ES2586203T3 - Composición anti-fúngica mejorada - Google Patents

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ES2586203T3 ES10178203.5T ES10178203T ES2586203T3 ES 2586203 T3 ES2586203 T3 ES 2586203T3 ES 10178203 T ES10178203 T ES 10178203T ES 2586203 T3 ES2586203 T3 ES 2586203T3
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Ferdinand Theodorus Jozef Rijn Van
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Abstract

Un procedimiento para la producción de natamicina a partir de un caldo de fermentación que contiene biomasa y natamicina, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) desintegrar la biomasa mediante calentamiento durante 1 a 8 horas a 30 hasta 50ºC; (b) separar la natamicina del caldo de fermentación tratado de este modo mediante centrifugación por gradiente de gravedad para obtener una suspensión de natamicina; (c) ajustar el pH de la suspensión de natamicina a un valor que oscila entre 10,0 y 11,0 y añadir una cantidad de propanol suficiente para disolver la natamicina en la suspensión de natamicina; (d) separar los sólidos insolubles de la disolución de natamicina obtenida en la etapa (c) mediante filtración en membrana, seguida de filtración en profundidad; (e) bajar el pH de la disolución de natamicina obtenida en la etapa (d) a un pH de 5 a 8 para precipitar la natamicina; (f) separar mediante filtración la natamicina de la suspensión de natamicina; (g) secar la natamicina separada; y (h) reducir el tamaño de la natamicina secada.

Description

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DESCRIPCION
Composicion anti-fungica mejorada Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a una composicion anti-fungica mejorada, a un procedimiento para preparar una composicion anti-fungica de este tipo y a su uso.
Antecedentes de la invencion
La necesidad de metodos mejorados de conservacion de alimentos es grande. Se ha estimado que aproximadamente una cuarta parte del suministro mundial de alimentos se pierde como resultado de la descomposicion microbiana e infecciones microbianas transmitidas por los alimentos representan una amenaza constante y grave para la salud humana.
La descomposicion por hongos puede conducir a graves perdidas economicas. Varios productos alimenticios, p. ej., productos agncolas, productos lacteos y carnicos, frutas y verduras y productos derivados, productos de panadena y cosmeticos son muy susceptibles al desarrollo de hongos. Ejemplos de productos lacteos son el queso, queso fresco, requeson y yogur. Embutidos curados secos son un ejemplo de los productos carnicos. Ejemplos de productos agncolas son cultivos como los cereales, frutos secos, frutas, verduras y bulbos de flores. La descomposicion por hongos no solo afecta a la calidad del producto, sino que tambien representa un riesgo para la salud. Es bien sabido que algunas especies de hongos, que crecen, p. ej., en productos lacteos y embutidos, pueden producir micotoxinas. Algunas micotoxinas son extremadamente peligrosas, ya que pueden causar enfermedades letales. Por lo tanto, siempre se debe evitar el brote de los hongos no deseados en y sobre los productos alimenticios.
Tecnicas de conservacion de alimentos, p. ej., tratamiento termico, congelacion, ultrasonidos, irradiacion y envasado en atmosfera modificada, reducen significativamente la carga microbiana, pero de especial preocupacion es la evidencia de que los alimentos procesados estan siendo contaminados con microorganismos despues del procesamiento y antes del envasado. De creciente preocupacion en la industria alimentaria es el deterioro microbiano de diversos alimentos tales como productos lacteos y carnicos, aderezos, pastas para untar, margarinas y marisco. Especialmente los productos alimenticios en el intervalo de pH de 2,0 a 7,0 se sabe que son susceptibles a la descomposicion microbiana por levaduras, hongos, bacterias tolerantes de acidos y/o bacterias formadoras de esporas mesofilas o termofilas y no formadoras de esporas.
En su mayona, los alimentos procesados no se consumen directamente despues del procesamiento, permitiendo de esta manera que se desarrollen bacterias, levaduras u hongos introducido por la contaminacion posterior. Dado que el consumo de alimentos puede producirse sin recalentar los alimentos procesados a temperaturas suficientes durante un tiempo suficiente, existe el riesgo de intoxicacion alimentaria o descomposicion de los alimentos. Ademas de ello, la tendencia reciente a alimentos mmimamente procesados con las cualidades nutricionales y sensoriales intnnsecas de los alimentos crudos y frescos ha planteado un nuevo riesgo de seguridad. Tratamientos de conservacion mas suaves tales como alta presion hidrostatica y campos electricos pulsados han demostrado tener exito, pero dependen de obstaculos eficaces, es decir, la cadena del frio y la adicion de agentes antimicrobianos naturales.
Ha habido una amplia investigacion realizada en el campo de la seguridad alimentaria para desarrollar composiciones anti-fungicas eficaces. Natamicina, tambien conocida como pimaricina o tennecetina, es un antibiotico de polieno, que ha sido conocida desde finales de los cincuenta (Struyk et al. Antibiot. Ann 1957-1958, 878) y que se utiliza actualmente como un conservante en muchos productos alimenticios y agncolas. El documento US 5.821.233 describe natamicina que exhibe una alta velocidad de liberacion de al menos 3 jg/24 horas durante las primeras 24 horas cuando entra en contacto sobre un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga de soporte de 40 |jg de natamicina. El documento US 5.997.926 describe complejos de natamicina con velocidades de liberacion similares. Para algunas aplicaciones de alimentos, este tipo de natamicina con una alta velocidad de liberacion no ofrece una proteccion adecuada, ya que, por ejemplo, la duracion de la proteccion no es suficiente y/o la estabilidad de la natamicina no es optima. Como consecuencia de ello, sena necesaria una cantidad mas alta de natamicina para ofrecer una proteccion adecuada. Natamicina con una alta velocidad de liberacion tambien puede penetrar demasiado en el producto tratado, que puede ser no deseado en algunos productos.
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Para controlar la liberacion de natamicina, se ha propuesto la encapsulacion, vease, por ejemplo los documentos WO2005/018322 y US2005/042341. La encapsulacion no altera las caractensticas de la propia natamicina, sino que trata de asegurar una liberacion mas lenta de natamicina mediante la aplicacion de una barrera adicional. Esto requiere automaticamente etapas de formulacion adicionales despues de la recuperacion de la natamicina de una fuente de natamicina, que hace que el proceso de produccion de natamicina sea mas complicado cuando la natamicina en sf sena cambiado para dar una liberacion mas lenta.
