KR20150118836A - 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20150118836A
KR20150118836A KR1020140044996A KR20140044996A KR20150118836A KR 20150118836 A KR20150118836 A KR 20150118836A KR 1020140044996 A KR1020140044996 A KR 1020140044996A KR 20140044996 A KR20140044996 A KR 20140044996A KR 20150118836 A KR20150118836 A KR 20150118836A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bacteriophage
φcj27
kccm11465p
composition
escherichia coli
Prior art date
Application number
KR1020140044996A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101591793B1 (ko
Inventor
김재원
신은미
배기덕
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1020140044996A priority Critical patent/KR101591793B1/ko
Application filed by 씨제이제일제당 (주) filed Critical 씨제이제일제당 (주)
Priority to PCT/KR2015/002472 priority patent/WO2015160089A1/ko
Priority to BR112016023613-0A priority patent/BR112016023613B1/pt
Priority to US15/304,489 priority patent/US9950018B2/en
Priority to JP2016561664A priority patent/JP6324535B2/ja
Priority to EP15780499.8A priority patent/EP3133152B1/en
Priority to TR2019/01906T priority patent/TR201901906T4/tr
Priority to CN201580020154.XA priority patent/CN106232806B/zh
Publication of KR20150118836A publication Critical patent/KR20150118836A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101591793B1 publication Critical patent/KR101591793B1/ko
Priority to PH12016502003A priority patent/PH12016502003B1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/381—Microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/48—Medical, disinfecting agents, disinfecting, antibacterial, germicidal or antimicrobial compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

본 발명은 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 및 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 또는 상기 조성물을 이용하여 인간을 제외한 동물의 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물{Novel bacteriophage and composition comprising the same}
본 발명은 장독소성 대장균에 특이적인 사멸능을 나타내는 신규 박테리오파지, 이를 포함하는 조성물 및 상기 신규 박테리오파지 또는 상기 조성물을 이용하여 동물의 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
대장균 (Escherichia coli, 이하, 'E. coli'라 한다)은 장내 세균과 (Enterobacteriaceae) 에스케리키아속 (Escherichia)에 속하는 그람 음성의 단간균으로, 포유동물을 비롯한 다양한 동물의 장관 내에 존재하는 정상 세균총 중의 하나이다. 대장균은 대부분 비병원성으로 기회 감염을 유발할 수 있으나 일부 고병원성 균주는 사람을 비롯한 동물 내에서 다양한 장 질환 및 패혈증 등을 유발하는 것으로 알려져 있다.
대장균의 종류에는 장독소성 대장균 (Enterotoxigenic E. coli, ETEC), 장병원성 대장균 (Enteropathogenic E. coli, EPEC), 장출혈성 대장균 (Enterohemorrhagic E. coli, EHEC), 장응집성 대장균 (Enteroaggregative E. coli, EAEC), 장침입성 대장균 (Enteroinvacive E. coli, EIEC), 괴사소성 대장균 (Necrotoxigenic E. coli, NTEC) 등이 있으며, 이들 중 특히 장독소성 대장균은 양돈에서 대장균 감염성 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다.
현재, 양돈 산업의 대규모 집단 사육 추세에 따라 돼지의 대장균증은 양돈장에서 가장 흔하고 또 문제시되는 질병으로 대두되고 있다 (비특허문헌 1). 최근 우리 나라에서도 돼지의 대장균증 발생이 증가하여 설사로 인한 어린 돼지의 성장 지연 및 폐사로 사육 농가에 경제적으로 커다란 손실을 초래하고 있는 실정이다 (비특허문헌 2).
이러한 돼지 대장균증을 예방 및 치료하기 위하여 종래에는 돼지에 여러 항생제들을 사용하여 왔으나, 항생제를 오남용하는 경우 돼지에 내성을 유발하거나 항생제들이 돼지 체내에 잔류할 가능성이 있어 현재는 전세계적으로 항생제 투여에 많은 제한을 두고 있다 (비특허문헌 3).
한편, 박테리오파지(bacteriophage)는 특정 세균을 감염시켜 감염된 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스를 의미한다. 박테리오파지는 항생제에 비하여 숙주 특이성이 강할 뿐만 아니라, 최근 들어 항생제 사용에 대한 내성균 출현의 문제 및 항생제의 육류 내 잔류 문제 등이 심각해짐에 따라 그 활용에 대한 관심이 높아지고 있다 (비특허문헌 4 및 5).
이에 세계 여러 나라에서 박테리오파지에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 박테리오파지에 대한 특허 출원은 물론, 이를 활용한 조성물에 대하여 미국식품의약국 (Food and Drug Administration, FDA)의 승인 등을 취득하려는 움직임이 증가하고 있는 추세이다.
박테리오파지에 관한 선행 기술로 특허문헌 1에서는 E. coli 0157:H 균을 통제하기 위한 7 종의 박테리오파지에 대하여 개시하고 있으며, 특허문헌 2에서는 황색 포도상 구균에 특이적인 사멸능을 갖는 박테리오파지에 대하여 개시하고 있다. 특허문헌 3에서는 세균 세포막의 펩티도글리칸 구조물을 특이적으로 파괴시키는 박테리오파지 유래 용균 단백질 및 이에 의한 세균 파쇄물에 대하여 개시하고 있다.
