JP4843792B2

JP4843792B2 - 経粘膜及び経皮投与を可能にする抗原薬物ヴィークル、これを用いる粘膜免疫の誘導方法、粘膜ワクチン及びｄｄｓ

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Publication number: JP4843792B2
Application number: JP2006512040A
Authority: JP
Inventors: 博木戸; 大水野
Original assignee: University of Tokushima
Current assignee: University of Tokushima
Priority date: 2004-04-05
Filing date: 2005-03-22
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2025-03-22
Also published as: CA2579710A1; CA2579710C; CN1942205A; WO2005097182A1; KR20070017348A; CN1942205B; US20070141073A1; EP1738765A1; RU2006138182A; JPWO2005097182A1; BRPI0508792A; RU2396090C2; EP1738765B1; EP1738765A4; KR100992492B1; US8268321B2

Description

本発明は、経粘膜投与及び経皮投与を可能にする抗原薬物ヴィークルに関するものであり、更に詳しくは、該ヴィークルを所望の抗原や薬物に用いることを特徴とする、抗原特異的分泌型免疫グロブリンＡを優先的かつ効果的、特に選択的に産生させる粘膜免疫の誘導方法、粘膜ワクチン、アレルギーの予防・治療、及びドラッグデリバリーシステムに関するものである。

従来の不活化ワクチンやトキソイド等には次の欠点が知られている：
（１）自然感染ルートでの乏しい感染防御
ワクチン接種ルートが皮下、筋肉内等であるのに対し、細菌やウイルス等の自然感染ルートは、例えば鼻腔、気管、腸管等の粘膜であり、上記接種ルートとは異なる。自然感染の実態に即した接種ルートによる感染防御、特に粘膜経由のワクチン投与よる粘膜での感染防御の実現が望まれる。
（２）低い粘膜免疫性
ワクチン被接種者においては、主に免疫グロブリンＧ（以下「ＩｇＧ」又は「ＩｇＧ抗体」と略記する）が血中に産生され、体液性免疫が誘導される。しかし、粘膜免疫を担う免疫グロブリンＡ（以下「ＩｇＡ」又は「ＩｇＡ抗体」と略記する）は、ほとんど産生されず、粘膜免疫の成立は期待できない。尚、ＩｇＡ抗体の必要性と有効性は次の通りである：ＩｇＡ抗体は、飛沫や空気による鼻腔、気管等の呼吸器への感染、また、経口による腸管への感染の門戸である粘膜での感染防御、即ち、粘膜免疫を担っており、臨床免疫上、極めて重要な役割を演じている。更に、ＩｇＧ抗体が、抗原に対する特異性が高く、感染防御スペクトルが狭隘で、抗原変異した病原体の感染防御にはほとんど無効であるのに対し、ＩｇＡ抗体は、交差免疫性、即ち、交差中和活性があるので、それだけ感染防御スペクトルの幅が広く、変異抗原に対する感染をも防御する。
（３）追加接種の必要性と重なる費用
初回免疫の１回接種だけでは産生されるＩｇＧ抗体が低く、確実な効果が期待できないため、その後のＩｇＧ抗体保有状況に基づき、更に１回以上の追加接種、いわゆるブースター接種により血中ＩｇＧ抗体価を高める必要がある。そのため、経費や労力を繰り返し要する上に、ブースター接種の機会に恵まれた高齢者、成人及び学童では効果が認められるが、その機会を逸し易い低年齢、特に２歳以下の乳幼児では効果なしのケースが散見される。
以上につき換言すれば、従来の不活化ワクチンやトキソイド等は、被接種者において主に血中ＩｇＧ抗体の産生を誘導し、体液性免疫を高める作用効果をもたらし、その有効性は確認されている。しかし、ＩｇＡ抗体産生ないしは粘膜免疫の誘導能が低いため、自然感染を防御するに十分な機能と効果には限界がある。かかる現状から、従来ワクチンの欠点を解消するため、現在までに多種多様な側面から多くの試みがなされている。例えば、ワクチン抗原の質的又は量的改良、不活化ワクチンに代わる生ワクチンの試作、新しい接種ルートや粘膜ワクチン等の開発、体液性免疫の高進とその持続をもたらすアジュバントのスクリーニング、粘膜免疫アジュバントの開発に特定した試行等々。しかし、未だ安全かつ有効な粘膜ワクチンの開発は達成されていない。
以下、粘膜ワクチンの開発につき、説明する。
（１）ワクチン抗原の増量
皮下又は筋肉内接種するワクチン抗原を増量し、粘膜に分泌されるＩｇＧ及びＩｇＡ抗体量を増加させる試みがされている。例えば、従来の不活化インフルエンザワクチンに該ウイルス膜蛋白のノイラミニダーゼを添加混合して抗体産生量を増加させたり、アジュバントとしてＭＦ５９を添加混合する方法等が試みられている。しかし、これには痛みを生じ、副反応が強くなる等の不都合が見られる。
（２）経鼻投与型ワクチン
最も有効と考えられるＩｇＡ抗体による感染防御のため、液状のスプリット抗原を経鼻に直接接種する方法が試みられたが、ＩｇＡ産生量の低いことが指摘されている。そこでＩｇＡ抗体産生能を上げるため、スプリット抗原にアジュバントとして大腸菌易熱生毒素やコレラ毒素を添加混合し、粘膜免疫応答、即ち、ＩｇＡ抗体産生能を上げる試みがなされているが、アジュバントとしての毒素の安全性が保証されていない現状から、治検が中止され、実用化には至っていない。
（３）鼻腔内接種が可能な低温馴化株を用いる生ワクチン
増殖の最適温度が２５℃であり、３９℃ではほとんど増殖しない低温馴化インフルエンザウイルス株を鼻腔内に接種する方法が実用化されているが、低温馴化親株の弱毒のメカニズムが明らかでなく毒性復帰の危険性が否定できない。また、ワクチンの有効成分が生きたウイルスのため、細胞内への侵入力が高く免疫の初期化には優れているが、軽度のインフルエンザ症状が散発するので、インフルエンザに感染すると重症化しやすいハイリスクのヒトや高齢者等には使えない等の欠点が見られる。
（４）その他のワクチン
ワクチニアウイルスをウイルスベクターとしたベクターワクチンや、リバースジェネティクスによる弱毒生ワクチン、ＤＮＡやｃＤＮＡそのものを有効成分として用いるＤＮＡワクチン等の開発が実験的に進められてはいるが実用化には至っていない。
更に、以下、免疫アジュバントの開発につき、説明する。
（１）免疫アジュバント
免疫アジュバントは、免疫応答の強化や抑制等の調節活性を有する物質の総称であり、被接種体内での抗原の徐放や貯留等を目的とした投与形態に係る物質と、免疫応答の高進や抑制等を図るための物質に２大別される。これ等のうち、前者、投与形態のためのアジュバントとしては、例えばリン酸アルミニウム、ミョウバン等を用いるワクチンやトキソイドが既に実用化されている。しかし、後者、免疫応答の強化・高進を図るためのアジュバントの実用化は、未だ知られていない。例えば、細菌由来のＢＣＧ生菌、ＢＣＧ−ＣＷＳ、エンドトキシン、グルカン等、合成されたＭＤＰ、レバミソール、ポリＩ−ポリＣ、ベスタチン等、また、サイトカイン類のインターフェロン、ＴＮＦ、ＣＳＦ等が公知であるが、関節炎、慢性関節リウマチ、高_Ｙグロブリン血症、貧血等のアジュバント病、効果が不十分等々の理由により、これ等の実用化には安全性と有効性の保証が必要だと思量される。また、広く体液性免疫の誘導強化を図るため、高等動物由来の肺サーファクタント・プロテインをアジュバントとして用いる技術（特許文献１）が公知であるが、その実用化は未だ知られていない。
（２）粘膜免疫用アジュバントの開発
例えば、百日咳毒素Ｂオリゴマー（特許文献２）、コレラ毒素（特許文献３）、大腸菌の易熱性エンテロトキシンＢサブユニットＬＴＢ（特許文献４）、デンプン粒子（特許文献５）、コレラトキシンＢ鎖タンパク質ＣＴＢ（特許文献６）、ベロ毒素１のＢサブユニット（特許文献７）、オリゴヌクレオチド（特許文献８）、インターロイキン１２（非特許文献１）等々、多種多様に開発されてはいるが、未だ実用化には至っていない。
以上の通り、皮下や筋肉内等へ接種する従来ワクチンから、ウイルスの自然感染ルートである粘膜においてＩｇＡ抗体の産生を誘導する粘膜ワクチンへの切り替えの必要性は、広くかつ深く認識されている。特に、２１世紀における次世代ワクチンとしては、ＩｇＡ抗体の産生、局所免疫あるいは粘膜免疫を誘導する、いわゆる粘膜ワクチンの開発と実用化が全世界で待望されてはいるが、未だ達成されていない。その理由は、ＩｇＡ抗体産生、局所免疫ないしは粘膜免疫を誘導する機能をワクチンに付与するための安全かつ有効なアジュバントが特定・確立されていないことにあると思量される。
特表２００２−５２１４６０号公報特開平３−１３５９２３号公報特表平１０−５００１０２号公報特表２００１−５２３７２９号公報特表２００２−５０４５２号公報特開２００３−１１６３８５号公報特開２００３−５０４５２号公報ＰＣＴ公表ＷＯ００／２００３９号パンフレットＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ、第７１巻、４７８０−４７８８頁、２００３年ＪｏｕｒｎａｌｏｆｎｅｏｎａｔａｌＮｕｒｓｉｎｇ、第１０巻、２−１１頁、２００４年ＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＮｅｏｎａｔｅ、第７４巻（ｓｕｐｐｌ１）、９−１４頁、１９９８年ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第２４巻、４５２−４５８頁、２００１年

本出願は以下を課題とする。すなわち、従来の不活化ワクチンやトキソイド等に、ＩｇＡ抗体の産生、局所免疫あるいは粘膜免疫を誘導する機能を付与する。そのための安全かつ有効な技術の開発。従来の体液性免疫ワクチンから安全かつ有効な粘膜免疫ワクチンへの変換。また、アレルギーの予防と治療、更に、粘膜や皮膚を経由して薬物を投与かつ輸送する経粘膜・経皮ドラッグデリバリーシステム（以下「ＤＤＳ」と略記する）の確立。
本発明は、前記課題の解決手段として、経粘膜投与及び経皮投与を可能にする抗原薬物ヴィークル、該ヴィークルを所望の抗原や薬物に用いることを特徴とする、抗原特異的分泌型免疫グロブリンＡを優先的かつ効果的、特に選択的に産生させる粘膜免疫の誘導方法、粘膜ワクチン、アレルギーの予防と治療剤、並びに経粘膜・経皮ＤＤＳを提供する。
