KR20100130842A - 진핵 생물에서 분리한 리소좀의 항균 활성을 증대시키는 방법 및 이를 이용하여 얻어진 친환경 항균제 - Google Patents

진핵 생물에서 분리한 리소좀의 항균 활성을 증대시키는 방법 및 이를 이용하여 얻어진 친환경 항균제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 진핵 생물에서 분리한 리소좀의 항균 활성을 증대시키는 방법 및 이를 이용하여 얻어진 친환경 항균제에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 진핵 생물에 산화적 손상을 준 다음 분리한 리소좀의 항균활성을 증대시킬 수 있음을 규명하였을 뿐 아니라 이를 이용하여 항균 활성이 대폭 개선된 친환경 항균제를 제공할 수 있다.
진핵 생물, 진핵 미생물, 진핵 동물세포, 리소좀, 항균 활성, 산화적 조건

Description

진핵 생물에서 분리한 리소좀의 항균 활성을 증대시키는 방법 및 이를 이용하여 얻어진 친환경 항균제{Antimicrobial materials using lysosomes isolated from eukaryotic cells and oxidative conditions to enhance its activity}
본 발명은 진핵 생물에서 분리한 리소좀의 항균 활성을 증대시키는 방법 및 이를 이용하여 얻어진 친환경 항균제에 관한 것이다.
합성 농약의 오남용, 인축에 직접적 피해, 농산물에의 잔류 농약, 환경오염으로 인한 생태계의 파괴와 저항성 병해충의 증가로 인해서 국제적으로 화학적인 합성 농약 및 항생제 사용을 줄이려는 추세를 보이고 있고, 국내의 경우도 향후 10년 이내에 화학농약 및 항생제의 사용량을 70% 이하로 줄이는 것으로 확정하였다. 그리고 생물농약으로 현재 미생물 농약을 사용하고 있으며 2006년 3월 당시 20종 (살균제 11종, 살충제 9종)이 출시되었으나, 소재 자체가 살아 있는 미생물이라는 특성 때문에 꺼리는 소비자들이 많다. 따라서 본 발명에서는 화학적 합성 농약 및 항생제를 대처할 기술개발이 미진한 상태로 생체기능성 신소재인 리소좀을 이용한 항균제 개발을 하고자 하였고, 세포내부에 존재하는 작은 소기관인 리소좀을 이용하는 것으로 생물체자체를 사용하지 않으면서 단지 기능만을 활용하는 친환경적 신 생믈 소재로 사업화 추진시 수요가 급증할 것으로 판단된다.
현재 농업경쟁력 및 농가 소득 보장 등 농업인들의 기술적 애로를 해결하기 위한 정부의 노력이 지속되고 있는 가운데, 저렴한 항균제 개발이 시급한 상황이고, 합성 농약 및 항생제를 대체하여 국내에서 제조, 유통되고 있는 천연물 유래 제품들의 경우, 유해 미생물 및 곰팡이류에 대한 효율은 뛰어나지만 최근 문제가 되고 있는 환경 내의 바이러스 등에 대한 처리는 불가능하다. 그러므로 리소좀을 함유하고 있고 대량생산이 쉬운 진핵 미생물의 경우 개발에 큰 어려움이 없으며 저렴한 가격으로 판매되어 질 수 있고, 리소좀의 경우 세포 내로 외부 유해 물질이 침입하였을 때 세포를 미생물, 곰팡이, 유해 활성산소족 뿐만 아니라 바이러스에 대한 처리 효율도 검증된 상태이다. 또한 최근까지 개발된 항균제들의 경우, 농업 및 식품 등으로 응용분야가 제한되어 있었으나, 유해물질 제거 후 곰팡이 오염 문제가 시급한 페인트업, 여러 가지 바이러스로 인해 발생하는 인축 등의 질병등에 대한 응용이 시급한 실정이다. 그러나 리소좀의 경우 친환경 농약물질, 의약픔, 식품, 화장품, 동물 약품 및 사료 첨가제 등으로의 응용 범위가 매우 다양한 장점이 있다.