그러나, 상기와 같은 선행 기술들의 존재에도 불구하고 양돈을 비롯한 축산업에 있어서 중요한 문제가 되고 있는 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 박테리오파지 관련 선행 기술은 여전히 부족한 실정이며, 따라서 이러한 박테리오파지 및 그 관련 기술의 개발이 요구되고 있다.
미국 등록특허 제6,485,902호 대한민국 등록특허 공보 B1 제10-0910961호 대한민국 공개특허 공보 A 제10-2009-0021475호
박영일. 양돈학, 선진문화사, 353-359, 1998 홍의철. 단국대학교 석사학위논문, 조기 이유 자돈에 있어 난황 항체의 첨가 효과, 2001 Mason HS 외. Trends in Biotech, 13:388-392, 1995 Cislo, M 외. Arch Immunol. Ther. Exp. 2:175-183, 1987 김성훈 외. 박테리오파지, 새로운 대체 항생제, BioWave Vol.7 No.15, 2005, BRIC
본 발명자들은 항생제 사용에 의한 내성균의 출현 및 항생제의 육류 내 잔류 문제 등을 해결하고 대장균 감염성 질병을 효율적으로 예방 및 치료하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 장독소성 대장균에 대하여 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)를 자연계에서 분리해 내기에 이르렀다.
또한, 상기 신규 박테리오파지의 형태적, 생화학적, 유전적 특성을 동정하고 상기 박테리오파지가 내산성 및 내열성 등이 뛰어남을 확인하여 이를 활용한 항생제, 소독제, 사료 첨가제, 기타 조성물 등을 개발하였고, 나아가 대장균 감염성 질병의 예방 또는 치료를 위한 조성물 및 이를 이용한 질병의 예방 또는 치료 방법을 개발하였다.
본 발명은 장독소성 대장균에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 항생제, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 사료, 음용수, 소독제 또는 세척제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 또는 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 이용하여, 인간을 제외한 동물의 장독소성 대장균 감염성 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는, 장독소성 대장균에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)를 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는 항생제, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 사료, 음용수, 소독제 또는 세척제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 또는 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)은 장독소성 대장균을 특이적으로 사멸시키는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)은 내산성 및 내열성이 우수하여 다양한 온도 및 pH 범위에서 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 물질로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효성분으로 포함하는, 항생제, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 사료, 음용수, 소독제 또는 세척제 등으로 활용될 수 있는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 또는 이를 유효 성분으로 포함하는 항생제를 제공하여, 종래 항생제에 비하여 병원성 대장균에 대한 특이성이 매우 높아 익균은 죽이지 않고 특정 병원균만을 사멸시킬 수 있으며, 약물 내성을 유도하지 않아 종래의 항생제에 비하여 제품 수명이 연장되는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 또는 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 갖는다.
도 1은 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)(이하, 'ΦCJ27')의 전자 현미경 사진이다.
도 2는 신규 박테리오파지 ΦCJ27의 PFGE 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 신규 박테리오파지 ΦCJ27의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 신규 박테리오파지 ΦCJ27의 내산성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 신규 박테리오파지 ΦCJ27의 60 ℃에서의 내열성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 당해 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 발명의 일 양태는,장독소성 대장균 (Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) (이하, 'ΦCJ27')을 제공한다.
장독소성 대장균은 그람 음성의 간균으로 락토오스 (Lactose), 프럭토오스 (Fructose)를 분해하여 산과 가스를 생성하는 호기성 또는 통성 혐기성균이다. 장독소성 대장균은 보통의 배지에서도 잘 자라며 약 7℃ 내지 48℃의 온도에서 발육 가능하고 발육 최적 온도는 약 35℃ 내지 37℃일 수 있다. 또한 장독소성 대장균은 pH 4.5 내지 pH 9의 범위에서 발육 가능하다.
장독소성 대장균은 콜레라균 (Vibrio cholerae)과 유사한 독소를 생산하기 때문에 장독소성 대장균에 감염되면 콜레라에 감염된 경우와 유사한 병증을 나타낼 수 있게 된다. 상기 생산되는 독소는 크게 이열성 독소 (heat-labile enterotoxin, LT) 및 내열성 독소 (heat-stable enterotoxin, ST) 두 가지로 구별된다. 상기 이열성 독소는 약 60℃에서 약 10분 동안 가열하는 경우 활성을 잃는 독소이고 상기 내열성 독소는 약 100℃에서 약 30분 동안 가열하여도 활성을 잃지 않는 내성을 나타내는 독소를 말한다.
장독소성 대장균은 소장 상부에서 증식하며, 장독소성 대장균의 농도가 장액의 단위 부피 (1 ml)당 약 107 cfu (colony formation unit) 내지 108 cfu에 도달한 경우에 대장균증을 비롯한 대장균 감염성 질병을 유발할 수 있게 된다.
박테리오파지 (bacteriophage)는 특정 세균에 감염하여 당해 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스로, 단일 혹은 이중 사슬의 DNA (Deoxyribonucleic acid) 또는 RNA (Ribonucleic acid)를 유전 물질로 포함하는 바이러스를 의미한다.
구체적으로, 본 양태의 박테리오파지 ΦCJ27은 장독소성 병원성 대장균을 선택적으로 감염시키는 종 특이성을 갖는 박테리오파지로서, 긴 머리 (elongated head)를 가지며 수축성이 있는 꼬리 (contractile tail)가 관찰되는 구조를 갖는, 형태학상 마이오비리데 (Myoviridae)에 속하는 박테리오파지이다(도 1 참조).