本発明が提供する抗原薬物ヴィークルの適用・汎用により、多種多様な感染症に対する粘膜ワクチン、アレルギーの予防と治療剤、及び経粘膜・経皮ＤＤＳの実現と普及をもたらす。粘膜ワクチンは、自然感染の実態に即した免疫手段であるので、従来ワクチンに比し、著しく優れた感染防御効果を発揮する。また、抗原薬物ヴィークルが誘導する鼻腔粘膜ＩｇＡは、そこでのアレルゲンの失活をもたらし、減感作を可能にする。更に、多種多様な薬剤への該ＤＤＳの適用は、薬物の経粘膜投与及び経皮投与による予防・治療効果を強化かつ促進させる。その結果、この発明は、人類全体の医療・保健・衛生を多大に向上させると共に、世界の医療・保健・衛生分野の従事者には待望の福音になる。併せて、従来及び未来のワクチンやトキソイド等を含む生物学的製剤、更に多種多様な薬物に広く、注射に比べ簡便な経粘膜投与及び経皮投与が可能な機能と性能を付加する手段を与える。

図１は、各種経鼻インフルエンザワクチン投与における鼻腔（ａ）、肺胞（ｂ）、皮下注インフルエンザワクチン投与における鼻腔（ｃ）、肺胞（ｄ）におけるインフルエンザウイルス感染抑制効果。＊はｔ検定によるワクチン単独（ＡＤヴィークル又はアジュバントなし）投与群との間の有意水準（ｐ＜０．０１）を示す。（実施例１）
図２は、経鼻投与（ａ）、皮下注射（ｂ）インフルエンザワクチンによる鼻腔洗浄液の抗インフルエンザ抗体産生ＩｇＡとＩｇＧ量。白いバーはＩｇＡ量を、黒いバーはＩｇＧ量をそれぞれ示す。（実施例２）
図３は、経鼻（ａ）、皮下注射（ｂ）インフルエンザワクチン投与による肺洗浄液における抗インフルエンザ特異抗体ＩｇＡ及びＩｇＧ産生に対するアジュバントの影響を示す。（実施例３）
図４は、経鼻（ａ）、皮下注射（ｂ）インフルエンザワクチン投与による血中抗インフルエンザ特異抗体産生に対するＰＳＦ−２，ＣＴＢの影響を示す。（実施例４）
図５は、経鼻インフルエンザワクチン投与による鼻腔（ａ）、肺胞（ｂ）粘膜におけるＴＧＦ−β１分泌レベルに対するＰＳＦ−２，ＣＴＢの影響を示す。（実施例６）
図６は、経鼻投与インフルエンザワクチンによる鼻腔（ａ）、肺胞（ｂ）及び血液中（ｃ）の抗インフルエンザ特異抗体産生に対するＰＳＦ−２、ＣＴＢの影響を示す。（実施例７）。
図７は、経鼻インフルエンザワクチン投与による鼻、肺および脾臓のリンパ球から分泌される各種サイトカインに対するＳＰＦ−２、ＣＴＢの影響を示す。（実施例８）。
図８は、経鼻投与インフルエンザワクチンによる鼻腔（ａ）、肺胞（ｂ）及び血液中（ｃ）の抗インフルエンザ特異抗体産生に対するＰＳＦ−３の影響を示す。（実施例９）。

以下、本発明の実施形態を詳しく説明する。
１．用語及び抗原薬物ヴィークル構成成分の説明
（１）抗原薬物ヴィークル
該ヴィークル（ＡｎｔｉｇｅｎａｎｄＤｒｕｇＶｅｈｉｃｌｅ、以下、「ＡＤヴィークル」又は「ＡＤＶ」と略記する）は、抗原や薬物等の経粘膜投与及び経皮投与が可能になるよう設計（デザイン）された、脂質とタンパク質との複合体（コンプレックス）である。ＡＤヴィークルは、次の（ａ）〜（ｃ）からなる。
（ａ）肺サーファクタントプロテインＢ又はその断片（タンパク質分解酵素により得られる天然断片だけではなく、遺伝工学やペプチド合成により得られる人工断片、かかる断片を構成するアミノ酸の１個以上が置換及び／又は欠失した変異断片等々をも含む）。
（ｂ）肺サーファクタントプロテインＣ又はその断片（タンパク質分解酵素により得られる天然断片だけではなく、遺伝工学やペプチド合成により得られる人工断片、かかる断片を構成するアミノ酸の１個以上が置換及び／又は欠失した変異断片等々をも含む）。
（ｃ）リン脂質や脂肪酸等の脂質。その形状構造は、表面に棘状あるいはスパイク状のポリペプチド鎖を保有の膜状（シート状又はローリング状の脂質膜）であり、複数のポリペプチド鎖の疎水領域末端を、脂質膜に嵌入させスパイク状に植鎖したかたちになっており、従来の脂質小胞（リポソーム）とは異なる。
この発明に係る抗原薬物ヴィークルに所望の抗原や薬物等を共存、接触、捕捉、吸着又は結合させれば（乗せれば）、かかる抗原や薬物等の経粘膜投与及び経皮投与が可能になる。換言すれば、該ヴィークルは、抗原や薬物等の経粘膜投与及び経皮投与を可能にする、これ等の乗り物である。
尚、ＡＤヴィークルの構成成分、該ヴィーイグルの調製・製造に用いるタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドと脂質、即ち、肺サーファクタントプロテインＢおよびＣ、これ等の断片、かかる断片ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸が置換及び／又は欠失した変異断片等々、及びリン脂質、脂肪酸等の脂質の詳細については、後述される。
（２）肺サーファクタント
肺サーファクタントは、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ：ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＤｉｓｔｒｅｓｓＳｙｎｄｒｏｍｅ）の治療に１９９０年代中頃から実用化され、既に現在、ヒト、ウシ、ブタ等に由来の、多様な製剤が広く市販され常用化されている（非特許文献２）。また、ＲＤＳ治療に係る活性ドメインを含む合成ペプチド製剤も市販され、更に、ＳＰ−ＢやＳＰ−Ｃアナログのデザイン開発や合成も進められている（非特許文献３）。肺サーファクタントの組成と構成は通りである：約９０％の脂質（ホスファチシセルコリン６７．３％、ホスファチジルグリセロール１９．３％、ホスファチジルセリン３．２％、その他の遊離脂肪酸等）と、約１０％の蛋白質（サーファクタントプロテインＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ；以下「ＳＰ−Ａ」、「ＳＰ−Ｂ」、「ＳＰ−Ｃ」及び「ＳＰ−Ｄ」とそれぞれ略記する）からなる複合体である。分子量はＳＰ−Ａが２８−３６ｋＤａ、Ｂが１５ｋＤａ、Ｃが３．５ｋＤａ、及びＤが４３ｋＤａである。ＳＰ−ＡとＤは親水性（水溶性）かつレクチン様（膜アソシエィテッド）である。ＳＰ−ＢとＣは、疎水性（脂溶性）かつ脂質結合性で、リン脂質膜への嵌入能及び界面活性作用を有する。ヒト、ウシ、ブタ等に由来の肺サーファクタントプロテイン遺伝子は公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／）におけるヒトＳＰ−Ｂ遺伝子ＤＮＡの完全長塩基配列のアクセッション番号はＪ０２７６１、ヒトＳＰ−Ｃ（及びＳＰ−Ｃ１）のそれは、Ｊ０３８９０である。以下、このＮＣＢＩより得たヒトＳＰ−Ｂ及びＣのコーディング領域（ＣＤＲ）とそれがコードするアミノ酸配列を記載する。
配列番号１：ヒトＳＰ−Ｂ遺伝子ＤＮＡのＣＤＲ塩基配列；
配列番号２：配列番号１から解読されたヒトＳＰ−Ｂ完全長アミノ酸配列；
配列番号３：ヒトＳＰ−Ｃ遺伝子ＤＮＡのＣＤＲ塩基配列；
配列番号４：配列番号３から解読されたヒトＳＰ−Ｃ完全長アミノ酸配列；
配列番号５：ヒトＳＰ−Ｃ遺伝子ＤＮＡ上に占めるＳＰ−Ｃ１のＣＤＲ塩基配列；及び
配列番号６：配列番号５から解読されたヒトＳＰ−Ｃ１完全長アミノ酸配列。
（３）この発明で用いるタンパク質あるいはペプチド
この発明に係る抗原薬物ヴィークルの調製・製造には、ヒト、ウシ、ブタ、クジラ、イルカ等の哺乳類に由来、更に、マグロ、サメ、エイ、ブリ等の魚類に由来のＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃとの組合せ、及びＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃ１との組合せをそれぞれ用いることができる。例えば、上記の配列番号２、４及び６にそれぞれ記載の完全長アミノ酸配列からなるヒト由来タンパク質、ＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃとの組合せ、及びＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃ１との組合せを、それぞれ用いることができる。更に、例えばＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性値に基づくＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃの疎水性（脂溶性）領域及び該領域を含む断片、かかる断片ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸が置換及び／又は欠失した変異断片等々をも用いることができる。例えば、以下に示す配列番号７〜２０に記載のアミノ酸配列からなる天然ペプチドあるいは遺伝子工学や化学合成により得られるペプチド、これ等のペプチドを含むこれより長鎖のペプチド、及びかかるペプチドの少なくとも１個のアミノ酸が置換及び／又は欠失した変異体や合成アナログ等々を使用できる。尚、アミノ酸番号は、各配列のＮ末端を占めるＭｅｔを第１番アミノ酸とし、これよりＣ末端方向（記載配列の左から右方向）に順に付された序数で表示されている。
配列番号７：配列番号２の第２１４〜２２５番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号８：配列番号２の第２５７〜２６６番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号９：配列番号４及び６の第２９〜５８番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｃ断片）；