이에 본 발명자들은 리소좀을 포함하는 친환경 항균제에 대한 연구를 통하여 대한민국 특허출원 제10-2007-0079191(리소좀을 포함하는 친환경 항균제 및 그 제조방법)를 개시한 바 있다. 그러나 상기 특허출원은 가금류 알에서 분리한 리소좀을 사용한 것으로 그 대상이 한정되었을 뿐 아니라 항균 효과 또한 원하는 정도로 범위가 넓지 못하였다.
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이에 본 발명자들은 모든 진핵 생물의 세포내에 있는 소기관인 리소좀을 대상으로 할 뿐 아니라, 단세포로 구성된 진핵 미생물이나 진핵 생물체의 세포에 산화적 손상을 유발하는 경우 리소좀의 항균력이 향상되는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 일 목적은 진핵 생물에서 분리한 리소좀의 항균 활성을 증대시키는 방법을 제공하려는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항균 활성이 증대된 리소좀을 이용하여 친환경 항균제를 제공하려는데 있다.
본 발명의 제1 견지에 의하면,
진핵 생물에 산화적 손상을 가하는 단계;
산화적 손상을 준 진핵 생물을 키운 다음 균질화 하여 세포분획법을 이용해 리소좀을 분리하는 단계; 및
분리한 리소좀 20-40% 농도범위로 H4.0~6.0 범위내의 0.1M phosphate buffer에 현탁시키는 단계; 로 이루어지는 진핵 생물에서 분리한 리소좀의 항균 활성을 증대시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 견지에 의하면,
상기 제1 견지에 의해 항균 활성이 개선된 리소좀을 포함하는 친환경 항균제를 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명에서 진핵 생물에 산화적 손상을 주어 분리된 리소좀의 항균 활성을 증대시키는 방법은 다음과 같은 순서로 이루어진다. 이때 진핵 생물로는 진핵 미생물의 일종인 Saccharomyces cerevisiae (KCTC 7947), 혹은 진핵 동물세포의 일종인 HeLa (HC 18802) 등을 포함할 수 있다.
상기 진핵 생물에 산화적 손상을 준다. 이때 진핵 미생물인 S. cerevisiae에 대한 산화적 손상은 20mM H2O2하에 수행되는 것이 바람직하고, 진핵 동물세포인 HeLa에 대한 산화적 손상은 200㎛ H2O2, 400㎛ 6-ydroxydopamine, 40분 UV하에 수행되는 것이 바람직하다. 이같은 산화적 손상에 의해 리소좀이 활성화되어 결과적으로 항균 활성이 개선되는 것을 규명되었다 (하기 실시예중 일반 진핵생물와 산화적 손상을 준 진핵 생물에서 리소좀을 분리하여 여러 종류의 균주에 항균성을 확인한 결과, 산화적 손상을 준 진핵생물에서 분리한 리소좀의 항균활성이 향상된 것을 확인한 표 1과 산화적 손상의 조건을 달리하면서 실험한 결과를 도시하는 도 7을 함께 참조하라).
나아가, 이같이 진핵 미생물을 stationary phase 가 될때까지 키운 다음 산화적 손상을 준 진핵미생물을 균질화 하여 세포분획법을 이용해 리소좀을 분리하거나, 혹은 진핵 동물세포를 60-70% confluency가 되게 키운 다음 산화적 손상을 주어 세포를 균질화 하여 세포분획법을 이용해 리소좀을 분리한다. 이같이 분리한 리소좀을 0.1M phosphate buffer에 넣은 다음 세균과 리소좀을 1:9로 섞어 spreading하고 항균력을 실험하게 된다.