El documento WO97/29207 describe un procedimiento para la recuperacion de natamicina a partir de un caldo de fermentacion que contiene biomasa y natamicina, que comprende desintegrar la biomasa y separar la natamicina del caldo de fermentacion asf tratado.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de composiciones anti-fungicas mejoradas que puedan resolver al menos algunos de estos problemas: liberacion mas lenta, duracion mas larga de la proteccion y/o una estabilidad mejorada.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a una composicion anti-fungica mejorada, especialmente se proporciona una natamicina, que exhibe una baja velocidad de liberacion de natamicina. Esta natamicina se prepara preferiblemente mediante el procedimiento definido mas adelante.
Procedimiento para preparar natamicina que exhibe una baja velocidad de liberacion de natamicina
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de la natamicina de la invencion con una baja velocidad de liberacion de natamicina tal como se define mas adelante. En el procedimiento de la invencion, la natamicina se recupera de un caldo de fermentacion que contiene biomasa y natamicina y dicho procedimiento comprende:
las etapas del procedimiento de la reivindicacion 1.
La primera ventaja del procedimiento de acuerdo con la invencion es que, sin encapsulacion u otro modo de procesamiento complejo, conduce a un producto de natamicina que tiene una velocidad de liberacion mas lenta que las formulaciones de alta liberacion de natamicina tales como los documentos US 5.997.926 y US 5.821.233, y otros productos de natamicina comercialmente disponibles tales como Delvocid® y Delvocid® Instant, tal como se ilustra en los Ejemplos. Al mismo tiempo, la velocidad de liberacion es lo suficientemente alta para ofrecer una proteccion mas larga. Sorprendentemente, el procedimiento de produccion de acuerdo con la invencion conduce a un producto con nuevas caractensticas que no podna haber sido anticipado a partir de la tecnica anterior.
Una segunda ventaja es que el procedimiento mantiene la ventaja de los procedimientos anteriores, vease, por ejemplo, el documento WO 97/29207, de que natamicina se separa de la biomasa y otras impurezas sin utilizar disolventes organicos, que es preferible desde un punto de vista medioambiental.
Las fermentaciones que producen natamicina habitualmente resultan en un caldo de fermentacion que comprende natamicina, solidos de biomasa, nutrientes disueltos o suspendidos, otros productos de fermentacion y agua.
El caldo de fermentacion contiene, en general, de al menos 2 g/l de natamicina, preferentemente al menos 7 g/l de natamicina. Por ejemplo, la concentracion de natamicina en el caldo de fermentacion puede ser de aproximadamente 7 g/l tal como se describe en el documento WO 93/03170. Dado que la natamicina tiene una solubilidad muy baja en agua bajo condiciones de fermentacion tfpicas, la natamicina en el caldo de fermentacion esta presente en forma solida. Preferiblemente, la natamicina esta presente principalmente en forma solida. Principalmente significa al menos 50%, preferiblemente al menos 70% y mas preferiblemente al menos 80%. Natamicina en forma solida significa 'natamicina no disuelta en agua'. La forma solida de natamicina presente en el caldo de fermentacion puede comprender, preferentemente, partfculas de natamicina. Las partfculas de natamicina son cristales de natamicina que, por ejemplo, pueden tener las siguientes formas: cristales en forma de aguja, cristales en forma de disco, o similares. Durante la fermentacion se forman partfculas de natamicina. Habitualmente, las partfculas de natamicina tienen diametros que oscilan entre 0,5-20 micrometros. El diametro de la partfcula de natamicina es la mayor distancia de una parte de la partfcula al otro extremo de la partfcula. Se han observado partfculas de natamicina en forma de aguja con un diametro de mas de 40 micrometros. Los diametros pueden determinarse utilizando un microscopio. Preferiblemente, en el procedimiento de la invencion, el caldo de fermentacion comprende partfculas de natamicina con un diametro medio de partfcula de al menos 2 micrometros,
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mas preferiblemente las partfculas de natamicina tienen un diametro medio de partfcula de al menos 5 micrometros, y lo mas preferiblemente las partfculas de natamicina tienen un diametro medio de partfcula de al menos 10 micrometros.
La biomasa de los organismos Streptomyces, utilizados en la produccion de natamicina, consiste generalmente en racimos (micelios) de hilos, aunque tambien pueden estar presentes otras formas de biomasa, p. ej., los llamados "granulos". En estos hilos (hifas) estan presentes compartimientos en los que se localizan actividades celulares. El tamano de estos hilos, tal como se presentan en los racimos, es, en general, de 10-30 micrometros (oscilando los diametros entre 0,5-1,0 micrometros).
De acuerdo con un procedimiento preferido, la natamicina esta presente principalmente en forma solida en el caldo de fermentacion. Preferiblemente, al menos 50% de la natamicina esta presente en forma solida, mas preferiblemente al menos 70%, incluso mas preferiblemente al menos 80%.
Etapa (a)
En la presente invencion, el caldo de fermentacion obtenido al final del proceso de fermentacion es tratado para desintegrar la biomasa. La desintegracion de la biomasa puede resultar en la lisis, solubilizacion de materias celulares y fragmentacion (reduccion de tamano) de los racimos y los hilos. La desintegracion de la biomasa puede verificarse mediante la visualizacion de la biomasa con un microscopio (aumento 400 x). La desintegracion es completa si apenas se pueden observar a traves del microscopio racimos o hilos de la biomasa. La desintegracion de la biomasa tambien puede determinarse midiendo la viscosidad del caldo de fermentacion. Por ejemplo, durante la desintegracion de una biomasa del tipo racimo, la viscosidad disminuye. Si la viscosidad no disminuye sustancialmente tras un tratamiento ulterior, la biomasa sera desintegrada lo suficientemente. Aunque diferentes condiciones de fermentacion o diferentes organismos Streptomyces utilizados en la produccion de natamicina pueden resultar en formas de la biomasa algo diferentes presentes al final de la fermentacion, un experto en la tecnica es capaz de encontrar una duracion adecuada de la desintegracion de la biomasa de cualquier caldo de fermentacion.
Homogeneizacion, mezcladura de alta cizalla y tecnicas ultrasonicas o tratamientos termicos, de pH (alcalino) o enzimaticos o tratamientos con agentes tensioactivos pueden, por ejemplo, utilizarse solos o en combinacion para desintegrar la biomasa. Las tecnicas de desintegracion se eligen de manera que se obtenga una desintegracion sin afectar sustancialmente a la natamicina. La mayor parte de la natamicina, por lo menos 80%, preferiblemente hasta el 100%, mantiene su forma solida y la actividad de la natamicina no se reducira sustancialmente. Ademas, resultara evidente para un experto en la tecnica que las tecnicas de desintegracion pueden no afectar de manera sustancial al tamano de partfculas de natamicina. Si el tamano de partfcula de natamicina se reduce como el tamano de partfcula de la biomasa, entonces la separacion de la natamicina de la biomasa sena diffcil. Un ejemplo eficaz de desintegracion es el uso de un tratamiento termico, opcionalmente combinado con un tratamiento del pH.
