KR101672783B1 - 진핵미생물로부터의 리소좀 분리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글라스 비드(glass bead)를 이용하여 진핵미생물로부터 리소좀을 분리하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리소좀의 분리 수율이 증가하고 분리공정의 시간이 단축되어 효율적으로 리소좀을 분리할 수 있는 방법 및 상기 분리방법으로 분리되어 항균활성이 증가된 리소좀을 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다.

Description

진핵미생물로부터의 리소좀 분리방법{Method of isolating lysosome from eukaryotic microorganism}

본 발명은 글라스 비드(glass bead)를 이용하여 진핵미생물로부터 리소좀을 분리하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리소좀의 분리 수율이 증가하고 분리공정의 시간이 단축되어 효율적으로 리소좀을 분리할 수 있는 방법 및 상기 분리방법으로 분리되어 항균활성이 증가된 리소좀을 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다.

합성 농약의 오남용, 인축에 직접적 피해, 농산물에의 잔류 농약, 환경오염으로 인한 생태계의 파괴와 저항성 병해충의 증가로 인해서 국제적으로 화학적인 합성 농약 및 항생제 사용을 줄이려는 추세를 보이고 있고, 환경에 대한 세계적 관심이 부각됨에 따라서 사람들은 환경 친화적인 제품에 관심을 돌리기 시작하여 소비자들의 요구가 변화됨에 따라 국·내외 기업에서도 그 요구에 맞추어 친환경 소재 및 제품을 개발하고 있다.

또한 최근 소비자의 건강 지향적 성향과 함께 천연물에 대한 요구가 높아지고 있고 합성 보존료가 첨가된 식품의 사용을 꺼리고 있다. 이와 같은 경향으로 인하여 식품 산업계에서도 인공 합성보존제의 사용을 될 수 있는 한 제한하려는 추세이고, 안전성이 확보된 천연항균성 물질을 식품의 보존에 이용하고자 하는 연구가 집중적으로 이루어지고 있다. 일반적으로 인간이 장기간 식용으로 사용했던 천연물을 그대로 이용하거나 추출하여 보존제로 사용하는 경우, 미국에서는 이를 GRAS(generally recognized as safe) 목록으로 분류하여 관리하고 있다. 또한 식물체, 특히 생리 활성을 갖고 있어 식용으로 사용되어 온 생약류는 정제하거나 순수 분리하는 과정을 거치지 않고 식품에 직접 첨가가 가능하므로 그 경우 항균 효과와 인체에 유용한 생리활성을 동시에 얻을 수 있는 효과가 있다. 천연 항균물질의 개발과 이용은 인공합성 보존제의 대체라는 의미와 소비자 기피현상을 유발시키지 않으면서 각종 가공식품의 저장성 향상과 안전성 확보라는 견지에서 그 중요성이 강조된다. 천연 항균 물질에는 전통적으로 사용해 온 소금, 식초 등 일반 식품 소재뿐만 아니라 동물이나 식물에 천연적으로 존재하는 특정 단백질 및 효소류, 갑각류의 키틴질에서 추출한 키토산, 유기산, 식물의 정유(essestial oil) 및 미생물에서 유래된 니신(nisin), e-폴리리신(e-polylysine) 및 나타마이신(natamycin) 등이 있다. 그러나 이들 중에는 특유의 맛과 냄새, 자극성으로 인하여 식품에 적용하기 위해서는 관능적 측면에서 해결되어야 할 문제가 남아있는 것도 있고, 항균력이 약하거나 항균 스펙트럼이 좁아 아직까지 천연항균제로 개발되어 상품화된 제품은 극히 일부에 지나지 않고 있다.

한편 진핵세포로부터 유래하는 리소좀이라는 세포소기관은 단일막으로 이루어져있으며 50여 가지의 가수분해 효소를 지니고 있어 세포내의 불필요한 물질 및 외부로부터 유입된 물질을 분해시키는 데에 사용하는 것으로 알려져 있다. 이러한 리소좀은 진핵세포 내에서 상기와 같은 역할을 하지만 세포 밖으로 추출되어서도 리소좀의 기능을 유지하여 항균제 및 화장품의 원료로 함유되어 친환경적인 물질로서 사용이 되고 있다.