配列番号１０：配列番号２の第１〜２０番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号１１：配列番号２の第１０２〜１１０番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号１２：配列番号２の第１１９〜１２７番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号１３：配列番号２の第１３６〜１４２番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号１４：配列番号２の第１７１〜１８５番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号１５：配列番号２の第２０１〜２７９番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号１６：配列番号２の第２５３〜２７８番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号１７：配列番号２の第３００〜３０７番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号１８：配列番号２の第３１７〜３３０番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号１９：配列番号２の第３４４〜３５１番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号２０：配列番号２の第３５８〜３８１番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｂ断片）；
配列番号２１：配列番号４及び６の第２４〜５８番のアミノ酸配列（ＳＰ−Ｃ断片）。
尚、この発明によれば、配列番号２、７、８、１０〜２０に記載のアミノ酸配列からなるＳＰ−Ｂとその断片群から選ばれる少なくとも１種と、配列番号４、６、９及び２１に記載のアミノ酸配列からなるとＳＰ−Ｃ（及びＳＰ−Ｃ１）とその断片群から選ばれる少なくとも１種とを組合せて用いることができる。
（４）本発明で用いる脂質
リン脂質としては、肺サーファクタントが含有するリン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン等の使用が望ましい。その他、ジパルミトイルグリセロホスホコリン、ジアシルグリセロホスホグリセロール、ホスファチジルグリセロール（カルジオリピン）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン等を用いることができる。また、脂肪酸としては、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸等を用いることができる。更に、肺の膨張が活発なクジラ、マグロ、イルカ等の水棲動物に由来の脂質を用いることができる。
（５）ＲＤＳ治療用の市販の肺サーファクタント製剤
この発明によれば、ＲＤＳ治療剤としての安全性と有効性が関係当局により認可され、かつ、疎水性あるいは脂溶性のＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃ並びにリン脂質を含有する市販の肺サーファクタント、例えば、商品名サーファクテン（Ｓｕｒｆａｃｔｅｎ）Ｉｎｆａｓｕｒｆ、Ｃｕｒｏｓｕｒｆ、Ｈｕｍａｎｓｕｒｆ、Ｅｘｏｓｕｒｆ、Ａｌｖｅｏｆａｃｔ等をＡＤヴィークルとして用いることができる。尚、ＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃ以外に、親水性あるいは水溶性のＳＰ−Ａ及びＳＰ−Ｄを含有する市販製剤では、例えば１−ブタノールでこれ等の水溶性タンパク質ＳＰ−ＡとＳＰ−Ｄとを抽出し、これ等を検出限界以下にまで除去した後、使用に供する。また、ＡＤヴィークルの調製における使用濃度の調整を考慮すると、液状製剤に比べ、乾燥製剤の使用が望ましい。
２．本発明の基礎となる新規な知見
この発明は、前述した背景技術の激しく厳しい渦中にあって、１０余年にも及ぶ試行錯誤を重ねた筆頭発明者の卓抜した観察力と解析力、そして深い学識経験と斬新な着想によるものであり、次の驚くべき発見に基づく。
（１）従来のアジュバントが炎症を惹起して抗原提示能を増強するのに対し、本来、肺や消化管粘膜が分泌の界面活性物質である肺サーファクタントの４種のタンパク質有効成分、ＳＰ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから、ＡとＤとを除去したＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃの組合せとリン脂質との複合体、あるいはこれ等の脂溶性領域（有効領域）を含むＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃ両断片の合成ペプチドの組合せと脂質膜との複合体（前述したＡＤヴィークル）に、ウイルス抗原を共存又は接触又は捕捉又は吸着させると、炎症を惹起することなく鼻腔粘膜の抗原提示細胞が活性化され、ウイルス抗原が該細胞内に効率よく取り込まれると共に、粘膜や血液中でのＩｇＧ産生の誘導を起こすことなく、粘膜の抗ウイルスＩｇＡ産生が効果的かつ優先的に、就中、選択的に誘導されることを発見した。
（２）更に、従来から安全な不活化ワクチン抗原として使用されているインフルエンザウイルス・スプリット抗原に、ＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃの組合せとリン脂質との複合体、あるいはこれ等の脂溶性領域（有効領域）を含むＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃ両断片の合成ペプチドの組合せと脂質膜との複合体（ＡＤヴィークル）を添加混合することにより、スプリット抗原の高い安全性を保持しながら、しかもスプリット抗原単独では生ワクチンに比べて劣る抗原提示細胞の活性化が十分に増強され補われた状態で、分泌型ＩｇＡ産生の選択的誘導が実現されることを発見した。
３．上記の発見に至る経緯
（１）筆頭発明者は、インフルエンザ発症機序と治療、予防法を解明するべく鋭意研究を重ねてきた。その過程で、インフルエンザウイルス膜蛋白質のヘマグルチニン（ＨＡ）を限定分解してウイルスの膜融合活性と感染能を発現させる気道のＨＡプロセシングプロテアーゼのトリプターゼクララを肺サーファクタントが吸着して不活性化し、結果としてウイルスの増殖サイクルを阻止することを解明した。
（２）引き続く研究の結果、肺サーファクタントには上記の作用以外に、選択的に粘膜の抗原提示細胞を活性化してウイルス抗原に対する免疫能を活性化して、分泌型ＩｇＡの誘導を引き起こすがＩｇＧの誘導は起こさないことを見いだした。さらに肺サーファクタント中の粘膜免疫増強有効成分として、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃが脂質成分と共に重要であることを明らかにし、これら蛋白成分の有効領域の特定と、粘膜免疫増強の有効性を検証した。
（３）更に、上述したように気道粘膜の生体防御物質とウイルス感染防御の観点から研究を進め、体内に分泌されている肺サーファクタントが生体内由来の粘膜免疫アジュバントとして選択的ＩｇＡ産生の誘導に関与していることを証明した。
（４）上記の肺サーファクタントが本来生体内の生理的作用物質で、（ａ）特定の生体物質を吸着する性質のあること（ＫｉｄｏＨ．，ｅｔａｌ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．ＰｕｌｍｏｎａｒｙｓｕｒｆａｃｔａｎｔｉｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＳｅｎｄａｉｖｉｒｕｓａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓ，３２２（２９），１１５−１１９，１９９２）、（ｂ）肺胞ＩＩ型細胞やクララ細胞から分泌された後、選択的にマクロファージーに取り込まれて代謝されること（諏訪部彰、Ｊ．Ｊｐｎ．Ｍｅｄ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ；肺胞蛋白症におけるサーファクタント代謝異常、３３，１０−１３，２００２）、更に（ｃ）その類縁細胞、例えば抗原提示細胞（樹状細胞）に取り込まれて代謝されることに注目し研究を重ねた。
その結果、肺サーファクタントの蛋白成分の中で、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ及び脂質成分だけで、選択的にＩｇＡ産生を誘導する粘膜ワクチンの「ＡＤヴィークル」として機能すること、更に、ＳＰ−Ｂの有効成分領域あるいは粘膜免疫誘導活性ドメインが次のアミノ酸配列からなるペプチドであることを明らかにした：
ＳＰ−Ｂ２１４−２２５：ＬｅｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇＩｌｅＧｌｎＡｌａＭｅｔＩｌｅＰｒｏＬｙｓＧｌｙ（配列番号７）；及び
ＳＰ−Ｂ２５７−２６６：ＬｅｕＬｅｕＡｓｐＴｈｒＬｅｕＬｅｕＧｌｙＡｒｇＭｅｔＬｅｕ（配列番号８）。
併せて、ＳＰ−Ｃの有効成分領域あるいは粘膜免疫誘導活性ドメインが次のアミノ酸配列からなるペプチドであることを明らかにした：
ＳＰ−Ｃ２９−５８：ＣｙｓＰｒｏＶａｌＨｉｓＬｅｕＬｙｓＡｒｇＬｅｕＬｅｕＩｌｅＶａｌＶａｌＶａｌＶａｌＶａｌＶａｌＬｅｕＩｌｅＶａｌＶａｌＶａｌＩｌｅＶａｌＧｌｙＡｌａＬｅｕＬｅｕＭｅｔＧｌｙＬｅｕ（配列番号９）。
（５）更に、選択的ＩｇＡ誘導の機序として、肺サーファクタントの有効成分は、抗原提示樹上細胞のＭＨＣＣｌａｓｓＩＩ、ＣＤ４０、Ｂ７−２の発現増加を誘導してＴ−リンパ球への抗原提示を効果的に実行する以外に、粘膜局所のサイトカインＴＧＦ−β１を誘導してＩｇＡ産生Ｂ−リンパ球へのクラススイッチを促進していることを明らかにした。
４．以上の発見とその経緯に基づき完成された本発明の目的は次の通りである
（１）第１の目的は、粘膜免疫方法の確立である。「ＡＤヴィークル」の提供とその活用により、粘膜免疫の有効物質である抗原特異的ＩｇＡ産生の選択的誘導を実現すると共に、安全かつ有効な（副作用のない）粘膜免疫の誘導とその方法を確立する。
（２）第２の目的は、合成ペプチドの使用による、ＡＤヴィークルの安全性・有効性・均質性に係る品質の向上にある。ＳＰ−Ｂの粘膜免疫誘導活性ドメイン（前述ＳＰ−Ｂ２１４−２２５及びＳＰ−Ｂ２５７−２６６の各アミノ酸配列からなる）の合成ペプチド、及びＳＰ−Ｃの粘膜免疫活性導活性ドメイン（前記ＳＰ−Ｃ２９−５８のアミノ酸配列からなる）の合成ペプチド、これ等の合成アナログ、更に、これ等のアミノ酸配列を部分として含む長鎖の合成ペプチド等々と、肺サーファクタント脂質成分との間で調製される複合体（ＡＤヴィークル）を提供し、ＡＤヴィークルの品質を向上させる。
（３）第３の目的は、従来ワクチンの皮下接種から経粘膜投与への転換にある。ＡＤヴィークルを、気道感染ウイルスの不活化ワクチン、例えばインフルエンザ、ＳＡＲＳ、麻疹、風疹、ムンプス等の不活化ワクチン、更に、腸管感染ウイルスの不活化ワクチン、例えばロタ、ポリオ等の不活化ワクチンに利用し、これ等の皮下接種ワクチンを粘膜ワクチンに変換する。
