーを計数し、そしてＢＡＬおよびＬＨ中のＮＴＨｉ−１６４数（コロニー形成単位、またはＣＦＵ）を計算した。肺中の総ＮＴＨｉ−１６４ ＣＦＵを決定した。ワクチン免疫動物およびプラセボ免疫動物に関する肺中の平均ＣＦＵを計算し、そして各ワクチン接種措置によって提供される細菌クリアランスを適切な対照群と比較して計算した。結果を図２に示す。用量が３ｘ１０^８または３ｘ１０^９である場合、１以上の用量を投与された動物において、優れた細菌クリアランスが得られた。用量が３ｘ１０^７である場合、２または３の用量を投与された動物において、優れた細菌クリアランスが得られた。

１．５ ＮＴＨｉ−１６４は、マウスにおけるインフルエンザ菌呼吸器感染に対して防御する
これらの実験によって、ＮＴＨｉ−１６４がラットと同様にマウスを防御する能力を立証する。これらの実験はまた、ワクチンが、感染に最も感受性であるマウス株において、最も防御性であることを立証する。

Ｃ５７ＢＬ／６またはＢａｌｂ／ｃマウスを、第０日および第１４日のＰＢＳまたはＰＢＳ中の死菌ＮＴＨｉ−１６４（用量サイズ、５ｘ１０^６、５ｘ１０^７、および５ｘ１０^８）の強制投与（ｇａｖａｇｅ）によって免疫した。第２０日または第２１日の死菌ＮＴＨｉ−１６４の非免疫用量（５ｘ１０^５）を用いてマウスを気管内ブーストした。第２７日または第２８日に、１ｘ１０^７生菌ＮＴＨｉ−１６４でマウスを気管内感染させ、そして試料採取のため、４時間後に屠殺した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）および肺ホモジネート（ＬＨ）の連続希釈をチョコレート寒天プレート上にプレーティングし、そして５％ＣＯ_２中、３７℃で一晩培養することによって、肺における生菌Ｈｉ−１６４のレベルを測定した。コロニーを計数し、元来のＢＡＬおよびＬＨ試料中のＮＴＨｉ−１６４数を計算し、そして各マウス肺における総細菌レベルを計算した。各マウス群における平均細菌レベル（±ＳＥＭ）を図３Ａおよび３Ｂに示す。非免疫Ｂａｌｂ／ｃマウスよりも非免疫Ｃ５７ＢＬ／６マウスの方が、より高い感染レベルを有し、Ｂａｌｂ／ｃマウスがより優れた生得的防御を有することが示された。しかし、死菌ＮＴＨｉ−１６４ワクチンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて非常に有効であり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＴｈ１表現型を有することが示されてきており（すなわちＴｈ１型免疫反応で、より容易に反応する）そしてＢａｌｂ／ｃマウスはＴｈ２表現型をより多く有する（すなわちＴｈ２型反応で、より容易に反応する）ため、特異的防御機構はＴｈ１型のものであることが示唆された。

１．６ 他のインフルエンザ菌単離体に対して交差防御する能力
本実施例は、ホルマリンで殺したＮＴＨＩ−１６４での免疫によって、広い交差防御が提供されることを立証する。これは、主要ＯＭＰ Ｐ２の保存が欠如していることが、ヒトにおける交差防御の見かけの欠如の原因であると捉えていたＳｅｔｈｉおよびＭｕｒｐｈｙ（ＳｅｔｈｙおよびＭｕｒｐｈｙ， ２００２， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １４（２）：３３６−３６３）によっては予測されなかったであろう。

５０μＬ ＰＢＳ中に５ｘ１０^８死菌ＮＴＨｉ−１６４を含むワクチンを用いて、第０日および第１４日の気管内経路によってラットを免疫した。続いて、第２１日に、異なる生物型の分類不能株またはｂ型株である多様なインフルエンザ菌株の１つを用いて、ラットを感染させた。表２は、分類不能株の試験したすべての生物型に対して、防御が提供されたことを示す。表３は、試験した３つのｂ型株のうち２つに対してもまた、防御が提供されたことを示す。

表２： ＮＴＨｉクリアランス％

表３： Ｂ型インフルエンザ菌のクリアランス％

１．７ げっ歯類における特異的免疫反応の誘導
本実施例は、死菌ＮＴＨｉ−１６４でのワクチン接種が、細菌感染に対する肺防御において重要なＮＴＨｉ特異的Ｔ細胞の誘導を導くことを立証する。

第０日、５匹のラットの群を、０．５ｍＬの
・ＰＢＳ
・５００μＬ ＰＢＳ中、５ｘ１０^８の用量のＮＴＨｉ１６４標本
・５００μＬ ＰＢＳ中、５ｘ１０^９の用量のＮＴＨｉ１６４標本
の腸管腔（開腹手術によって曝露）への滴下によって免疫した。

第１４日にラットを屠殺し、そして腸間膜リンパ節を収集して、リンパ球懸濁物を調製し、そして０．１、１および１０μｇ／ｍＬのＮＴＨｉ１６４抗原と５日間ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した（３つ組）。培養の最後の６時間の間、ウェルを^３Ｈ−チミジンでパルス処理して、抗原刺激に反応したリンパ球増殖を検出し、そして次いで、フィルターマット上に培養を採取した。各培養ウェルに関して、シンチラントおよび放射能（１分あたりのカウント）を含むバッグ中にマットを入れ、β−カウンターで測定した。図４は、各ラット群由来のリンパ球に関する平均増殖反応を示す。これによって、死菌ＮＴＨｉ−１６４で免疫した後、腸間膜リンパ節において、ＮＴＨｉ−１６４特異的リンパ球を検出可能であることが立証される。

１．８ げっ歯類における死菌単離体の毒性の欠如
これらの研究は、ワクチンがヒトにおいて安全であることを示唆するＨＩ−１６４ＯＶに関する毒性データを提供する。

１２匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの群に、ＰＢＳ（プラセボ）、ＰＢＳ中に懸濁されたＨＩ−１６４活性物質（製造バッチ番号ＶＲＩ０４０１）の２．２５ｍｇ（５ｘ１０^９死細胞に対応する）のラット療法用量、または４５ｍｇ（１ｘ１０^１１死細胞に対応する）のヒト・サイズ用量を投薬した。投薬は第０日および第１４日であり、そしてラットを死後検査および試料収集のため、第２１日に安楽死させた（ペントバルビトン過剰投与）。以下のパラメーターを測定した：
・臨床的評価を毎日
・体重を毎週
・死後検査（獣医師によって実施）
・血液生化学
・血液学
・心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、膵臓、十二指腸、空腸、回腸、結腸、腸間膜リンパ節に関する組織病理学
・生化学、血液学および組織病理学はＩｄｅｘｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オーストラリアによって実施された。

これらのパラメーターのいずれに関しても、活性治療群およびプラセボ群の間で相違はまったく見られなかった。
１．９ ヒト血液中のＮＴＨｉ特異的Ｔ細胞を刺激する能力
本研究は、ヒト血液中のインフルエンザ菌特異的Ｔ細胞が、ＮＴＨＩ−１６４を認識し、そしてこれに反応してＩＦＮ−γなどのサイトカインを分泌可能であることを示唆する。ＩＦＮ−γはまた、防御機構にも関与し、これにより、ＩＦＮ−γは食作用細胞（マクロファージおよび多形核細胞）をより活発に貪食し、そして細菌を殺すように活性化する。

最初の研究では４人の志願者を調べた。第１日、静脈穿刺によって、血液をリチウムヘパリン試験管に収集した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配上での遠心分離によって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＰＢＭＣを平底９６ウェルプレートのウェル中、血清不含培地中で培養した。５％ＣＯ_２を加え、３７℃に設定したインキュベーター中で３日間、培養を刺激しない（培地のみ）か、あるいは２ｘ１０^６および２ｘ１０^８／ｍＬの死菌ＨＩ−１６４、または１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび０．１μｇ／ｍＬのＮＴＨｉ １６４超音波処理抗原で刺激した。第３日、各ウェルから１．５ｍＬエッペンドルフ試験管内に培養上清を収集し、１２０００ｒｐｍ（ｇ）で２分間の遠心分離によって清澄化し、アリコットして、そしてＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のレベルをＥＬＩＳＡによって測定するまで−７０℃で保存した。

ＮＴＨｉ １６４で刺激したＰＢＬ培養上清から得たＩＦＮ−γレベルを以下の表４に示す：
表４： ＮＴＨｉ １６４抗原およびＰＨＡで刺激したＰＢＬの培養上清におけるＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍＬ）のレベル

第二の研究では、ＨＩ−１６４ワクチンの安全性および免疫原性研究のために採用された７人の被験体を調べた。第０日、研究薬剤を投与する前に、臨床試験ＨＨＩ００３被験体、００１ ＥＳＹ、００２ ＳＰ、００３ ＭＢＷ、００４ ＪＭＷ、００５ ＪＤＬ、００６ ＲＧＢおよび００７ ＭＡの第１回の来診から、１０ｍＬのヘパリン処理血液を得た。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配上で末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を単離し、洗浄し、そしてアンホテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍＬ）、１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液および２−メルカプトエタノール（５ｘ１０^−５Ｍ）（ＳＯＰ：ＩＭＭ０２７）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中に再懸濁した。

１ｍＬの培地中、１ｘ１０^６細胞／ウェルで平底２４ウェルプレート中で細胞を５日間培養した。２つの濃度のＮＴＨｉ １６４抗原（１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ）およびＰＨＡ（５μｇ／ｍＬ）で細胞を刺激した（ＳＯＰ：ＩＭＭ０１１）。ＰＨＡは、全Ｔ細胞刺激因子である。

第５日、各ウェルから培養上清を収集し、遠心分離によって清澄化し、次いでアリコットして、そして培養上清中のＩＦＮ−γレベルをＥＬＩＳＡによって測定するまで、−７０℃で保存した。結果を以下の表５に示す。

表５：ＮＴＨｉ １６４抗原およびＰＨＡで刺激したＰＢＬの培養上清中のＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍＬ）のレベル

ＮＴＨｉ １６４（１０μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬ）は、すべての被験体のＰＢＬ培養上清において、ＩＦＮ−γの産生を刺激した。
ヒトにおいて特異的リンパ球免疫反応を誘導する能力
プラセボ対照安全性および免疫原性研究に採用した被験体を、特異的免疫反応誘導に関して調べた。図４は、研究経過に渡って、ワクチンおよびプラセボ治療群で生じた特異的Ｔリンパ球誘導を示す。プラセボ患者群の血中の特異的Ｔリンパ球は研究期間に渡って増加した（図５Ａ、５Ｂ）。この反応は、この期間中にインフルエンザ菌細菌への曝露によって誘導された可能性が最も高い。活性錠剤治療を受けた患者において、特異的リンパ球の誘導が増進され、天然誘導免疫反応がブーストされることが示唆された。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＨＡに対する反応増進もまた、ＨＩ−１６４ＯＶ群由来の血液リンパ球で観察された（図５Ｃ）。