박테리오파지 ΦCJ27의 염기서열과 다른 박테리오파지의 해독 염기 서열의 상동성을 비교한 결과는 [표 1]과 같다. 박테리오 파지 ΦCJ27의 내산성에 있어서는 pH 2.0부터 pH 5.0 까지 활성을 잃지 않고 안정적이며(도 4), 내열성에 있어서는 60 ℃에서 1시간 동안 노출되었을 때까지는 1 로그 이하의 활성 감소를 나타내었다(도 5). 박테리오파지 ΦCJ27의 DNA 염기서열은 서열목록상 서열번호 1과 같다.
상기 박테리오파지 ΦCJ27은 본 발명자들이 신규 분리한 박테리오파지로서, 2013년 10월 25 일자로 한국 미생물 보존 센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 KCCM11465P으로 기탁되었다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 박테리오파지 ΦCJ27은 장독소성 대장균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 항균 활성을 나타내기 때문에 장독소성 대장균에 의한 감염으로 유발되는 질병들을 예방하거나 치료하기 위한 목적으로 이용될 수 있다. 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 이용한 장독소성 대장균 감염성 질병의 예로 대장균증 (Colibacillosis)을 들 수 있고, 구체적으로 돼지 대장균증 (Colibacillosis in pigs)을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "대장균증"이란, 동물에 병원성 대장균이 감염되어 발생하는 질병을 의미하며 그 증상으로 패혈증, 설사 (신생기 설사 및 이유 후 설사), 독혈증 (부종병 및 뇌척수혈관증) 등이 나타난다. 이 중에서 패혈증은 생후 2일 내지 3일 이내의 신생기에 주로 발생하는 급성의 전신 감염증으로 폐사율이 상당히 높다. 설사는 1주 내지 2주령 이내의 포유기 및 이유 직후에 다발하는 장관 감염증으로 폐사 또는 발육 장애의 원인이 된다. 독혈증은 이유 후 8주 내지 12주령의 자돈에서 주로 발병하며 부종 및 신경 증상을 나타내다 급사를 일으키는 경우가 빈번히 발생한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"이란, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 및/또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 동물에 제공하여 해당 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 및/또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 동물에 제공하여 기(旣)감염된 해당 질병의 증세를 호전시키거나 개선시키는 모든 행위를 의미한다.
본 양태의 상기 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 5×102 내지 5×1012 pfu/㎖로 함유할 수 있으며, 구체적으로, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 1×106 내지 1×1010 pfu/㎖로 함유할 수 있다.
본 양태의 상기 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
본 양태에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및/또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 양태의 상기 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
상기 경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 양태의 조성물을 정제 또는 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스 (Saccharose), 솔비톨 (Sorbitol), 만니톨 (Mannitol), 전분, 아밀로펙틴 (Amylopectin), 셀룰로오스 (Cellulose) 또는 젤라틴 (Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 (dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘 (magnesium stearate), 스테아르산 칼슘 (calcium stearate), 스테아릴 푸마르산 나트륨 (sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 (polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 함유할 수 있다.
본 양태의 조성물을 비경구 투여하는 방법으로는 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다.
상기 비경구 투여를 위한 제형으로는, 예를 들어 피하 주사, 정맥 주사 또는 근육 내 주사 등의 주사용 형태; 좌제 주입 방식; 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다. 상기 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 양태의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 (ampoule) 또는 바이알 (vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 상기 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 양태의 상기 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 적합한 도포, 분무 또는 투여량은, 상기 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로는 물론, 투여 대상이 되는 동물의 나이, 체중, 성별, 질병 증상의 정도, 섭취하는 음식, 배설 속도 등과 같은 요인들에 의해 다양해 질 수 있으며, 보통으로 숙련된 수의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.
본 발명에 사용되는 용어 "항생제"란, 약제 형태로 인간을 포함한 동물에 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 효능을 갖는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭하는 개념에 해당한다.
본 양태의 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 항생제는 종래 항생제에 비하여 장독소성 대장균에 대한 특이성이 매우 높아 익균은 죽이지 않고 특정 병원균만을 사멸시킬 수 있으며, 약물 내성을 유도하지 않아 종래의 항생제에 비하여 제품 수명이 연장된 신규 항생제로 이용될 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 제공한다.
본 양태의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 이를 포함하는 조성물을 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료 또는 음용수에 혼합시키는 방식으로 사용되거나, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 이를 포함하는 조성물을 사료 또는 음용수 제조 시 직접 첨가하는 방식으로 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제로 사용되는 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 포함하는 조성물은 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 예를 들어, 건조된 분말 형태일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 박테리오파지 ΦCJ27는 분말 형태로 사료 첨가제 중량의 0.05 내지 10 중량%, 구체적으로 0.1 내지 2 중량%의 성분비로 혼합될 수 있다.
본 양태의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 건조된 분말 형태로 제조하기 위한 건조 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 건조 방법의 비제한적인 예로는, 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조, 동결 건조 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 가지 이상의 방법을 함께 이용하는 방식으로 수행될 수 있다.