Un tratamiento termico puede aplicarse al caldo de fermentacion al final de la fermentacion (p. ej. en el fermentador, despues de haber cesado todos los suministros (p. ej., fuentes de oxfgeno, carbono o nitrogeno)). El tratamiento termico puede llevarse a cabo, por ejemplo, durante 1 a 8 horas y, por ejemplo, a 30 hasta 50°C. Preferiblemente, el tratamiento termico puede llevarse a cabo a 30 hasta 40°C. Las temperaturas mas altas pueden resultar en una floculacion, precipitacion y coagulacion, lo que afectana negativamente a la separacion de la biomasa de las partfculas de natamicina.
Un tratamiento de pH durante, por ejemplo, 1 a 8 horas y, por ejemplo, a un pH de 8 a menos de aproximadamente 10 puede realizarse tambien facilmente al final de la fermentacion en el fermentador. A un pH por encima de 10, la natamicina se volvera mas soluble y mas vulnerable a la inactivacion, lo que podna afectar negativamente al rendimiento de recuperacion y a la pureza de la natamicina final. El hidroxido de sodio o cualquier otro material caustico compatible, por ejemplo hidroxido de amonio o hidroxido de potasio, se puede utilizar para aumentar el pH. Despues de la incubacion alcalina el caldo se neutraliza mediante acido clortndrico u otro acido compatible, por ejemplo acido fosforico, acido sulfurico o acido acetico. Preferiblemente, la neutralizacion tiene lugar despues de separar la natamicina del caldo de fermentacion.
Tratamientos enzimaticos pueden implicar la incubacion con enzimas que descomponen la pared celular y/o enzimas que descomponen polfmeros organicos tales como lisozima, xilanasa, celulasa, proteasa, glucanasa, lipasa y amilasa. Las enzimas, solas o en forma de mezclas de enzimas, generalmente se incuban bajo las condiciones
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optimas para que operen las enzimas. Las enzimas contribuyen a la lisis de celulas y a la solubilizacion de poKmeros organicos.
La homogeneizacion puede implicar el uso de un homogeneizador tipo Manton-Gaulin. El caldo de fermentacion es forzado a traves de un orificio. Debido a las fuerzas de presion, la biomasa se desintegrara.
La desintegracion de la biomasa mediante tecnicas ultrasonicas puede obtenerse mediante la aplicacion de ondas ultrasonicas al caldo de fermentacion, que proporcionara la oscilacion del lfquido celular que las paredes de las celulas no pueden soportar. La desintegracion de la biomasa mediante mezcladura de alta cizalla implica la aplicacion de altas fuerzas de cizalla a la biomasa. Estas altas fuerzas de cizalla se pueden obtener mediante sacudimiento u otra agitacion mecanica. Determinados fermentadores pueden estar equipados, por ejemplo, con dispositivos de agitacion que sean capaces de proporcionar las altas fuerzas de cizalla necesarias para desintegrar la biomasa. Durante la fermentacion, la agitacion se puede adaptar al crecimiento optimo o las condiciones de produccion de natamicina para la biomasa. Despues de la fermentacion la agitacion se puede adaptar con el fin de desintegrar la biomasa, por ejemplo, mediante la aplicacion de altas velocidades de agitacion. La mezcladura de alta cizalla tambien puede conseguirse, por ejemplo, utilizando mezcladores Waring (u otros) de alta cizalla.
La desintegracion de la biomasa mediante un tratamiento con agentes tensioactivos puede implicar, por ejemplo, el uso de compuestos de octilfenoxipolietoxietanol tales como compuestos de tipo Triton. El caldo de fermentacion puede incubarse con, por ejemplo, 0,01 a 1% de, por ejemplo, Triton X-100 durante, por ejemplo, 1 a 24 horas.
Etapa (b)
Despues de la etapa de desintegracion de la biomasa, la natamicina se separa de la biomasa para obtener una suspension de natamicina. Debido al tratamiento de desintegracion, la biomasa consiste ahora principalmente en pequenas partfculas solidas y/o materia solubilizada. En los casos en los que las tecnicas de separacion convencionales utilizadas en los procesos de recuperacion para productos de fermentacion se utilicen principalmente para separar el solido de la fase lfquida, las tecnicas de separacion utilizadas preferiblemente en la presente invencion separan las partfculas solidas de la biomasa desintegrada, por ejemplo sobre la base de diferencias de tamano y/o diferencias de densidad. Las tecnicas de separacion utilizadas preferiblemente en la presente invencion no tendran como resultado una fase lfquida transparente, sino que resultaran en una fase lfquida turbulenta que contiene la mayona de las partfculas solidas mas pequenas y/o menos densas (que comprenden principalmente la biomasa desintegrada).
Con el fin de separar la biomasa de las partfculas de natamicina, el caldo de fermentacion puede, por ejemplo, tratarse utilizando una tecnica de separacion por gradiente de gravedad. La tecnica de separacion por gradiente de gravedad separa las partfculas de natamicina tanto de las impurezas solubles como insolubles. Tecnicas de separacion por gradiente de gravedad incluyen, por ejemplo, centrifugacion por gradiente de gravedad y pueden utilizar, por ejemplo, columnas de flujo ascendente e hidrociclones. Tecnicas de separacion por gradiente de gravedad hacen uso del principio de que las partfculas de diferentes densidades y/o tamanos se pueden separar cuando estas partfculas de diferentes densidades y/o tamanos son sometidos a la gravedad o fuerzas equivalentes.
Durante la desintegracion de la biomasa las partfculas de biomasa se hacen mas pequenas. Esto hace que sea posible separar la biomasa de las partfculas de natamicina. Habitualmente, mas de 90% de la biomasa desintegrada y otras impurezas se pueden separar con la tecnica de separacion por gradiente de gravedad. La eficiencia de la separacion se puede aumentar mediante la adicion de agua y/o una sal (p. ej. cloruro sodico) al caldo de fermentacion desintegrado.