１．１０ ＨＩ−１６４ＯＶ治療は唾液リゾチームを減少させる
ＨＩ−１６４ＯＶ治療群における唾液リゾチームの減少が観察され、炎症の減少が示唆される（図６）。

１．１１ 死菌ＮＴＨｉ−１６４経口ワクチン（ＨＩ−１６４ＯＶ）が、細菌が下気道に到達するのを防止する能力
血清ＩｇＧ、および喉の含嗽剤中でＮＴＨｉが検出された来診の回数の間の関係に関して、上記と同じ被験体を調べた。第１回および第６回の来診の間の血清ＮＴＨｉ特異的ＩｇＧの平均（±ＳＥＭ）対数変化を、インフルエンザ菌が含嗽剤中で検出された来診の数（来診時０〜１回または来診時２〜４回のいずれかとして分類する）に対してプロットした（図７Ａ）。プラセボ群では、高レベルの血清ＮＴＨｉ特異的ＩｇＧは、来診時２回以上での生菌ＮＴＨｉ検出と関連した。活性ＨＩ−１６４ＯＶ錠剤で治療した被験体では、こうした関連は明らかではなかった。基準からの血清ＩｇＧの変化中央値のプロットを、第２回〜第７回の来診すべてに関して、図７Ｂに示す。ここでも再び、プラセボ治療群における血清ＮＴＨＩ特異的ＩｇＧの増加およびＨＩ−１６４ＯＶ治療群における血清ＮＴＨｉ特異的ＩｇＧの減少が立証される。このデータは、上気道の細菌が下気道に進入し、そして血清においてインフルエンザ菌特異的ＩｇＧを誘導するのが、活性治療によって防止されると解釈された。インフルエンザ菌が含嗽剤中で検出された来診回数が０〜１回または２〜６回であった被験体に関する、血清ＮＴＨｉ特異的ＩｇＧにおけるベースライン（第１回の来診）からの変化中央値を図７Ｂに示す。

１．１２ 死菌ＮＴＨｉ−１６４経口ワクチン（ＨＩ−１６４ＯＶ）が、軽度から中程度または中程度から重度の気道疾患を有する患者において、増悪の重症度に対して防御を提供する能力。

ＨＩ−１６４ＯＶワクチンの有効性を調べる二重盲検プラセボ対照平行臨床研究において、軽度から中程度または中程度から重度の気道疾患を有する１６４人の患者に、４５ｍｇ（１０^１１死細菌に同等）を含有する１８錠剤を投薬した。１日あたり２錠剤を、第１日、第２日、第３日、第２９日、第３０日、第３１日、第５７日、第５８日、第５９日に投与した。全身健康状態、不都合な事象、慢性気管支炎の急性増悪およびこれらの増悪の重症度を監視した。活性治療群が、プラセボ対照群に比較して、入院（大部分、気管支炎の増悪による）がかなり減少している（プラセボ群において７人の患者で１０回の入院、およびＨＩ−１６４ＯＶ群において１人の患者で１回の入院）ことが見出された。これらのデータは、経口ワクチンとして用いた際に、このワクチン活性物質が防御能を有することの指標となる。

実施例２： ＨＩ−１６４ＯＶの臨床的利点
過去２年間に１日あたり少なくとも１０本のタバコを喫煙していたことに基づき、６４人の被験体を採用し、そして二重盲検研究において、経口ＮＴＨｉ療法またはプラセボ治療群に割り当て、プラセボ対照二重盲検臨床研究を行った。被験体をプラセボ群および活性群にランダム化し、そして研究薬剤の３回のコースを月間隔で投与した。各コースは、３日間の１日あたり２錠剤からなった。活性錠剤は、各々、４５ｍｇのホルマリンで殺したＮＴＨｉ（活性錠剤あたり１０^１１死細菌と同等）を含有した。２週間ごとの７回の来診時に、血液、唾液、含嗽剤、喉スワブ、および鼻スワブ（微生物学的評価のため）を収集した。

１．１３ ＮＴＨｉの検出およびＮＴＨｉ特異的ＩｇＧの測定
驚くべきことに、冬期に渡るプラセボ治療群およびワクチン治療群における測定によって、どちらの群でもＮＴＨｉが検出され、この細菌にランダムに曝露されていることが示された。図８は、各来診時のプラセボ群の含嗽剤におけるＮＴＨｉの平均レベルを示す。

ＥＬＩＳＡアッセイによって、血清および唾液中のＮＴＨｉ特異的ＩｇＧを測定した。簡潔には、９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートのウェルをインフルエンザ菌１６４超音波処理抗原調製物でコーティングした。２〜８℃で一晩インキュベーションした後、プレートを洗浄し、そして血清または唾液試料を多様な希釈で添加した。室温で６０分間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、そして西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎカタログ番号ＡＰ１１２Ｐ）を添加した。室温でさらに６０分間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、そしてＴＭＢ基質（Ｂｉｏｍｅｄｉｑカタログ番号５０−７６．００）を添加した後、室温で１０分間さらにインキュベーションし、そして１Ｍリン酸を添加することによって反応を停止した。４５０ｎｍの一次フィルターおよび６５５ｎｍの参照フィルターの二重波長モードで、ＢｉｏＲａｄマイクロプレート読み取り装置上、吸光度を読み取った。標準曲線を用いて、各試料中のＥＬＩＳＡ単位を決定した。

プラセボ群における血清および唾液中のＮＴＨｉ特異的ＩｇＧレベルは、ワクチン治療群におけるレベルよりより高く、そしてより多様であった（図９および図１０を参照されたい）。出願者らは、これは、プラセボ群においてはＮＴＨｉが下気道に到達し、ＩｇＧの全身産生を生じるためであり、そしてワクチン治療群においてはＮＴＨｉが下気道に到達することが本質的に防止されたと考えている。これを試験するため、含嗽剤中にＮＴＨｉが検出された来診回数、ならびに第１回および第６回の来診間での血清ＩｇＧの変化中央値の間の関係のプロットを作成した（図７）。含嗽剤中にＮＴＨｉが見出された来診回数が０〜１回または２〜６回であるかにしたがって、プラセボおよび活性被験体をグループ化した。プラセボ群では、血清ＩｇＧの陽性増加は、ＮＴＨｉ検出の回数増加と関連した。これは、活性治療群では見られなかった。プラセボおよび活性のＩｇＧ変化間の相違は統計的に有意であり（ｐ＝０．０１８６）、プラセボ群における血清ＩｇＧが、実際に、下気道に到達した細菌の結果、ＮＴＨｉによって生成されたことを示す。さらに、プラセボ洗浄中に存在するＮＴＨｉがより多いと、ＩｇＧ抗体レベルはより高かった。これはまた、プラセボ群における唾液ＮＴＨｉ特異的ＩｇＧの出現にも当てはまると考えられる。

１．１４ 考察
ワクチン有効性に関するマーカーとして血清ＩｇＧ抗体を測定した。ワクチン治療群におけるＩｇＧ反応の見かけの欠如が見出され、一方、患者のプラセボ治療群は、血清ＩｇＧの増加を示した。理論によって制限されることなく、本出願者らは、プラセボ群で観察されたＩｇＧの増加は、下気道に到達した感染細菌に対する免疫反応を反映しており、下気道では、抗原提示細胞によって細菌が取り込まれ、そして排出リンパ節に輸送されて、抗細菌ＩｇＧ反応が誘導されると考えている。対照的に、ワクチン治療群においてこうした反応が欠如していることは、細菌の下気道への到達が本質的に防止されている（粘膜ワクチン特異的免疫反応によって）ことを示す。また、低頻度（来診時に０〜１回検出）または高頻度（来診時に２〜６回検出）でＮＴＨｉが上気道で検出された被験体におけるＩｇＧ反応を比較すると、プラセボ群ではＩｇＧの増加が示されたが、活性（ワクチン）治療群では示されなかった。これによって、ＮＴＨｉでの経口ワクチン接種後の血清ＩｇＧ測定は、感染に対する曝露およびこれが粘膜免疫によってどの程度防止されたかを反映することが示唆される。唾液ＩｇＧ反応は、血清中で見られたものを反映した。

総合すると、本研究は、治療群およびプラセボ群の両方で、被験体の上気道におけるＮＴＨｉが検出されること、そして経口死菌ＮＴＨｉワクチン療法での治療は、治療群において血清および唾液中のＮＴＨｉ特異的ＩｇＧの減少を導くことを立証し、ワクチンが下気道へのＮＴＨｉのアクセスを制限するかまたは防止するのに成功した（すなわち喘息を開始するかまたはＣＯＰＤを悪化させるアレルゲンがより少ない）ことを示す。

したがって、ＩｇＧ抗体の刺激によって立証されるように、プラセボ群においてのみＮＴＨｉが下気道にアクセスし、そしてＮＴＨｉワクチンでの経口「免疫」は、気道中のＮＴＨｉアレルゲンを減少させた。

実施例３： 軽度の、中程度のまたは重度の気道疾患を有する被験体に経口投与した死菌ＮＴＨＩ−１６４ワクチン（ＨＩ−１６４ＯＶ）は、抗喘息療法の使用を減少させた
軽度から中程度または中程度から重度の気道疾患を有する１４０人のヒト被験体を二重盲検プラセボ対照研究に採用して、喘鳴可逆性気道閉塞の回数および重症度に対する経口死菌分類不能インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）ワクチン、ならびに併用薬剤の使用の効果、ならびに気道中のＮＴＨｉおよび他の細菌の存在を評価した。

対照群に比較して、治療群において、抗喘息型薬剤（気管支拡張剤、ステロイドなど）の使用の減少およびＮＴＨｉによる感染の減少が見出された。特に、ＮＴＨｉに対するＩｇＥ抗体レベル（血清および分泌）が高い被験体の気道内で、ＮＴＨｉの特異的減少が達成され、そして喘息症状が減少した結果、喘息薬剤の必要性の減少が達成された。