이에 본 발명자들은 대한민국 공개특허 제10-2010-0130842호를 통해 진핵생물에서 분리한 리소좀의 항균활성을 증대시키는 방법 및 이를 이용하여 얻어진 친환경 항균제에 대해 개시한 바 있다. 그러나 상기 공개특허에 개시된 리소좀 분리방법은 진핵생물에 산화적 손상을 가하여 초음파 분쇄기(sonicator)를 통해 리소좀을 분리한 것으로, 분리 수율이 낮을 뿐만 아니라 산화적 손상을 가하는데 많은 시간이 소요되어 분리공정의 효율성이 떨어진다.

따라서, 리소좀의 분리수율 및 분리공정의 효율성을 증가되고 항균활성이 보다 증진된 리소좀을 분리하기 위한 방법에 대한 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 다음의 단계를 포함하는 진핵미생물로부터의 리소좀 분리방법을 제공하는데 있다:

a) 진핵미생물을 배양한 후 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거하는 단계;

b) 상기 a) 단계에서 침전시킨 세포에 트리스 버퍼를 처리하여 진탕 배양하는 단계;

c) 상기 b) 단계에서 배양된 세포를 포함하는 배양액을 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거하는 단계;

d) 상기 c) 단계에서 침전시킨 세포에 브레이킹 버퍼(breaking buffer)와 글라스 비드를 첨가한 후 볼텍싱(vortexing)하는 단계;

e) 마이크로원심분리(microcentrifuge)하여 침전물을 제거한 후 상층액을 수득하는 단계; 및

f) 수득된 상층액을 마이크로원심분리하여 리소좀을 포함하는 침전물을 수득하는 단계.

본 발명의 다른 목적은 상기 리소좀 분리방법으로 분리된 리소좀을 포함하는 항균용 조성물을 제공하는데 있다.

상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 다음의 단계를 포함하는 진핵미생물로부터의 리소좀 분리방법을 제공한다:

a) 진핵미생물을 배양한 후 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거하는 단계;

b) 상기 a) 단계에서 침전시킨 세포에 트리스 버퍼를 처리하여 진탕 배양하는 단계;

c) 상기 b) 단계에서 배양된 세포를 포함하는 배양액을 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거하는 단계;

d) 상기 c) 단계에서 침전시킨 세포에 브레이킹 버퍼와 글라스 비드를 첨가한 후 볼텍싱(vortexing)하는 단계;

e) 마이크로원심분리하여 침전물을 제거한 후 상층액을 수득하는 단계; 및

f) 수득된 상층액을 마이크로원심분리하여 리소좀을 포함하는 침전물을 수득하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 진핵미생물은 효모일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 효모는 사카로마이세스속(Saccharomyces spp.)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계의 트리스 버퍼는 세포 1g 당 5ml의 용량으로 처리될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 d) 단계에서 브레이킹 버퍼는 세포 1g 당 5ml의 용량으로 처리될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 d) 단계에서 세포와 글라스 비드는 1:1의 중량비로 혼합될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 d) 단계의 볼텍싱(vortexing)은 8회 내지 12회로 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 전술한 리소좀 분리방법으로 분리된 리소좀을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명은 글라스 비드를 이용하여 진핵미생물로부터 리소좀을 분리하는 방법을 제공함으로써 항균효능 물질로서 그 기능을 입증 받은 리소좀의 분리수율 및 항균활성을 증대시킬 수 있으며, 분리공정에 따른 시간을 단축하여 공정의 효율성을 높일 수 있다. 나아가, 이러한 방법으로 분리된 리소좀은 종래의 분리방법으로 분리된 리소좀 보다 항균활성이 증대되어 우수한 항균활성을 갖는 항균용 조성물을 제공한다.

도 1은 글라스 비드를 이용하여 진핵미생물로부터 리소좀을 분리하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 리소좀 분리방법에 있어서 볼텍싱(vortexing) 횟수 및 리소좀 농도에 따른 항균활성을 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 3은 종래의 초음파 분해(sonication)를 이용하여 진핵미생물로부터 분리된 리소좀에 대한 항균활성을 용매와 리소좀 농도에 따라 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 종래의 초음파 분해를 이용한 리소좀 분리방법과 본 발명의 글라스비드를 이용한 리소좀의 분리방법에 따른 분리수율을 비교한 그래프이다.

