CN101104065B - 一种预防呼吸道病毒感染性疾病的中药制剂和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预防呼吸道病毒感染疾病的中药制剂,它是由苍术、草果、荆芥、香薷、薄荷、藿香、丁香、冰片等原药材按一定重量配比制成;其制法为:将丁香加水,用水蒸气蒸馏提取挥发油;称取苍术、草果、荆芥、香薷、薄荷、藿香6味药加水,用水蒸气蒸馏提取挥发油;然后将上述二步骤的挥发油合并后,加入冰片,溶入挥发油中,得总挥发油。最后以每60g挥发油加入乙醇580ml、甘油100g、芳樟醇1ml,并加水至1000ml的比例加入辅料,充分搅拌使原料药与辅料均匀分散在溶剂中,然后装入塑料喷雾瓶中即制成喷雾剂,它具有良好的抗病毒和抗菌作用,可提高抗体的细胞免疫和体液免疫功能。
Description
一、技术领域
本发明涉及中药技术领域,具体地说是涉及以中草药为原料而制备的一种预防呼吸道病毒感染性疾病的药物。
二、背景技术
呼吸道感染性疾病(其中包括多种急性传染病)历来是临床的常见病、多发病,约占内科疾病的1/4,严重威胁着人们的健康甚至生命。迄今为止,因呼吸道疾病死亡的人数仍然高居死亡原因的首位。呼吸道感染的致病微生物涉及到细菌、病毒、支原体、衣原体等多种类型,特别是病毒感染在防治方面尤为棘手,其中有些至今仍未找到特效疗法或有效疗法,加之多数病种起病急骤、传播迅速、病理损害严重、病情复杂多样,一旦发病往往造成很大危害。然而,长期以来,人们对于呼吸道病毒感染性疾病还是处于“重治轻防”的状态,以至当疫情发生时只能疲于应付,处境被动。因此,如何把好预防关,最有效的保护人类的生命和健康,是当前医学研究的热点之一。
呼吸道病毒具有种类多、变异强、易传染等特点,为人类的防治带来很大的困难。西医主要的应对之法是研制相应的疫苗,但研制的速度及针对性均不能满足实际需要。尽管从增强免疫功能的角度出发,有免疫球蛋白、干扰素等免疫增强剂可以选择,但既缺乏直接抗病毒的针对性又有较高的价格,而且在无特殊需要时西医本身也不主张盲目滥用,以防止该类药物对人体正常免疫的不良干扰,因此不可能在一般健康人群中作为预防用药。中医学自古以来就十分强调对疾病的预防,呼吸道病毒感染性疾病大多属于中医温病范畴,千百年来中医学家对温病的防治作了许多研究,并在长期的医疗实践中积累了不少经验。古代中医文献中记载了大量防治温病的方法,并先后使用了药物烧烟或制成汤液喷洒进行空气消毒、以药物涂抹局部、嗅鼻或佩带祛邪香囊、口服预防药剂等方法。在祛除病毒、扶助正气等方面均有很好的效果。但现代临床尚缺乏实用、有效的预防制剂,尤其是外用以喷雾形式预防的新制剂。因而在很大程度上限制了中药在呼吸道病毒感染性疾病预防中发挥出重要的作用。
三、发明内容
1、发明目的
本发明的目的在于提供一种效果显著、使用方便的预防呼吸道病毒感染性疾病的药物。
2、技术方案
一种预防呼吸道病毒感染性疾病的中药制剂,由下列重量配比的原料药所制成:
苍术6~15g、草果8~15g、荆芥8~15g、香薷8~15g、薄荷8~15g、藿香4~10g、丁香2~8g、冰片0.05~0.20g。
组方意义:方中苍术性味辛香苦温,具有除恶气、辟秽浊,健脾燥湿之功,用为君药;草果辛得浓烈,性温而燥,能燥湿辟秽,透散浊邪,与苍术共为君药。
薄荷味辛性凉,善于疏散风热,且质轻气香,兼有宣散之能,为温病初起之常用药,用为臣药;荆芥味辛微苦性微温,能祛风解表,疏散邪热,微温而不燥,;藿香、丁香芳香理气,透达秽浊之邪;香薷辛温透散,宣肺和中,与薄荷共为臣药。冰片味辛苦而凉,芳香走窜,散热止痛,用为使药。