１．１５ 被験体および臨床試験
本研究は、臨床研究機構の監視の下に、４つの場所で行われた、多施設二重盲検プラセボ対照試験であった。これらの場所は：Ｈｏｌｌｙｗｏｏｄ Ｐｒｉｖａｔｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ウェスタンオーストラリア州パース（Ｍ．Ｋ． Ｔａｎｄｏｎ博士）； Ｓｉｒ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｇａｉｒｄｎｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ウェスタンオーストラリア州パース（Ｍ． Ｐｈｉｌｌｉｐｓ博士）； Ｒｏｙａｌ Ｐｅｒｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ウェスタンオーストラリア州パース（Ｇ． Ｗａｔｅｒｅｒ准教授）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ、ニューサウスウェールズ州ニューカッスル（Ｒ． Ｃｌａｎｃｙ教授）であった。各施設の倫理委員会によって同一のプロトコルが認可され、そして研究はこれらの委員会の指針にしたがった。主な参加基準（ａｄｍｉｓｓｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）は、連続２年間で１年あたり２回以上のエピソード歴であった（「エピソード」は「バックグラウンドレベルからの咳および膿性痰の増加」と定義された）。被験体を２つの群に層別化した：ｉ）予測される正常値の５０％以下のＦＥＶ_１を持つ患者（３８人の被験体）、およびｉｉ）予測される正常値の５０％より大きいＦＥＶ_１を持つ患者（１０２人の被験体）。この二番目の群には、ＣＯＰＤの患者、気管支拡張症の一次診断を受けた患者、および「正常」ＦＥＶ_１レベルを持つ患者が含まれた。＜８０％のＦＥＶを持ち、そして気管支拡張症の一次診断を受けていない２つの研究群由来の患者は、ＣＯＰＤを有すると定義され、そしてこの分析の対象である。分析は、すべてのＣＯＰＤ患者におけるＨＩ−１６４ＯＶでの治療を調べ、そして次いで、特に、中程度から重度のＣＯＰＤ患者群における治療を調べる。

すべての被験体を、南半球の冬および早春に渡る、８〜９ヶ月間追跡した：採用は２００６年３月７日に始まり、そして最後の患者は２００６年１０月３１日に完了した。ＨＩ−１６４ＯＶ錠剤は、４５ｍｇ（ＣＦＵ １０^１１細菌と同等）のホルマリン不活性化ＨＩ−１６４を含有し、腸溶性コーティング錠剤として提供され；プラセボ錠剤は賦形剤のみを含有し、経口投与用の腸溶性コーティング錠剤として提供された。患者は３コースの錠剤を摂取した。各コースは、連続３日間、毎日２錠剤（朝食前）からなり、第２８日および第５６日にコースを反復した。被験体は、第０週、第４週、第８週、第１２週、第１８週、第２４週、第３０週、第３６週に、対面式インタビューを受けた。第４週および第８週に次の錠剤コースを投与した。すべての来診時に、構造化されたアンケートの補助で、急性エピソードおよびその性質を文書化し；不都合な事象を記録し；痰および血液を収集して、それぞれ、細菌コロニー形成および安全性パラメーターを監視し；そして併用薬剤を評価した。

この分析に関して評価した一次変数は（ｉ）増悪の回数（「痰の体積および化膿の増加」として定義）；（ｉｉ）１以上の増悪を経験している被験体の比率；（ｉｉｉ）増悪の平均期間；（ｉｖ）増悪に関して処方される抗生物質コースの数であった。評価した二次変数は、有害作用（入院を含む）、および痰の微生物学であった。

治療意図（ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ）集団に関する統計分析は、両側として考慮した「Ｐ値」を用いた。事象数を曝露（ランダム化から最近の来診までの日数として計算）によって割り、１００を乗じたものとして、急性エピソード（または「治療によって定義される急性エピソード」）の率を計算した。反復測定Ｐｏｉｓｓｏｎ回帰を用いて、率における治療相違を調べ、ここで、曝露の対数（日数）をオフセットと見なした（ｗａｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｎ ｏｆｆｓｅｔ）。これらの回帰から、率（リスク）比およびそれに関連する９５％信頼区間（ＣＩ）を得た。フィッシャーの正確な検定を用いて、１以上のエピソードを持つ被験体の比率を比較した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によってエピソードの期間（開始日から停止日まで）を概算し、そして治療相違をログランク検定によって分析した。治療日を計算するため、開始日および停止日に関する重複と関わりなく、各関連投薬期間の合計として、日数を計算した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定（スチューデントの「ｔ」近似）を用いて、治療間で、各被験体が治療を受けた日数を比較した。０、１、２回等の抗生物質コースを経験した被験体の数を提示し、そしてＣｏｃｈａｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ検定を用いて、治療群を比較した。Ｐｏｉｓｓｏｎ回帰を用いて、治療間の入院率を比較し、ここで被験体の対数変換数をオフセットとして用いた。

目的は、中程度から重度および軽度から中程度の群各々に、１２４人を採用して、２０％の脱落率を可能にすることであった。各群５０人が研究を完了すると、これによって（５％有意レベルおよび８０％検出力で）３７％のエピソード数の相対リスク減少（プラセボ群において感染率を２と仮定して）；２８％の患者比率の減少（プラセボ群の８０％が少なくとも１回の感染を有すると仮定して）；３３％の処方抗生物質の相対リスク減少（プラセボ群が２．４の処方率であると仮定して）；プラセボ群が２日間のＳＤであると仮定して、１．２の期間の平均日数の相違を検出するであろう。２年間に渡って、１年あたり２回以上のエピソードが必要であることが採用の主な障害であることがわかり、ＣＯＰＤを有する総数７３人が登録された（３８人は中程度から重度の疾患を有し、そして３５人が軽度から中程度の疾患を有した）。気管支拡張症を有するか、または予測される正常値の割合として（すなわち８０％以上）「正常」ＦＥＶ_１値を有するさらに６７人の被験体を研究したが、ＣＯＰＤを有する被験体のこの分析には含めない。統合分析は、研究前決定であった。

１．１５．１ 人口統計学的特性
患者特性を以下の表６に示す。
表６： 患者特性

中程度から重度のＣＯＰＤを有するもののベースラインでは、活性群の、およびプラセボ群の１３人が虚血性心臓疾患の病歴を有し、活性群の６人およびプラセボ群の２人が「喘息」の過去の病歴を有し、活性群の２人およびプラセボ群の４人が関連気管支拡張症を有した。この群において、ベースラインでの関連療法として：各群の１２人の被験体がサルブタモールを投与され；活性群の１４人およびプラセボ群の１３人がチオトロピウムを投与され；そして活性群の１０人およびプラセボ群の９人がサルメテロール／フルチコゾン（ｆｌｕｔｉｃｏｓｏｎｅ）（Ｓｅｒｅｔｉｄｅ（登録商標））を投与されていた。プレドニゾンは、活性群の６人およびプラセボ群の７人によって摂取された。酸素療法は、活性群の５人およびプラセボ群の２人によって用いられた。プラセボ群および活性群両方のおよそ半数が、季節性インフルエンザワクチン接種を受け、一方、３分の２が肺炎球菌ワクチン接種を受けていた。

１．１６ 結果
プラセボに対するＨＩ−１６４ＯＶ投与の結果を以下の表７に示す：
表７：結果の要約

１．１６．１ 急性エピソード数
急性エピソードを「痰の体積および化膿の増加」とするプロトコル定義を用いると、総ＣＯＰＤ群に関して、ＨＩ−１６４ＯＶ群では３６のエピソードがあり、そしてプラセボ群では５０のエピソードがあり、これらは毎月の期間で分析すると、０．７６のリスク比（９５％ＣＩ ０．５０、１．１５；Ｐ＝０．１９）を有した。３ヶ月間に渡って分析すると、事象率／１００日で、２番目の３ヶ月の期間、活性群でより大きい利益があった（プラセボ：事象／１００日−０．８２（最初の３ヶ月）、０．７４（第二の３ヶ月）；活性：０．７２および０．４８。Ｐ値。期間効果０．６８、および治療効果０．１９）。急性エピソードのプロトコル定義（「痰の体積および化膿の増加」）を用いると、中程度から重度のＣＯＰＤ群で、プラセボ群の２９エピソードに比較して活性群では２２エピソードがあり、０．８４のリスク比（９５％ＣＩ：０．４８、１．４９）であり、有意ではなかった。しかし、３ヶ月の期間による分析では、事象率／１００日は、最初の３ヶ月に関して、活性群およびプラセボ群で０．８２で同じであったが、第二の３ヶ月では、プラセボ群に比較して活性群で減少し（０．６対０．８５）、事象の２９％の減少に相当した。中程度から重度の疾患をもつものでは、活性治療群（６人の被験体）に比較した際、２〜４のエピソードを伴い、プラセボ群ではほぼ２倍多い患者（１１人の被験体）であり、再発減少に対する療法効果と一致した。総ＣＯＰＤ群では、防御にはまったくまたはほとんど相違がないが、より重度の疾患を持つものでは、より高いレベルの防御（２７％）が見られた。

１．１６．２ 急性エピソードを伴う患者の比率
急性エピソードを伴う患者の比率は、「コルチコステロイド治療」エピソードの定義を用いて、より重度のエピソードのみを捉える場合を除いて、療法ではわずかしか減少しなかった。

１．１６．３ エピソードの期間
エピソードの平均期間は、プラセボ群に比較して活性群でより少なかった（「全ＣＯＰＤ」；１７．３日に比較して１４．７日；中程度から重度のＣＯＰＤ ２２．７日に比較して１４．３日）が、この相違は中程度から重度の群においてのみ統計的有意性に到達した（Ｐ＝０．０１）。

１．１６．４ 薬剤使用
ＣＯＰＤを有する被験体の全群および中程度から重度のＣＯＰＤを有するものの両方で、活性治療に続く抗生物質の処方コースの数および抗生物質治療の日数（増悪に対するもの）両方の有意な減少が見られた。どちらの型の分析に関しても、「全ＣＯＰＤ」および中程度から重度のＣＯＰＤ患者群の両方において、防御は統計的に有意であった。プラセボ群におけるよりも活性群において、抗生物質の３以上のコースを投与される患者はより少なく（「全ＣＯＰＤ」に関しては１４人の患者に対して５人、中程度から重度のＣＯＰＤに関しては１１人の患者に対して２人）、再発エピソードに対する防御があることが裏付けられた。

中程度から重度のＣＯＰＤを有し、そして経口ワクチンで治療された被験体は、活性群において、気管支拡張剤療法の使用が５０％減少することが見出された。経口ＮＴＨｉ療法の３回のコースの投与後、好酸球数は、活性群でのみ、有意に減少することが見出された。結論として、経口ＮＴＨｉ療法によって、急性エピソードにおいて気管支拡張剤療法の使用が減少し、そしてまた、ＮＴＨｉに特異的なアレルギー反応に関連する好酸球数も減少する。

１．１６．５ 入院
ＣＯＰＤの増悪のための入院率は高く（以下の表８を参照されたい）、中程度から重度のＣＯＰＤのプラセボ群（２０人の被験体）では７人の患者が１０回入院した。より重度でないＣＯＰＤの被験体（１７人の被験体）では、研究期間全体で、ＣＯＰＤの増悪のため、２人のみが入院した。「全ＣＯＰＤ」におけるＣＯＰＤの増悪による入院に対する防御は６１％であり、そして有意性は境界線であった（Ｐ＝０．０７）が、中程度から重度のＣＯＰＤを有する被験体では、より高い防御レベルが見出され（９０％）、これは有意であった（Ｐ＝０．０１）。このより重度の群では、「すべての原因による入院」の有意な相違が検出された（Ｐ＝０．０４）が、非呼吸器事象による入院に対する独立の効果を同定するには、数が小さすぎた。

