CN104498440B - 鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株及其应用，属于鹅副黏病毒的分离及应用领域。本发明首先分离了一株鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，其微生物保藏编号是：CGMCC No.9901。本发明进一步公开了一种制备预防鹅副黏病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：(1)培养鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，收集病毒液；(2)灭活病毒液；(3)离心，取病毒上清液，与佐剂混合，乳化，即得。本发明分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株对鸡胚成纤维细胞高度适应，适合细胞培养；免疫原性良好，与胚毒制备的疫苗相比，具有产生抗体效价高并且节约生产成本等优点。

Description

鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株及其应用

技术领域

本发明涉及鹅副黏病毒，尤其涉及一株分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株，本发明还涉及所述分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株在制备预防鹅副黏病毒病的疫苗中的用途，属于鹅副黏病毒的分离及应用领域。

背景技术

鹅副黏病毒(Goose paramyxovirus,GPMV)是副黏病毒科，副黏病毒亚科，腮腺炎病毒属。鹅副黏病毒病是以消化道病变为主要特征的具有高度发病率和死亡率的烈性传染病，一年四季均可发生，发病率为40％-100％，平均为60％左右，死亡率为30％-100％，平均为40％左右。不同日龄的鹅均易感染，但日龄越小发病率和死亡率越高，其中15日龄以内雏鹅的发病率和死亡率可高达100％。随鹅群日龄的增长，发病率和死亡率也随之下降，部分病鹅可逐渐康复。种鹅感染发病后，除死亡外，产蛋量大大下降，受精率也很低。

目前，部分养殖户用新城疫疫苗免疫鹅，以预防鹅副黏病毒。根据报道，新城疫病毒一般不感染鹅，即使感染也不发病(Gagic et al,1999)。任涛等(2000)曾用国内NDV标准强毒株F48E8攻击28日龄的鹅，发现NDV强毒株对鹅的发病率和死亡率均为0。鹅副黏病毒病至今仍无有效的治疗方法，预防该病最行之有效的办法是疫苗的接种。目前，市售的鹅副黏病毒疫苗绝大多数为鸡胚生产的组织苗，相对于细胞苗而言，其具有成本高、产品质量批间差较大等缺点。因此，分离一株鹅副黏病毒细胞适应毒株，对于降低鹅副黏病毒疫苗的生产成本、稳定产品质量具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株鹅副黏病毒(Goose paramyxovirus)鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，其具有在鸡胚成纤维细胞上增殖的特性，免疫原性良好，产生抗体效价高，且降低疫苗生产成本。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先分离了一株鹅副黏病毒株，其具有在鸡胚成纤维细胞上增殖的特性；在此基础上，本发明进一步驯化分离出了一株细胞适应毒，命名为DQ03株。

本发明将分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9901；分类命名是：鹅副黏病毒；保藏时间是：2014年10月22日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明从黑龙江省大庆市郊某养殖场无菌采集病死鹅的肝脏、脾脏等组织中分离出一株鹅副黏病毒。分离病毒能被ND阳性血清所抑制，HI效为2⁸；不能被EDS₇₆阳性血清、H5和H9禽流感阳性血清所抑制。分离毒株的EID₅₀为10^8.17/0.1ml，脑内致病指数(ICPI)为0.16，鸡胚平均致死时间(MDT)为114h，表明本发明分离的鹅副黏病毒毒株为低毒力病毒。

本发明将分离毒株接种在生长良好的鸡胚成纤维细胞(CEF)上，36h后开始出现典型的细胞病变，病变初期表现为细胞聚缩，之后，合胞体数量逐渐增多、变大；60h时75％CEF出现细胞病变，细胞逐渐脱落，细胞之间的空白区逐渐增大，残留的细胞呈拉网状结构；当细胞病变达70％时，测定细胞液的HA效价为1∶512。表明，分离毒株具有CEF细胞适应株的特性。

本发明将分离病毒进行蚀斑纯化，挑选中等大小的5个蚀斑进行传代纯化，分离得到5个病毒株，分别命名为DQ01株、DQ02株、DQ03株、DQ04株和DQ05株。分离到的5个病毒株(DQ01～DQ05株)的HA及TCID₅₀检测结果表明，病毒DQ03株性能最优，其对鸡胚成纤维细胞高度适应，HA效价达1：1024，TCID₅₀达10^9.38TCID₅₀/0.1ml，显著高于其他分离毒株。

本发明分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株能够应用于制备预防鹅副黏病毒病的疫苗。

本发明进一步公开了一种预防鹅副黏病毒病的疫苗组合物，包括：免疫有效量的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株和药学上可接受的佐剂。