本方遵循预防温病须“芳香辟秽,解毒散邪”的古训,用药以辛香轻透、辟秽化浊为特点,其气轻味薄,寒温并用,祛邪之力特强。全方组合严谨,配伍精当,具有祛除温邪预防温病的功效。
称取上述重量的丁香加10倍量水,水蒸气蒸馏提取挥发油,以油水分离器分离得丁香挥发油;再按如上重量将苍术、草果、荆芥、香薷、薄荷、藿香6味加15倍量水,用水蒸气蒸馏提取挥发油,油水分离器分离得挥发油。将所得挥发油合并,加入冰片溶入挥发油,即得总挥发油。以每60g挥发油加入乙醇580ml、甘油100g、芳樟醇1ml,并加水至1000ml的比例加入辅料,采用搅拌混匀工艺将原料药及辅料均匀分散至溶剂中,然后装入塑料喷雾瓶即成。
本发明的中药喷雾制剂的制备,主要用于预防呼吸道病毒感染性疾病。
该药物药理试验结果表明,苍果喷雾剂与同类西药相比,具有良好的抗病毒、抗菌及调节免疫功能的作用,能减轻因流感病毒感染引起的的肺部病变,降低肺指数。由于苍果喷雾剂在组方上具有气轻味薄、寒温并用、祛邪之力特强的特点,因此对呼吸道多种病毒感染性疾病均有良好的预防效果。
3、有益效果
目前临床上预防呼吸道感染性疾病可选择的中成药种类不多,尤其是以喷雾剂进行预防的方法尤为少见。本发明的中药预防制剂与现有中成药相比,具有以下优点:
(1)苍果喷雾剂选用古代著名辟温方为基础,选择多味芳香祛邪、辟温透散的药物,在组方上充分体现了寒温并用,祛邪扶正的宗旨。其所用药物既有多年临床运用防治温病的实际效验,又有现代药理实验抗生、提高免疫功能的依据,具有融传统中医预防温病的理论与现代医学针对病原治疗为一体的特点。
(2)以喷雾剂喷洒口腔的方式达到预防目的的方式新颖、简便,可以填补目前这一研究领域的空白。本发明采用了先进的技术手段提取药物的挥发成分,使药物的作用得到充分发挥,效果将远远高于传统剂型。而且,喷雾剂使用方便,起效迅速(粘膜吸收快),无任何毒副作用,便于推广运用。
(3)苍果喷雾剂具有良好的抗病毒作用和抗菌作用,可以提高机体的细胞免疫和体液免疫功能。
四、具体实施方式
实施例1、苍果喷雾剂的组成
苍术8g、草果10g、荆芥10g、香薷10g、薄荷10g、藿香6g、丁香2g、冰片0.10g。
实施例2、苍果喷雾剂的制备
称取上述重量的丁香加10倍量水,水蒸气蒸馏提取挥发油,以油水分离器分离得丁香挥发油;再按如上重量将苍术、草果、荆芥、香薷、薄荷、藿香6味加15倍量水,用水蒸气蒸馏提取挥发油,油水分离器分离得挥发油。将所得挥发油合并,加入冰片溶入挥发油,即得总挥发油。以每60g挥发油加入乙醇580ml、甘油100g、芳樟醇1ml,并加水至1000ml的比例加入辅料,采用搅拌混匀工艺将原料药及辅料均匀分散至溶剂中,然后装入塑料喷雾瓶即成。
实施例3、苍果喷雾剂的抗病毒作用
(一)苍果喷雾剂体外抗病毒试验
1实验材料
1.1药物:苍果喷雾剂油液由南京中医药大学新药研发中心提供。
1.2病毒:甲型流感病毒FM1株,血凝效价1∶1280;副流感病毒仙台株,血凝效价1∶640;鼻病毒N36株,为成人普通感冒分离鉴定株,均在-80℃低温冰箱保存备用。
1.3细胞:人胚胎皮肤肌肉纤维母细胞,第4-6代,为本室自建株。
1.4鸡胚:9日龄。
1.5豚血球:采集新鲜豚血,配制成0.5%血球悬液用作血凝测定。
2实验方法
2.1所用病毒在实验前从低温冰箱取出,传代,病毒效价滴定后取100TCID50为感染量。流感和副流感病毒采用鸡胚体内外试验,鼻病毒采用细胞培养体外试验。
2.2药物体外对细胞毒性试验。预试验结果,生药以1.7mg/ml为无毒性,每只鸡胚0.2ml;细胞对药物以1mg、2mg为无毒界线。
2.3苍果喷雾剂对流感病毒、副流感病毒的影响:将实验分为3组,每组分别处理后接种2只鸡胚,每种病毒重复2次。