본 양태의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 상기 첨가될 수 있는 미생물의 비제한적인 예로는, 단백질 분해 효소, 지질 분해 효소 및/또는 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 등과 같은 고초균; 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능을 갖는 락토바실러스 균주 (Lactobacillus sp.)등과 같은 유산균; 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 갖는 아스퍼질러스 오리자에 (Aspergillus oryzae) 등과 같은 사상균; 및 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 등과 같은 효모로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 양태의 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 필요에 따라 기타 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 사용 가능한 첨가제의 비제한적인 예로는, 사료 또는 음용수의 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등; 사료 또는 음용수의 효용 증대를 위하여 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백질태질소화합물 (非蛋白質態窒素化合物), 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제 또는 올리고당 등이 있으며, 그 외에 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 함께 첨가될 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 사료 100 중량부에 대하여, 0.05 내지 10 중량부로 함유될 수 있으며, 구체적으로, 0.1 내지 2 중량부로 함유될 수 있다. 본 발명의 상기 음용수 첨가제는 음용수 100 중량부에 대하여, O.0001 내지 0.01 중량부로 함유될 수 있으며, 구체적으로 0.001 내지 0.005 중량부로 함유될 수 있다. 상기 범위 내에서 장독소성 대장균에 대한 박테리오파지 ΦCJ27의 활성이 충분히 발휘되는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 사료 또는 음용수에 첨가하거나, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 사료 또는 음용수에 직접 첨가하여 제조된 사료 또는 음용수를 제공한다
본 양태에서 사용되는 사료는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 양태에서 사용되는 음용수는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 음용수를 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는, 소독제 또는 세척제를 제공한다. 상기 소독제 또는 세척제의 제형은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 알려진 제형으로 제조되어 사용될 수 있다.
상기 소독제는 장독소성 대장균을 제거하기 위하여 살포될 수 있으며 동물의 활동 영역, 도축장, 폐사 지역, 조리 장소 또는 조리 설비 등에 살포될 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.
상기 세척제는 장독소성 대장균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 동물의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척하는 용도로 사용될 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 장독소성 대장균에 의해 감염되었거나 감염될 위험이 있는 인간을 제외한 대상체에 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 이를 포함하는 조성물의 적합한 1일 총 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며 이는 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명한 사항이다.
특정 동물에 대한 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 구체적인 약학적 유효량은, 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 해당 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 또는 식이는 물론, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 이를 포함하는 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다.
본 양태의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에 분무식 비강 투여되거나, 동물의 사료 또는 음용수에 직접 첨가되어 이를 섭식시키는 방식으로 투여될 수 있으며, 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제의 형태로 사료 또는 음용수에 혼합되어 투여될 수 있다.
본 양태의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 조직에 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 이를 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 즉, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] - 장독소성 대장균에 감염하는 박테리오파지의 분리
< 실시예 1-1>
박테리오파지 스크리닝 및 단일 박테리오파지 분리
충청도 홍성군 광천 지역의 삼화원종 농장 지역의 양돈 분변 및 환경 샘플로부터 수득한 시료 50 ㎖를 4,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 그 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 시료액을 준비하고 이를 이용하여 소프트 아가 오버레이 (soft agar overlay) 방법을 수행하였다. 상기 소프트 아가 오버레이 방법이란 탑-아가 (top-agar, 0.7% 한천을 이용하여 고체 배지 위에 붙이는 것)에서 성장하는 숙주세포를 이용하여 박테리오파지가 용균하는 것을 관찰하는 방법을 말한다.
구체적으로, 건국대학교 수의학과에서 분리한 장독소성 대장균 (UK27) 진탕 배양액 (OD600 = 2) 150 ㎕와 10×LB 배지 (트립토판 (tryptone) 10 g/ℓ; 효모 추출물 5 g/ℓ; NaCl 10 g/ℓ) 2 ㎖에 상기 시료 여과액 18 ㎖를 혼합하고 이를 30℃에서 18시간 동안 배양한 다음, 상기 배양액을 4,000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 그 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하였다. 그 다음, LB 평판 배지 위에 0.7%(w/v) 한천 5㎖와 장독소성 대장균 (UK27) 진탕 배양액 (OD600 = 2) 150 ㎕의 혼합액을 부어 굳힌 후, 그 위에 상기 시료액 10 ㎕를 적가하고 30℃에서 18시간 동안 배양하여 용균반이 형성됨을 확인하였다.
하나의 용균반에는 한 종류의 박테리오파지가 존재한다고 알려져 있기 때문에, 상기 형성된 용균반으로부터 단일 박테리오파지를 분리하고자 하였다. 구체적으로, 상기 용균반을 400 ㎕의 SM 용액 (NaCl 5.8 g/ℓ; MgSO47H2O 2 g/ℓ; 1M Tris-Cl (pH 7.5) 50 ㎖)에 가하고 실온에서 4시간 동안 방치하여 박테리오파지 용액을 수득하였다. 이어서, 상기 박테리오파지 용액 100 ㎕를 0.7%(w/v) 한천 5 ㎖ 및 장독소성 대장균 (UK27) 진탕 배양액 (OD600 = 2) 150 ㎕와 혼합하고 150 mm 지름의 LB 평판 배지를 이용한 소프트 아가 오버레이 방법을 수행하였으며, 완전히 용균될 때까지 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 LB 평판 배지에 5 ㎖의 SM 용액을 가하고 실온에서 4시간 동안 방치하여 박테리오파지 용액을 수득하였다.