（４）第４の目的は、気道、腸管以外の粘膜経由ウイルス感染に対する不活化ワクチン、例えばエイズ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等の不活化ワクチンにおいて、ＡＤヴィークルの利用可能な方法を提供することである。
（５）第５の目的は、ＤＮＡワクチン、生ワクチン、アレルギーの予防や治療等についても、ＡＤヴィークルの利用可能な方法を提供することである。
（６）第６の目的は、粘膜以外のＩｇＡを誘導可能な免疫ルートとして、経皮接種（塗布や貼付等）において、ＡＤヴィークルの利用可能な方法を提供することにある。
（７）第７の目的は、ＤＤＳや製薬のみならず、農業、漁業等々へのＡＤヴィークルの用途と応用の道を開くことにある。
尚、本発明が提案するＡＤヴィークルは、従来免疫学で使用されているアジュバントとは、次の通り性能と作用を異にする。すなわち、従来アジュバントは、通常、皮下あるいは筋肉内接種され、局所の炎症反応を引き起こし、抗原提示細胞やＢ−、Ｔ−リンパ球を引き寄せ、その能力を発揮する異物を有効成分としている。更に、長時間にわたる炎症反応を維持するため、抗原の徐放や貯留を惹起する鉱油や金属塩が併用されている。また、従来の粘膜ワクチン・アジュバントとして知られているものは、前述した通り、大腸菌易熱生毒素やコレラ毒素等の異物であり、為害作用や副作用の生じる危険性がある。これに対し、本発明に係るＡＤヴィークルは、局所の炎症反応を引き起こさない。更に、生体成分由来である上に、肺サーファクタントの中の活性成分あるいはその活性ドメインが限定されていると共に、かかるドメインや該ドメイン領域を含む低分子ペプチドを使い、効果的な粘膜ワクチンを実現している。従って、極めて安全であり、かつ非侵襲的である。
５．この発明によれば、次（１）〜（５）が、それぞれ提供される
（１）肺サーファクタントプロテインＢ又は該プロテインＢに由来の複数の断片から選ばれる少なくとも１つの断片、肺サーファクタントプロテインＣ又は該プロテインＣに由来の複数の断片から選ばれる少なくとも１つの断片、及び少なくとも１種の脂質からなる複合体である抗原薬物ヴィークル。
更に詳しくは、ＡＤヴィークルは、次のＩ群（肺サーファクタントプロテインＢ及び該プロテインＢに由来あるいは起因する天然及び合成ポリペプチド群）ＩＩ群（肺サーファクタントプロテインＣ及び該プロテインＣに由来あるいは起因する天然及び合成ポリペプチド群）及びＩＩＩ群（リン脂質、脂肪酸等の脂質群）の各群から少なくとも１種ずつ選ばれる、合計、少なくとも３種の物質からなる複合体である。
［Ｉ群］肺サーファクタントプロテインＢ、及び配列番号２に記載の次のアミノ酸配列からなるポリペプチド（アミノ酸番号は、Ｎ末端のＭｅｔを第１番アミノ酸とし、これよりＣ末端方向に順次付されている）：第１−３８１番（配列番号２）、第２１４−２２５番（配列番号７）、第２５７−２６６番（配列番号８）、第１−２０番（配列番号１０）、第１０２−１１０番（配列番号１１）、第１１９−１２７番（配列番号１２）、第１３６−１４２番（配列番号１３）、第１７１−１８５番（配列番号１４）、第２０１−２７９番（配列番号１５）、第２５３−２７８番（配列番号１６）、第３００−３０７番（配列番号１７）、第３１７−３３０番（配列番号１８）、第３４４−３５１番（配列番号１９）、第３５８−３８１番（配列番号２０）、上記のアミノ酸配列の少なくとも１つの配列を活性ドメインとして保有するポリペプチド、上記の各アミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が置換及び／又は欠失したポリペプチド、これ等の合成アナログ、これ等の糖又は糖鎖による修飾体等々。
［ＩＩ群］肺サーファクタントプロテインＣ、及び配列番号４に記載の次のアミノ酸配列からなるポリペプチド（アミノ酸番号は、Ｎ末端のＭｅｔを第１番アミノ酸とし、これよりＣ末端方向に順次付されている）：第１−１９７番（配列番号４）、第２９−５８番（配列番号９）、第２４−５８番（配列番号２１）、配列番号６の第１−１９１番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、上記のアミノ酸配列の少なくとも１つの配列を活性ドメインとして保有するポリペプチド、上記の各アミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が置換及び／又は欠失したポリペプチド、これ等の合成アナログ、これ等の糖又は糖鎖による修飾体等々。
［ＩＩＩ群］ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ジパルミトイルグリセロホスホコリン、ジアシルグリセロホスホグセロール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸等のリン脂質、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の脂肪酸等々の脂質。
またこの抗原薬物ヴィークルは、前記ＩＩＩ群がシート状又はロール状の脂質膜であり、前記Ｉ群及びＩＩ群のそれぞれ複数鎖が、疎水領域末端を該脂質膜に嵌入した状態でスパイク状に植鎖されていることを、その構成及び形状の一つの好ましい態様としている。
（２）上記（１）の抗原薬物ヴィークルに抗原を共存、接触、捕捉、又は吸着させることにより得られ、粘膜免疫を誘導することを特徴とする粘膜ワクチン。
（３）上記（１）の抗原薬物ヴィークルにアレルゲンを共存、接触、捕捉、又は吸着させることにより得られ、粘膜免疫を誘導することを特徴とするアレルギーの予防及び治療剤。その作用効果は、例えば、飛来吸引されたスギ花粉、ダニ等のアレルゲンの鼻腔あるいは鼻咽頭粘膜ＩｇＡによる失活あるいは減感作にある。
（４）上記（１）の抗原薬物ヴィークルに薬効を奏する量の薬物を共存、接触、捕捉又は吸着させることにより得られる経粘膜及び／又は経皮ＤＤＳ。
（５）上記（１）の抗原薬物ヴィークルに抗原を共存、接触、捕捉又は吸着させることによって得られる粘膜ワクチンを鼻または上気道に投与することを特徴とする粘膜免疫の誘導方法。
なお、上記の発明（２）、（３）および（５）においては、粘膜免疫の誘導が、粘膜局所におけるＩｇＡ抗体の産生促進によって、さらには粘膜局所におけるＴＧＦ−β１およびＴｈ２タイプサイトカインの産生促進によって特徴付けられることを好ましい態様としている。
６．以下、この発明の実施態様につき説明する。
（１）ＡＤヴィークルの組成
前述したＩ群（肺サーファクタントプロテインＢ及び該プロテインＢに由来あるいは起因する天然及び合成ポリペプチド群）、ＩＩ群（肺サーファクタントプロテインＣ及び該プロテインＣに由来あるいは起因する天然及び合成ポリペプチド群）及びＩＩＩ群（リン脂質、脂肪酸等の脂質群）の３群の乾燥重量％は、次の通りである：Ｉ群は約０．１〜約６．０重量％、ＩＩ群は約０．１〜約６．０重量％、及びＩＩＩ群は約８８〜約９９．８重量％である。抗原薬物ヴィークルの調製では、重量％においてＩ群％＋ＩＩ群＋ＩＩＩ群％＝１００％になるよう調整する。
（２）ＡＤヴィークルの調製
以下に調製手順を例示する。例えば、Ｉ群を２ｍｇ、ＩＩ群を２ｍｇ、及びＩＩＩ群を９６ｍｇそれぞれ秤取し（重量％にてＩ群％＋ＩＩ群＋ＩＩＩ群％＝１００％）、これ等を５ｍｌの等張液、例えば生理的食塩水やリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に均一に懸濁させる。得られた懸濁液は、抗原薬物ヴィークル（１００ｍｇ／５ｍｌ）液として使用に供する。該ヴィークルは、使用時にその都度、調製する。尚、懸濁には、超音波、ホモジナイザー、ミキサー、振盪器等を用いることができる。超音波は過剰処理による液の変性（粘性の増加）をもたらし易いので、ミキサー、例えばボックスミキサー（例えば商品名Ｖｏｒｔｅｘｍｉｘｅｒ）の使用が望ましい。
尚、ＩＩＩ群の脂質９６ｍｇの内訳については、例えば、ホスファチジルコリン７１ｍｇ、ホスファチジルグリセロール２１ｍｇ、及びホスファチジルセリン４ｍｇの混合等を採用することができる（脂質量の合計は９６ｍｇ）。また、ＳＰ−ＡとＤが除去され、ＳＰ−ＢとＣの含有が確実な市販のＲＤＳ治療用の肺サーファクタント製剤を用いる場合には、その使用書に従って調製した懸濁液をそのまま、抗原薬物ヴィークル液として使用に供することができる。
（３）粘膜ワクチンの調製
ワクチン中の抗原量（Ａ）に対する抗原薬物ヴィークル量（Ｖ）の乾燥重量比Ａ／Ｖが約０．２〜約５になるよう、ワクチン原液に抗原薬物ヴィークル液を添加混合し調製する。例えば、抗原含有量が１μｇ／ｍｌのワクチン原液１，０００ｍｌに対し、重量比Ａ／Ｖ＝１を採用すると、上記（２）で調製した抗原薬物ヴィークル（１００ｍｇ／５ｍｌ）液の添加混合量は５０μｌである。尚、均一に混合するには、ホモジナイザー、ミキサー、振盪器、攪拌器等を用いることができる。
（４）経粘膜・経皮ＤＤＳの調製
上記（３）と同様にして、抗原の代わりに薬物を用いることにより、調製できる。

以下、実施例を示し、この発明の構成と効果につき、具体的に説明する。但し、この発明は、これ等の具体例、説明及び記載にのみ限定されるわけではない。
なお、この実施例で使用した材料、試験手続等は以下のとおりである。
（１）肺サーファクタント