实验1组,将药物预先接种鸡胚,24小时后再接种病毒;
实验2组,将病毒与药物按比例稀释后4℃过夜,次日晨接种鸡胚尿囊腔;
实验3组,将药物与病毒同时接种鸡胚尿囊腔。
鸡胚尿囊接种病毒后,35℃培养72小时,取出放4℃过夜。第2天,吸取尿囊液,测血凝效价。
同时设对照组:病毒对照组,只加病毒,不加药物;药物对照组,只加药物,不加病毒;盐水对照组,盐水接种鸡胚。
2.4苍果喷雾剂抗鼻病毒的抑毒效果:
2.4.1药物对人胚胎皮肤肌肉纤维母细胞的毒性试验,在96孔板中进行。将药物稀释为100mg/ml、25mg/ml、6.25mg/ml、1.51mg/ml、0.45mg/ml、0.11mg/ml,观察其毒性。观察到药物浓度为100mg/ml、25mg/ml时均有++++强毒性作用;在6.25mg/ml时有+到++毒性,因此实验选用2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml三种浓度。
2.4.2实验分为7组,每组设3个复孔,重复2次
第1组:药物不同浓度先处理细胞过夜,24小时后用鼻病毒攻击,攻击量为10-6(100 TCID50);
第2组:鼻病毒加不同浓度药物4℃过夜,次日接种细胞;
第3组:病毒和药物同时加入细胞;
第4组:病毒对照:只加病毒,不加药物;
第5组:药物对照:只加药物,不加病毒;
第6组:病毒唑作为抗鼻病毒有效药物对照;
第7组:细胞对照。
3实验结果
3.1苍果喷雾剂抗甲型流感病毒FM1株、副流感病毒仙台株的作用:本实验为重复2次的结果,见表1。
表1苍果喷雾剂在鸡胚体内抑毒效应(血凝法)
病毒 | 药物先处理鸡胚,次日加病毒 | 药物和病毒加入后放4℃过夜,次日接种鸡胚 | 病毒和药物同时接种鸡胚 | 病毒对照 | 药物对照 | 盐水对照 |
甲型流感病毒FM1株 | 1∶256 | - | 1∶256 | 1∶1024 | - | - |
副流感病毒仙台株 | 1∶1024 | - | - | >1∶2048 | - | - |
以上结果表明:①苍果喷雾剂具有抗流感病毒FM1株的作用。其中,以药物加病毒放4℃过夜,次日接种鸡胚,血凝效价为阴性,效果最好(高度敏感)。药物先处理鸡胚,次日加病毒和药物同时加入,则不能完全抑制病毒增殖,但血凝效价也要降低4倍,因此也有效(中度敏感)。②苍果喷雾剂具有抗副流感病毒仙台株的作用。其效果也以药物加病毒放4℃过夜,次日接种鸡胚和药物同时加入为最好,血凝效价均为阴性(高度敏感)。药物先处理鸡胚,次日加病毒血凝效价和对照组相比只相差1倍,判断为不敏感。
3.2苍果喷雾剂对鼻病毒的抑毒效果:实验结果见表2。
表2苍果喷雾剂抗鼻病毒的抑毒作用
药物浓度 | 药物先处理细胞,次日加病毒 | 药物和病毒加入后放4℃过夜 | 病毒和药物同时加入细胞 |
2mg/ml | +/++ | - | - |
1mg/ml | + | - | - |
0.5mg/ml | ++ | - | + |
病毒唑 | - | - | - |
药物浓度 | 药物先处理细胞,次日加病毒 | 药物和病毒加入后放4℃过夜 | 病毒和药物同时加入细胞 |
药物对照 | - | - | - |
病毒对照 | +++ | +++ | +++ |
细胞对照 | - | - | - |
以上结果说明苍果喷雾剂具有抗鼻病毒的作用。其中,药物加病毒4℃过夜和药物与病毒同时加入均为高度敏感,效果和阳性对照病毒唑相当。药物先处理效果较前两种差,但与病毒对照组比较也有轻度保护作用。
4结论