이때 리소좀은 20-40% 농도범위로 H4.0~6.0 범위내의 0.1M phosphate buffer에 현탁시키면 진핵 생물에서 분리한 리소좀의 항균 활성을 최적화 시키게 되는 것이다. 바람직하게는 상기 phosphate buffer의 pH는 4.0인 것이 가장 좋고, 상기 리소좀의 농도는 40%인 것이 가장 좋다.
이같은 항균 활성은 Saccharomyces cerevisiae(KCTC7947), Corynebacterium glutamicum(ATCC13032), Escherichia coil(KCTC1041), Shigella flexneri(KCTC2517) 및 Streptomyces albus(KCTC1136)에 대하여 개선된 활성을 갖게 된다.
또한, 본 발명에 따르면, 이같이 항균 활성이 개선된 리소좀을 유효성분으로 포함하여 이루어지는 친환경 항균제를 제공할 수 있다. 이때 항균력은 하기 도 8에서 확인할 수 있듯이, 일반 진핵생물에서 분리한 리소좀보다 산화적 손상을 준 진 핵 생물에서 리소좀을 분리한 경우 대장균에 대한 항균활성이 향상된 것으로부터 개선할 수 있을 뿐 아니라 친환경이므로 인체 및 농축산물에 무해한 물질로서 안심하고 사용할 수 있는 잇점 또한 갖는다.
상술한 항균제는 미생물 농약을 대체한 가축 산업 및 농업 산업에 적용할 수 있는데, 일례로서 가축 산업에는 가축 사료 첨가제나 가축의 항생제 대신 사용할 수 있으며, 농업 산업에는 미생물 농약대신 친환경 농약제로 사용가능하다. 또한 일반 생활에 쓰이는 항균제 대신 대체 항균제로 사용 가능하다. 즉, 항균 스프레이로 개발하여 공기 중의 세균이나 자동차 시트, 옷 등에 스프레이할 수 있는 제품으로 사용하는 것 또한 가능하다.
본 발명에 따르면, 산화적 손상을 준 진핵 생물에서 분리한 리소좀 조건하에 항균 활성을 증대시킬 수 있음을 규명하였을 뿐 아니라 이를 이용하여 항균 활성이 대폭 개선된 친환경 항균제를 제공할 수 있다.
<실험 재료>
진핵 생물로는 Saccharomyces cerevisiae (KCTC 7947), HeLa (HC 18802)를 사용하였으며, 세균으로는 Saccharomyces cerevisiae (KCTC7947), Corynebacterium glutamicum (ATCC13032), Escherichia coil (KCTC1041), Shigella flexneri (KCTC2517), Streptomyces albus (KCTC1136), Deinococcus radiophilus (ATCC 27603), Xanthomonas oryzae (KACC 10859)를 사용하였다.
또한, 본 발명에서 사용한 실험 장치는 centrifuge, sonicator, CO2 incubator, clean bench 이었다.
<실험예: 진핵 생물에 산화적 손상을 주지 않은 경우>
상기 실험재료로서 언급된 진핵 생물에 해당하는 진핵 미생물로서 Saccharomyces cerevisiae (KCTC 7947)를 그리고 진핵동물세포로서 HeLa (HC 18802)를 사용하여 도 1에 도시한 공정에 따라 진핵 미생물의 경우 stationary phase가 되게 키우고, 진핵동물세포의 경우에는 YPD에 30oC incubator에서 키워 spectrophotometer 를 이용하여 OD값 측정시 60-70% confluency가 되게 키운 다음 진핵 미생물과 세포를 각각 균질화하였다.
구체적으로는 진핵 미생물의 경우는 100ml의 Tris-SO4 buffer에 1M DTT를 1ml처리하여 효모 5g 당 25ml을 첨가해 30oC incubator에서 90rpm으로 진탕한다. 그 후 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액은 제거 하고 25ml의 Sorbitol K+ buffer를 섞어준다. 다시 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액은 제거 하고 앞의 과정을 두 번 반복한다. 세포를 균질화 하기 위하여 sonicator로 40% pulse로 10초 on/ 10초 off를 10분동안 진행후 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액은 제거 하고 breaking buffer를 넣어 sonicator로 30% pulse로 10초 on/ 10초 off를 5분동안 진행한 다음 3000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 모은다. 모은 상 층액을 20000 x g, 30분간 분리하여 얻어진 하층에 리소좀이 포함되어있다.