１．１６．６ 痰の細菌学
「急性事象」の痰試料の分析は、抗生物質治療、輸送の遅延および通知の遅れのため、ほとんど情報を提供しなかった。研究開始後の定期的な来診時に収集された標本は、培養が収集４時間未満で行われた場合に有効と見なされ、そして唾液が混入した標本（上皮細胞の存在によって検出）は排除された。「全ＣＯＰＤ」のプラセボ群（３７人の被験体）におけるこれらの「ルーチン」の試料に関して、患者の半数（１９人の被験体）が陽性培養を有し、総数８８の陽性培養が生じた。活性群（３６人の被験体）に関する同等の数値は、１３人の被験体で４５の陽性培養であり、すなわちＨＩ−１６４ＯＶ療法後、呼吸器病原体に関して陽性の痰培養を有する被験体はより少なく（３１％少ない）、陽性痰培養の総数が、プラセボ群のもののほぼ半数であった。プラセボ群において、１４人の被験体で、平均２．８回、ＮＴＨｉが単離された。他の病原菌に関しては：カタル球菌が５人の被験体で（平均２．４回）；肺炎球菌が６人の被験体で（平均１．７回）；緑膿菌が１１人の被験体で（平均２．３回）単離された。活性群では、ＮＴＨｉが８人の被験体で（平均２．９回）；カタル球菌が７人の被験体で（平均１．０回）；肺炎球菌が４人の被験体で（平均１．５回）；緑膿菌が３人の被験体で（平均３回）単離された。さらなる分析によって、プラセボ群では、陽性痰培養を有した２１人の被験体が３４回の急性エピソード（被験体あたり１．６２回）を有した一方、陽性試料がなかった１６人は１６回の急性エピソード（被験体あたり１．０回）を有した。活性群では、陽性培養を有した１４人が２０回の急性エピソード（被験体あたり１．４２回）を有し、そして陽性痰培養を有した２２人が１６回の急性エピソード（被験体あたり０．７３回）を有した。ＮＴＨｉ単離体に関して、類似のパターンが示された（プラセボ：２０回の急性エピソードを伴う１４人の被験体（被験体あたり１．４２回）で陽性培養、および３０回の急性エピソードを有した２３人（被験体あたり１．３１）では増殖なし）；活性：陽性培養を有した８人の被験体が１０回のエピソードを有する（被験体あたり１．２５回）一方、増殖がない２８人は２６回のエピソードを有した（被験体あたり０．９３回）。（ｉ）陽性痰培養は、急性臨床的エピソードを有するリスクがより高いことを予測し（被験体がプラセボ群または活性群にあるかどうかに関わらず）、（ｉｉ）活性群においては、培養陽性および培養陰性群の両方において、明らかな防御があり（培養陽性群ではおよそ１２％−プラセボ群の１．６２に対して、活性群の１．４２の感染エピソード／個体値として計算；そして「非培養陽性」群ではおよそ２７％−プラセボ群の１．０に対して、活性群の０．７３の感染エピソード／個体値として計算）；（ｉｉｉ）ＨＩ−１６４ＯＶ経口療法後には、陽性培養がより少ない、と結論づけられる。これらの「増殖がない」培養は、より少ない増悪と関連する（上記）。ＮＴＨｉ陽性痰の類似の分析によって、経口ＨＩ−１６４ＯＶ療法の防御効果に関してほぼ同一の転帰が提供された（データ未提示）。

表８：入院

Ｐ（１）はすべての被験体における入院率を比較する。
Ｐ（２）は入院した被験体における入院率を比較する。
表９：痰陰性被験体における、プラセボに対する活性の防御

表１０：痰陰性被験体における、プラセボに対する活性の防御

表９および表１０は、被験体／患者の多様な痰試料から増殖する細菌の割合を立証する。活性群は、ＨＩ１６４ＯＶ産物で治療された。
１．１７ 考察
ＣＯＰＤの自然経過における重要な事象である急性増悪は、現在の指針では、介入療法のための特別のターゲットと認識されている。増悪の発生および重症度に対するＮＴＨｉの新規単離体（ＮＴＨＩ−１６４）から調製した経口ワクチン（ＨＩ−１６４ＯＶ）での免疫療法の影響を決定するため、再発性増悪の病歴を有するＣＯＰＤの被験体を研究した。しかし、こうした被験体は、ＣＯＰＤを有するもの全体の２０〜２５％にしか相当せず、このため、本研究では、計画したよりもはるかに少ない登録者数しか得られなかった。この困難は、「痰の体積および化膿の増加」としての急性エピソードの古典的な記述定義を使用することによって、さらに困難となった。この定義は、急性エピソードが感染起源であることを反映するものの、ＣＯＰＤにおける気管支内炎症のバックグラウンド・レベルが多様であり、別個のエピソードの区別が不鮮明であることを考慮すると、不正確でありうる。定義によって課される制限にもかかわらず、この研究から、２つの結論が得られうる。第一に、ＣＯＰＤおよび再発性増悪を伴う被験体は、ＨＩ−１６４ＯＶでの経口免疫療法から利益を得て、特にその重症度が減少する。第二に、中程度から重度のＣＯＰＤを有する被験体は、より軽度な疾患を持つ被験体よりも、大きな度合いで利益を得る。

痰化膿の増加の記述的定義を用いると、「全ＣＯＰＤ」において、増悪発生が減少する傾向があるが、いくつかの観察によって、この転帰は、臨床的妥当性を有する尺度となることが裏付けられた。プラセボ群における分析は、研究開始時の高い事象率を示した。したがって、本研究の第二の３ヶ月における防御レベルが３５％でより高いことは、免疫増進開始の遅延と一致し、研究の後半の結果は、防御をより正確に反映した。さらに、プラセボ群には、２〜４のエピソードを有する２倍より多い数の被験体が含まれ、ＨＩ−１６４ＯＶ治療が、再発性エピソードを防止するのに特に有効であることが示唆された。治療に関して定義されるエピソードの分析から、説得力があるデータが生じ、特にコルチコステロイドでの治療では、５０％を超える防御レベルであった。より重度のエピソードに関する、より明確な防御を示すこれらのデータセットによって、免疫療法の主な値は、少なくともＣＯＰＤおよび頻繁なエピソードを有するものにおいては、増悪重症度のパラメーターの減少に関連することが示される。

重症度のすべてのパラメーターにおける利益と一致して、活性治療後の重症度のパラメーターには相違があり、ＨＩ−１６４ＯＶ治療の後には、より短いエピソード、抗生物質および経口コルチコステロイドでのより少ない治療、およびより少ない入院可能性が続いた。単に抗生物質で治療されたエピソード数を分析するよりも、処方されるコースまたは投与日数に関する抗生物質使用の方が、利益の改善された指標であり、膿性痰の大部分のエピソードは、重症度に関わらず抗生物質で治療されるが、臨床的に重度と見なされるもののみが、コース反復を引きつけることが示唆される。中程度から重度の疾患を有する被験体の入院が有意に減少しているのは、試料サイズが小さいことを考慮すると印象的な転帰である。本出願者らは、入院率を減少させる類似の能力を有する、いかなる他の介入療法も知らない。数は少なく、そしてこの転帰は、中程度から重度のＣＯＰＤ群でのみ有意であったが、中程度から重度の疾患を有するものにおいて最大の影響を有する、重症度の他のすべてのパラメーターと一致する。これは、最も損なわれた気道を持つものにおいて、気道炎症における任意の所与の減少に関する、より大きな臨床的利点を反映しうる。

ＣＯＰＤにおける急性増悪の影響を減少させることを目的とする療法の比較のための標準は、フルチカゾン／サルメテロール（５００／５０ｍｃｇ）である。この併用の研究には、流動率の保持またはすべての原因の死亡率を測定する、一次転帰を伴う多数の被験体が含まれた。研究に含まれる被験体は、中程度から重度のＣＯＰＤを有したが、本研究におけるように、頻繁な急性エピソードのため、選択されなかった。コルチコステロイド療法によって定義される急性エピソードに対する約４０％の防御レベルが各研究で観察され、これはＨＩ−１６４ＯＶ研究におけるより少なかったが、数が大きい場合に可能な、より大きい検出力を反映して有意なレベルであった。ＨＩ−１６４ＯＶ研究で見られるように、より重度の疾患を有するものにおいて、特に利益が注目された。しかし、フルチカゾン／サルメテロールは、ＨＩ−１６４ＯＶを用いて選られるデータとは対照的に、入院を必要とすると定義される「重度の」増悪に対して、防御するとしてもわずかしか（０％および１７％）防御しなかった。この研究において、本研究における２〜３倍のより高い率と比較して、年あたり約９％の入院率であることが注目された。このより高い率は、おそらく、より重度の疾患のマーカーとしての、頻繁な増悪を反映する。しかし、抗生物質療法に関して急性エピソードを定義すると、活性群のエピソード数には増加があった。これは、ＨＩ−１６４ＯＶ研究における抗生物質治療エピソードの減少とは対照的であった。抗生物質によって定義される急性エピソードの増加は、感染に対する吸入ステロイド関連傾向と一致する（口腔咽頭鵞口瘡および肺炎）。

ＣＯＰＤ患者の初期長期研究は、病因形成において細菌が果たす役割を明確にするのに失敗し、これは主に、安定疾患中の痰における細菌の単離率が、急性エピソード中のものと類似であるためであった。最近の前向き研究は、分子型決定を用いて、ＣＯＰＤの増悪と細菌病原体の新規株の間の関連を立証してきている。ルーチンの痰試料中の、この後者の研究における細菌の単離頻度は、本研究で見られるものと非常に類似であり、そして病原体の単離は、進行中の増悪と有意に関連した。安定疾患から得られる本研究由来のデータにおける傾向は、これらの概念と一致する：陽性痰培養は、急性増悪に関するリスク要因であるようであり（被験体が、研究のプラセボ肢または活性肢にあるかどうかには関わりなく）；そしてプラセボと活性を比較すると、病原体が増殖しているものおよびしていないものの両方で、活性群において、防御の付加が認められる。これらの転帰は、「新規」細菌株の獲得に対する、および／または介入性のウイルス感染などの炎症促進性事象に抵抗する、気道の細菌コロニー形成レベル減少に対する粘膜耐性増進を反映する。どちらの状況でも、ＮＴＨｉ抗原によるパイエル板由来Ｔ細胞の特異的活性化は、非特異的エフェクター機構として働く、食作用細胞の補充および活性化を仲介する。