本发明还公开了一种制备预防鹅副黏病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)培养所述鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，收集病毒液；(2)灭活病毒液；(3)离心，取病毒上清液，与佐剂混合，乳化，即得。

其中，步骤(1)所述培养是经鸡胚成纤维细胞培养或者经SPF鸡胚培养；优选为，经鸡胚成纤维细胞培养。

步骤(2)所述灭活是向病毒液中加入终浓度为0.1％甲醛溶液，37℃灭活24小时。

步骤(3)所述离心是5000r/min离心30min；所述病毒上清液与佐剂按照体积比1：1.5混合；所述佐剂优选为进口油佐剂。

本发明所述方法制备得到的鹅副黏病毒灭活疫苗，能够有效预防鹅副粘病毒。

本发明将分离的鹅副黏病毒DQ01-DQ05株分别制备油乳剂灭活疫苗；经鸡胚成纤维细胞培养，病毒液半成品的HA及TCID₅₀测定结果表明，DQ03株HA效价达1：1024，TCID₅₀达10^9.38TCID₅₀/0.1ml，高于鸡胚扩增的原始病毒液及其他分离株。动物免疫保护试验结果表明，分离的鹅副粘病毒DQ03株免疫原性良好，免疫后不同时间抗体效价均高于其他实验组，免疫后21天HI抗体效价达8.5log2；与胚毒制备的疫苗相比，具有产生抗体效价高，并且节约生产成本等优点。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株对鸡胚成纤维细胞高度适应，适合细胞培养；免疫保护试验表明，分离的鹅副粘病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株免疫原性良好，与胚毒制备的疫苗相比，具有产生抗体效价高，并且节约生产成本、产品质量稳定等优点。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“分离的”意指所指代的材料从其天然环境中取出。因此，经分离的生物材料可以不含某些或所有细胞组分，即其中天然材料自然存在的细胞的组分(例如细胞质或膜组分)。如果材料存在于细胞提取物或上清液中，那么它是经分离的。

可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。

术语“佐剂”意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质。

附图说明

图1为分离毒在鸡胚成纤维细胞中增殖；其中，A为细胞接毒前形态；B为细胞接毒产生病变。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1鹅副黏病毒的分离和鉴定

1、实验方法

1.1病毒的分离

病料来自黑龙江省大庆市郊某养殖场，无菌采集病死鹅的肝脏、脾脏等病料混合剪碎并研磨，按1∶3(v/v)加入双抗含量为2000IU/mL的灭菌PBS，置4℃冰箱作用4h，4000r/min离心5min；取上清经尿囊腔接种5枚10日龄SPF鸡胚，0.2mL/枚，置37℃孵育120h；弃去24h内死亡鸡胚，以后每天照蛋两次，将死亡鸡胚放置4℃冰箱保存4-24小时；收取48h～120h死亡鸡胚尿囊液及羊水，作为传代毒种，-20℃保存。

1.2病毒的鉴定

1.2.1血凝试验(HA)

取鸡胚病毒液在96孔微量凝集板上用生理盐水作倍比稀释至2¹²，同时设空白对照及鸡新城疫L系毒(购自中国兽医药品监察所)阳性对照，再加等体积1％鸡红细胞后于震荡器上震荡2～3min，置室温25min后观察结果。

1.2.2血凝抑制试验(HI)

取25μl鸡新城疫阳性血清、EDS₇₆阳性血清、H5和H9禽流感阳性血清在96孔微量凝集板上用生理盐水作倍比稀释至2¹²，每孔加25μl血凝价4个单位的分离毒，并设阳性对照(鸡新城疫阳性血清，每孔加25μl血凝价4个单位的鸡新城疫L系毒)，同时设阴性(阴性血清+鸡新城疫L系毒)及空白对照，再加1％鸡红细胞25μl后于震荡器震荡2～3min，置室温25min后观察结果。

1.2.3鸡胚血清病毒中和试验

分别取收集的鸡胚病毒液作10倍稀释后与新城疫病毒阳性血清等量混合，感作后，尿囊腔接种10日龄鸡胚，每组5枚胚，0.1ml/胚，同时设病毒对照组和空白对照组，观察鸡胚死亡情况。