El uso de tecnicas de separacion por gradiente de gravedad tiene la ventaja de que es posible modificar facilmente o dirigir el proceso de acuerdo con la pureza y el rendimiento del producto final deseado. Mediante la variacion de las condiciones de funcionamiento, se pueden aumentar la pureza o el rendimiento. En general, cuando aumenta la pureza, el rendimiento disminuira y viceversa. El procedimiento de acuerdo con la invencion puede, por ejemplo, proporcionar natamicina de aproximadamente 70% p/p de pureza (base anhidra) en materia seca con un rendimiento de aproximadamente 90%. Utilizando diferentes parametros del proceso, con el procedimiento de la presente invencion tambien se puede obtener natamicina de aproximadamente 90% p/p de pureza (base anhidra) basada en materia seca con un rendimiento de aproximadamente 80%. Incluso es posible producir varios productos de distintas calidades a partir de un caldo de fermentacion.
Tecnicas de separacion por gradiente de gravedad daran mejores resultados, p. ej., purezas y/o rendimientos mas altos, si se aumenta la diferencia de densidad de las partfculas y/o el tamano entre las partfculas de producto y las impurezas. Por lo tanto, se prefiere que el caldo de fermentacion contenga partfculas de natamicina que tengan un diametro medio de partfcula de al menos 2 micrometros. El diametro se determina preferiblemente utilizando un 5 microscopio. Preferiblemente, el diametro medio de las partfculas de natamicina es de al menos 5 micrometros, mas preferiblemente al menos 10 micrometros. Se han observado caldos de fermentacion que contienen partfculas de natamicina con un diametro medio de aproximadamente 25 micrometros Dado que la natamicina puede estar presente en el caldo de fermentacion con diametros que oscilan entre por debajo de 0,05 micrometros y aproximadamente 40 micrometros, resultara evidente para un experto en la tecnica que las partfculas mas pequenas 10 pueden perderse durante la separacion. Ademas, resultara evidente para un experto en la tecnica que fracciones de partfculas de natamicina con diametros grandes de gran pureza pueden obtenerse mediante la tecnica de separacion por gradiente de gravedad. Las condiciones bajo las cuales se hace funcionar la tecnica de separacion por gradiente de gravedad determinan que fraccion de la natamicina se recuperara. En general, partfculas de natamicina mas grandes pueden obtenerse, por ejemplo, mediante el uso de condiciones de baja cizalla durante la 15 fermentacion, o sembrando la fermentacion con partfculas de natamicina pequenas o prolongando la fermentacion.
La centrifugacion por gradiente de gravedad puede simularse a escala de laboratorio haciendo funcionar una centnfuga por tandas durante menos tiempo o con un numero menor de revoluciones por minuto en comparacion con el funcionamiento estandar de la centnfuga, lo que resultana en una clara separacion de los solidos de los lfquidos.
20 En una escala de produccion, la centnfuga se hace funcionar habitualmente de forma continua. En comparacion con el funcionamiento normal de este tipo de centnfuga, el tiempo de espera en la centnfuga disminuye con el fin de separar la natamicina de la biomasa desintegrada. Cuanto menor sea el tiempo de espera, tanto mayor sera la pureza y menor el rendimiento de la natamicina obtenida. Un experto en la tecnica es capaz de encontrar un tiempo de espera adecuado que corresponda a una relacion pureza:rendimiento optimizada o deseada.
25 Al final de la etapa (b), la suspension de natamicina obtenida tiene preferiblemente un volumen total que es aproximadamente 5 a 10% en comparacion con el caldo de fermentacion original y que contiene preferiblemente menos de 20% v/v de resto de biomasa. Mas preferiblemente, la suspension de natamicina obtenida tiene un volumen total que es aproximadamente 6 a 8% en comparacion con el caldo de fermentacion original y que contiene menos de 15% v/v de resto de la biomasa. Lo mas preferiblemente, la suspension de natamicina obtenida tiene un 30 volumen total que es aproximadamente 6 a 8% en comparacion con el caldo de fermentacion original y que contiene menos de 10% v/v de resto de la biomasa.
Etapa (c)
En una siguiente etapa del procedimiento de la invencion, el pH de dicha suspension de natamicina se ajusta a un valor de al menos 10 y se anade una cantidad de un disolvente sustancialmente miscible con agua, suficiente para 35 disolver la natamicina en dicha suspension de natamicina.
Preferiblemente, el disolvente miscible en agua utilizado en la etapa (c) se selecciona del grupo que consiste en acetona, metanol, etanol, propanol, isopropanol, propanodiol, tetrahidrofurano.
De acuerdo con una realizacion preferida, el pH de la etapa (c) se ajusta a un valor que oscila entre 10,0 y 11,0, preferiblemente entre 10,2 y 10,8, mas preferiblemente entre 10,3 y 10,6 y lo mas preferiblemente se ajusta a un 40 valor de aproximadamente 10,4.
El pH de la suspension de natamicina se ajusta preferentemente mediante la adicion de una cantidad apropiada de un agente alcalino tal como NaOH, KOH, Na2CO3, K2CO3.
La adicion de un disolvente miscible en agua y el aumento del pH de la suspension de natamicina conduce a una disolucion que comprende natamicina disuelta.
45 Etapa (d)
Posteriormente, cualesquiera solidos insolubles se separan de dicha disolucion de natamicina ajustada en pH. La separacion de los solidos insolubles puede llevarse a cabo utilizando cualquier metodo adecuado tal como filtracion
en membrana, filtracion profunda o centrifugacion. Un experto en la tecnica sera capaz de realizar la separacion de solidos insolubles utilizando cualquiera de las tecnicas descritas anteriormente. Preferiblemente, la eliminacion de los residuos restantes se hace mediante filtracion en membrana, seguida de una filtracion en profundidad. Despues de la filtracion de membrana, la torta de filtro se lava con una disolucion de propanol para separar cualquier 5 natamicina disuelta de la torta. Preferiblemente, la disolucion de propanol es 35% v/v. Preferiblemente, la filtracion en profundidad se realiza en un filtro que tiene un diametro de los poros de al menos 0,4 pm. Mas preferiblemente, el filtro tiene un diametro de los poros de al menos 0,25 pm.
Etapa (e)
Posteriormente, el pH de la disolucion de natamicina se reduce a un nivel suficiente para precipitar la natamicina y 10 para formar una suspension de natamicina. Se puede utilizar cualquier producto qmmico de caracter acido para bajar el pH. Un ejemplo de un producto qmmico de caracter acido adecuado es acido clorlddrico. El pH se baja a un valor que oscila entre 5,0 y 8,0. Preferiblemente, el pH se reduce a un valor que oscila entre 5,0 y 7,0, mas preferiblemente entre 5,5 y 6,5. Lo mas preferiblemente, el pH se reduce hasta alcanzar un valor de aproximadamente 6,0. Preferiblemente, el pH se reduce utilizando pequenas etapas de pH con el fin de asegurar la 15 formacion de cristales cristalinos que poseen alta pureza (preferiblemente con agitacion continua).