死菌ＮＴＨｉ（ＨＩ−１６４ＯＶワクチン）での経口免疫療法は、腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）を活性化し、特異的Ｔリンパ球が気管支粘膜にホーミングする。最近の研究によって、気管支内容物の腸への吸入は、ＧＡＬＴに対する抗原提示の生理学的機構であり、そしてＨＩ−１６４ＯＶの経口投与は、Ｔ細胞活性化の季節性プロセスを最適化するように働くことが示されてきている。ＨＩ−１６４ＯＶは、「免疫防御」のために欧州で広く用いられている多重細菌抽出物とは異なる産物である。ＨＩ−１６４ＯＶは、単一種の細菌を含有し、多重細菌製品で使用されているものより数対数高い濃度の全細胞調製物として配合され、そのため、特定のパイエル板免疫反応を誘発する。慢性気道疾患を有する被験体における多重細菌単離体を用いた研究の分析は、増悪の有意な減少を示すことに失敗し、この転帰はまた、多重細菌製品および経口ＮＴＨｉ免疫療法間の比較研究でも見出された。

実施例４： ＮＴＨＩ−１６４は、曝露実験において、ＮＴＨＩ−１６６よりも、より高い度合いの交差防御を伝達する
気管内（ＩＴ）免疫および一団のＮＴＨｉ単離体での急性呼吸器感染曝露のラットモデルにおいて、ＮＴＨＩ−１６４およびＮＴＨＩ−１６６（ＮＴＨｉ２８９）をワクチンとして試験すると、異なるレベルの防御が生じた。感染曝露に用いた単離体は、ＮＴＨＩ−１６４、ＮＴＨｉ−１６５、ＮＴＨＩ−１６６、ＮＴＨＩ−１６７、ＮＴＨｉ−１６８、ＡＴＣＣ ３０４１、ＡＴＣＣ ４３０９５、ＡＴＣＣ ３５０９２およびＡＴＣＣ５１９９７であった。

ワクチンによって提供される防御を決定するため、８〜１０週齢のＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉラットの群（群あたり５〜６匹のラット）を、５０μＬのＰＢＳあるいは５ｘ１０^８の死菌ＮＴＨＩ−１６４またはＮＴＨＩ−１６６を含有する５０μＬのＰＢＳで、第０日および第１４日に気管内（ＩＴ）免疫した。第２１日、ラットを一団の感染曝露ＮＴＨｉ株の１つに感染させた。感染４時間後にラットを屠殺し、そして５ｘ２ｍＬ ＰＢＳで肺洗浄して１０ｍＬの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を得た。次いで、肺を１０ｍＬ ＰＢＳ中でホモジナイズして肺ホモジネート（ＬＨ）懸濁物を得た。ＢＡＬおよびＬＨの連続１０倍希釈の２０マイクロリットルの試料をチョコレート寒天上にプレーティングし、そして空気中の５％ＣＯ_２中、３７℃で一晩インキュベーションした。コロニーを計数し、そしてＢＡＬおよびＬＨ中の生存ＮＴＨｉの数を各ラットに関して計算した。ＢＡＬおよびＬＨ中の細菌数を付加することによって、各ラットに関する肺中の総細菌レベルもまた決定した。各群のラットに関して平均細菌レベルを計算し、そして以下のように、対照ＰＢＳ群に比較して細菌クリアランス％を決定した。

（ＰＢＳ群中の平均細菌−ワクチン群中の平均細菌）ｘ１００
ＰＢＳ群中の平均細菌
４時間の細菌クリアランス・パーセントは、ワクチンによって提供される防御の度合いの尺度となる。

一団の９つの曝露感染株に関して、各試験ワクチンによって提供される平均細菌クリアランス・パーセントを計算した。ＮＴＨＩ−１６４ワクチンに関しては、一団に関する平均細菌クリアランスは８４±４％であり、そしてＮＴＨＩ−１６６ワクチンに関しては、一団に関する平均細菌クリアランスは７８±２％であった。これによって、死菌ＮＴＨＩ−１６４から調製されたワクチンは、ＮＴＨＩ−１６６から調製されたワクチンよりも、一団の感染株に対して、より高い度合いの細菌クリアランスを提供し、そしてしたがって、全細胞ワクチンとしてより有効であることが立証される。

実施例５： ＨＩ−１６４は、非ヘモフィルス属種に対する非特異的免疫反応を誘発する
中程度から重度の気道疾患を有する患者において、急性気管支炎のエピソードを防止する際の、ホルマリンで殺したＮＴＨＩ−１６４を含有する、経口投与された死菌全細胞分類不能インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）ワクチン（本明細書において、「ＨＩ−１６４ＯＶ」と称する）の安全性および有効性を評価する、多施設二重盲検プラセボ対照前向き研究。

１．１８ 目的および方法
１．１８．１ 主な目的（活性群対プラセボ群において）：
・急性気管支炎エピソード数を比較する
・急性気管支炎エピソードを有する患者の比率を比較する
・急性気管支炎のエピソード期間を比較する
１．１８．２ 方法論
中程度から重度（予測される値の５０％以下のＦＥＶ_１）の気道疾患を有する患者における急性気管支炎のエピソードを防止する際の、経口投与された死菌全細胞ＮＴＨｉ ＨＩ−１６４ＯＶの安全性および有効性を評価する、前向き二重盲検プラセボ対照平行群多施設研究。

患者を１：１の比でランダムに研究薬剤またはプラセボのいずれかに割り当てた。患者は連続３ヶ月間、各月に連続３日間、薬剤を投与された。Ｈｉの定量的検出のため喉の含嗽剤に対して微生物学評価を行い、そしてグラム染色およびＨｉの定量的検出ならびにカタル菌、肺炎球菌およびシュードモナス属種の半定量的検出のため痰試料に対して微生物学評価を行った。

１．１８．３ 患者数（計画および分析）
研究サンプルサイズを、５％有意性レベルおよび８０％検出力に基づいて計算し、群あたり５０人の参加者のサンプルサイズは：
・プラセボ群において感染率を２と仮定して、およそ０．６３の相対感染リスク（すなわち３７％の相対リスク減少）；
・２８％の何らかの感染を経験している患者比率の絶対減少（プラセボ群の８０％が何らかの感染を有すると仮定して）；
・プラセボ群が２．４の処方率であると仮定して、０．６７の処方抗生物質に関する相対リスク（すなわち３３％の相対リスク減少）；
・１．２日の感染期間の平均日数の相違（２日間の期間の標準偏差と仮定して）
の検出を可能にするであろう。

２０％の参加者が研究を完了しないと仮定して、１２４人をランダム化するには、各群に関して６２人を採用する必要があった。ランダム化し、そして分析した実際の人数は３８人であった。各治療群に２人の脱落者があり、各群１人が不都合な事象のために研究を中断した。４つの研究施設で患者を採用した。４つの参加施設で、先の２年間で、年あたり２回の急性気管支炎エピソードの包含基準をも満たす、必要な疾病重症度である参加可能な集団が限定されていたため、患者採用が計画した数に到達しなかったことに注目されたい。

１．１８．４ 産物、用量およびバッチ数
ＨＩ−１６４ＯＶ腸溶性コーティング錠剤： ４５ｍｇのホルマリン不活性化ＮＴＨｉ−１６４に加えて賦形剤を含有した。凍結乾燥活性物質をＨＩ−１６４と称する。プラセボ腸溶性コーティング錠剤は賦形剤のみを含有した。プラセボおよびＨＩ−１６４ＯＶを２〜８℃で保存し、そして錠剤は約４５０ｍｇの重量であった。

１．１８．５ 投与および研究期間
患者は、連続３ヶ月間、各月に連続３日間、朝食の３０分前の空腹時に、コップ一杯の水で研究薬剤を経口摂取した（第１〜３日、第２９〜３１日、および第５７〜５９日）。研究期間はおよそ８ヶ月であった。

患者は、連続３ヶ月間、各月に連続３日間、研究薬剤を摂取した（第１〜３日、第２９〜３１日、および第５７〜５９日）。研究期間はおよそ８ヶ月であった。
１．１８．６ 評価基準
主な有効性変数は：
・急性気管支炎エピソード数
・急性気管支炎エピソードを経験している治療中の患者の比率
・急性気管支炎エピソードの期間
・急性気管支炎エピソードを治療するための抗生物質コース数
・痰中のインフルエンザ菌、カタル菌、肺炎球菌およびシュードモナス属種の存在
・急性気管支炎エピソードの重症度
であった。

１．１８．７ 統計法
３８人の患者の治療意図集団、すなわち研究薬剤を投与されたかどうかに関わらず、治療にランダム化されたすべての患者に対して統計分析を行った。すべての関連するデータを治療群によって要約した。分析は３つのセクションからなった：
・採用、および研究終了時の状態
・ベースライン特性
・一次および二次目的に対する治療効果の評価。

試験した主な仮説は、急性気管支炎のエピソードを防止する際に、プラセボよりもＨＩ−１６４ＯＶが優れていることであった。反復測定ＧＥＥ Ｐｏｉｓｓｏｎ回帰およびＣｏｃｈｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ Ｈａｅｎｓｚｅｌ検定を用いて、群間で、急性気管支炎のエピソード数を比較した。Ｆｉｓｈｅｒの正確な検定を用いて、各治療群において、試験追跡期間内で急性気管支炎の１回以上のエピソードを発展させた参加者の比率を比較した。ログランク検定およびＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を用いて、急性気管支炎エピソード期間を比較した。

研究者の報告および呼吸器感染性のものである不都合な事象に基づいて、急性気管支炎エピソードを判定し；必要な場合、研究施設から確認を得た。Ｃｏｃｈｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ Ｈａｅｎｓｚｅｌ検定を用いて、急性気管支炎エピソードの治療のための抗生物質コース数を比較した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を用いて、急性エピソードの治療のための抗生物質コースの総期間（日数）を比較した。

１．１８．８ 患者集団要約
１２４人のランダム化患者の採用目標は満たされず；実際にスクリーニングした患者の総数は４２人であり、このうち３８人がランダム化され、そして３４人が研究を完了した。ランダム化された患者のうち、研究を完了しなかった患者が各群に２人おり、このうち各群１人の患者が不都合な事象のために中断した。ベースライン患者人口統計学は、ＨＩ−１６４ＯＶ群およびプラセボ群に関して、概して類似であった。集団の平均年齢は約７０歳であった。女性よりも多くの男性が登録され、活性群およびプラセボ群に関して、それぞれ、８３．３％および７０．０％が男性、そして１６．７％および３０．０％が女性であった。すべての患者における平均ＦＥＶ_１は、０．９５リットル／秒であり、そして活性群およびプラセボ群間で類似であった；活性群およびプラセボ群において、中央値はそれぞれ、１．００および０．８５であった。両群で、喫煙したことがない患者に比較して、喫煙歴がある患者がより多い比率であると報告された（８４．２％が喫煙ありに対して１５．８％が喫煙したことがない）。患者は年間、平均５１．３６パックを喫煙し、そして中央値は年間、４５．５パックであり；活性群およびプラセボ群に関して、それぞれ、中央値は年間４５．０パックおよび４６．０パックであった。スクリーニング時、すべての患者の１５．８％（群間で類似の分布）がなお喫煙していた。