상기 용액을 회수하고, 1%(v/v) 클로로포름을 가한 다음, 10분간 혼합하고 4,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였으며 상기 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 최종 시료를 수득하였다.
< 실시예 1-2>
박테리오파지의 대량 배양 및 정제
상기 실시예 1-1에서 수득한 박테리오파지를 장독소성 대장균 (UK27)을 이용하여 대량으로 배양하고 이로부터 박테리오파지를 정제하였다.
구체적으로, 장독소성 대장균 (UK27)을 진탕 배양하여 1.5×1010 cfu가 되도록 분주하여 4,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 이를 4 ㎖ SM 용액에 재부유시켰다. 여기에 상기 박테리오파지를 1.5×107 pfu로 접종하고 MOI (multiplicity of infection) = 0.001로 적정한 다음, 상온에서 20분간 정치시켰다. 이어서, 이를 150 ㎖ LB 배지에 접종하고 30℃에서 5시간 동안 배양하였다.
배양이 종료된 후, 최종 부피의 1%(v/v)가 되도록 클로로포름을 첨가하고 20 분간 교반하였으며 제한 효소인 DNase I과 RNase A를 각각 최종 농도 1 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고 30℃에서 30분 동안 정치시켰다. 그 다음, 최종 농도가 각각 1M과 10%(w/v)가 되도록 NaCl과 폴리에틸렌 글리콜을 가하고 4℃에서 3 시간 동안 추가 정치시켰으며 4℃에서 12,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 침전물을 수득하였다.
상기 수득한 침전물을 5 ㎖ SM 용액에 현탁시키고 20 분간 실온에서 정치시킨 다음, 1 ㎖ 클로로포름을 가하여 교반하고 4℃에서 4,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과한 다음, 글리세롤 밀도 구배법 (밀도: 40%, 5% 글리세롤)을 이용한 초원심 분리 (35,000 rpm, 1시간, 4℃)를 수행하여 박테리오파지를 정제하였다.
본 발명자는 양돈분으로부터 시료를 채취하여, 장독소성 대장균에 대한 특이적 사멸능을 갖는 상기 박테리오파지를 "Bacteriophage ΦCJ27"로 명명하고, 2013년 10월 25일 한국미생물 보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM11465P호로 기탁하였다.
< 실시예 2>
Φ CJ27 의 형태 관찰
상기 실시예 1에서 정제한 박테리오파지 ΦCJ27을 0.01% 젤라틴 용액에 희석하고 2.5% 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 이를 탄소 코팅된 운모판 (carbon-coated mica plate (ca. 2.5 mm×2.5 mm))에 적가하여 10분간 적응시킨 다음, 멸균 증류수로 세척하였다. 탄소 피막 (carbon film)을 구리 그리드 (copper grid)에 끼워 2% 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate)에서 60 초간 염색하고 건조한 다음, 투과 전자 현미경 (JEM-1011, 120 kV, 배율 ×200,000)으로 검경하였다 (도 1).
도 1은 박테리오파지 ΦCJ27의 투과 전자 현미경 사진을 나타낸 것으로, 긴 머리(elongated head)를 가지며 수축성이 있는 꼬리(contractile tail)로 구성된 형태형(morphotype)을 나타내는 것으로 보아 마이오비리데(Myoviridae)에 속함을 알 수 있었다.
< 실시예 3>
Φ CJ27 의 전체 게놈 DNA 의 크기 분석
상기 실시예 1에서 정제한 박테리오파지 ΦCJ27로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
구체적으로, 정제된 박테리오파지 ΦCJ27 배양액에 20 mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), 50 ㎍/㎖ 단백질 분해 효소 (proteinase) K 및 0.5%(w/v) SDS (sodium dodecyl sulfate)를 가하고 50℃에서 1시간 동안 정치하였으며 동일 부피의 페놀 (pH 8.0)을 가하여 교반한 다음, 실온에서 12,000 rpm으로 10 분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였다.
상기 상등액을 동일 부피의 PC (페놀: 클로로포름 = 1 : 1)와 혼합하고 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 동일 부피의 클로로포름과 혼합하고 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 그 상등액을 수득하였다. 상기 상등액에 3M 초산 나트륨 (sodium acetate)을 전체 부피의 10%(v/v)가 되도록 가하여 혼합하고, 2배 부피의 차가운 95% 에탄올을 가하여 혼합한 다음, -20℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 이어서, 0℃에서 10분간 12,000 rpm으로 원심 분리한 후 상등액을 제거하여 침전물을 수득한 다음, 이에 50 ㎕ TE 완충액 (Tris-EDTA, pH 8.0)을 가하여 용해하였다. 상기에서 추출된 DNA를 10배 희석하여 OD260에서 흡광도를 측정하여 농도를 측정하였다.
그 다음, 1 ㎍의 DNA를 1% PFGE (pulse-field gel electrophoresis) 아가로스겔에 로딩하고, 바이오래드 (BIORAD) PFGE 시스템 7번 프로그램 (크기 범위 25 kb 내지 100 kb; 스위치 타임 램프 (switch time ramp) 0.4초 내지 2.0초, 선형 (linear shape); 순방향 전압 (forward voltage) 180 V; 역방향 전압 (reverse voltage) 120 V)을 이용하여 상온에서 20 시간 동안 전개하였다 (도 2).