Una pequena etapa de pH significa preferiblemente que se realiza la adicion de una cantidad adecuada de un agente acidificante para alcanzar una reduccion de 0,1, preferiblemente 0,2 y mas preferiblemente 0,3 unidades de pH cada 5 minutos. El pH se baja preferiblemente 0,3 unidades de pH cada 5 minutos hasta que la disolucion se vuelva turbia. Despues de agitar continuamente a este pH, el pH se reduce con 0,3 unidades de pH cada 3 minutos 20 hasta que el pH sea 6,0.
Opcionalmente, antes de bajar el pH de la disolucion de natamicina, la temperatura de esta disolucion puede aumentar desde 20°C a 35°C.
Despues de la cristalizacion la temperatura de la suspension de natamicina baja a 5°C para aumentar el rendimiento.
25 Etapa (f)
En una etapa adicional del procedimiento de la invencion, la natamicina se separa de dicha suspension de natamicina. Preferiblemente, la natamicina se separa utilizando un filtro prensa de membrana. Despues de la filtracion, la natamicina se lava utilizando una disolucion de propanol y posteriormente se seca mediante ventilacion de la torta de filtro de natamicina. Preferiblemente, la disolucion de propanol es 35% v/v. Preferiblemente, la torta de 30 filtro producida se suspende una vez mas utilizando una disolucion de propanol al 70% y posteriormente se filtra para reducir aun mas el contenido de agua.
Etapa (g)
Opcionalmente, despues de la etapa de separacion, la suspension de natamicina se puede, por ejemplo, secar con el fin de obtener un producto seco. Se puede utilizar cualquier tecnica de secado conveniente, p. ej., secado en 35 vado, secado por conduccion o secado por conveccion. Dado que la natamicina es estable en la forma cristalina de
la misma [natamicina.3 H2O], es cntico no secar el producto hasta un contenido en humedad por debajo de aproximadamente 7%. El secado en vado se lleva a cabo preferiblemente a aproximadamente 40°C.
Preferiblemente, el secado se realiza utilizando un mezclador Nauta hecho funcionar en vado. El secado se termina cuando se alcanza una temperatura de 40°C. Preferiblemente, despues del secado, la temperatura de la natamicina 40 se reduce hasta por debajo de 20°C para evitar el crecimiento microbiano de cualquier posible contaminacion.
Etapa (h)
Opcionalmente, la natamicina secada, obtenida en la etapa (g) se tritura preferiblemente utilizando un molino de martillo con el fin de obtener cristales que tengan un diametro que oscile entre 1 y 50 pm, preferiblemente 1 y 10 pm. De acuerdo con una realizacion preferida, la natamicina se tritura tal como se describe en el documento US 45 6.576.617.
5
10
15
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25
30
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45
Natamicina
Sorprendentemente, la natamicina obtenible por dicho procedimiento exhibe una velocidad de liberacion baja y/o una disminucion en la velocidad de liberacion con respecto a la natamicina conocida en la tecnica. Por lo tanto, la invencion tambien se refiere a una natamicina obtenible mediante dicho procedimiento descrito anteriormente. La natamicina de acuerdo con la invencion exhibe una velocidad de liberacion baja y/o una disminucion en la velocidad de liberacion tal como se define mas adelante. De acuerdo con una realizacion preferida, la natamicina de la invencion no se incorpora en cualquier formulacion espedfica para obtener estas caractensticas. Es la natamicina per se la que exhibe estas caractensticas. La persona experta entendera que el alcance de la invencion no se limita a la natamicina preparada de acuerdo con el procedimiento de la invencion.
Natamicina definida por tener una disminucion especifica en la velocidad de liberacion
De acuerdo con una realizacion preferida, la velocidad de liberacion de la natamicina de la invencion disminuye en 1 a 45 por ciento despues de al menos 9 dfas, cuando entra en contacto sobre un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga de soporte de 5 a 40 |jg de natamicina. Mas preferiblemente, la velocidad de liberacion en estas condiciones se reduce en un 10 a 45 por ciento, incluso mas preferiblemente en un 20 a 45 por ciento y lo mas preferiblemente en un 40 a 45 por ciento.
Preferiblemente, la velocidad de liberacion de la natamicina disminuye en un 1 a 45 por ciento despues de 9 dfas, cuando entra en contacto sobre un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga de soporte de 40 jg de natamicina. Mas preferiblemente, la velocidad de liberacion en estas condiciones disminuye en un 10 a 45 por ciento, incluso mas preferiblemente en un 20 a 45 por ciento y lo mas preferiblemente en un 40 a 45 por ciento despues de 9 dfas.
Incluso mas preferiblemente, la velocidad de liberacion de la natamicina disminuye en un 1 a 35 por ciento despues de 9 dfas, cuando se pone en contacto sobre un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga de soporte de 10 jg de natamicina. Mas preferiblemente, la velocidad de liberacion disminuye en un 10 a 35 por ciento, mas preferiblemente en un 20 a 35 por ciento y lo mas preferiblemente en un 30 a 35 por ciento.
Natamicina definida por tener una velocidad de liberacion especifica
De acuerdo con otra forma de realizacion preferida, la natamicina exhibe una velocidad de liberacion que oscila entre 6 y 10 por ciento de la carga de soporte inicial despues de al menos 9 dfas, cuando se ensayo en un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga de soporte de 5 a 40 jg de natamicina. Mas preferiblemente, la velocidad de liberacion oscila entre 6 y 8 por ciento, mas preferiblemente entre 6 y 7 por ciento y lo mas preferiblemente entre 6 y 6,5 por ciento.
Preferiblemente, la natamicina exhibe una velocidad de liberacion que oscila entre 0,60 y 0,90 jg/dfa despues de 11 dfas, cuando se ensaya en un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga de soporte de 10 jg de natamicina. Mas preferiblemente, la velocidad de liberacion oscila entre 0,60 y 0,80, mas preferiblemente entre 0,60 y 0,70 y lo mas preferiblemente entre 0,60 y 0,65.
Incluso mas preferiblemente, la natamicina exhibe una velocidad de liberacion que oscila entre 0,35 y 0,50 jg/dfa despues de 11 dfas, cuando se ensaya en un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga de soporte de 5 jg de natamicina. Mas preferiblemente, la velocidad de liberacion oscila entre 0,35 y 0,45, y lo mas preferiblemente entre 0,35 y 0,40.