苍果喷雾剂对甲型流感病毒FM1株和副流感病毒仙台株,在鸡胚体内具有明显抑制病毒增殖的效应。对引起普通感冒的鼻病毒,在体外人胚皮肤肌肉纤维细胞上,此药从0.5~2mg/ml能保护细胞免受病毒的攻击,具有抑制病毒致细胞病变的作用。
(二)苍果喷雾剂对小鼠感染流感病毒后肺指数的影响
1实验材料
1.1动物ICR小鼠,雌雄各半,18-22g,普通级,购自南京中医药大学实验动物中心。许可证号:SCXK(苏)2002-0031
1.2药物
1.2.1苍果喷雾剂 由南京中医药大学新药研发中心提供,储藏环境符合要求,药品质量良好。苍果药液稀释方法:取0.6苍果挥发油加6环糊精和60蒸馏水配成混悬液,取0.6加植物油60混匀配成药液,再取药液06加吐温1研磨,加蒸馏水至60,配成乳浊液。再将乳浊液按成人用量的0.0026倍稀释给小鼠用。
1.2.2病毒唑 江西汇仁药业有限公司提供,生产批号:0503008。
1.2.3乙醚,南京第一化学试剂厂生产,批号041001。
1.2.4灭菌生理盐水,蒸馏水。
1.3流感病毒流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1,南京中医药大学温病教研室提供,-80℃超低温保存,病毒血凝效价为1∶1024,LD50为10-4.86。
1.4实验器械 电子秤,灌胃针,微量移液器。
2实验方法
2.1动物分组 按性别将小鼠随机平均分成7组,分别为正常对照组,模型对照组,病毒唑组,苍果大剂量、中剂量、小剂量组以及苍果喷雾组。每组雌雄各5只。各组小鼠在相同条件下自由饮水、摄食,保持自然光照。由南京中医药大学实验动物中心提供全价颗粒饲料,垫料。
2.2造模方法 除了正常对照组外,其余各组小鼠均在乙醚麻醉下以0.75×10-3LP浓度流感病毒FM1鼠肺适应株滴鼻,每只50ul,放入标记好的鼠盒内。
2.3给药及处理 各组小鼠从病毒感染前两天开始给药,每天灌胃1次。病毒唑组,苍果大剂量、中剂量、小剂量组每组给药0.3ml,其中病毒唑组,苍果中剂量组给予成人等效量,大剂量组、小剂量组分别为成人等效量的3倍、1/3倍浓度,苍果喷雾组每次经口吸入给药,每次2喷,每日3次,正常对照组、模型对照组给等容积的生理盐水,连续给药7天,直到感染后5天。观察小鼠一般状态,末次给药24h后称体重,断颈处死,观察肺部病变,取出肺脏,称重,供肺指数的测定。
2.4肺指数的测定 取出全肺,去除周围组织,生理盐水清洗,用滤纸将水分吸干,称肺重量,计算肺指数和肺指数抑制率。
肺指数=小鼠肺重(g)/小鼠体重(g)×100%。
肺指数抑制率=(对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/对照组平均肺指数×100%
2.5数据处理 成组设计的多个样本均数比较采用方差齐性检验,单因素方差分析;多个样本率比较采用χ2检验,多个样本率之间比较采用χ2分割法。全部数据采用SPSS(11.0)处理,P<0.05为有统计学意义。
3结果
3.1一般情况观察正常组小鼠皮毛光泽,尾静脉淡红,正常觅食,食量无明显变化,体重持续增长。模型组小鼠耸毛现象较为明显,失去光泽,尾巴及四肢发凉,尾静脉呈黑紫色,聚成一堆,较其它各组小鼠活动减少,食量减少,逐渐消瘦。药物治疗组小鼠较模型组小鼠上述症状轻,并且没有明显差别。
3.2各组小鼠肺指数比较(见表1)
表1各组小鼠肺指数比较(x±s)
与模型组比较:*p<0.05;**p<0.01
各组肺指数之间比较显示:模型对照组的肺指数较正常对照组和病毒唑组的肺指数有明显升高(P<0.01);苍果中剂量组、苍果小剂量组以及苍果喷雾组的肺指数较模型对照组有明显降低,有显著性差异(P<0.05);苍果大剂量组与模型对照组比较无显著性差异(P>0.05)。