도 2는 박테리오파지 ΦCJ27의 게놈 DNA의 전기 영동 사진으로서, 박테리오파지 ΦCJ27의 게놈 DNA는 98 kb 이상임을 나타냄을 확인할 수 있었다. 도 2에서 M은 크기 측정의 기준이 되는 DNA이다.
< 실시예 4>
Φ CJ27 의 단백질 패턴 분석
1011 pfu/㎖ 타이터 (titer)의 정제된 박테리오파지 ΦCJ27 용액 15 ㎕와 5×SDS 시료 용액 3 ㎕를 혼합하고 5분간 끓인 다음, 12% SDS-PAGE를 수행하였다 (도 3).
도 3은 박테리오파지 ΦCJ27을 대상으로 수행한 SDS-PAGE 결과를 나타내는 전기 영동 사진으로서, 약 27.9 kDa, 51.8 kDa 및 74.5 kDa 크기의 주요 단백질을 확인할 수 있었다.
< 실시예 5>
Φ CJ27 의 유전적 특성 분석
상기 실시예 1에서 정제한 박테리오파지 ΦCJ27의 유전자적 특성을 알아보기 위하여, 박테리오파지 ΦCJ27의 DNA를 유전자 분석기기 FLX 티타늄 시퀀서 (titanium sequencer)(Roche)를 사용하여 분석하였다. (주)마크로젠 (Macrogen Inc.)에서 GS와 드 노보 어셈블리 소프트웨어 (de novo assembler software)(Roche)를 사용하여 유전자를 조합하였다. 전사 해석틀 (open reading frame)은 GeneMArk.hmm, Glimmer v3.02 및 FGENESB 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. BLASTP와 인터프로스캔 (InterProScan) 프로그램을 사용하여 전사 해석틀의 이름을 명명 (annotation)하였다.
상기 박테리오파지의 염기 서열은 기존에 보고된 박테리오파지(Enterobacteria phage HX01, complete genome)의 염기 서열과 다양한 유사성을 보였으나, 모든 단편이 100% 일치하는 박테리오파지는 없는 것으로 확인되었다. 이에 상기 박테리오파지는 신규 분리된 박테리오파지임을 확인할 수 있었다.
하기 표 1은 박테리오파지 ΦCJ27의 염기 서열과 다른 박테리오파지의 해독 염기 서열의 상동성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
Query Subject 　 Identities
Name Length Start End Description E- Value Match / Total Pct .(%)
서열번호 1 171637 144696 167103 Enterobacteria phage HX01, complete genome 0 21905/22425 97
상기 제조된 박테리오파지 ΦCJ27의 DNA를 유전자 분석기기를 사용하여 분석한 염기 서열 전체의 결과는 서열목록상 서열번호 1과 같다.
< 실시예6 >
pH 에 따른 Φ CJ27 의 안정성 조사
박테리오파지 ΦCJ27이 위장 내의 조건에서와 같이 낮은 pH에서 안정성을 보유할 수 있는지를 확인하기 위하여 다양한 pH 범위 (pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0)에서 안정성 조사 실험을 실시하였다.
실험을 위하여 다양한 pH 용액 (아세트산 나트륨 완충 용액 (pH 4.0 및 pH 5.0), 시트르산 나트륨 완충 용액 (pH 2.0 및 pH 3.0)을 각각 0.2 M로 제작하였다.
상기 각 pH 용액 180 ㎕와 3.8×109 PFU/㎖ 타이터의 박테리오파지 용액 20㎕를 섞어 각 pH 용액의 농도가 1M이 되게 한 후, 2 시간 동안 상온에서 정치하였다. 대조군은 동일한 방법으로 3.8×109 PFU/㎖ 박테리오파지 용액 20 ㎕를 SM 용액 180 ㎕에 섞어 준 후, 2 시간 동안 상온에서 정치하였다. 그 다음, 이들을 단계 희석하고 소프트 아가 오버레이 방법을 이용하여 각 단계의 희석액을 10 ㎕씩 떨어뜨린 뒤 30℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다 (도 4).
도 4는 박테리오파지 ΦCJ27의 내산성 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 박테리오파지 ΦCJ27는 pH 2.0부터 pH 5.0까지 활성을 잃지 않고 안정적임을 확인할 수 있었다.
< 실시예 7>
온도에 따른 Φ CJ27 의 안정성 조사
박테리오파지의 제품 제형 중 사료 첨가제로 이용할 경우 박테리오파지의 제형 과정에서 열이 발생할 수 있으므로, 열에 대한 안정성을 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 3.8×108 PFU/㎖ 농도의 박테리오파지 ΦCJ27의 용액 200 ㎕를 60℃의 온도 조건 하에서 각각 0 분, 30분, 60분 및 120분 동안 정치시켰다. 그 다음, 상기 처리한 실험 배양액을 단계 희석하여 소프트 아가 오버레이 방법으로 각 단계의 희석액 10 ㎕씩 떨어뜨린 뒤 30℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다 (도 5).
도 5는 박테리오파지 ΦCJ27의 내열성 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 5에 나타난 바와 같이, 박테리오파지 ΦCJ27는 60℃에서 1 시간 동안 노출되었을 때까지는 약 1 로그 이하 활성 감소를 보였고, 120분 노출 시에는 1 로그 이상의 활성이 감소됨을 알 수 있었다.