이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래의 리소좀 분리방법으로서, 진핵생물에 산화적 손상을 가하여 초음파 분해(sonication)를 통해 리소좀을 분리하는 방법은 분리 수율이 낮을뿐만 아니라 산화적 손상을 가하는데 많은 시간이 소요되어 분리공정의 효율성이 떨어진다. 따라서, 리소좀의 분리수율 및 분리공정의 효율성을 증가시키고 항균활성이 보다 증진된 리소좀을 분리하기 위한 방법에 대한 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명은 글라스 비드를 이용하여 진핵미생물로부터 리소좀을 분리하는 방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명의 글라스 비드를 이용한 리소좀의 분리방법은 리소좀의 분리수율 및 항균활성을 증대시킬 수 있으며, 분리공정에 따른 시간을 단축하여 공정의 효율성을 높일 수 있다. 나아가, 이러한 방법으로 분리된 리소좀은 종래의 분리방법으로 분리된 리소좀 보다 항균활성이 증대되어 우수한 항균활성을 가지므로 식품, 화장품, 의약품, 친환경 농약물질, 동물 약품 및 사료 첨가제와 같은 다양한 분야의 폭넓게 적용될 수 있다.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 진핵미생물로부터의 리소좀 분리방법을 제공한다:

a) 진핵미생물을 배양한 후 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거하는 단계;

b) 상기 a) 단계에서 침전시킨 세포에 트리스 버퍼를 처리하여 진탕 배양하는 단계;

c) 상기 b) 단계에서 배양된 세포를 포함하는 배양액을 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거하는 단계;

d) 상기 c) 단계에서 침전시킨 세포에 브레이킹 버퍼(breaking buffer)와 글라스 비드를 첨가한 후 볼텍싱(vortexing)하는 단계;

e) 마이크로원심분리하여 침전물을 제거한 후 상층액을 수득하는 단계; 및

f) 수득된 상층액을 마이크로원심분리하여 리소좀을 포함하는 침전물을 수득하는 단계.

상기 진핵미생물은 리소좀을 분리할 수 있는 진핵미생물이라면 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 효모일 수 있다.

이때 상기 효모는 사카로마이세스속(Saccharomyces spp.)일 수 있으며, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.

본 발명의 리소좀 분리방법에 있어서, 상기 a) 단계의 진핵미생물은 진핵미생물의 종류에 따라 통상적으로 사용되는 적합한 배지를 임의로 선택하여 배양될 수 있으며, 리소좀이 분리될 수 있을 정도로 충분히 배양된 후 원심분리를 통해 세포를 침전시킬 수 있다. 리소좀이 분리될 수 있을 정도로 충분히 배양된 상태는 이로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, OD값이 0.8 내지 1.0인 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 리소좀 분리방법에 있어서, 상기 b) 단계의 트리스 버퍼는 세포 1g 당 5ml의 용량으로 처리될 수 있다.

상기 트리스 버퍼(Tris-buffer)는 통상적으로 세포의 일정한 pH 범위를 유지하기 위해 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 Tris-SO₄ 일 수 있다.

나아가, 상기 트리스 버퍼는 환원제를 포함할 수 있으며, 통상적으로 사용되는 환원제라면 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)을 포함할 수 있다.

상기 b) 단계에서의 환원제를 포함하는 트리스 버퍼의 처리는 세포벽을 부드럽게 하여 이후 글라스 비드를 이용하여 물리적으로 세포를 깨는 d) 단계에 있어서 세포를 효과적으로 깰 수 있도록 도와주는 역할을 한다. b) 단계에서 진탕 배양된 세포는 원심분리를 통해 상층액을 제거하고 세포를 침전시키는 c) 단계를 수행하여 침전물의 형태로 수득된다.