4结论
苍果喷雾剂对流感病毒引起的肺部炎症有一定抑制作用,能减轻肺部病变,降低肺指数。
实施例4、苍果喷雾剂的抑菌试验
1材料
1.1肉汤、琼脂培养基。
1.2羊血
1.3小牛血清
1.4菌种:金黄色葡萄球菌,肺炎球菌,乙型链球菌。均为标准株。
1.5受试药物:苍果喷雾剂,由南京中医药大学新药研发中心提供。
2方法与结果
2.1肉汤连续稀释法
将受试药用无菌肉汤培养基稀释成1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32,1∶64,1∶128。每一稀释度分装6管,每管1ml。将培养6h的金黄色葡萄球菌,肺炎球菌,乙型链球菌液分别用无菌肉汤稀释成1/1000浓度的菌液,分别接种于不同稀释度的药液中,每管0.1ml,同时分别接种肉汤管作细菌对照,置37℃培养24h后判定结果。凡(一)者再传代肉汤及琼脂平板各1支,37℃培养24h后判定结果。
结果判定:若对照管细菌生长良好,药液管发生混浊,即表示细菌生长,受试药物无抑菌作用,如药液管清亮则表示细菌生长受到抑制,其能抑制细菌生长的最大稀释度的药液,即为该药物的最小抑菌浓度。将清亮的药液肉汤各管转种肉汤琼脂平板,培养观察,仍无细菌生长的最小药物浓度即为该药物的杀菌浓度。
本试验结果:
2.2扩散试验(打孔法)
用无菌吸管吸取供试菌金黄色葡萄球菌,肺炎球菌,乙型链球菌液的6-8h肉汤培养物的1/10000稀释度菌液0.1ml分别于肉汤琼脂平板和血琼脂平板,取L形玻棒涂布均匀,用无菌金属打孔器打成6mm直径的小孔4个,除去孔内琼脂,吸取受试药液约0.1ml加在孔内,盖上皿盖,置37℃培养24h后观察结果。若药物无抗菌作用,则不形成抑菌圈,若有抗菌作用,依其抗菌效力的强弱形成不同直径的抑菌圈。
本试验结果:受试药物对三种细菌均形成抑菌圈,其抑菌圈大小:金黄色葡萄球菌>乙型链球菌>肺炎球菌。
2.3挥发性物质的熏蒸试验
各吸取3种菌液(1/10000稀释度)0.1ml分别于肉汤琼脂、血琼脂平板上,用L形玻棒涂布均匀,然后在皿盖中心放置一个1cm直径的圆柱体,并用熔化的石蜡焊住圆柱体底部,然后在圆柱体中注满药液,并各套上已经接种的三个细菌的平板,用塑料薄膜包好(避免挥发性物质相互影响),置37℃培养24h后观察结果。若药物的挥发性物质具有杀菌作用,则受试药物熏蒸那部分琼脂平板上无菌落形成。根据无菌区域环直径的大小,可判断出药物抗菌力的强弱。
本试验结果:受试药物熏蒸部分的琼脂平板上,3种细菌均无菌落形成。
3结论
苍果喷雾剂对金黄色葡萄球菌,肺炎球菌,乙型链球菌液均有抑菌和杀菌作用。
实施例5、苍果喷雾剂对机体免疫免疫功能的影响
(一)苍果喷雾剂对流感病毒感染小鼠肺中NK细胞的影响
1材料与方法
1.1实验材料
实验动物ICR小鼠,雌雄各半,18-22g,清洁级,购自南京中医药大学实验动物中心。许可证号:SCXK(苏)2002-0031。
病毒毒种流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1,南京中医药大学温病研究所保留毒种,血凝效价为1∶1024,LD50为10-4.86,-80℃超低温保存。
药物及试剂苍果喷雾剂,由南京中医药大学新药研发中心提供。病毒唑,购自江西汇仁药业有限公司,生产批号:0503008。RAT anti-MOUSE NK Cells,HAMSTER anti-MOUSE CD3,购自联科生物科技有限公司,美国加利福尼亚理工学院实验室(Caltag Laboratories)提供。
主要仪器流式细胞仪,美国BD公司制造,型号为FACS·calibur。
1.2实验方法