1.2.4动物回归试验

将鸡胚病毒液肌肉注射15日龄的鹅、鸡各5羽，每羽0.5ml，同时分别设空白对照组。严格隔离饲养，每天观察试验动物发病和死亡情况。

1.2.5病毒EID₅₀测定

将分离病毒用灭菌生理盐水作10^-1～10^-9稀释，并设立空白对照组，每个稀释度接种5枚10日龄非免疫鸡胚，弃24h死亡胚，于接种后120h4℃过夜冻死鸡胚，收获鸡胚尿囊液，测定其HA效价，并参考Reed-Muench方法计算出病毒EID₅₀。

1.2.6脑内致病指数(ICPI)的测定

按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定的方法测定ICPI。取1日龄SPF雏鸡10只，各脑内注射10^-1稀释的新鲜毒液50μL(接种针头直径0.45mm，长5mm)；另取2只1日龄SPF雏鸡以同样方法注射生理盐水50μL。接种后，每天在相应接种的时间观察并记录雏鸡的状态，分正常(活动灵活，行动无共济失调现象)、发病(包括麻痹、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡)和死亡，观察8d，计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值(正常为0、发病为1、死亡为2)累计总分数。ICPI为累计总分除以正常、发病和死亡鸡的累计总数的平均值。

1.2.7鸡胚平均致死时间(MDT)的测定

将病毒用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，自10^-4～10^-10分别接种9～10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，0.1ml/枚，剩余病毒液4℃保存，8h后再将每个稀释度接种另外5枚鸡胚。接种鸡胚于37℃孵化7天，每天早晚各观察1次，记录使所有鸡胚死亡的最高稀释度致死鸡胚的平均时间。OEI推荐的判定标准是MDT≤60h为强毒型；60～90h为中等毒力型；90h以上为低毒力。

1.3分离毒在鸡胚成纤维细胞中增殖

(1)在无菌条件下取9日龄鸡胚，取出胚胎置于灭菌平皿中，除去头、爪、翅、内脏，用Hanks液漂洗3次，去除血污，并剪成1～2mm³大小的块，加入Hank’s液充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加Hank’s液，如此反复冲洗3遍后，吸弃上清液；于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25％胰酶溶液，振荡混匀后置于37℃水浴中感作5min，每隔1min轻轻摇动一次。

(2)消化完毕后立即小心吸弃上层胰酶溶液，沿瓶壁加入5～6mLDMEM轻洗2次；之后加入20mL 1×DMEM营养液，用大口吸管吹打数十次，并静置几分钟，待组织块下沉，吸取上层液体，用6层纱布过滤；沉淀组织块中再加20mL的1×DMEM营养液，如此反复进行3遍。按每个鸡胚80mL的量补加DMEM营养液。

(3)吸取细胞液用计数板进行细胞计数，调整细胞浓度为2×10⁶个/mL，以每孔4mL的量加入到6孔培养板中，将其置入CO₂培养箱中，37℃培养24h，将6孔细胞培养板中已长成单层的鸡胚成纤维原代细胞中的营养液吸弃，用Hanks液反复冲洗单层细胞3次；之后，用不含血清的1×DMEM培养液将分离病毒尿囊液作1×10⁴倍稀释，接种于单层细胞，每孔接种量为500μL，置37℃感作lh，其间每隔20min轻轻晃动细胞培养板一次，使病毒与细胞充分接触、吸附；吸附完毕后吸出病毒液，每孔补加4mL含新生牛血清为2％的1×DMEM营养液，将其置CO₂培养箱中37℃培养；同时，设空白对照孔；每日观察记录CPE情况，当细胞病变达70％时，经3次冻融后收毒，分装于玻璃瓶内，留样检测HA；按照上述方法，将分离到的鹅副粘病毒在鸡胚成纤维细胞上连续传8-10代，直至分离毒在鸡胚成纤维细胞上增殖良好。

1.4分离毒蚀斑纯化

(1)按照鸡胚成纤维原代细胞培养所叙述的方法，制备鸡胚成纤维原代细胞并接毒，接毒后置37℃感作lh，其间每隔20min轻轻晃动6孔细胞培养板一次，使病毒与细胞充分接触、吸附；吸附完毕后，吸出病毒液，铺一层不含中性红的营养琼脂糖，厚度约2mm，待琼脂糖凝固后倒置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养；

(2)有细胞病变出现时滴加100μL含量为1/10000的中性红溶液，倒置于37℃、5％CO₂培养箱中继续避光培养并观察出斑情况。当细胞培养板上出现清晰可见的蚀斑时，即可进行挑斑。选择蚀斑间间距明显的培养孔，从中挑取具有代表性的优势蚀斑，用200μL去尖吸头吸取选定的蚀斑后连同琼脂糖一起放入500μL不含血清的l×DMEM培养液中。将含有蚀斑及琼脂糖的DMEM培养液反复冻融三次，使病毒充分释放；之后再按上述方法将其做连续的10倍稀释(一般为10¹～10⁴)后接种鸡胚成纤维原代单层细胞，按上述方法挑斑。