De acuerdo con una realizacion preferida, la natamicina exhibe:
- una velocidad de liberacion que disminuye en un 1 a 45 por ciento despues de al menos 9 dfas, al entrar en contacto con un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga del soporte de 5 a 40 jg de natamicina, y/o
- una velocidad de liberacion que oscila entre 6 y 10 por ciento de la carga inicial
de soporte despues de al menos 9 dfas, cuando se ensaya en un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga de soporte de 5 a 40 jg de natamicina, y
- una velocidad de liberacion que oscila entre 0,1 y 2,0 jg cada 24 horas a lo largo
5
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de las primeras 24 horas, cuando entra en contacto con un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga de soporte de 40 |jg de natamicina. Mas preferiblemente, la velocidad de liberacion oscila entre 0,5 y 2,0, mas preferiblemente entre 1,0 y 2,0 y lo mas preferiblemente entre 1,5 y 2,0,
- opcionalmente, los cristales de natamicina tienen un diametro que oscila entre 1 y 50 jm, preferiblemente entre 1 y 10 pm.
De acuerdo con una realizacion preferida, la natamicina exhibe:
- una velocidad de liberacion que disminuye en un 1 a 45 por ciento despues de al menos 9 dfas, al entrar en contacto con un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga del soporte de 5 a 40 jg de natamicina, y/o
- una velocidad de liberacion que oscila entre 6 y 10 por ciento de la carga inicial
de soporte despues de al menos 9 dfas, cuando se ensaya en un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga de soporte de 5 a 40 jg de natamicina, y
- una velocidad de liberacion que oscila entre 0,1 y 1,0 jg cada 24 horas a lo largo
de las primeras 24 horas, cuando entra en contacto con un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro, y una carga de soporte de 10 jg de natamicina. Mas preferiblemente, la velocidad de liberacion oscila entre 0,2 y 1,0, mas preferiblemente entre 0,4 y 1,0 y lo mas preferiblemente entre 0,8 y 1,0,
- opcionalmente, los cristales de natamicina tienen un diametro que oscila entre 1 y 50 jm, preferiblemente entre 1 y 10 pm.
El ensayo utilizado para medir la velocidad de liberacion de natamicina se ha descrito en el ejemplo 1 de esta solicitud. En smtesis, la muestra que comprende natamicina se aplica a un soporte. El soporte puede ser cualquier material que proporcione un transporte ilimitado de agua. Preferiblemente, el soporte es un disco de papel de filtro, mas preferiblemente el disco de papel de filtro utilizado en el ejemplo 1. Posteriormente, el soporte cargado con la composicion de natamicina se aplica a la superficie de una placa de agar sembrado con celulas de levadura o fungicas (en el ejemplo 1 se utilizaron celulas de Saccharomyces cerevisiae). La placa de agar y el soporte se incuban posteriormente a una temperatura tal que la natamicina se libera en el agar (en el ejemplo 1, la temperatura elegida es de 6°C) durante 24 horas. Despues de haber retirado el soporte de la placa de agar, esta se incuba bajo condiciones que permiten el crecimiento de dichas celulas (en el ejemplo 1, la temperatura es 30°C) durante un penodo elegido. En este caso, el penodo es de 24 horas o 48 horas, dependiendo del tipo de velocidad de liberacion deseada a determinar. Finalmente, se determina la inhibicion del crecimiento de celulas en el agar debido a la presencia de la natamicina, que ha sido liberada del soporte en el agar. El tamano de la zona de inhibicion es una medida de la natamicina liberada de la muestra.
Natamicina con una velocidad de liberacion de natamicina baja de este tipo es muy atractiva para todas las aplicaciones en las que, por ejemplo, se desea una larga proteccion. Por ejemplo, en queso o embutidos o en otros productos carnicos tales como aves de corral o en marisco y de panadena en donde se desea una proteccion de al menos varias semanas contra hongos.
De acuerdo con una realizacion preferida, un disolvente miscible en agua esta presente con la natamicina de la invencion. Preferiblemente, el disolvente miscible en agua se selecciona del grupo que consiste en acetona, metanol, etanol, propanol, propanodiol, tetrahidrofurano y combinaciones de los mismos.
Uso de la natamicina de la invencion
La invencion se refiere, ademas, a una composicion anti-fungica que comprende la natamicina de la invencion que exhibe una baja velocidad de liberacion de natamicina. De acuerdo con una realizacion preferida, la composicion anti-fungica de la invencion comprende adicionalmente al menos otro agente anti-microbiano seleccionado del grupo que consiste en un conservante acido debil, dioxido de azufre, sulfito, nitrato, nitrito, dicarbonato de dimetilo, bifenilo, difenilo, ortofenilfenol, tiabendazol, un acido inorganico, un imidazol y una bacteriocina. Todos estos componentes son ya conocidos por la persona experta en la tecnica y se describen brevemente a continuacion:
1. un conservante acido debil tal como acido sorbico, acido propionico, acido benzoico, acidos p- hidroxibenzoicos, acido lactico, acido cftrico, acido acetico o un metal alcalino o sal de metal alcalino de los mismos;
2. un compuesto anti-fungico de polieno, preferiblemente natamicina;
3. dioxido de azufre o sulfitos;
4. nitrato y nitrito;
5. dicarbonato de dimetilo;
5
6. bifenilo, difenilo, ortofenilfenol o tiabendazol;
7. un acido inorganico, tal como acido clorhudrico;
8. un imidazol tal como imazalilo; y/o
10
9. cualquier compuesto anti-fungico conocido en la tecnica para uso como un conservante para productos alimenticios, proteccion de cultivos o tratamiento post-cosecha de frutos, verduras o cereales, productos farmaceuticos o cosmeticos.
10. nisina o pediocina o lisozima.
Preferiblemente, el agente antimicrobiano es un conservante acido organico debil y/o natamicina. El conservante acido organico debil puede ser acido sorbico, acido propionico, acido benzoico, acido lactico, acido citrico o una sal de metal alcalino o de metal alcalinoterreo, o mezclas de los mismos. De acuerdo con una realizacion mas preferida, 15 el agente anti-microbiano es acido sorbico, sorbato de potasio o calcio; acido benzoico, benzoato de sodio, potasio o calcio; natamicina o mezclas de los mismos.