또한, 진핵 동물세포의 경우는 buffer 100㎕를 처리하고 scraper로 긁은 후에 2000rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액은 제거한다. pellet에 0.25M sucrose와 1mM EDTA를 10ml 넣어 섞는다. sonicator를 이용하여 20% pulse, 5초 on/ 5초 off를 반복하여 5분간 세포를 깨고 2000rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 모은다. 그 상층액을 다시 20000 x g, 30분간 분리하면 하층액에 리소좀이 포함되어 있다. 분리한 리소좀을 0.1M phosphate buffer에 넣은 다음 세균과 리소좀을 1:9로 섞어 spreading하였다.
그런 다음 진핵 미생물로부터 분리된 리소좀을 phosphate buffer에 농도를 1, 5, 10, 20, 40, 70, 100%로 다양하게 조절하여 대장균의 처리효율을 비교하였으며 그 결과를 도 2에 정리하였다. 도 2에서 보듯이, 40% 농도의 리소좀을 활용한 경우가 가장 높은 처리효율을 나타내었다.
한편, 40% 농도의 리소좀을 현탁 시키는 phosphate buffer의 pH를 다양하게 조절하여 처리 효율을 도 3에 정리한 결과, pH4.0~6.0까지 약산성에서 phosphate buffer를 활용했을 때 대장균 처리 효율이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
최적의 조건으로 확인된 pH4.0으로 제작된 phosphate buffer에 40%의 리소좀을 현탁하여 만들어진 친환경 항균제의 보관 온도를 달리하여 처리 효율이 가장 우수한 경우를 확인해 보니, 50도로 보관하였을 경우를 제외하고는 크게 변화가 없는 것으로 확인되어, 제작된 항균제를 상온이나 냉장 보관하여도 높은 처리 효율이 나타나는 것을 확인하였다(도 4 참조).
이뿐 아니라 세균으로서 대장균뿐만 아니라 몇 종의 다른 균주와 진핵 미생물들에 대해서도 높은 처리 효율을 나타내는 것을 확인하였다(도 5 참조).
<실시예 1 : 진핵미생물에 산화적 손상을 준 경우>
앞서 실험예와 동일한 실험을 반복하되 사용된 진핵세포에 산화적 손상을 주어 리소좀의 활성을 확인한 결과, 하기표 1 및 도 6에서 보듯이, S. cerevisiae에 산화적 손상은 0, 5, 10, 20mM H2O2 로 주었고 20mM H2O2에서 가장 높은 활성을 보였으며, 특히 산화적 손상이 심해질수록 리소좀의 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었는데, 구체적으로는 Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Shigella flexneri 및 Streptomyces albus에 대하여 개선된 활성을 갖게 된다.
Tested strains Mortality by normal lysosomes (%) Mortality by H2O2treatedlysosomes(%)
Saccharomyces cerevisiae 82.1 90.1
Deinococcus radiophilus 93.5 93.5
Corynebacterium glutamicum 81.4 85.1
Escherichia coli 90.9 92.2
Xantamonas oryzae 93.3 93.3
Shigella flexneri 91.2 95.7
Streptomyces albus 41.6 76.3
<실시예 2 : 진핵동물세포에 산화적 손상을 준 경우>
나아가 진핵동물세포에 가장 항균 활성이 우수한 산화적 조건을 알아보기 위하여, 도 1에 도시한 바와 같이, 진핵동물세포를 100p dish에 90%정도 되게 키운 다음 세포를 균질화 하여 세포분획법을 이용해 리소좀을 분리하였다. 분리한 리소좀을 0.1M phosphate buffer에 넣은 다음 세균과 리소좀을 1:9로 섞어 spreading하였다.