「抗原薬物ヴィークル（ＡＤヴィークル）」して用いた肺サーファクタントは、牛の肺よりＨｏｗｇｏｏｄらの方法（ＨｏｗｇｏｏｄＳ，ｅｔａｌ．，：Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｃａｌｃｉｕｍｉｏｎｓｏｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｓｕｒｆａｃｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｌｕｎｇｓｕｒｆａｃｔａｎｔｌｉｐｉｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４，１８４−１９０，１９８５）で調整した標品（ＰＳＦ−１）か、あるいは多くはこの標品を１−ブタノールで抽出して水溶性蛋白成分ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｄを除去、あるいは検出限界以下にまで減じた標品（ＨａａｇｓｍａｎＨＰ，ｅｔａｌ．，：Ｔｈｅｍａｊｏｒｌｕｎｇｓｕｒｆａｃｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＰ２８−３６，ｉｓａｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１３９７７−１３８８０，１９８７）（ＰＳＦ−２）、さらに主にホスファチジルコリンやジパルミトイルホスファチジルコリンからなるリン脂質を全体として４０重量％以上含有し、さらに肺サーファクタント脂質に類似してホスファチジルグリセロールを１０−２０％、ホスファチジルセリンが２〜５％含有され、脂溶性蛋白質のＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃの有効領域の合成ペプチドのどちらか、あるいは両方のペプチドを合わせて、０〜３．５％含む標品が用いられる。この標品の中でＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃの有効領域の両方のペプチドを合わせ持つ標品（ＰＳＦ−３）、ＳＰ−Ｂの有効領域の合成ペプチドを有する標品（ＰＳＦ−４）、ＳＰ−Ｃの有効領域の合成ペプチドを有する標品（ＰＳＦ−５）についても検討した。あるいはＰＳＦ−１、ＰＳＦ−２に相当する公知の標品、例えば商品名サーファクテン、インサァーフ（Ｉｎｆａｓｕｒｆ）、キューロサーフ（Ｃｕｒｏｓｕｒｆ）、ヒューマンサーフ（Ｈｕｍａｎｓｕｒｆ）、エキソサーフ（Ｅｘｏｓｕｒｆ）、アルビオファクト（Ａｌｖｅｏｆａｃｔ）なども用いられる。
（２）動物
６週齢、メスＢＡＬＢ／ｃマウスおよび、１０週齢Ｈａｒｔｌｅｙモルモットを日本エスエルシー株式会社（日本・静岡）から購入して用いた。全ての動物実験は徳島大学医学部実験動物センターの感染動物舎（Ｐ２レベル）で行われ、徳島大学医学部動物実験委員会のガイドラインに従って行われた。
（３）スプリット型インフルエンザワクチンの作製
インフルエンザウイルスＡＡｉｃｈｉ／６８／２／Ｈ３Ｎ２株を接種した発育鶏卵由来浮遊液（１×１０^８Ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ（ＰＦＵ））（川崎医科大学・微生物学教室大内正信教授より供与された）を用いて以下の操作でスプリット型インフルエンザワクチンの作成を行った。０．００４ＭＰＢＳ（タカラバイオ株式会社日本・東京・滋賀）で一晩透析されたウイルス浮遊液にβプロピオラクトン（和光純薬株式会社日本・大阪）を液量の０．０５％、最終濃度８ｎＭになるように添加し、氷浴中で１８時間インキュベートした。その後、３７℃で１．５時間インキュベートすることで、βプロピオラクトンの加水分解を行った。その後、終濃度０．１％となるようにＴｗｅｅｎ２０（和光純薬株式会社）を加え、さらにＴｗｅｅｎと等量のジエチルエーテル（和光純薬株式会社）を加え、４℃で２時間転倒混和した。この液を２０００ｒｐｍ、５分間遠心分離することにより水層を回収した。さらにＡｕｔｏｍａｔｉｃＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｐｅｅｄＶａｃＳｙｓｔｅｍ（ＳＡＶＡＮＴＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ，ＩＮＣ．アメリカ・ニューヨーク）を用いて水層よりジエチルエーテルの除去を行った。これをＭｉｌｌｅｘ０．４５μｍフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥアメリカ・マサチューセッツ）で濾過し、不活化スプリット型インフルエンザワクチンとして用いた。
（４）免疫法
上記の製造法で作製したスプリット型インフルエンザワクチンに「ＡＤヴィークル」として上記の肺サーファクタント（ＰＳＦ−１）、１−ブタノール抽出肺サーファクタント（ＰＳＦ−２）、ＳＰ−Ｂ，ＳＰ−Ｃの有効領域の合成ペプチドと肺サーファクタント脂質（ＰＳＦ−３、４、５）、公知の肺サーファクタント商品、あるいは免疫アジュバントとしてコレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ、ＳＩＧＭＡアメリカ・ミズーリ）を混合して用いた。肺サーファクタントあるいは上記の相当標品を、ワクチン投与に必要な濃度で用時ＰＢＳに懸濁し、室温、５分間の超音波処理により均一な懸濁液とした。これに肺サーファクタントあるいは上記の相当標品の乾燥重量で０．１μｇに対してスプリット型インフルエンザワクチンを０．１μｇ加え、ボルテックスミキサーで混合したのち、室温で１時間静置して使用した。ＣＴＢも同様に用時に調整し、スプリット型インフルエンザワクチン０．１μｇに対して０．１μｇになるように混合した（ＷａｔａｎａｂｅＩ，ｅｔａｌ．，：ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｎａｓａｌｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｍｕｔａｎｔｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎａｓａｓａｆｅＡｄｊｕｖａｎｔ（ＣＴ１１２Ｋ）．Ｖａｃｃｉｎｅ２００２；２０：３４４３−５５）。
ワクチンの経鼻投与においては、上記の調整品を乾燥重量相当量として０．１μｇ／１μｌＰｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）溶液になるようにＰＢＳで希釈し、これを１匹当たり片側１μｌづつを両側に投与して、合計２μｌをエーテルで麻酔したマウスの両側鼻腔に点鼻投与した。比較のために行った従来型皮下注射においては、スプリット型インフルエンザワクチンを０．１μｇ／５０μｌ溶液になるようにＰＢＳで希釈し、これをマウス頸部皮下に投与した。対照群にはワクチン液と同量のＰＢＳを投与した。４週間後に初回免疫と同様の方法によって２次免疫を行い、２次免疫後２週間目のマウスの、鼻腔・肺胞洗浄液および血清を調製して、ウイルス特異的なＩｇＡ、ＩｇＧの測定とウイルス感染実験に用いた。
（５）マウス鼻腔・肺胞洗浄液および血清の調製
ワクチン投与マウスをペントバルビタール麻酔下で開腹開胸し、気管を切開しアトム静脈カテーテル節付３Ｆｒ（アトムメディカル株式会社日本・東京）を肺へ挿入後、生理食塩水１ｍｌを注入し、この液を回収した。これを３回繰り返して採取した液、計３ｍｌを肺胞洗浄液として用いた。肺洗浄液採取後、切開した気管から鼻腔方向へアトム静脈カテーテルを挿入し、１ｍｌの生理食塩水を注入し、鼻から出てきた液を採取した。この液を鼻洗浄液として用いた。さらに、心臓より採血を行い、５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により血清を調製した。
（６）タンパク定量
鼻洗浄液、肺洗浄液、および血清のタンパク含有量をＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ（ＰＩＥＲＣＥアメリカ・イリノイ）を用いて測定した（ＳｍｉｔｈＰＫ．ｅｔａｌ．，：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｐｒｏｔｅｉｎｕｓｉｎｇｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５０，７６−８５，１９８５）。５６２ｎｍの吸光度はＳＰＥＣＴＲＡｍａｘＰＬＵＳ３８４（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎアメリカ・カリフォルニア）を用いて測定した。
（７）ウイルス感染実験および感染価の評価
スプリット型インフルエンザワクチンの調製に用いたウイルス株と同じインフルエンザウイルス株、ＡＡｉｃｈｉ／６８／２／Ｈ３Ｎ２株を感染に用いた。２次免疫終了後２週間目のマウスをエーテルで麻酔した後、インフルエンザウイルス発育鶏卵由来浮遊液を、両側鼻腔に合計７×１０^４ＰＦＵ／３μｌを滴下して感染させた。感染３日後に鼻腔、肺胞洗浄液を上記の要領で調製し、ウイルス感染価の評価に用いた。ウイルス感染価の評価をＡ５４９細胞（川崎医科大学・微生物学教室大内正信教授より供与された）を用いて行った。Ａ５４９細胞は、５％牛胎児血清／ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏアメリカ・ニューヨーク）の条件下で培養を行った。Ａ５４９細胞を６ウェル培養プレート（グレイナードイツ・シュトゥットガルト社）に１００％コンフルエントになるように継代し、２４時間後に無血清培地に交換した。各ウェルにインフルエンザ感染マウスの鼻腔・肺胞洗浄液を５００μｌずつ滴下し、ＣＯ_２インキュベーターにて１２時間から１６時間３７℃で培養を行った。これにモルモットより採血した赤血球１％ＰＢＳ液を加え、５分間室温下で静置した。これを１ｍＭＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋ＰＢＳを用いて洗浄し、赤血球を凝集させた細胞をウイルス感染細胞としてカウントし、ウイルス感染価の評価を行った（ＴａｓｈｉｒｏＭ．，ＨｏｍｍａＭ．：ＰｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｓｍｏｆＳｅｎｄａｉｖｉｒｕｓｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｐｒｏｔｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｍｏｕｓｅｌｕｎｇｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３９，８７９−８８８，１９８３）。
（８）抗インフルエンザ特異的ＩｇＡおよびＩｇＧの精製