将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、病毒唑组及苍果喷雾剂i组、ii组。各组小鼠分别给药,病毒唑组以0.0585g/kg/d灌胃给药;苍果喷雾剂口腔喷雾给药,其中i组3次/日,2喷/次,ii组2次/日,2喷/次;模型对照组灌以生理盐水。给药第3天,以乙醚轻度麻醉小鼠后,各感染组以15LD50流感病毒FM1株病毒液滴鼻,50ul/只。正常对照组同法滴入等量生理盐水。滴鼻感染后第5天,采血后处死小鼠,进行相关检测
NK细胞测定:摘眼球采血,以肝素抗凝。取全血样本100ul,分别加入CD3 +、NK抗体各0.5ug,室温下静置反应15min。然后加入溶血素500ul,充分混匀,室温静置反应10min后以1300转/分离心5min,弃除上清液。沉淀用PBS2ml洗涤,1300转/分离心5min。沉淀再加PBS 0.4ml混匀,上流式细胞仪检测,用CELLQuest软件分析。
检测结果以X±s表示,采用SPSS统计分析软件进行统计学处理。
2结果
实验结果表明,流感病毒感染后小鼠血中的NK细胞含量明显下降,而苍果喷雾剂2个剂量组均对其有不同程度的抑制作用,差异有显著性(P<0.05,P<0.01)。见表4。
表4苍果喷雾剂对流感病毒感染小鼠NK细胞的影响(X±s)
3结论
苍果喷雾剂对流感病毒感染引起的NK细胞下降有明显抑制作用。
(二)苍果喷雾剂对流感病毒感染小鼠肺中TNF-α的影响
1材料与方法
1.1实验材料
实验动物ICR小鼠,雌雄各半,18-22g,清洁级,购自南京中医药大学实验动物中心。许可证号:SCXK(苏)2002-0031。
病毒毒种流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1,南京中医药大学温病研究所保留毒种,血凝效价为1∶1024,LD50为10-4.86,-80℃超低温保存。
药物及试剂苍果喷雾剂,由南京中医药大学新药研发中心提供。病毒唑购自江西汇仁药业有限公司,生产批号:0503008。TNF-α,由南京建成生物试剂有限公司提供。
1.2实验方法
将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、病毒唑组及苍果喷雾剂组。各组小鼠分别给药,病毒唑组以0.0585g/kg/d灌胃给药;苍果喷雾剂口腔喷雾给药,2次/日,2喷/次;模型对照组灌以生理盐水。给药第3天,以乙醚轻度麻醉小鼠后,各感染组以15LD50流感病毒FM1株病毒液滴鼻,50ul/只。正常对照组同法滴入等量生理盐水。滴鼻感染后第5天,采血后处死小鼠,进行相关检测。
TNF-α测定:取出小鼠肺脏,在低温条件下,按常规方法制成肺组织匀浆(肺重(g)/生理盐水(ml)=1/9),4℃2500r·min-1离心30min后取上清,采用双抗体夹心ABC ELISA法检测肺中TNF-α的含量。
检测结果以X±s表示,采用SPSS统计分析软件进行统计学处理。
2结果
实验结果显示,流感病毒感染后,模型组小鼠肺匀浆中TNF-α含量明显升高,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)。而苍果喷雾组却能有效抑制TNF-α含量的升高,与模型组差异显著(P<0.01)。见表1。
表1苍果喷雾剂对流感病毒感染小鼠肺匀浆TNF-α含量的影响(X±s)
与模型对照组比较:*P<0.05;**P<0.01
3结论
苍果喷雾剂能明显降低因流感病毒感染所致的肿瘤坏死因子含量的增高。
(三)苍果喷雾剂对流感病毒感染小鼠肺中γ-IFN的影响
1材料与方法
1.1实验材料