< 실시예 8>
야생 분리주 장독소성 대장균에 대한 Φ CJ27 의 감염 범위 조사
실험에 사용된 장독소성 대장균 (UK27) 이외에 서울대학교 수의과대학, 건국대학교 수의과대학 및 검역원에서 분리한 야생 분리주 장독소성 대장균 99주에 대하여, 박테리오파지 ΦCJ27의 용균 활성이 있는지 여부를 확인하였다. 이 분리주는 F-혈청형 F4 타입(type) 37주, F5 타입 31주, F6 타입 7주, F18 타입 19 주 및 기타 균주 5주이다.
구체적으로, 각 균주의 진탕 배양액 (OD600 = 2) 150 ㎕를 섞어 소프트 아가 오버레이 방법을 진행하여 109 pfu/㎖ 타이터의 박테리오파지 ΦCJ27의 용액 10 ㎕씩 떨어뜨린 뒤 30℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균반 형성 유무를 관찰하였다.
상기 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
no . Type strains Ø CJ27 no . Type Host cell Ø CJ27
1 F4 345 51 F5 UK21 O
2 105 O 52 UK23 O
3 122 53 UK24 O
4 O149 54 UK25 O
5 JG280 O 55 UK26 O
6 F4 O 56 1-1 O
7 162 O 57 6-1 O
8 160 O 58 9
9 107 O 59 10 O
10 RO8 O 60 14
11 193 61 16 O
12 274 O 62 17
13 3220 O 63 30 O
14 UK1 O 64 31
15 UK3 65 34
16 UK4 66 35
17 UK7 O 67 21 O
18 UK8 O 68 23 O
19 UK9 O 69 F6 F6
20 UK11 70 626 O
21 UK14 O 71 p87 O
22 UK15 O 72 S127 O
23 UK16 O 73 132
24 UK17 O 74 133
25 UK18 O 75 135
26 UK19 O 76 F18 UK5
27 UK20 O 77 UK6 O
28 O105 O 78 UK10 O
29 UK24 O 79 UK12 O
30 UK25 O 80 UK13 O
31 UK26 O 81 UK22
32 UK29 82 UK27 O
33 UK30 O 83 E2-4 O
34 UK31 O 84 5 O
35 66-1 O 85 8
36 검역 43 O 86 11
37 검역 45 87 12
38 2618 O 88 23
F5
39 2617 89 24
40 1 90 25
41 2 91 28 O
42 3 O 92 31
43 4 O 93 35
44 5 O 94 42
6
45 O 95 49
46 F5O41 O 96 기타 UK32
47 645 97 UK33
48 k99 98 UK34 O
49 S192 99 UK35 O
50 UK2 100 UK36 O
상기 표 2에서 나타난 바와 같이, 박테리오파지 ΦCJ27는 일반 양돈 농가에서 돼지 설사의 원인균으로 상당 부분을 차지하고 있는 F-혈청형 F4, F5, F6, F18 타입 등에 대한 감염능을 보이고 있어서 현장 적용 시 우수한 효율성을 나타낼 것으로 기대된다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11465P 20131025

Claims (12)

  1. 장독소성 대장균 (Enterotoxigenic Escherichia coli)에 특이적인 사멸능을 갖는, 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P).
  2. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 감염성 질병은 대장균증인, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는 항생제.
  5. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 사료 첨가제.
  6. 제5항의 사료 첨가제를 포함하는, 사료.
  7. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)를 유효 성분으로 포함하는, 음용수 첨가제.
  8. 제7항의 음용수 첨가제를 포함하는, 음용수.
  9. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 소독제.
  10. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 세척제.
  11. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 또는 제2항의 상기 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 감염성 질병은 대장균증인, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법.

KR1020140044996A 2014-04-15 2014-04-15 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물 KR101591793B1 (ko)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140044996A KR101591793B1 (ko) 2014-04-15 2014-04-15 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물
BR112016023613-0A BR112016023613B1 (pt) 2014-04-15 2015-03-13 Composição, usos da composição, aditivo alimentar, alimentos, aditivo para água potável, água potável, desinfetante, e detergente
US15/304,489 US9950018B2 (en) 2014-04-15 2015-03-13 Bacteriophage and composition comprising same
JP2016561664A JP6324535B2 (ja) 2014-04-15 2015-03-13 新たなバクテリオファージ及びこれを含む組成物
PCT/KR2015/002472 WO2015160089A1 (ko) 2014-04-15 2015-03-13 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물
EP15780499.8A EP3133152B1 (en) 2014-04-15 2015-03-13 Novel bacteriophage, and composition containing same
TR2019/01906T TR201901906T4 (tr) 2014-04-15 2015-03-13 Yeni bakteriyofaj ve bunu içeren antibakteriyel bileşim.