ＥＬＩＳＡａｓｓａｙにおける定量の基準として用いるために、特異的抗インフルエンザＩｇＡおよびＩｇＧの精製を以下のようにして行った。組換え大腸菌発現ＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース４Ｂカラム（ＺＹＭＥＤＬＡＢＯＲＴＯＲＩＥＳＩＮＣ，アメリカ・サンフランシスコ）を用いたアフィニィティークロマトグラフィーにより、インフルエンザワクチン投与およびウイルス感染マウスの肺洗浄液からＩｇＧ画分を精製した。抗マウスＩｇＡヤギＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ）をＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅアメリカ・ニュージャージー）に結合し、ＰｒｏｔｅｉｎＧの素通り画分からこれを用いたアフィニィティークロマトグラフィーによりＩｇＡ画分を精製した。これらのＩｇＧ、ＩｇＡ画分からウイルス特異的抗体を精製するため、免疫に用いた不活化スプリット型インフルエンザワクチンをＢｒＣＮ活性化セファロースカラムに結合し、ＩｇＡ、ＩｇＧ画分からこれを用いた抗原アフィニィティークロマトグラフィーによりそれぞれ抗インフルエンザ特異的ＩｇＡおよびＩｇＧを精製した。リガンドとしてのスプリット型インフルエンザ蛋白質のカラムへのカップリングは、０．１ＭＮａＨＣＯ_３／０．５ＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて結合反応を行い、フリーのリガンドを０．１Ｍ酢酸／０．５ＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて除去後、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）により中和を行った。各アフィニティクロマトグラフィーはＰＢＳ（ｐＨ７．５）によりアフィニティ結合反応およびフリーの抗体の除去を行った後、ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．８）によって特異抗体の溶出を行った。溶出された画分は直ちに０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）により中和を行い、ＭｉｌｌｉＱ水にて透析後凍結乾燥し、用時ＰＢＳに溶解して用いた。
（９）抗インフルエンザ抗体の定量
鼻腔、肺胞洗浄液および血清中の抗インフルエンザＩｇＡ、ＩｇＧ含有量を、ＥＬＩＳＡａｓｓａｙにより定量した。ＥＬＩＳＡａｓｓａｙはＢＥＴＨＹＬＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社（アメリカ・テキサス）のＭｏｕｓｅＥＬＩＳＡｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｋｉｔの方法に従って行った。９６ウェルＮｕｎｃイムノプレート（ＮａｌｇｅｎＮｕｎｃＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌアメリカ・ニューヨーク）各ウェルにワクチン１μｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，ＳＩＧＭＡアメリカ・ミズーリ）１μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液１００μｌを加え、４℃で一晩固層化反応を行った。その後洗浄液（５０ｍＭＴｒｉｓ，０．１４ＭＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８．０）で３回すすぎワクチン液を除去した。各ウェルに０．１５ＭＮａＣｌ、１％ＢＳＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）２００μｌを加え、室温で１時間ブロッキング反応を行った。各ウェルを洗浄液で３回すすいだのち、サンプル結合緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ，０．１５ＭＮａＣｌ，１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８．０）にて適量に希釈した鼻洗浄液・肺洗浄液あるいは血清を１００μｌ加え、室温で２時間反応させた。Ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＡまたはＩｇＧ−ｈｏｒｓｅｒＡＤｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）（ＢＥＴＨＹＬＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳＩＮＣ．）を二次抗体として用い、ＴＭＢＭｉｃｒｏｗｅｌｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅＳｙｓｔｅｍ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．アメリカ・メリーランド）を用いて発色反応を行った。各ウェルに１００μｌ、２ＭＨ_２ＳＯ_４（和光純薬株式会社）を添加することによって反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度をＳＰＥＣＴＲＡｍａｘＰＬＵＳ３８４で測定した。定量のためのスタンダードとして、上記肺洗浄液から精製した抗インフルエンザＩｇＡおよびＩｇＧ１０ｎｇについて同様にして得られた吸光度を用いた。
（１０）樹状細胞の調製およびフローサイトメトリー
初回免疫後２日目の各群のマウス（１群４匹）より採取した鼻、肺、脾臓より、樹状細胞の調製をＧｏｎｚａｌｅｚ−ＪｕａｒｒｅｒｏＭの方法（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−ＪｕａｒｒｅｒｏＭ，ＯｒｍｅＩＭ．：ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅｌｕｎｇｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ２００１；６９：１１２７−３３）によりの調製を行った。なお、鼻より樹状細胞の調製、およびそのコラゲナーゼ処理はＡｓａｎｕｍａＨ等の方法（ＡｓａｎｕｍａＨ，ｅｔａｌ．，：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｎａｓａｌｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｂｙｅｎｚｙｍａｔｉｃｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ．ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ１９９５；１８７：４１−５１）に従って行った。各組織から調製された樹状細胞を１ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳにて洗浄し、１０^６細胞当たりＦＩＴＣｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｎｔｉ−ＩＡ／ＩＥ（ＭＨＣｃｌａｓｓＩＩ）およびＰＥｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｎｔｉＣＤ４０あるいはＦＩＴＣｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｎｔｉ−ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＰＥｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｎｔｉＣＤ８６（Ｂ７−２）（ＢＤバイオサイエンスアメリカ・ニュージャージー）各１μｇ／ｍｌを加え、５０μｌ１ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳ懸濁液として氷上で３０分間反応させた。１ｍｌの１ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳで２回洗浄を行ってフリーの抗体を除き、１ｍｌの１ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳに再懸濁した。これを用いてＢＤＦＡＣＳＣａｌｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス）により細胞表面修飾因子の検出を行った。
（１１）ＴＧＦ−β１の定量
鼻腔、肺胞洗浄液中のＴＧＦ−β１の分泌量を、ＥＬＩＳＡａｓｓａｙにより定量した。
ＥＬＩＳＡａｓｓａｙはＴＧＦ−β１ＥＬＩＳＡｋｉｔ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬアメリカ・カリフォルニア）を用いて、キットに添付された使用法に従って行った。
（１２）各種サイトカインの定量
鼻腔、肺胞洗浄液中、および脾臓のリンパ球からそれぞれ分泌されるサイトカイン（インターロイキン４：ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３）の量を、それぞれの市販ＥＬＩＳＡキットにより定量した。
（１３）ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃの合成ペプチドとリン脂質とからなるＰＳＦ−３の調製
ＳＰ−Ｂ２５３−２７８（配列番号１６）とＳＰ−Ｃ２４−５８（配列番号２１）のそれぞれのペプチドを公知の方法により化学合成した。これらのペプチドを、リン脂質膜（ジパルミトイルホスファチジルコリン（７５）、ホスファチジルグリセロール（２５）、パルミチン酸（１０））に加えて板状のリン脂質膜を作成し、ＡＤヴィークルＰＳＦ−３を調製した。
実施例１
経鼻インフルエンザワクチンと皮下注射インフルエンザワクチンのウイルス増殖抑制作用の比較
経鼻ワクチンとしてスプリット型インフルエンザワクチン０．１μｇを単独、あるいは「ＡＤヴィークル」として１−ブタノール抽出（ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｄ除去）サーファクタント（以下ＰＳＦ−２）０．１μｇ、あるいはＣＴＢ０．１μｇとともに、ＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス両鼻に１μｌずつ投与を行った。皮下注射ワクチンとしては、経鼻ワクチンと同量のワクチン単独、あるいはＡＤヴィークルとしてＰＳＦ−２、又はアジュバントとしてＣＴＢを加え、全体で５０μｌＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス頸部皮下に投与した。４週間後に初回免疫と同様の方法によって２次免疫を行った。対照群にはそれぞれ同容量のＰＢＳを投与した。２次免疫２週間経過後に６．６×１０^４ＰＦＵのインフルエンザウイルスを３μｌＰＢＳ溶液として経鼻感染させた。感染３日後にマウスを屠殺し、鼻腔および肺胞洗浄液を調製しこれらを用いてウイルス感染価の評価を行った（ｎ＝１５〜２０；平均±ＳＥ；＊，ｔ検定による有意水準はワクチン投与群に対してｐ＜０．０１）。