2、实验结果

2.1病毒分离结果

SPF鸡胚尿囊腔接种，鸡胚在48～120h死亡；致死胚体充血，尿囊膜水肿出血。

2.2血凝、血凝抑制试验检测结果

尿囊液的HA效价为1∶128，随着代次增加，HA效价增大，最高达1∶512。

分离病毒能被ND阳性血清所抑制，HI效为2⁸，HI试验呈阳性；不能被EDS₇₆阳性血清、H5和H9禽流感阳性血清所抑制，HI试验呈阴性。

2.3病毒中和试验结果

试验组鸡胚10d后全部存活，而对照组鸡胚在48～120h全部死亡。

2.4动物回归试验结果

接种病毒分离物的鹅、鸡均于第2d开始发病。病禽精神萎顿，食欲与饮水减少直至废绝。病程2～3d，至接种后第6d全部死亡。对照组均未受影响。

病死鹅的临诊症状和剖检病变与自然感染相似，接种后5d左右死亡，剖检肠道可见散在性淡黄色痂块，易剥离，剥离后见溃疡面，胰腺有灰白色坏死灶，腺胃及肌胃粘膜充血、出血。病死鸡的临诊症状和剖检病变与鸡新城疫非常相似。

2.5EID₅₀测定结果

用Reed和Muench法计算毒株EID₅₀，得出分离毒株EID₅₀＝10^8.17/0.1ml。

2.6脑内致病指数(ICPI)及(MDT)的测定结果

ICPI＝13/80＝0.16；鸡胚平均致死时间(MDT)为114h，确定分离的毒株为低毒力病毒。

2.7分离毒在鸡胚成纤维细胞中增殖结果

将分离株接种在生长良好的CEF上，36h后开始出现典型的细胞病变，病变初期表现为细胞聚缩，之后，合胞体数量逐渐增多、变大；60h时75％CEF出现细胞病变，细胞逐渐脱落，细胞之间的空白区逐渐增大，残留的细胞呈拉网状结构(图1)；当细胞病变达70％时，收集细胞连同细胞液反复冻融三次，测定细胞液的HA效价为1∶512。结果表明，分离株具有CEF细胞适应株的特性。

2.8分离毒蚀斑纯化结果

分离株滴加中性红5～8h后形成无色、透明、清亮的圆形蚀斑；镜检发现蚀斑中心为圆缩成葡聚团状的不着色的死细胞，周围被吞噬大量中性红颗粒的正常细胞所包围。挑选中等大小的5个蚀斑进行传代纯化，将分离到的5个病毒株(DQ01-DQ05)蚀斑克隆作5×10³倍稀释，接种鸡胚成纤维细胞后置37℃孵育72h；当细胞病变达70％时，经3次冻融后收毒，并进行杂菌检验。同时，测定其血凝价(HA)及TCID₅₀。

分离到的5个病毒株DQ01～DQ05株HA及TCID₅₀检测结果见表1。

表1 DQ01～DQ05株HA及TCID₅₀检测结果

检测结果表明，分离到的病毒株DQ03株性能最优，对鸡胚成纤维细胞高度适应，HA及TCID₅₀最高。

本发明将分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号是：CGMCC No.9901。

实施例2动物免疫保护试验

1、实验方法

1.1油乳剂灭活疫苗的制备

1.1.1病毒液的制备

将实施例1分离的鹅副黏病毒DQ01株、DQ02株、DQ03株、DQ04株和DQ05株分别经鸡胚成纤维细胞转瓶培养，收集细胞培养病毒液，测定HA及TCID₅₀；另外，将实施例1分离的原始毒株接种SPF鸡胚(收集尿囊液)，测定其HA和EID₅₀。

1.1.2病毒液的灭活及灭活检验

1.1.2.1病毒液的灭活

将检验合格的病毒液加入终浓度为0.1％甲醛溶液进行灭活，37℃，灭活24小时。

1.1.2.2灭活检验

(1)细胞病毒液的灭活检验

取灭活后的细胞病毒液作1：100倍稀释，按5％接毒量接种已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞培养瓶3个，观察72小时均应不出现细胞病变，并混合后盲传1代，观察72小时均应不出现细胞病变，判为灭活完全。