La composicion antimicrobiana que comprende una bacteriocina sera activa contra las bacterias. Nisina es una sustancia antibacteriana similar a un peptido, producida por microorganismos tales como Lactococcus lactis subsp. lactis. Es principalmente activa contra bacterias gram-positivas. La nisina es no toxica y esta libre de efectos 20 secundarios. La nisina es una sustancia Generalmente Reconocida como Segura (GRAS) y se utiliza ampliamente en una diversidad de alimentos. Ejemplos de productos de este tipo son queso procesado, leche, nata, postres lacteos, mezclas de helados, huevo lfquido, productos de harina calentados al horno, aderezos y cerveza. La nisina es estable al calor y puede soportar temperaturas de esterilizacion con una perdida minima de actividad. El Comite de Organizacion Mundial de la Salud en Patrones Biologicos ha establecido una preparacion de referencia 25 internacional de nisina, la unidad internacional (UI en adelante). Delvoplus® y Nisaplin®, nombres de marcas de concentrados de nisina se distribuyen, respectivamente, por DSM y Danisco. Delvoplus® y Nisaplin® contienen 2,5% de nisina pura o 1 millon de UI por gramo. Niveles eficaces de nisina para conservar los productos alimentarios vanan de 10 a 800 Ul/g o 0,25 a 20 ppm de nisina.
La invencion se refiere, ademas, a un producto tratado con la composicion anti-fungica de la invencion. La 30 composicion anti-fungica de la presente invencion se puede utilizar para tratar una amplia diversidad de productos alimenticios y piensos tales como queso, queso rallado, yogur, mantequilla, productos carnicos procesados, embutidos, cereales, verduras, frutas, productos de frutas y comidas listas para usar. La composicion anti-fungica tambien se puede utilizar para el tratamiento de bebidas tales como zumos de frutas, limonadas, te helado, vino y cerveza. Aplicaciones en agricultura tales como pulverizacion en el campo o en invernaderos o tratamiento post- 35 cosecha tambien se incluyen en esta invencion. Ejemplos de cultivos son cereales, frutas, verduras, legumbres, frutos secos, hierbas, flores y plantas. Tambien semillas, bulbos de flores y patatas de siembra se pueden tratar con la composicion anti-fungica de esta invencion. Ejemplos de aplicaciones farmaceuticas o cosmeticas son composiciones para aplicaciones topicas, lociones, cremas, unguentos, champus y jabones.
Preferiblemente, la natamicina de la invencion se incorpora en un recubrimiento de alimentos. Preferiblemente, el 40 recubrimiento se utiliza para recubrir una carne o producto lacteo. Todos los recubrimientos tal como se describe en el documento EP 1 239 732B se incorpora con ello como referencia en este contexto. En smtesis, un recubrimiento de este tipo se utiliza preferiblemente en el recubrimiento de un queso, un embutido o un producto derivado. Todos los tipos de polfmeros descritos en esta patente tambien se pueden utilizar en un revestimiento que comprende la natamicina de la invencion. Adicionalmente, el agente anti-oxidante y/o agente quelante tal como se describe en el 45 documento EP 1 239 732 B tambien se pueden anadir a la natamicina de la invencion y/o al recubrimiento que comprende la natamicina de la invencion.
La invencion tambien se refiere al uso de la composicion anti-fungica de la invencion para el tratamiento de un producto susceptible a la descomposicion por hongos. La invencion se refiere adicionalmente a un metodo para conservar un producto susceptible a la descomposicion por hongos mediante tratamiento del producto con la composicion anti-fungica de la invencion.
5 La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invencion.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Metodo microbiologico para determinar la disponibilidad de un componente anti-fungico
10 Este ejemplo describe un metodo microbiologico para determinar la disponibilidad de un componente anti-fungico dentro de una composicion anti-fungica. En este ejemplo, natamicina es el componente anti-fungico.
Discos de papel de filtro (discos de ensayo S&S Antibiotics Test Discs n° 321260) con un diametro de 0,6 cm se cargaron con la preparacion a ensayar de tal manera que cada uno de los discos se cargo con 40 |jg de natamicina, p. ej., 50 jl de una muestra que contiene 800 ppm de la natamicina a ensayar se aplico a un disco. Los discos se 15 colocaron entonces en agar, que se sembro con Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763. Las placas de Petri que conteman el agar se almacenaron a continuacion durante 24 horas a 6°C para permitir que la natamicina se libere en el agar. En estas condiciones, Saccharomyces no crece. Como referencia, los discos estaban recien cargados con un intervalo de cantidades conocidas de natamicina disueltas en metanol acuoso.
Al dfa siguiente, los discos de muestra se transfirieron a nuevas placas de Petri que conteman agar sembrado con 20 Saccharomyces cerevisiae. Discos nuevos recien cargados con un intervalo de cantidades conocidas de natamicina
disuelta se prepararon para su uso como una referencia. Las nuevas placas con los discos de la muestra y la nueva referencia se almacenaron a 6°C durante 24 horas y las placas viejas que conteman la natamicina liberada se incubaron a 30°C durante 24 horas.
El tamano de la zona de inhibicion es una medida de la natamicina liberada del disco de muestra. La cantidad de 25 natamicina liberada se puede calcular por metodos conocidos per se. Repitiendo el proceso, la natamicina liberada
puede ser medida sobre una base diaria. Alternativamente, pueden elegirse otros penodos de tiempo de liberacion.
Ejemplo 2
Procedimiento de produccion de natamicina con propiedades mejoradas
Un caldo de fermentacion de Streptomyces natalensis que contema natamicina con un diametro medio de partfcula 30 de aproximadamente 10 micrometros se incubo a una temperatura de 35°C durante 3 horas. Este caldo tratado termicamente se trato adicionalmente a una centrifugacion por gradiente de gravedad. La centnfuga se hizo funcionar en condiciones tales que la mayona de los solidos de biomasa se retiraron junto con el sobrenadante. Este tratamiento resulto en una suspension de natamicina al 70% p/p (base anhidra) basada en materia seca. El rendimiento de natamicina era de aproximadamente 97%. Despues se anadio una disolucion de propanol para 35 obtener una suspension de natamicina que contiene propanol al 35% v/v. Se anadio una disolucion de NaOH para aumentar el pH de la suspension a 10,4 con el fin de disolver la natamicina. Subsiguientemente, la disolucion de natamicina se filtro utilizando un filtro prensa de membrana equipado con una tela de filtro que tiene un tamano de poros de al menos 10 jm. Subsiguientemente, la torta del filtro se lavo con una disolucion de propanol al 35% v/v. Despues de la filtracion de membrana, se llevo a cabo una filtracion en profundidad utilizando un tamano de poros 40 de 0,25 micras. Subsiguientemente, los filtros de filtracion en profundidad se lavaron con una disolucion de propanol al 35% v/v. Despues de la filtracion en profundidad, el pH del filtrado se redujo a 6,0 mediante reduciendo el pH a 0,3 unidades de pH durante 5 minutos mediante la adicion de acido clortudrico con el fin de precipitar la natamicina de dicho filtrado. Subsiguientemente, las aguas madre se separaron despues por filtracion de membrana. Para reducir adicionalmente el contenido de agua, los cristales se lavaron utilizando una disolucion de propanol. La torta de 45 natamicina producida se seco utilizando un secador de vado. Los cristales secados se micronizaron luego a entre 1 y 10 micrometros.