図１（ａ）と（ｂ）に示すように、経鼻インフルエンザワクチン投与の場合、鼻腔と肺洗浄液中のインフルエンザウイルスの増殖は、ワクチン単独投与によっても抑制されるが、ＰＳＦ−２、ＣＴＢはその効果を有意に増強してほぼ完全にまでインフルエンザの増殖をおさえてワクチンの効果を確実にした。図には示していないが、ＰＳＦ−２の代わりにＰＳＦ−１、ＰＳＦ−３を使用してもほほ程度の効果が得られている。ＰＳＦ−４、−５についても同様な現象は確認されたが、効果は減弱している。
尚、図には示していないがＰＳＦ−２、ＣＴＢをそれぞれ単独に初回免疫時と２次免疫時に経鼻投与しても、ウイルス増殖の抑制効果は全く認められず、ＰＳＦ−２、ＣＴＢの効果はワクチン作用の増強効果と判定された。
一方、皮下注射インフルエンザワクチンの場合、図１（ｃ）と（ｄ）に示す通り、鼻腔、肺洗浄液中のインフルエンザウイルスのタイター（ＰＦＵ）はワクチン単独でも有意に減少して、ワクチンの効果は確認されたが、ＰＳＦ−２、ＣＴＢのワクチン作用の増強効果は認められなかった。則ち皮下投与の場合には、ＰＳＦ−２、ＣＴＢの免疫増強効果はほとんど認められないか、あっても極僅かと推定された。なお、この実験においては図には示していないが、ＰＳＦ−２、ＣＴＢをそれぞれ単独に初回免疫時と２次免疫時に皮下投与しても、ウイルス増殖の抑制効果は全く認められなかった。図には示していないが、ＰＳＦ−２の代わりにＰＳＦ−１、ＰＳＦ−３、ＰＳＦ−４、ＰＳＦ−５を使用してもワクチン作用の増強効果は認められなかった。
実施例２
経鼻（ａ）、皮下注射（ｂ）によるインフルエンザワクチン投与後の鼻腔洗浄液中における抗インフルエンザ特異抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ）産生に対するＰＳＦ−２、ＣＴＢの影響
図１に記載した方法で、経鼻ワクチンとしてスプリット型インフルエンザワクチン０．１μｇを単独、あるいはＡＤヴィークルとしてＰＳＦ−２０．１μｇ、あるいはアジュバントとしてＣＴＢ０．１μｇと共に、ＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス両鼻に１μｌずつ合計２μｌ投与を行った。皮下ワクチンとしては、経鼻ワクチンと同量のワクチン、ＰＳＦ−２、ＣＴＢを５０μｌＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス頸部皮下に投与した。４週間後に初回免疫と同様の方法によって２次免疫を行った。対照群にはそれぞれ同容量のＰＢＳを投与した。２次免疫２週間経過後に６．６×１０^４ＰＦＵのインフルエンザウイルスを３μｌＰＢＳ溶液として経鼻感染させた。感染３日後にマウスを屠殺し、鼻腔洗浄液を調製しこれらを用いてウイルス感染価の評価を行った（ｎ＝１５〜２０；平均±ＳＥ；＊，ｔ検定による有意水準はワクチン投与群に対してｐ＜０．０１）。
その結果を図２（ａ）と（ｂ）に示す。経鼻投与したスプリット型インフルエンザワクチンによって、抗インフルエンザ特異ＩｇＡが選択的に鼻腔で産生されて洗浄液中に増加するが、この特異的ＩｇＡ量をＰＳＦ−２、ＣＴＢは共に同程度、著明に増加させた。一方皮下注射した場合も、スプリット型インフルエンザワクチン単独による鼻腔洗浄液中の特異的ＩｇＡ量の増加は認められたが、鼻腔投与に比べてその程度は低かった。またワクチンの皮下注射の場合、ＰＳＦ−２、ＣＴＢの免疫増強効果はＩｇＡ、ＩｇＧ産生において共に認められなかった。図には示していないが、ＰＳＦ−２の代わりにＰＳＦ−１、ＰＳＦ−３を使用してもＰＳＦ−２と同程度の効果が得られている。ＰＳＦ−４、−５についても同様な現象は確認されたが、その効果は減弱している。
実施例３
経鼻投与（ａ）、皮下注射（ｂ）インフルエンザワクチンによる肺洗浄液中の抗インフルエンザ特異抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ）産生に対するＰＳＦ−２、ＣＴＢの影響
経鼻ワクチンとしてスプリット型インフルエンザワクチン０．１μｇを単独、あるいはＡＤヴィークルとしてＰＳＦ−２０．１μｇ、あるいはアジュバントとしてＣＴＢ０．１μｇと共に、ＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス両鼻に１μｌずつ合計２μｌ投与を行った。皮下ワクチンとしては、経鼻ワクチンと同量のワクチン、ＰＳＦ−２、ＣＴＢを５０μｌＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス頸部皮下に投与した。４週間後に初回免疫と同様の方法によって２次免疫を行った。対照群にはそれぞれ同容量のＰＢＳを投与した。２次免疫２週間経過後に６．６×１０^４ＰＦＵのインフルエンザウイルスを３μｌＰＢＳ溶液として経鼻感染させた。感染３日後にマウスを屠殺し、肺胞洗浄液を調製しこれらを用いて抗インフルエンザ特異抗体ＩｇＡ、ＩｇＧ産生に対する抗原薬物ヴィークルの影響を検討した。（ｎ＝１５〜２０；平均±ＳＥ；＊，ｔ検定による有意水準はワクチン投与群に対してｐ＜０．０１）。
図３（ａ）と（ｂ）に示すようにワクチンの鼻腔投与の場合と同様、肺洗浄液中に産生される抗インフルエンザ特異抗体に対するＰＳＦ−２、ＣＴＢの産生促進効果は著明で、両者の間に大きな差はなかった。この免疫増強効果はＩｇＡに特異的で、ＩｇＧに対して効果は認められなかった。皮下注射の場合、肺洗浄中のＩｇＡの増加が認められたが、ＰＳＦ−２、ＣＴＢの免疫増強効果は、鼻腔洗浄液中の場合と同様に認められなかった。なお、図には示していないがＰＳＦ−２、ＣＴＢをそれぞれ単独に初回免疫時と２次免疫時に経鼻投与、皮下投与しても、肺洗浄中のウイルス特異的ＩｇＡ、ＩｇＧの増加は認められず、ＰＳＦ−２、ＣＴＢの効果はワクチン作用の増強効果と判定された。図には示していないが、ＰＳＦ−２の代わりにＰＳＦ−１、ＰＳＦ−３を使用してもほほ程度の効果が得られている。ＰＳＦ−４、−５についても同様な現象は確認されたが、その効果は減弱している。
実施例４
経鼻投与（ａ）、皮下注射（ｂ）インフルエンザワクチンによる血液中の抗インフルエンザ特異抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ）産生に対するＰＳＦ−２、ＣＴＢの影響
経鼻ワクチンとしてスプリット型インフルエンザワクチン０．１μｇを単独、あるいはＡＤヴィークルとしてＰＳＦ−２０．１μｇ、あるいはアジュバントとしてＣＴＢ０．１μｇと共に、ＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス両鼻に１μｌずつ合計２μｌ投与を行った。皮下注射ワクチンとしては、経鼻ワクチンと同量のワクチン、ＰＳＦ−２、ＣＴＢを５０μｌＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス頸部皮下に投与した。４週間後に初回免疫と同様の方法によって２次免疫を行った。対照群にはそれぞれ同容量のＰＢＳを投与した。２次免疫２週間後にマウスを屠殺し、心臓採血を行い、これより血清を調製しこれらを用いて抗インフルエンザ抗体発現量の定量を行った（ｎ＝１５〜２０，平均±ＳＥ）。
図４（ａ）と（ｂ）に示すように、血液中抗インフルエンザ抗体ＩｇＡ（白いバー）、ＩｇＧ（黒いバー）の産生量は、経鼻ワクチン投与の場合、軽度のＩｇＡ、ＩｇＧの増加が認められるものの、ＰＳＦ−２、ＣＴＢによるＩｇＡ、ＩｇＧの増加はなく、免疫増強効果は認められなかった。一方、皮下注射の場合、スプリット型インフルエンザワクチン投与による著しいＩｇＧの増加と、ＩｇＡの明らかな増加が認められたが、ここでもＰＳＦ−２、ＣＴＢによる抗体産生量の増加はなく、免疫増強効果は認められなかった。特に皮下注射の場合、ＩｇＧが特異的に血液中で増加していた。ＰＳＦ−２の代わりにＰＳＦ−１を使用してもほほ同様の結果が得られている（図には示していない）。
なお、ＰＳＦ−２、ＣＴＢをそれぞれ単独に初回免疫時と２次免疫時に経鼻投与、皮下投与しても血液中のウイルス特異的ＩｇＡ、ＩｇＧの増加は認められず、ＰＳＦ−２、ＣＴＢの効果はワクチン作用の増強効果と判定された（図には示していない）。
実施例５
経鼻投与（ａ）、皮下注射（ｂ）インフルエンザワクチンによる鼻、肺、脾臓の樹状細胞の抗原提示能に対するＰＳＦ−２、ＣＴＢの影響
経鼻ワクチンとしてスプリット型インフルエンザワクチン０．１μｇを単独、あるいはＰＳＦ−２０．１μｇ、ＣＴＢ０．１μｇと共に、１μｌＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス両鼻に合計２μｌ投与を行った。皮下ワクチンとして経鼻ワクチンと同量のスプリット型インフルエンザワクチン、ＰＳＦ−２、ＣＴＢを５０μｌＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス頸部皮下に投与した。２日後にマウスを屠殺し鼻、肺、脾臓より樹状細胞を調製し、フローサイトメトリーによりＭＨＣｃｌａｓｓＩＩ、ＣＤ４０、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８０）の細胞表面発現レベルを測定した。
その結果、ＣＴＢによってワクチンをチャレンジした鼻の樹状細胞（抗原提示細胞）の膜表面の抗原提示関連分子、ＣＤ４０、Ｂ７−２の発現増加が認められ、アジュバント効果が分子のレベルで確かめられた。ＰＳＦ−２の場合、鼻の樹状細胞のＣＤ４０、Ｂ７−２に加えてＭＨＣＩＩ分子の発現増加も認められ、その免疫増強効果に樹状細胞の少なくとも３つの分子が関与していることが明らかとなった。
しかし肺と脾臓の樹状細胞のＣＤ４０、Ｂ７−２、ＭＨＣＩＩ分子では、明らかな変化は認めることができなかった。また、ＰＳＦ−２の代わりにＰＳＦ−１、ＰＳＦ−３を使用してもほほ程度の効果が得られた。ＰＳＦ−４、−５についても同様な現象は確認されたが、その効果は減弱していた。
実施例６
経鼻インフルエンザワクチン投与による鼻腔（ａ）、肺胞（ｂ）粘膜におけるＴＧＦ−β１分泌レベルに対するＳＰＦ−２、ＣＴＢの影響