본 발명의 리소좀 분리방법에 있어서, 상기 d) 단계에서 브레이킹 버퍼는 세포 1g 당 5ml의 용량으로 처리될 수 있으며, 글라스 비드는 세포와 1:1의 중량비로 혼합될 수 있다. 이때 상기 브레이킹 버퍼는 페닐메탄술포닐 플루오리드(PMSF)를 포함할 수 있으며, PMSF는 세린 단백질가수분해효소(serine protease) 억제제 역할을 한다.

상기와 같은 비율로 브레이킹 버퍼와 글라스 비드를 세포에 처리한 후 볼텍싱을 수행하여 세포를 깨는 d) 단계를 수행하게 되는데 이때 볼텍싱은 30초 볼텍싱 및 30초 얼음(ice)에서 반응시키는 것을 8회 내지 12회, 바람직하게는 10회 내지 12회로 반복하여 수행될 수 있다.

본 발명의 리소좀 분리방법에 있어서, 상기 d) 단계를 수행하여 세포를 깬 후, 마이크로원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 수득하는 e) 단계 및 수득된 상층액을 마이크로원심분리하여 리소좀을 포함하는 침전물로 수득하는 f)단계를 수행함으로써 최종적으로 진핵미생물로부터 리소좀을 분리할 수 있다.

본 발명의 리소좀 분리방법에 있어서 볼텍싱 횟수를 7회, 8회, 10회 및 12회로 수행하여 분리된 리소좀의 항균활성을 비교해본 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 1 용량%, 5 용량%, 10 용량%, 20 용량% 및 30용량%로 증류수에 희석시킨 리소좀의 모든 농도 범위에 걸쳐 10회 볼텍싱을 수행한 경우가 가장 우수한 항균활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었고, 특히 5 용량% 농도에서 10회 또는 12회 볼텍싱을 실시한 경우 95% 이상의 세포사멸 유도하여 항균활성이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 리소좀 분리방법은 볼텍싱 횟수의 조절을 통해 현저하게 뛰어난 항균활성을 갖는 리소좀을 분리할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

또한 본 발명의 리소좀 분리방법으로 분리한 리소좀의 항균활성을 종래의 초음파 분해를 이용하여 분리한 리소좀의 항균활성과 비교해 본 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 초음파 분해를 이용하여 분리한 리소좀은 1 용량%, 5 용량% 및 10 용량%의 모든 농도 범위에 걸쳐 희석 용매와 관계없이 60% 내지 70% 정도의 대장균 세포사멸을 나타냈으며, 이는 본 발명의 리소좀 분리방법으로 분리된 리소좀의 항균활성을 보여주는 도 2와 비교하였을 때 동일한 리소좀 농도에서 현저하게 낮은 수준의 항균활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.

이와 같이 본 발명의 분리방법으로 분리한 리소좀은 종래의 분리방법으로 분리한 리소좀 보다 현저히 우수한 항균활성을 나타내므로, 이를 식품, 화장품, 의약품, 친환경 농약물질, 동물 약품 및 사료 첨가제 등에 폭넓게 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

또한, 분리공정에 있어서도 초음파 분해를 이용한 리소좀 분리방법은 상기 실시예 2의 글라스 비드를 이용한 리소좀 분리방법에 비해 분리공정 시간이 긴 반면 리소좀의 항균활성은 현저히 떨어져 본 발명의 리소좀 분리방법이 보다 효율적으로 항균활성이 우수한 리소좀을 분리하는데 적합하다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명은 또한 전술한 리소좀 분리방법으로 분리된 리소좀을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

상기 항균용 조성물은 그람 음성균주에 대한 항균활성을 가질 수 있으며, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균활성을 가질 수 있다. 상기 대장균은 가장 대표적인 그람 음성균으로 병원세균으로 분류되기 때문에 본 발명의 분리방법으로 분리된 리소좀의 대장균에 대한 항균력을 실험하여 항균활성을 검증하였다.

상기 항균용 조성물은 화장료 조성물에 활용될 수 있으며, 상기 화장료 조성물은 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다. 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.