구체적으로, HeLa에 산화적 손상은 0, 50, 100, 200, 400㎛ H2O2와 6-ydroxydopamine로 주었고 0, 5, 10, 20, 40, 60분의 UV로 주었다. 그 결과 200㎛ H2O2, 400㎛ 6-ydroxydopamine, 40분 UV를 주어 산화적 손상을 준 조건에서 가장 높은 활성을 나타내었다.(도 7 참조).
< 실시예 3: 항균 활성 대비>
상기 실험예에서 얻어진 일반 진핵세포에서 분리한 리소좀에 대한 대장균 항균성과 상기 실시예1에서 얻어진 산화적 손상을 준 진핵미생물에서 분리한 리소좀에 대한 대장균 항균성과, 상기 실시예 2에서 얻어진 산화적 손상을 준 진핵동물세포에서 분리한 리소좀에 대한 대장균 항균성을 각각 확인한 결과, 산화적 손상을 준 진핵미생물과 진핵동물세포에서 분리한 리소좀의 항균활성이 향상된 것을 확인하였다(도 8 참조).
도 1은 진핵 생물로부터 리소좀을 분리한 후 세균을 처리하기 위한 항균제 제작공정을 보이는 도면이다.
도 2는 진핵 생물로부터 분리된 리소좀을 여러 가지 농도별로 phosphate buffer에 희석하여 항균성 효율을 분석한 도면이다.
도 3은 진핵 생물로부터 분리된 리소좀을 phosphate buffer의 pH를 달리하여 대장균 처리 효율을 비교한 도면이다.
도 4는 진핵 생물로부터 분리된 리소좀을 phosphate buffer에 희석 후 보관 온도를 여러 가지로 선정하여 대장균 처리 효율을 비교한 도면이다.
도 5는 개발된 친환경 항균제의 여러 가지 균주들에 대한 처리 효율을 비교한 도면이다.
도 6은 진핵 생물 중 진핵미생물인 효모에 산화적 손상을 주어 리소좀의 활성을 증가시킨 도면이다.
도 7은 진핵 생물 중 진핵동물세포에 산화적 손상을 주어 리소좀의 활성을 증가시킨 도면이다.
도 8는 진핵 생물에 산화적 손상을 주고 리소좀을 분리해낸 다음 대장균에 대한 항균성 처리효율을 대비한 도면이다.

Claims (9)

  1. 진핵 생물에 산화적 손상을 가하는 단계;
    산화적 손상을 준 진핵 생물을 키운 다음 균질화 하여 세포분획법을 이용해 리소좀을 분리하는 단계; 및
    분리한 리소좀 20-40% 농도범위로 H4.0~6.0 범위내의 0.1M phosphate buffer에 현탁시키는 단계; 로 이루어지는 진핵 생물에서 분리한 리소좀의 항균 활성을 증대시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 진핵 생물은 진핵 미생물과 진핵동물세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 산화적 손상은 H2O2, 6-ydroxydopamine, UV하에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 진핵 미생물에 대한 산화적 손상은 20mM H2O2 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 진핵동물세포에 대한 산화적 손상은 200uM H2O2, 400uM 6-hydroxydopamine농도와 40분의 UV노출하에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 phosphate buffer의 pH는 4.0인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 리소좀의 농도는 40%인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항균 활성은 Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Shigella flexneri 및 Streptomyces albus의 세균류에 대하여 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항, 제2항, 제6항, 제7항, 제8항중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어진 항균 활성이 개선된 리소좀을 유효성분으로 포함하여 이루어지는 친환경 항균제.
KR1020090049551A 2009-06-04 2009-06-04 진핵 생물에서 분리한 리소좀의 항균 활성을 증대시키는 방법 및 이를 이용하여 얻어진 친환경 항균제 KR20100130842A (ko)

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