实验动物ICR小鼠,雌雄各半,18-22g,清洁级,购自南京中医药大学实验动物中心。许可证号:SCXK(苏)2002-0031。
病毒毒种 流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1,南京中医药大学温病研究所保留毒种,血凝效价为1∶1024,LD50为10-4.86,-80℃超低温保存。
药物及试剂 苍果喷雾剂,由南京中医药大学新药研发中心提供。病毒唑购自江西汇仁药业有限公司,生产批号:0503008。γ-IFN测定试剂盒,由南京建成生物试剂有限公司提供。
1.2实验方法
将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、病毒唑组及苍果喷雾剂组。各组小鼠分别给药,病毒唑组以0.0585g/kg/d灌胃给药;苍果喷雾剂口腔喷雾给药,2次/日,2喷/次;模型对照组灌以生理盐水。给药第3天,以乙醚轻度麻醉小鼠后,各感染组以15LD50流感病毒FM1株病毒液滴鼻,50ul/只。正常对照组同法滴入等量生理盐水。滴鼻感染后第5天,采血后处死小鼠,进行相关检测
1.2.1γ-IFN测定:取出小鼠肺脏,在低温条件下,按常规方法制成肺组织匀浆(肺重(g)/生理盐水(ml)=1/9),4℃2500r·min-1离心30min后取上清,采用双抗体夹心ABC ELISA法检测肺中γ-IFN的含量。
检测结果以X±s表示,采用SPSS统计分析软件进行统计学处理。
2结果
实验结果显示,流感病毒感染后,模型组小鼠肺匀浆中γ-IFN含量明显升高,与正常对照组相比有显著性差异(P<0.01)。而苍果喷雾剂组可降低其含量,与模型组差异显著(P<0.01)。见表1。
表1苍果喷雾剂流感病毒感染小鼠肺匀浆γ-IFN含量的影响(X±s)
*P<0.05,**P<0.01
3结论
苍果喷雾剂能有效抑制流感病毒感染早期γ-IFN的异常升高。
(四)苍果喷雾剂对流感病毒感染小鼠血中T淋巴细胞亚群的影响
1材料与方法
1.1实验材料
实验动物 ICR小鼠,雌雄各半,18-22g,清洁级,购自南京中医药大学实验动物中心。许可证号:SCXK(苏)2002-0031。
病毒毒种 流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1,南京中医药大学温病研究所保留毒种,血凝效价为1∶1024,LD50为10-4.86,-80℃超低温保存。
药物及试剂 苍果喷雾剂,由南京中医药大学新药研发中心提供。病毒唑购自江西汇仁药业有限公司,生产批号:0503008。Mouse Anti RatCD3 Fitc,MouseAnti Rat CD4:Rpe,Mouse Anti Rat CD8:Rpe-Cy5,英国Sertec公司生产,深圳晶美生物工程有限公司提供。
主要仪器 流式细胞仪,美国BD公司制造,型号为FACS·calibur。
1.2实验方法
将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、病毒唑组及苍果喷雾剂组。各组小鼠分别给药,病毒唑组以0.0585g/kg/d灌胃给药;苍果喷雾剂口腔喷雾给药,2次/日,2喷/次;模型对照组灌以生理盐水。给药第3天,以乙醚轻度麻醉小鼠后,各感染组以15LD50流感病毒FM1株病毒液滴鼻,50ul/只。正常对照组同法滴入等量生理盐水。滴鼻感染后第5天,采血后处死小鼠,进行相关检测。
T淋巴细胞亚群测定:摘眼球采血后以3.8%枸橼酸钠抗凝,取FITC标记CD3 +单抗0.8ul,PE-CD4 ++单抗1ul,混匀,室温避光作用20min,加入FACS溶红细胞液,作用15min后,1800转/分离心5min。弃除上清液,加入PBS冲洗2遍。每管加入0.5mlPBS,悬浮细胞,上流式细胞仪检测,用CELLQuest软件分析。