또한 미생물 농약을 대체한 가축 산업 및 농업 산업에 적용할 수 있는데, 일례로서 가축 산업에는 가축 사료 첨가제나 가축의 항생제 대신 사용할 수 있으며, 농업 산업에는 미생물 농약대신 친환경 농약제로 사용가능하다. 나아가 일반 생활에 쓰이는 항균제 대신 대체 항균제로 사용 가능하다. 즉, 항균 스프레이로 개발하여 공기 중의 세균이나 자동차 시트, 옷 등에 분무할 수 있는 제품으로 사용하는 것 또한 가능하다.

상기 항균용 조성물이 식품에 포함되는 경우 식품 보존제로 사용될 수 있으며, 기존의 합성보존제에 비해 인체에 안전하다는 이점을 갖는다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

글라스 비드를 이용한 효모로부터의 리소좀 분리

본 실시예에서는 진핵미생물로서 효모인 사카로마이세스 세레비지애s2805(Saccharomyces cerevisiae , ATCC^® 4002805^TM)를 YPD 배지에서 OD₆₀₀값이 0.8~1.0이 되도록 배양하였으며, 배양한 배양액을 3,000rpm, 4℃, 10분간 분리하여 세포를 침전시켰다. 침전시킨 세포는 상층액을 제거하고 세포 5g당 Tris-SO₄ 버퍼 25ml에 10mM DTT를 첨가하여, 30℃에서 90rpm으로 15분간 진탕 배양하여 효모의 세포벽을 부드럽게 해주는 단계를 진행하였다. 세포벽이 부드러워진 효모를 다시 3,000rpm, 4℃, 10분간 분리하여 세포를 침전시켜 상층액을 제거하고, 세포 5g당 브레이킹 버퍼(breaking buffer) 25ml에 1mM PMSF와 글라스 비드 5g을 첨가하여 60초 볼텍싱(vortexing), 60초 얼음(ice)에서 반응시키면서 횟수를 조절하여 세포를 깨는 단계를 진행하였다. 세포가 깨진 후에는 마이크로원심분리기(microcentrifuge)를 사용하여 500×g, 4℃, 5분간 분리하여 세포벽과 핵 등을 제거하고 상층액만 수득해서 다시 20,000×g, 4℃, 30분간 분리하여 침천물을 수득하였다. 침전물에 리소좀이 포함되어있다.

또한 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에 따른 글라스 비드를 이용한 리소좀의 최종 분리 수율은 22%였다.

글라스 비드 볼텍싱 (glass bead vortexing ) 횟수에 따른 리소좀의 대장균( Escherichia Coli )에 대한 항균활성 검증

상기 실시예 1에서 글라스 비드를 이용하여 리소좀을 분리하는데 있어서 볼텍싱 횟수를 다양하게 조절하여 수득한 리소좀의 항균활성을 검증하였다. 글라스 비드의 볼텍싱 횟수는 7회, 8회, 10회, 그리고 12회로 진행하였으며, 분리된 리소좀을 각각 증류수(DW)에 1 용량%, 5 용량%, 10 용량%, 20 용량%, 30 용량%로 희석한 뒤 대장균에 대한 항균활성을 비교하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 모든 농도의 리소좀에서 7회, 8회 또는 12회 볼텍싱을 실시한 경우보다 10회 볼텍싱을 실시한 경우가 대장균에 대한 항균활성이 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다.

이를 통해 글라스 비드를 이용하여 10회 볼텍싱을 실시한 뒤 분리된 리소좀의 항균활성이 가장 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

초음파 분해( sonication )를 이용하여 분리한 리소좀의 대장균( Escherichia Coli )에 대한 항균활성 검증

본 발명의 글라스 비드를 이용하여 분리한 리소좀의 항균활성을 종래의 초음파 분해를 이용하여 분리한 리소좀의 항균활성과 비교하기 위하여 하기와 같이 초음파 분해를 이용하여 리소좀 분리를 실시하였다.