病歴は、この年齢の患者集団と一致し、大部分は喫煙歴があり、そして気道疾患を認識していた。ＨＩ−１６４ＯＶ群と比較して、プラセボ群において、有意により多くの患者が心臓障害の病歴を報告した（１３（６５％）対５（２７．８％）；ｐ＝０．０２８）。器官別大分類にしたがって、群間の条件分布の他の統計的に有意な相違はなかった。呼吸器障害に関しては、ＣＯＰＤが、活性群およびプラセボ群で、それぞれ６１．１％および４５．０％で報告され；喘息が、活性群およびプラセボ群で、それぞれ３３．３％および１０．０％で報告され；気管支拡張症が、活性群およびプラセボ群で、それぞれ１１．１％および２０．０％で報告され；そして肺気腫が、活性群およびプラセボ群で、それぞれ２２．２％および３５．０％で報告された。感染および寄生（ｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎ）がＨＩ−１６４ＯＶ群の８人（４４．４％）およびプラセボ群の１０人（５０％）で報告された。

１．１８．９ 一次有効性変数
急性気管支炎のエピソード数： ＨＩ−１６４ＯＶ群において、１８人の患者のうち１３人で２２のエピソードがあり、そしてプラセボ群において、２０人の患者のうち１３人で２９のエピソードがあった。１ヶ月の期間を用いた急性気管支炎エピソードの分析によって、０．８３のリスク比［９５％ＣＩ ０．４７、１．４６］が示され、治療の利益があるが、統計的有意性は達成しないことが示された（ｐ＝０．５２０）。３ヶ月の期間を用いた分析によって、０．８４のリスク比［９５％ＣＩ ０．４８、１．４９］が示され、やはり治療群で利益があるが、統計的に有意でないことが示された（ｐ＝０．３９７）。しかし、研究の最初の３ヶ月では急性気管支炎事象は類似の率であった（各群に関して０．８２事象／１００患者日）一方、最後の数ヶ月には、プラセボ群では率は０．８５であったが、ＨＩ−１６４ＯＶ群では０．６０であった。これは、薬剤の３サイクルすべてが投与された後、この第二の期間ではＨＩ−１６４ＯＶが有益であることを示唆するが、これは有意ではなかった（回帰ｐ値：期間０．８９４、治療０．３９７、相互作用０．５３３）。第二の期間でエピソード数がほぼ３０％減少したのは、研究が晩秋に始まり、そして利益が明らかになる前に６〜８週間の遅滞期間があることが以前の研究から推測されるため、臨床的に関連している。

残りの冬期に対する３月〜５月の期間にしたがって分析すると、治療効果（リスク比）は０．９２［９５％ ＣＩ ０．５０、１．６７］であり、やはりＨＩ−１６４ＯＶでの治療の総合的な利点が示唆されるが、これは統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．２６２）。これらの期間中の群における事象の率は、３月〜５月では、プラセボ群では０．６９事象／１００患者日、およびＨＩ−１６４ＯＶ群では０．８５事象／１００患者日であった。６〜１０月では、プラセボ群では０．９０事象／１００患者日、およびＨＩ−１６４ＯＶ群では０．５９事象／１００患者日であった。

急性気管支炎のエピソードを経験している、治療中の患者の比率：２つの群において、急性気管支炎のエピソードを経験している患者の比率に統計的に有意な相違はなかった（ｐ＝０．７３４）。

急性気管支炎エピソードの期間：ＨＩ−１６４ＯＶ群における急性気管支炎エピソードの期間中央値（８．５日）は、プラセボ（１５．０日）と比較してより短かったが、これは統計的に有意な相違ではなかった（ｐ＝０．０８７９）。しかし、エピソードの平均期間には有意な相違があった：ＨＩ−１６４ＯＶ群では１４．３２±１７．０１（ＳＤ）日、そしてプラセボ群では２２．７２±１８．７６（ＳＤ）日（ｐ＝０．０１４１）。

急性気管支炎の最初のエピソードまでの時間中央値を分析すると、統計的に有意な相違ではなかった（ＨＩ−１６４ＯＶ群では８１．０日、そしてプラセボ群では１００．０日；ｐ＝０．７９６２）。

気管支炎の急性エピソードの治療のための抗生物質コース数：急性気管支炎エピソードのために抗生物質で治療した患者の数は、ＨＩ−１６４ＯＶ群およびプラセボ群間で類似であった（それぞれ１１対１３）。これらの同じ患者において、ＨＩ−１６４ＯＶ群では処方される抗生物質のコースがより少なく（プラセボに関する４８コースに対して１９コース）；この相違は有意であった、ｐ＝０．０３１（この計算は、気管支炎の急性エピソードのために処方された抗生物質の後向き臨床的概観に基づいた）。さらに、プラセボ群には、より多く抗生物質コースを伴う患者（３コースの５人の患者および４コース以上の６人の患者）が、活性群（３コースの１人の患者および４コース以上の１人の患者）よりも多くいた。急性気管支炎エピソードのための抗生物質治療の総日数では、＞７５％の減少があり；プラセボ群では総数５４３日であり、そしてＨＩ−１６４ＯＶ群では１３６日であった（ｐ＝０．０１３）。患者あたりに投与される抗生物質療法の平均日数は、プラセボ群では４１．７７日（５〜１１７日の範囲）であり、そしてＨＩ−１６４ＯＶ群では１２．３６日（１〜４１日の範囲）であった。

１．１８．１０ 二次有効性変数
防御の代理粘膜免疫マーカー（血清におけるＮＴＨｉ特異的抗体）の測定値：ＮＴＨｉ抗原に対する抗体をこの実施例研究の開始時および終了時に検出した。平均レベルまたは変動の度合い（大きなＳＥバーによって決定）のいずれに関しても、プラセボ群および活性群間で、有意な相違は見られず、これは、喫煙するが、その大部分が気管内コロニー形成の異なるレベルを反映する気道疾患に気付かなかった被験体のＨＩ−Ｈ００３研究において見られたとおりであった。中程度から重度のＣＯＰＤを有するものにおいて（ＨＩ−Ｈ００２研究）、ＩｇＧ抗ＮＴＨｉ抗体の変化の小さいが有意な相違があり（ｌｏｇ_１０の０．１５；ｐ＝０．００４）、ＩｇＡ抗ＮＴＨｉ抗体に関する変化に類似の方向の傾向があった（ｌｏｇ_１０の０．０９；ｐ＝０．０８）。この有意な治療効果は、予測の＞５０％のＦＥＶ_１を有するものでは見られなかった。機構は明らかでない。治療に対する抗体反応をより頻繁に監視すると、変化機構のより明らかな図が提供されうる。

痰におけるインフルエンザ菌、カタル菌、肺炎球菌およびシュードモナス属種の存在：この研究由来の痰試料の細菌学的結果は、経口ＮＴＨｉ療法を受けた被験体において、一貫して、より少ない非ＮＴＨｉ病原体（カタル菌、肺炎球菌、および緑膿菌）が単離されることを示した。例えば、ＨＩ−１６４ＯＶ群における陽性培養試料の総数は３４であり、そしてプラセボ群では６６であり、このうちインフルエンザ菌は、それぞれ、１７回および２２回単離された。「他の病原体」負荷は、活性群で１７単離体およびプラセボ群で４４単離体であり、これらの他のコロニー形成病原体は、主に、モラキセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）種およびシュードモナス属種であった。ＨＩ−１６４ＯＶ群における４人の患者、およびプラセボ群における８人の患者で、研究中に１より多い細菌が単離された。これらの結果は、以前のＢｒｏｎｃｏｓｔａｔ^ＴＭ研究における定性的データと一致する。ＨＩ−１６４ＯＶ治療後に認められる病原体単離の一般的な減少は、最終エフェクター機構（すなわち食作用）が非特異的な性質であること、またはプラセボ群において、抗生物質がより多く使用されることを反映すると解釈される。

急性気管支炎エピソードの重症度：急性気管支炎エピソードの重症度を測定するプロトコルにおいて特定される特定のパラメーターはなかった。しかし、これらのエピソードの管理のための全身コルチコステロイドおよび他の併用薬剤の使用、ならびにまた呼吸器事象のための患者の入院は、重症度の尺度に相当する。ＨＩ−１６４ＯＶ群の患者では、急性気管支炎エピソードのために投与される全身コルチコステロイドでの治療がより少ないことが見出された（ＨＩ−１６４ＯＶ群では４人、そしてプラセボ群では１１人）。全身ステロイド治療日数にもまた顕著な相違があったが、これは統計的に有意ではなかった（ＨＩ−１６４ＯＶ群：６１日（平均１５．２５日）；プラセボ群：２８９日（平均２６．２７日）；ｐ＝０．２５９）。さらに、不都合な呼吸器事象を管理するための入院は、ＨＩ−１６４ＯＶ群（ｎ＝１、１回の入院）におけるよりプラセボ群（ｎ＝７、１０回の入院）において、３倍多く；これは統計的に有意であった（ｐ＝０．０３６２）。

１．１９ 安全性の結果
不都合な事象：任意の一次器官別大分類においてＡＥを経験している患者の総比率は同様であった（ＨＩ−１６４ＯＶ群における１８人（１００％）対プラセボ群における１９人（９５％））。ＡＥと報告されるものの大部分は軽度または中程度であり、そして研究治療と関連しているとは見なされなかった；研究治療に関連している可能性があると記載される事象を有した患者が、ＨＩ−１６４ＯＶ群において１人（中程度の胃腸炎のエピソードを有した患者０３）およびプラセボ群において２人（第１回来診直後に中程度の発疹および体の火照りを有し、そしてそれ以上の研究薬剤の摂取を止めるよう助言された患者１４；および軽度の吐き気を有した患者２７）いた。研究治療に明確に関連すると見なされる事象はなかった。

プラセボ群の１人の患者は、研究開始のほぼ２ヶ月後、シュードモナス属での慢性気道制限の感染性増悪の結果、死亡した。該患者は、研究薬剤の２コースを完了し、そして０６年５月２５日に研究から退き；０６年７月６日に死亡した。該事象は研究治療に関連するとは見なされなかった。全部で１１人の患者（ＨＩ−１６４ＯＶ群における３人の患者（１６．７％）およびプラセボ群における８人の患者（４０．０％））が深刻な不都合な事象を報告した（統計的に有意ではなかった；ｐ＝０．１６０）が、治療に関連するものはなかった。これらの１１人の患者（ＨＩ−１６４ＯＶ群における３人対プラセボ群における８人）は、全部で１５回入院した（ＨＩ−１６４ＯＶ群では３つの事象が入院につながり、これに対してプラセボ群では１２の事象であった；ｐ＝０．０４７２）。ＨＩ−１６４ＯＶ群（ｎ＝１、１回の入院）におけるよりもプラセボ群（ｎ＝７、１０回の入院）において、呼吸器事象の管理のため、３倍よりも多くの患者が入院し；これは統計的に有意であった（ｐ＝０．０３６２）。非呼吸器事象のために入院した患者の数は、両群で同じであった（２人の患者）。