CN201580020154.XA CN106232806B (zh) 2014-04-15 2015-03-13 新型噬菌体以及包含其的组合物
PH12016502003A PH12016502003B1 (en) 2014-04-15 2016-10-10 Novel bacteriophage and composition containing same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140044996A KR101591793B1 (ko) 2014-04-15 2014-04-15 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150118836A true KR20150118836A (ko) 2015-10-23
KR101591793B1 KR101591793B1 (ko) 2016-02-04

Family

ID=54324250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140044996A KR101591793B1 (ko) 2014-04-15 2014-04-15 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9950018B2 (ko)
EP (1) EP3133152B1 (ko)
JP (1) JP6324535B2 (ko)
KR (1) KR101591793B1 (ko)
CN (1) CN106232806B (ko)
BR (1) BR112016023613B1 (ko)
PH (1) PH12016502003B1 (ko)
TR (1) TR201901906T4 (ko)
WO (1) WO2015160089A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022181891A1 (ko) * 2021-02-23 2022-09-01 씨제이제일제당(주) 장독소성 대장균에 대한 특이적인 사멸능을 가지는 신규한 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101381793B1 (ko) 2013-02-27 2014-04-07 씨제이제일제당 (주) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101761573B1 (ko) * 2014-12-29 2017-07-26 주식회사 인트론바이오테크놀로지 신규한 장출혈성 대장균 박테리오파지 Ｅｓｃ-ＣＨＰ-1 및 이의 장출혈성 대장균 증식 억제 용도
KR101761581B1 (ko) * 2014-12-30 2017-07-26 주식회사 인트론바이오테크놀로지 신규한 장침입성 대장균 박테리오파지 Ｅｓｃ-ＣＯＰ-4 및 이의 장침입성 대장균 증식 억제 용도
KR101649851B1 (ko) 2014-12-30 2016-08-30 주식회사 인트론바이오테크놀로지 신규한 시가독소생산 F18형 대장균 박테리오파지 Ｅｓｃ-ＣＯＰ-1 및 이의 시가독소생산 F18형 대장균 증식 억제 용도
KR101761578B1 (ko) * 2014-12-30 2017-07-26 주식회사 인트론바이오테크놀로지 신규한 장병원성 대장균 박테리오파지 Ｅｓｃ-ＣＨＰ-2 및 이의 장병원성 대장균 증식 억제 용도
US11058131B2 (en) 2015-04-16 2021-07-13 Kennesaw State University Research And Service Foundation, Inc. Escherichia coli O157:H7 bacteriophage Φ241
US11583565B2 (en) * 2020-04-04 2023-02-21 Intron Biotechnology, Inc. Compositions and methods for inhibiting the proliferation of pathogenic Escherichia coli
US11596659B2 (en) * 2020-05-12 2023-03-07 Intron Biotechnology, Inc. Compositions and methods for inhibiting the proliferation of pathogenic Escherichia coli
US20220105142A1 (en) * 2020-10-01 2022-04-07 Intron Biotechnology, Inc. Compositions and methods for inhibiting the proliferation of pathogenic escherichia coli
CN112280749B (zh) * 2020-10-16 2022-03-11 青岛农业大学 大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_swi3及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1458856B1 (en) 2001-12-13 2012-06-13 Societe Des Produits Nestle S.A. Isolated phages and their use in food or pet food products
KR101101376B1 (ko) 2009-10-16 2012-01-02 경희대학교 산학협력단 대장균 또는 시겔라속 균에 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지
CN101724607B (zh) * 2009-12-18 2012-05-09 江苏省农业科学院 一种产肠毒素性大肠杆菌的噬菌体ek99-c及其应用
CN102266552A (zh) * 2011-03-29 2011-12-07 佛山科学技术学院 特异性防治畜禽类养殖动物大肠杆菌性腹泻的复方微生物制剂及其制备
KR101260645B1 (ko) * 2011-11-14 2013-05-03 씨제이제일제당 (주) 대장균 특이적 사멸능을 나타내는 신규 분리된 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101299179B1 (ko) 2012-04-18 2013-08-22 씨제이제일제당 (주) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101381797B1 (ko) 2013-02-27 2014-04-07 씨제이제일제당 (주) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101381798B1 (ko) 2013-02-27 2014-04-07 씨제이제일제당 (주) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101381795B1 (ko) * 2013-02-27 2014-04-07 씨제이제일제당 (주) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101381793B1 (ko) 2013-02-27 2014-04-07 씨제이제일제당 (주) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022181891A1 (ko) * 2021-02-23 2022-09-01 씨제이제일제당(주) 장독소성 대장균에 대한 특이적인 사멸능을 가지는 신규한 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
EP3133152A1 (en) 2017-02-22
JP6324535B2 (ja) 2018-05-16
BR112016023613A2 (pt) 2017-10-17
PH12016502003A1 (en) 2017-01-09
JP2017518036A (ja) 2017-07-06
CN106232806A (zh) 2016-12-14
EP3133152A4 (en) 2017-12-27
EP3133152B1 (en) 2018-12-26
BR112016023613B1 (pt) 2022-09-13
TR201901906T4 (tr) 2019-03-21
US9950018B2 (en) 2018-04-24
WO2015160089A1 (ko) 2015-10-22
US20170035817A1 (en) 2017-02-09
PH12016502003B1 (en) 2017-01-09
KR101591793B1 (ko) 2016-02-04
CN106232806B (zh) 2019-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101591793B1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물
KR101381795B1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101590108B1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물
KR101260645B1 (ko) 대장균 특이적 사멸능을 나타내는 신규 분리된 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101381797B1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101381796B1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101381798B1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101381793B1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101299179B1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101591795B1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물
US10925909B2 (en) Bacteriophage and composition comprising same

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181126

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191125

Year of fee payment: 5