진핵미생물로서 효모인 사카로마이세스 세레비지애 s2805(Saccharomyces cerevisiae, ATCC^® 4002805^TM)를 YPD 배지에서 OD₆₀₀값이 0.8~1.0이 되도록 배양하였으며, 배양한 배양액을 3,000rpm, 4℃, 10분간 분리하여 세포를 침전시켰다. 침전시킨 세포는 상층액을 제거하고 세포 5g당 Tris-SO₄ 버퍼 25ml에 10mM DTT를 첨가하여, 30℃에서 90rpm으로 15분간 진탕 배양하여 효모의 세포벽을 부드럽게 해주는 단계를 진행하였다. 세포벽이 부드러워진 효모를 다시 3,000rpm, 4℃, 10분간 분리하여 세포를 침전시켜 상층액을 제거하고, 세포 5g당 소르비톨-K⁺ 버퍼(Sorbitol-K⁺ buffer) 25ml을 첨가하여 서스펜션하여 적응과정을 거친 후 다시 세포 침전하였다.

침전시킨 세포는 상층액을 제거하고 세포 5g당 소르비톨-K⁺ 버퍼 25ml를 첨가하여 40% 펄스(pulse)로 20분(on-10초, off-10초) 초음파 분해하여 세포벽을 1차로 깨준 후, 3,000rpm, 4℃에서 10분간 분리하여 상층액을 제거하고, 브레이킹 버퍼(breaking buffer) 25ml에 1mM PMSF를 첨가하여 30% 펄스(pulse)로 10분(on-10초, off-10초) 초음파 분해하여 세포벽을 깨주는 단계를 진행하였다. 이후 단계는 상시 실시예 1과 동일한 방법으로 진행하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 실시예에 따른 초음파 분해를 이용한 리소좀의 최종 분리 수율은 10%였으며, 이는 상기 실시예 1의 글라스 비드를 이용한 리소좀의 분리방법의 최종 분리 수율인 22%의 절반에도 미치지 못하는 낮은 수치이다. 이를 통해 본 발명의 글라스 비드를 이용한 리소좀 분리방법은 종래의 초음파 분해를 이용한 리소좀 분리방법보다 현저히 우수한 분리 수율을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

또한 본 실시예에서 수득한 리소좀은 증류수(DW) 또는 인산 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)를 용매로 하여 각각 1 용량%, 5 용량%, 10 용량%로 희석하여 대장균에 대한 항균활성을 확인하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 리소좀의 농도 및 용매 차이에 따른 뚜렷한 항균활성의 차이는 확인되지 않았다. 그러나 초음파 분해를 이용하여 분리한 리소좀의 항균활성은 상기 실시예 2의 글라스 비드를 이용하여 분리한 리소좀의 항균활성과 비교하여 전체적으로 낮은 활성을 보였다.

이를 통해 본 발명에 따른 글라스 비드를 이용하여 분리한 리소좀은 종래의 초음파 분해를 이용하여 분리한 리소좀과 비교하여 현저히 우수한 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 분리공정에 있어서도 초음파 분해를 이용한 리소좀 분리방법은 상기 실시예 2의 글라스 비드를 이용한 리소좀 분리방법에 비해 분리공정 시간이 긴 반면 리소좀의 항균활성은 현저히 떨어져 본 발명의 리소좀 분리방법이 보다 효율적으로 항균활성이 우수한 리소좀을 분리하는데 적합하다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (8)

1. 다음의 단계를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 리소좀 분리방법:
   a) 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 배양한 후 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거하는 단계;
   b) 상기 a) 단계에서 침전시킨 세포에 세포 1g 당 5ml의 용량의 트리스 버퍼를 처리하여 진탕 배양하는 단계;
   c) 상기 b) 단계에서 배양된 세포를 포함하는 배양액을 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 제거하는 단계;
   d) 상기 c) 단계에서 침전시킨 세포에 세포 1g 당 5ml 용량의 브레이킹 버퍼(breaking buffer)를 처리하고, 글라스 비드는 상기 세포와 글라스 비드의 중량비가 1:1이 되도록 첨가한 후 1회 볼텍싱 시간을 60초로 하여 10회 내지 12회 볼텍싱(vortexing)하는 단계;
   e) 마이크로원심분리하여 침전물을 제거한 후 상층액을 수득하는 단계; 및
   f) 수득된 상층액을 마이크로원심분리하여 리소좀을 포함하는 침전물을 수득하는 단계.
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