(2)鸡胚病毒液的灭活检验

取10～11日龄SPF鸡胚6枚，每枚尿囊腔接种灭活的鹅副黏病毒液0.2ml，每日照胚2次，观察至120小时，全部取出，鸡胚非特异性死亡不应超过1枚。分别测定每枚鸡胚液的红细胞凝集价，并盲传一代，红细胞凝集价均应不高于1:4。

1.1.3灭活疫苗的制备

取检验合格后的鸡胚成纤维细胞病毒液(DQ01-DQ05)和鸡胚扩增的病毒液，5000r/min离心30min，取上清病毒液与进口油佐剂按体积比(1：1.5)混合，乳化制成疫苗，用于动物免疫。

1.2动物免疫保护试验

取经鸡胚成纤维细胞和鸡胚增殖病毒液制备成油乳剂灭活疫苗，各组颈部皮下注射1ml疫苗，观察免疫后抗体产生情况。

实验动物分7组：

1组，雏鹅10只，30日龄，免疫鸡胚制造灭活疫苗(原始毒株)1ml；

2组，雏鹅10只，30日龄，免疫鸡胚成纤维细胞制造灭活疫苗(DQ01株)1ml；

3组，雏鹅10只，30日龄，免疫鸡胚成纤维细胞制造灭活疫苗(DQ02株)1ml；

4组，雏鹅10只，30日龄，免疫鸡胚成纤维细胞制造灭活疫苗(DQ03株)1ml；

5组，雏鹅10只，30日龄，免疫鸡胚成纤维细胞制造灭活疫苗(DQ04株)1ml；

6组，雏鹅10只，30日龄，免疫鸡胚成纤维细胞制造灭活疫苗(DQ05株)1ml；

7组，雏鹅10只，30日龄，健康对照组。

2、实验结果

2.1病毒液灭活检验结果

分别测定灭活后的6组病毒液、鸡胚液的红细胞凝集价均为阴性，并盲传一代，红细胞凝集价均为阴性。

2.2病毒液的半成品检验结果

病毒液的半成品检验结果见表2、3和表4。结果表明，实施例1分离的鹅副黏病毒DQ03株经鸡胚成纤维细胞培养，病毒液的HA达1：1024，TCID₅₀达10^9.38TCID₅₀/0.1ml，显著高于其他分离株及原始毒株。

表2两种生产方法半成品红细胞凝集价比较表

表3鸡胚病毒液半成品EID₅₀比较表(单位：10^XEID₅₀/0.1ml)

表4细胞病毒液半成品TCID₅₀比较表(单位：10^XTCID₅₀/0.1ml)

2.2免疫保护试验结果

所有试验组至免疫后14、21、28天进行采血，用HI方法进行抗体检测，结果见表5。

表5免疫抗体检测结果(㏒2)

鸡胚病毒液与细胞病毒液成本比较：鸡胚病毒液生产1ml需要1.30元，而细胞病毒液生产1ml需要0.65元。细胞毒与胚毒制备的疫苗相比，更加节约生产成本。

免疫保护试验结果表明，细胞毒与胚毒制备的疫苗相比，分离的鹅副粘病毒DQ03株免疫原性良好，免疫后不同时间产生的抗体效价均高于其他实验组，免疫后21天HI抗体效价达8.5log2。并且，DQ03株对鸡胚成纤维细胞高度适应，适合细胞培养，能够制成灭活疫苗用于预防鹅副粘病毒，降低生产成本，产品质量稳定。

Claims (10)

1.一株分离的鹅副黏病毒(Goose paramyxovirus)鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No.9901。

2.权利要求1所述的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株在制备预防鹅副黏病毒病的疫苗中的用途。

3.一种预防鹅副黏病毒病的疫苗组合物，其特征在于，包括：免疫有效量的权利要求1所述鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株和药学上可接受的佐剂。

4.一种制备预防鹅副黏病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养权利要求1所述鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，收集病毒液；(2)灭活病毒液；(3)离心，取病毒上清液，与佐剂混合，乳化，即得。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述培养是经鸡胚成纤维细胞培养或者经SPF鸡胚培养。

6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述培养是经鸡胚成纤维细胞培养。

7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述灭活是向病毒液中加入终浓度为0.1％甲醛溶液，37℃灭活24小时。

8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述离心是5 000r/min离心30min。

9.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述病毒上清液与佐剂按照体积比1：1.5混合；所述佐剂为进口油佐剂。

10.由权利要求4至9任何一项所述方法制备得到的鹅副黏病毒灭活疫苗。