检测结果以X±s表示,采用SPSS统计分析软件进行统计学处理。
2结果
实验结果表明,小鼠感染流感病毒FM1后血中的CD4 +和CD4 +/CD8 +明显下降,而苍果喷雾剂则对此有一定的抑制作用,与模型组比较有显著差异(P<0.01,P<0.05)。见表3。
表3苍果喷雾剂对流感病毒感染小鼠T淋巴细胞亚群的影响(X±s)
3结论
苍果喷雾剂对小鼠感染流感病毒FM1后血中CD4 +和CD4 +/CD8 +下降有明显抑制作用。
实施例6、苍果喷雾剂对小鼠口腔粘膜病理的影响
1材料与方法
1.1实验材料
实验动物ICR小鼠,雌雄各半,18-22g,清洁级,购自南京中医药大学实验动物中心。许可证号:SCXK(苏)2002-0031。
药物苍果喷雾剂,由南京中医药大学新药研发中心提供。
1.2实验方法
将小鼠随机分为正常对照组、苍果喷雾剂大、中、小剂量组。苍果喷雾剂口腔喷雾给药,大剂量(D)组2喷/次,3次/日,中剂量组(Z)2喷/次,2次/日,小剂量组(X)2喷/次,1次/日;正常组(M)以生理盐水口腔喷雾。于第5天,第10天、第15天各处死数只,取口腔粘膜做病理切片,观察其形态变化。
2结果
各组小鼠口腔粘膜的形态可见:上皮为复层扁平上皮,其基底生发层细胞矮柱状,位于基膜上,排列紧密,结构正常,未见增生和异常和分裂象;棘层细胞2-4层,核椭圆形,核仁明显,未见结构异常;颗粒细胞层细胞1-2层,细胞扁平,长轴平行于皮肤表面,细胞核少见,可见细胞中有一些透明角质颗粒;角质层完整被于颗粒层细胞上。整个上皮未见炎症细胞浸润,未见表皮细胞的破损和溃烂,未见溃疡存在。
真皮层结构正常,未见炎症细胞的浸润和炎症灶存在。
3结论
实验结果表明,苍果喷雾剂对动物口腔黏膜细胞没有不良的刺激和损害。
Claims (5)
1.一种预防呼吸道病毒感染疾病的中药制剂,其特征是在于它由下列重量原料药所制成:
苍术6~15g、草果8~15g、荆芥8~15g、香薷8~15g、薄荷8~15g、藿香4~10g、丁香2~8g、冰片0.05~0.20g。
2.根据权利要求1所述的中药制剂,其特征在于加入适量的辅料,用常规的制剂方法可制成液体口腔制剂。
3.根据权利要求2所述的中药制剂,其特征在于所述制剂为喷雾剂。
4.一种制备权利要求1所述中药制剂的方法,其特征在于制备方法步骤如下:
(1)称取丁香加10倍量水,用水蒸气蒸馏提取挥发油,以油水分离器得丁香挥发油,待用,药渣弃去;
(2)再称取苍术、草果、荆芥、香薷、薄荷、藿香6味药加15倍量水,用水蒸气蒸馏提取挥发油,用油水分离器分离得挥发油,待用,药渣弃去;
(3)将步骤(1)、(2)的挥发油合并后,加入冰片,溶入挥发油中,即得总挥发油,备用;
(4)将上述的总挥发油,以每60g挥发油加入乙醇580ml、甘油100g、芳樟醇1ml,并加水至1000ml的比例加入辅料,采用搅拌混匀工艺将原料药及辅料均匀分散至溶剂中,然后装入塑料喷雾瓶中即成。
5.如权利要求1所述的中药制剂在制备预防呼吸道病毒感染性疾病药物中的应用。
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张庆宏,郭海,杨进,龚婕宁,赵岩松.苍果挥发油对流感病毒感染小鼠肺中γ-IFN、TNF-α的影响.南京中医药大学学报23 2.2007,23(2),104-105. * |
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