本実施例の研究は、先の２年間に１年あたり少なくとも２回の急性気管支炎エピソードを有した、中程度から重度の気道疾患（約１．０リットル／秒および予測値の５０％以下のＦＥＶ_１によって示される）の、それぞれ１８人および２０人の患者における追加治療として、ＨＩ−１６４ＯＶ対プラセボの効果を評価した。ＨＩ−１６４ＯＶでの治療の利益が一次終点において観察されたが、治療群のサイズが小さいため、すべての分析が統計的有意性に到達するわけではなかった。プラセボ群において、より多数の心臓疾患患者が、感染に対して負に影響を受けた反応を有する可能性がある。利益の一貫性は一次有効性終点において明らかであった。ＨＩ−１６４ＯＶ群において、急性気管支炎エピソード数の１６％のリスク減少があり、そしてプラセボと比較して、これらのエピソードの平均期間の約３５％の減少があった（ｐ＝０．０１４１）。ＨＩ−１６４ＯＶの効果は、療法の最初の３ヶ月で明らかであり、そして研究を通じて維持された。さらに、気管支炎エピソードを治療するのに使用された抗生物質コースに６０％の減少があり、そして抗生物質療法の総日数に７５％の減少があった。プラセボ群において１１人の患者およびＨＩ−１６４ＯＶ群において４人の患者が、急性気管支炎エピソードを管理するため、全身（経口または静脈内）コルチコステロイドを投与された。これらの結果は、呼吸器事象のための入院の減少によってさらに裏付けられた；プラセボに比較してＨＩ−１６４ＯＶを投与された患者において入院した患者数は８０％減少し（７対１）、そして入院回数は９０％減少した（１０対１）。他の理由による入院率は、２群間で同じであった。重要なことに、ＨＩ−１６４ＯＶは、許容されうる安全性プロフィールを示した。ＨＩ−１６４ＯＶ群における不都合な事象の特定のパターンはなく、そしてバイタルサインまたは実験室データには、明白な論点は検出されなかった。

細菌学的データによって、プラセボ群において、インフルエンザ菌およびまた他の病原体の細菌コロニー形成がより多かったことが示される。これは、ＨＩ−１６４ＯＶの有効性による、そしたまたプラセボ群における抗生物質のより多量の使用によるか、または使用に反したか、いずれかの有効性に関連していると解釈される。ＮＴＨｉ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡレベルのわずかな上昇があった。

図１１および１２に示す、生じたデータは、ＨＩ−１６４ＯＶによる、特異的抗原免疫反応および非特異的免疫系刺激の成功を立証する。図１１は、推奨されるかまたは示唆されるＨＩ−１６４ＯＶコースを投与された患者群に比較して、対照群によって経験される感染数に関するすべての患者の結果（痰混入を除く）を示す。これらの結果は、インフルエンザ菌に関してだけでなく、患者の気道（限定されるわけではないが：カタル菌、肺炎球菌、ストレプトコッカス属種、緑膿菌、シュードモナス属種、黄色ブドウ球菌および／またはマイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種を含む）および粘膜層を感染させることが知られる他の生物に関してもまた、感染率の有意な低下があることを立証した。これらの結果は、ＨＩ−１６４ＯＶが、免疫患者において、特異的および非特異的両方の免疫反応を生じるという事実を特に強調する。

やはり重要なことに、図１１および１２の結果は、特異的および非特異的免疫反応が、ほぼ等しいかまたは釣り合っていることを立証する。特に、Ｈｉに対する特異的反応は、二次的細菌感染による（カタル菌、肺炎球菌、緑膿菌、シュードモナス属種および／または肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などによる）感染のほぼ同じ量を制限するかまたは防止する。本明細書の目的のためには、「ほぼ同等」は、０〜５倍の範囲内であると定義されることに注目されたい。

該結果はまた、非特異的免疫反応が起こるためには、患者は急性に感染している必要も、または本態様においてはＮＴＨｉである一次細菌抗原に曝露されている必要もないことも立証していることに注目されたい。したがって、本態様で記載する経口ワクチンは、経口ワクチンが有効であるべきＮＴＨｉまたはＨｉに以前曝露されていない患者における感染を防御するかまたは制限するのに有効でありうる。

結果の成功は、結果がＣＯＰＤなどの重度の気道疾患を患う患者の下位群を調べるように狭められた際に、さらに強調される。この下位群の結果を図１２に示し、そしてこの結果は、これらの患者に関して、感染率のさらにより大きい低下を示す。ここでも、ＨＩ−１６４ＯＶは、Ｈｉに対する特異的免疫反応および他の細菌生物に対する非特異的免疫反応の両方を生じ、そしてそれによって全体の感染率を減少させるための使用において有効であることが立証されている。非特異的免疫反応は、粘膜層または気道の他の細菌感染を防止するかまたは限定することも可能であり、そして本明細書の範囲内に属することに注目されたい。

図１３において、Ｂｒｏｎｃｏｓｔａｔ^ＴＭ（ＰＣＴ出願第ＷＯ８６／０５６９１号に記載されるようなもの）およびＨＩ−１６４ＯＶ間の相違は、容易に明らかである。この表は、それぞれのワクチンを投与した後の、血液Ｔ細胞増殖における刺激指標の増加を示す。第６２週の後であってさえ、ＨＩ−１６４ＯＶはＴ細胞増殖を刺激し、一方、Ｂｒｏｎｃｏｓｔａｔ^ＴＭは、統計的に有意な方式でこれを達成できない。この表のデータは、本出願のワクチンによる非特異的免疫系刺激を立証する。

実施例６： ＨＩ−１６４株の物理的特性
１．２０ 材料および方法
１．２０．１ 全細菌抽出物の調製
方法Ｉ−チョコレート寒天プレート上で増殖させた細菌
チョコレート寒天プレートに、ＮＴＨＩ−１６４または他のインフルエンザ菌単離体の単一コロニーを接種した。プレートを３７℃＋５％ＣＯ_２で一晩インキュベーションした。これによって、多量の増殖が生じた。滅菌１０μｌループを用いて、プレート表面から細菌を取り除き、そして微量遠心管のＣｅｌＬｙｔｉｃＢ細胞溶解試薬０．５ｍＬ内に浸した（溶解緩衝液に浸したまま、２本の指の間でループをこすりつけて回転させることによって、細菌を落とした）。試験管を５分間静置して細菌が完全に溶解するのを可能にした。次いで、試験管を１１，５００ｇで５分間遠心分離して、いかなる不溶性細胞破片もペレットにした。次いで、滅菌微量遠心管内に上清を注意深く取り除き、そして必要になるまで−７０℃で保存した。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いたタンパク質概算アッセイを行うことによって、試料のタンパク質濃度を決定した。

方法ＩＩ−トリプトン大豆ブロス＋ＨＴＭ補充剤中で増殖させた細菌
トリプトン大豆ブロス基剤およびＨＴＭ補充剤をＯｘｏｉｄから得た。
ＨＴＭ補充剤を含むトリプトン大豆ブロスを調製するため、１２．５ｇｍのＴＳＢ粉末を測り取り、そして１Ｌ Ｓｃｈｏｔｔ瓶に入れた。次いで、２．５ｇの酵母エキスを測り取り、そして瓶に添加した。蒸留水（０．５Ｌ）を添加し、そして瓶を振盪して材料を溶解させた。次いで、培地を１５分間オートクレーブした。培地を一晩、室温に冷却させた。第２日、滅菌技術を用いて、３ｍｌシリンジおよび１９Ｇ針を用い、ＨＴＭ補充剤のバイアルに、２ｍＬの滅菌蒸留水を添加した。これを回転させて固体を溶解し、そして室温で３０分間静置した。滅菌シリンジおよび針を用いて、バイアルの内容物を培地瓶に添加した。Ｓｃｈｏｔｔ瓶の内容物を混合し、そして日付を記した。培地を最長１ヶ月、２〜８℃で保存した。チョコレート寒天プレートに、ＨＩ−１６４の単一コロニーを接種し、そして３７℃＋５％ＣＯ_２で一晩インキュベーションした（これによって、多量の増殖が生じた）。第３日、１００ｍＬの調製ＴＳＢ＋ＨＴＭ培地を２５０ｍＬ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒコニカルフラスコに測り入れ、そして３７℃振盪インキュベーター中であらかじめ温めた。プレートからＰＢＳ内に細菌を採取し、光学密度を測定し、細菌濃度に対して、光学密度の先に調製したプロットを比較し、そして必要に応じて濃度を調整することによって、１ｘ１０^１０の生菌ＮＴＨＩ−１６４の調製物を調製した。ブロスに１．０ｘ１０^１０生菌ＮＴＨＩ−１６４（１ｍＬの１０^１０／ｍＬ）を接種して、１ｘ１０^８／ｍＬの開始濃度を生じ、そして回転させることによって混合した。細菌懸濁物を３７℃振盪インキュベーター中で１１時間、一晩インキュベーションした。この時点で、細菌は最適増殖期にあり、そして関心対象のタンパク質を発現していた。これを決定するため、懸濁物の５９５ｎｍでのＯＤ読み取り値を３０分ごとに決定した。ＯＤが安定したとき、増殖曲線は静止期に到達していた。１００μｌの懸濁物を平底９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル内にピペッティングして、そして５９５ｎｍの波長で読み取った。光学密度が０．５〜１．０の間であることが必要であった。懸濁物ＯＤが１．０より高い場合、さらなる滅菌ブロスをフラスコに添加することによって調整した。調整したら、１．５ｍＬの細菌懸濁物を１１，５００ｇで５分間遠心分離した。上清を取り除き、そしてペレットを０．４ｍＬのＣｅｌＬｙｔｉｃＢに再懸濁した。これを短時間ボルテックスし、そして５〜１０分間混合して、可溶性タンパク質の完全な抽出を確実にし、そして再び１１，５００ｇで５分間遠心分離して、いかなる不溶性細胞破片もペレットにした。上清を滅菌微量遠心管に注意深く取り除き、そして必要になるまで−７０℃で保存した。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いたタンパク質概算アッセイを行うことによって、試料のタンパク質濃度を決定した。

１．２０．２ 一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動
各抽出物由来の２０マイクログラムのタンパク質を、再蒸留水で２０μＬに希釈し、そして１０μＬのＳＤＳ−Ｓｔｏｐ溶液を添加した。試料を、ＢＩＯＲＡＤ正確分子量マーカーとともに、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェルに装填した。色素最先端がゲルの底に到達するまで、２００Ｖで試料を泳動した。次いで、Ｓｉｇｍａ ＥＺＢｌｕｅ染色剤でゲルを染色した。