経鼻ワクチンとしてスプリット型インフルエンザワクチン０．１μｇを単独、あるいはＳＰＦ−２０．１μｇ、ＣＴＢ０．１μｇとともに、１μｌＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス両鼻に合計２μｌ投与を行った。皮下ワクチンとして経鼻ワクチンと同量のワクチン、ＰＳＦ−２、ＣＴＢを５０μｌＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス頸部皮下に投与した。４週間後に初回免疫と同様の方法によって２次免疫を行った。対照群にはそれぞれ同容量のＰＢＳを投与した。２次免疫２週間後にマウスを屠殺し、鼻腔洗浄液を調製しこれらを用いてＴＧＦ−β１分泌量の定量を行った（ｎ＝１５〜２０；平均±ＳＥ；^＊，ｔ検定による有意水準はワクチン投与群に対してｐ＜０．０１）。
Ｂ細胞がＩｇＡ産生細胞に分化（クラススイッチ）するためには、産生細胞の局在している局所のＴＧＦ−β１濃度が重要であることが知られている（Ｓｔａｖｎｅｚｅｒ，Ｊ．：ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｌａｓｓｓｗｉｔｃｈｉｎｇｂｙＴＧＦ−ｂｅｔａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（４），１６４７−１６５１，１９９５）。そこで上記の条件下での鼻腔（ａ）、肺胞（ｂ）粘膜局所のＴＧＦ−β１濃度を検討した。
スプリット型インフルエンザワクチンを投与した鼻腔、肺胞粘膜局所のＴＧＦ−β１濃度は、共にＳＰＦ−２、ＣＴＢ存在下に有意に増加した。増加の程度は、ＳＰＦ−２、ＣＴＢ間で有意な差はなかった。その結果を図５（ａ）と（ｂ）に示す。生体内由来のＳＰＦ−２は、外来毒素のＣＴＢと同程度、ＩｇＡ分泌Ｂ細胞分化の促進を促すＴＧＦ−β１の濃度を増加させていることが判明した。図には示していないが、ＰＳＦ−２の代わりにＰＳＦ−１、ＰＳＦ−３を使用してもほほ程度の効果が得られている。ＰＳＦ−４、−５についても同様な現象は確認されたが、効果は減弱している。なお、ＰＳＦ−２、ＣＴＢをそれぞれ単独に初回免疫時と２次免疫時に経鼻投与、皮下注射投与してもＴＧＦ−β１の濃度の増加は認められず、ＰＳＦ−２、ＣＴＢの効果はワクチン作用の増強効果と判定された（図には示していない）。
実施例７
経鼻投与インフルエンザワクチンによる鼻腔（ａ）、肺胞（ｂ）及び血液中（ｃ）の抗インフルエンザ特異抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ）産生に対するＰＳＦ−２、ＣＴＢの影響
経鼻ワクチンとしてスプリット型インフルエンザワクチン０．２μｇを単独、あるいはＡＤヴィークルとしてＰＳＦ−２０．２μｇ、あるいはアジュバントとしてＣＴＢ０．２μｇと共に、ＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス両鼻に１μｌずつ合計２μｌ投与を行った。４週間後に初回免疫と同様の方法によって２次免疫を行った。対照群にはそれぞれ同容量のＰＢＳを投与した。各群とも、２次免疫２週間後にマウスを屠殺し、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液および心臓採血による血清を調製し、これらを用いて抗インフルエンザ抗体発現量の定量を行った（ｎ＝１５〜３０，平均±ＳＥ、＋，ｐ＜０．０１ｖｓ．ワクチン単独投与）。
図６（ａ）と（ｂ）に示すように、鼻腔洗浄液および肺胞洗浄液では、ＰＳＦ−２とワクチンとを投与した場合に血液中抗インフルエンザ抗体ＩｇＡ（青丸）が顕著な増加を示したが、図６（ｃ）に示すように、血液中ではＩｇＧ（赤丸）の増加は認められなかった。
一方、ＣＴＢとワクチンを投与した場合、ＩｇＧとＩｇＧが、鼻腔洗浄液およ肺胞洗浄液で増加し（図６（ａ）、（ｂ））、さらに血液中でも顕著に増加した（図６（ｃ））。
以上のとおり、ＣＴＢの場合には、従来からの報告のとおり、経鼻接種した抗原に反応して局所免疫を成立させる以外に、全身性の免疫反応（ＳｙｓｔｅｍｉｃＩｍｍｕｎｅＲｅｓｐｏｎｓｅ）を生じさせた。一方、ＰＳＦ−２を用いた場合には、局所粘膜免疫のみを成立させた。
なお、Ｊ．ＦｒｅｅｋｖａｎＩｗａａｒｄｅｎ等（非特許文献４）は、肺からマクロファージを人工的に除去すると、ＳＰ−Ｂと脂質によって全身性の免疫反応を誘導できるが、マクロファージを除去しない場合には免疫を誘導することができないことを報告している。また、前記文献においては、前身性免疫反応を誘導するために必要なＳＰ−Ｂ＋脂質量は２５０−３００μｌであり、前記実施例のＰＳＦ−２投与量（０．２μｌ）とは大きくかけ離れている。しかも、局所粘膜免疫については一切言及していない。
実施例８
経鼻インフルエンザワクチン投与による鼻、肺および脾臓のリンパ球から分泌される各種サイトカインに対するＳＰＦ−２、ＣＴＢの影響
経鼻ワクチンとしてスプリット型インフルエンザワクチン０．２μｇをＳＰＦ−２０．２μｇ、またはＣＴＢ０．２μｇとともに、１μｌＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウスの上気道に合計２μｌ投与した。２次免疫２週間後にマウスを屠殺し、鼻腔、肺胞および脾臓リンパ球からのＴＧＦ−β１およびサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３）の分泌量の定量を行った（ｎ＝１５〜２０；平均±ＳＥ；＋＋＋，Ｐ＝０．０６；＋＋，Ｐ＝０．０５；＋，Ｐ＝０．０１ｖｓ．ワクチン単独投与）。
図７（ａ）〜（ｅ）に示すように、ＰＳＦ−２とともにワクチン免疫した後の粘膜局所（鼻、肺）ではＴＧＦ−β１、ＩＬ−５およびＩＬ−６の有意な分泌増加が認められたが、ＩＬ−４およびＩＬ−１３では有意な増加は認められなかった。一方、脾臓ではいずれのサイトカインの有意な増加は観察されなかった。
以上の結果から、ＰＳＦ−２は、ＩｇＡを産生するＢ細胞の分化、誘導を促進するＴｈ２タイプのサイトカインを粘膜局所で増加させることが確認された。
実施例９
経鼻投与インフルエンザワクチンによる鼻腔（ａ）、肺胞（ｂ）及び血液中（ｃ）の抗インフルエンザ特異抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ）産生に対するＰＳＦ−３の影響
経鼻ワクチンとしてスプリット型インフルエンザワクチン０．２μｇを単独、あるいはＡＤヴィークルとしてＰＳＦ−３（配列番号１６に記載のＳＰ−Ｂ断片２５３〜２７８ペプチドと配列番号２１に記載のＳＰ−Ｃ断片２４〜５８ペプチドとの等重量混合物）０．２μｇ、または脂質成分０．２μｇと共に、ＰＢＳ溶液としてＢＡＬＢ／ｃマウス両鼻に１μｌずつ合計２μｌ投与を行った。４週間後に初回免疫と同様の方法によって２次免疫を行った。対照群にはそれぞれ同容量のＰＢＳを投与した。各群とも、２次免疫２週間後にマウスを屠殺し、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液および心臓採血による血清を調製し、これらを用いて抗インフルエンザ抗体発現量の定量を行った（ｎ＝１５〜３０，平均±ＳＥ、＋，ｐ＜０．０１ｖｓ．ワクチン単独投与）。
図８（ａ）と（ｂ）に示すように、鼻腔洗浄液および肺胞洗浄液では、ＰＳＦ−３とワクチンとを投与した場合に血液中抗インフルエンザ抗体ＩｇＡ（青丸）が顕著な増加を示したが、ＩｇＧ（赤丸）の有意な増加は認められなかった。一方、血清中（ｃ）では、ＩｇＧ（赤丸）およびＩｇＧ（青丸）とも、有意な増強は認められなかった。

この発明に係る「ＡＤヴィークル」は、抗原・薬物・栄養剤等々のあらゆる物質を、鼻・気管・腸管等々の粘膜あるいは皮膚から細胞内に輸送する機能を発揮すると共に、そこでのＩｇＡ産生を優先的かつ選択的に誘導するので、粘膜ワクチン、アレルギーの予防と治療、経粘膜及び経皮ＤＤＳ、薬物や栄養素等の有用物質の経粘膜投与及び経皮投与を可能にする。しかも、その臨床使用及び安全性は国内及び諸外国で既に認可されている。
従って、生物学的製剤やＤＤＳ等での医薬品・製薬、機能性食品や健康食品等での飲食品・食糧工業、農産物の育成・栽培・病気対策・昆虫駆除等での農業・農薬、魚病ワクチン・投薬等での栽培漁業、防蟻・防虫等での建築業や環境保全等々、極めて広範囲の産業における用途と活用が期待される。

Claims

肺サーファクタントプロテインＢ又は該プロテインＢに由来の複数の断片から選ばれる少なくとも1つの断片、肺サーファクタントプロテインＣ又は該プロテインＣに由来の複数の断片から選ばれる少なくとも1つの断片、及び少なくとも1種の脂質からなる複合体であり、プロテインBに由来の断片が配列番号2、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20のアミノ酸配列からなるペプチドであり、プロテインCに由来の断片が配列番号4、配列番号9、21、または配列番号6のアミノ酸配列からなるペプチドである抗原薬物ヴィークルに抗原を共存、接触、捕捉、又は吸着させることにより得られ、粘膜局所におけるIgA抗体の産生促進により粘膜免疫を誘導することを特徴とする経鼻投与型の粘膜ワクチン。
少なくとも1種の脂質が、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ジパルミトイルグリセロホスホコリン、ジアシルグリセロホスホグリセロール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、及びオレイン酸からなる脂質群から選ばれる請求項１に記載の粘膜ワクチン。
脂質がシート状又はロール状の膜であり、肺サーファクタントプロテインＢ又は該プロテインＢに由来の複数の断片から選ばれる少なくとも1つの断片、及び肺サーファクタントプロテインＣ又は該プロテインＣに由来の複数の断片から選ばれる少なくとも1つの断片のそれぞれ複数鎖が、疎水領域末端を該脂質膜に嵌入した状態でスパイク状に植鎖されている請求項１または２のいずれかに記載の粘膜ワクチン。
粘膜免疫の誘導が、粘膜局所におけるTGF-β1およびTh2タイプサイトカインの産生促進により特徴付けられる請求項１から３のいずれかに記載の粘膜ワクチン。
請求項１から４のいずれかに記載の粘膜ワクチンを非ヒト動物の鼻腔に投与し、粘膜局所におけるIgA抗体の産生を促進することを特徴とする粘膜免疫の誘導方法。
粘膜免疫の誘導が、粘膜局所におけるTGF-β1およびTh2タイプサイトカインの産生促進によって特徴付けられる請求項５に記載の粘膜免疫の誘導方法。