１．２０．３ 二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動
１００μｇの各試料をアセトン沈殿させ、そして再水和緩衝液中で再懸濁した。７ｃｍ、３〜１０のＮＬ ＩＰＧ片を最初の次元に用い、総フォーカシング時間は５時間および１８７５０Ｖ時間であった。ＩＰＧ片を１２％１．５ｍｍ厚のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上部に装填し、そしてアガロースで密封した。分子量アガロースプラグもまた、ゲルの上部に添加した。ゲルを５０Ｖで１０分間、そして次いで２００Ｖで４５分間泳動した。ゲルをクーマシーブルーで染色し、そして２４時間脱染色した。次いで、ゲルをスキャンし、そしてスポットを検出した。

１．２０．４ タンパク質のＭＡＬＤＩ分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからタンパク質バンドまたはスポットを切り出し、そして１．５ｍｌ試験管に入れた。５０％メタノール／５０ｍＭ重炭酸アンモニウムの３回交換を用いて、バンドを脱染色して、そして一晩風乾した。次いで、２０ｍＭ重炭酸アンモニウム中に溶解した２００〜４００ｎｇのトリプシンを用いて、バンドを再水和した。１０分後、必要であれば、さらに５〜１０μｌの２０ｍＭ重炭酸アンモニウムを各バンドに添加した。バンドを３７℃で３時間インキュベーションした。次いで、バンドを浸して柔らかくし（ｍａｃｅｒａｔｅｄ）、そして１μｌの試料を取り除いた。次いで、試料をＣＨＣＡマトリックスと１：１で混合し、そしてＭＡＬＤＩスライド上にスポットした。

次いで、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＴＴＡＮ Ｍａｌｄｉ−ＴｏＦを用いて、試料を分析して、ペプチド質量フィンガープリントを生じた。分析の一部として「ｎｒ」データベースを用いるため、マッチを検索した。次いで、優れたマッチを生じないいかなる試料も、「Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ」データベースを用いて、さらに検索した。

１．２１ 結果
１．２１．１ 一次元ゲル
ＨＩ−１６４およびＨＩ−１６６の抽出物を一次元ゲル上で泳動した。図１４の左パネルにゲル写真を示す。図１４の右パネルにバンド同一性を示す。外膜タンパク質２は、ＮＴＨＩ−１６４ゲル中、２本のバンドとして、そしてＮＴＨＩ−１６６ゲル中、１本のバンドとして現れる。これは、２つの細菌単離体におけるこのタンパク質の相違を示し、そして単離体の防御能の相違を説明しうる。ＮＴＨＩ−１６４中に存在する２つの同定されていないタンパク質（ＭＷ ２７および３５）は、ＮＴＨＩ−１６６には存在せず、そしてこれらのタンパク質はまた、ＨＩ−１６４によって提供される優れた防御に寄与しうる。

プレートで増殖させたＨＩ−１６４および他の細菌単離体に関して、図１５に示すように、一次元ゲルを泳動した。ブロスで増殖させたＮＴＨＩ−１６４からもまたゲルを泳動した。ＮＴＨＩ−１６４のゲルパターンは、プレートで増殖させたかまたはブロスで増殖させたかに関わらず一定であり、そして他のインフルエンザ菌株／単離体のものとは異なる。ＮＴＨＩ−１６４のものに最も類似のパターンは、単離体ＮＴＨＩ−１６７のものである。

１．２１．２ 二次元ゲル
プレート上で増殖させた細菌単離体の抽出物から、２次元ゲルを調製した。２Ｄゲルを以下の図１６Ａ〜１６Ｄに示す。２Ｄゲルは、ＨＩ−１６４ゲルに２つのスポットが存在するように、外膜タンパク質Ｐ２において、ＨＩ−１６４（図１６Ａ）およびＨＩ−１６６（図１３Ｂ）間での相違を示す。ＨＩ−１６４外膜タンパク質調製物（すなわち抽出された外膜タンパク質）の２Ｄゲル（図１６Ｃ）は、この調製物中のタンパク質が、主にＯＭＰ２およびＯＭＰ２６であったことを示す。

１．２１．３ ＭＡＬＤＩタンパク質分析
一次元ゲルから配列決定したバンドの同一性を図１４の右のパネルに示す。２Ｄゲルから配列決定した特定のスポットの同一性を以下の表１１Ａ〜１１Ｄに示す。

表１１Ａ： ＨＩ−１６４全細胞調製物の２Ｄゲル上のスポットの同一性

表１１Ｂ： ＨＩ−１６４ ＯＭＰ調製物の２Ｄゲル上のスポットの同一性

表１１Ｃ： ＨＩ−１６６全細胞調製物の２Ｄゲル上のスポットの同一性

表１１Ｄ： ＨＩ−１６７全細胞調製物の２Ｄゲル上のスポットの同一性

多様な特定の態様を例示しそして記載してきたが、本出願の精神および範囲から逸脱することなく、多様な変化を作製可能であることが認識されるであろう。

Claims (39)

1. （ａ）死菌インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）集団または死菌インフルエンザ菌集団の膜分画であって、前記インフルエンザ菌が以下の特性：
   （ｉ）分類不能である；
   （ｉｉ）生物型Ｉである；
   （ｉｉｉ）好気性条件下で増殖する；
   （ｉｖ）Ｂカプセル遺伝子を欠く；および
   （ｖ）β−ラクタマーゼ遺伝子を欠く
   の任意の２以上の組み合わせによって性質決定される、前記集団
   および
   （ｂ）薬学的に許容されうるキャリアー
   を含む、ワクチン。
2. 胃防御コーティングを有する、請求項１のワクチン。
3. カプセル、錠剤、または腸溶性コーティング顆粒の形である、請求項２のワクチン。
4. 前記錠剤が、前記集団または前記膜分画を含有するコア、および前記コアを取り巻く腸溶性コーティングを含む、請求項３のワクチン。
5. 前記コアおよび前記腸溶性コーティングの間にサブ腸溶性（ｓｕｂｅｎｔｅｒｉｃ）コーティングをさらに含む、請求項４のワクチン。
6. 最外層としてフィルムコーティングをさらに含む、請求項４のワクチン。
7. 前記コアがラクトースを含む、請求項４のワクチン。
8. 前記コアがセルロースまたはセルロース誘導体を含む、請求項４のワクチン。
9. 前記セルロースまたはセルロース誘導体がクロスカルメロースナトリウムである、請求項８のワクチン。
10. 前記コアが充填剤を含む、請求項４のワクチン。
11. 前記充填剤がステアリン酸マグネシウムである、請求項１０のワクチン。
12. 前記コア重量が４００ｍｇ〜５００ｍｇである、請求項４のワクチン。
13. 死菌インフルエンザ菌または膜分画が、前記コア重量の７．５％〜１５％を構成する、請求項４のワクチン。
14. 死菌インフルエンザ菌または膜分画が前記コアのおよそ１０％を構成する、請求項１３のワクチン。
15. 前記サブ腸溶性コーティングがコア重量の２％〜３％を生じる、請求項５のワクチン。
16. 前記サブ腸溶性コーティングがＯｐａｄｒｙＩＩホワイトを含む、請求項１５のワクチン。
17. 前記腸溶性コーティングがコア重量の１０％〜１２％を生じる、請求項４のワクチン。
18. 前記腸溶性コーティングが水性アクリルコーティングである、請求項１７のワクチン。
19. 前記水性アクリルコーティングがアクリルＥＺＥレッドである、請求項１８のワクチン。
20. 前記フィルムコーティングが精製水である、請求項６のワクチン。
21. 単一細菌ワクチンである、請求項１〜２０のいずれかのワクチン。
22. 多重細菌ワクチンである、請求項１〜２０のいずれかのワクチン。
23. インフルエンザ菌が、国立計量研究所（「ＮＭＩ」）に寄託されそして寄託番号第Ｖ０８／０２１００２号を割り当てられているような単離体ＮＴＨｉ−１６４、またはＮＭＩに寄託されそして寄託番号第Ｖ０８／０２１００３号を割り当てられているような単離体ＮＴＨｉ−１６７である、請求項１〜２０のいずれか一項のワクチン。
24. ワクチンの単位用量が、前記インフルエンザ菌の約１０^８〜約１０^１３の死菌コロニー形成単位または前記インフルエンザ菌の約１０^８〜約１０^１３の死菌コロニー形成単位の膜分画を含む、請求項１〜２３のいずれか一項記載のワクチン。
25. 慢性粘膜疾患患者を治療する方法であって、請求項１〜２３のいずれか一項記載のワクチンの有効量を前記患者に投与する工程を含む、前記方法。
26. 前記有効量が、連続２〜５日間、毎日投与される前記ワクチンの１〜３単位用量であり、各単位用量が、前記インフルエンザ菌の約１０^８〜約１０^１３の死菌コロニー形成単位または前記インフルエンザ菌の約１０^８〜約１０^１３の死菌コロニー形成単位の膜分画を含む、請求項２５の方法。
27. ３〜５週間間隔後、前記投与を反復する工程をさらに含む、請求項２６の方法。
28. 前記投与を２回反復し、各投与を、先行する投与後、３〜５週間の期間で反復する、請求項２７の方法。
29. 前記慢性粘膜疾患が慢性閉塞性肺疾患または嚢胞性線維症関連疾患である、請求項２５の方法。
30. 前記慢性閉塞性肺疾患が慢性気管支炎である、請求項２９の方法。
31. 前記慢性閉塞性肺疾患が肺気腫である、請求項２９の方法。
32. 前記慢性閉塞性肺疾患が中程度から重度である、請求項２９の方法。
33. 喘息を治療する方法であって、治療する必要がある患者に、請求項１〜２３のいずれか一項記載のワクチンの有効量を投与する工程を含む、前記方法。
34. 前記有効量が、連続２〜５日間、毎日投与される前記ワクチンの１〜３単位用量であり、各単位用量が、前記インフルエンザ菌の約１０^８〜約１０^１３の死菌コロニー形成単位または前記インフルエンザ菌の約１０^８〜約１０^１３の死菌コロニー形成単位の膜分画を含む、請求項３３の方法。
35. ３〜５週間間隔後、前記投与を反復する工程をさらに含む、請求項３４の方法。
36. 前記投与を２回反復し、各投与を、先行する投与後、３〜５週間の期間で反復する、請求項３５の方法。
37. 喘息が内因性喘息である、請求項３３の方法。
38. ＮＭＩに寄託されそして寄託番号第Ｖ０８／０２１００２号を割り当てられているような分離不能インフルエンザ菌単離体ＮＴＨｉ−１６４、またはその継代培養。
39. ＮＭＩに寄託されそして寄託番号第Ｖ０８／０２１００３号を割り当てられているような分離不能インフルエンザ菌単離体ＮＴＨｉ−１６７、またはその継代培養。