Ejemplo 3
Comparacion de la velocidad de liberacion de la natamicina de la invencion con natamicina de la tecnica anterior
Utilizando el metodo descrito en el ejemplo 1, se comparo el perfil de la velocidad de liberacion de la nueva natamicina de liberacion lenta con el perfil de la velocidad de liberacion de natamicina conocida comercial Delvocid® 5 (DSM, Pafses Bajos). Suspensiones de las preparaciones de natamicina se prepararon de una manera tal que cada una de las suspensiones contema 800 ppm de natamicina como tal. 50 pl de cada una de las respectivas mezclas se aplicaron sobre un disco de filtro de papel y se analizo la velocidad de liberacion mediante el metodo del ejemplo 1. Los resultados se resumen en las siguientes tablas.
Tabla 1: Velocidad de liberacion inicial (40 pg de carga de soporte)
Velocidad de liberacion despues de 24 horas (pg/24 horas) Velocidad de liberacion despues de 48 horas (pg/24 horas)
Natamicina de liberacion lenta
<2 <1,8
Delvocid®
<3 <2
10 Tabla 2: Disminucion de la velocidad de liberacion despues de 9 dfas
% de disminucion en la velocidad de liberacion
Natamicina de liberacion lenta (10 pg de carga de soporte)
35
Natamicina de liberacion lenta (40 pg de carga de soporte)
45
Delvocid® (40 pg de carga de soporte)
58
Tabla 3: Velocidad de liberacion despues de 11 dfas
Velocidad de liberacion (pg/24 horas)
Natamicina de liberacion lenta (5 pg de carga de soporte)
0,35
Natamicina de liberacion lenta (10 pg de carga de soporte)
0,6
Natamicina de liberacion lenta (40 pg de carga de soporte)
1,2
Delvocid® (10 pg de carga de soporte)
1,1
La natamicina de liberacion lenta de acuerdo con la invencion tiene claramente una velocidad de liberacion mas lenta que una preparacion de natamicina disponible comercialmente (Delvocid®).
Ejemplo 4
15 Comparacion de la velocidad de liberacion de la natamicina de la invencion con natamicina de la tecnica anterior en bebidas
La velocidad de liberacion de la nueva natamicina de liberacion lenta se comparo con la de natamicina Delvocid® Instant (DSM, Pafses Bajos) comercial conocida mediante la medicion de su estabilidad qmmica en diversas bebidas. Las preparaciones de natamicina se suspendieron en bebidas a una concentracion final de 150 a 170 ppm 20 de natamicina. Las bebidas que contienen natamicina se almacenaron a 4°C y la concentracion de natamicina en la bebida se midio en el tiempo. Los resultados se resumen en las siguientes tablas.
Tabla 1: Detalles de bebidas
Bebida
Fabricante pH
Zumo de tomate
Appelsientje (J44E3 34:38), Friesland Foods, Pafses Bajos 4,2
Te helado
Plus Supermarket (05125SE25056), Pafses Bajos 3,2
Tabla 2: Degradacion de natamicina en bebidas
Bebida
Tiempo (semanas) Degradacion total (ppm)
Natamicina de liberacion lenta
Natamicina de Delvocid® Instant Diferencia
Zumo de tomate
1 5,1 8,6 3,5
2 13,1 13.7 0,6
3 20,1 26,5 6,4
4 23,2 27,9 4,7
5 28,9 32,6 3,7
Te helado
1 3,4 14,9 11,5
2 5,4 15,5 11,1
3 3,2 15,3 12,1
4 15,0 28,2 13,2
5 17,4 31,7 14,3
Los datos demuestran que se degrada menos natamicina de liberacion lenta que natamicina en Delvocid® Instant en el zumo de tomate y te helado. Puesto que la fraccion disuelta de una formulacion de natamicina es susceptible a la degradacion, los resultados indican que la fraccion disuelta de natamicina de liberacion lenta es menor que la de 5 natamicina en Delvocid® Instant. Por lo tanto, la velocidad de liberacion de natamicina de liberacion lenta es menor que la de Delvocid® Instant en ambas bebidas.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para la produccion de natamicina a partir de un caldo de fermentacion que contiene biomasa y natamicina, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    (a) desintegrar la biomasa mediante calentamiento durante 1 a 8 horas a 30 hasta 50°C;
    (b) separar la natamicina del caldo de fermentacion tratado de este modo mediante centrifugacion por gradiente de gravedad para obtener una suspension de natamicina;
    (c) ajustar el pH de la suspension de natamicina a un valor que oscila entre 10,0 y 11,0 y anadir una cantidad de propanol suficiente para disolver la natamicina en la suspension de natamicina;
    (d) separar los solidos insolubles de la disolucion de natamicina obtenida en la etapa (c) mediante filtracion en membrana, seguida de filtracion en profundidad;
    (e) bajar el pH de la disolucion de natamicina obtenida en la etapa (d) a un pH de 5 a 8 para precipitar la natamicina;
    (f) separar mediante filtracion la natamicina de la suspension de natamicina;
    (g) secar la natamicina separada; y
    (h) reducir el tamano de la natamicina secada.
  2. 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que al menos 50% de la natamicina presente en el caldo de fermentacion esta en forma solida.
  3. 3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que despues de la filtracion en membrana en la etapa d, la torta de filtro se lava con una disolucion de propanol.
  4. 4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el pH en la etapa (e) se reduce a un pH de 5,5 a 6,5.
  5. 5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que despues de la filtracion en la etapa f, la natamicina se lava con una disolucion de propanol.
  6. 6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la natamicina separada se seca en vado.
  7. 7. Natamicina, que comprende una velocidad de liberacion que disminuye en 1 a 45 por ciento despues de al menos 9 dfas, cuando se pone en contacto en un soporte con una superficie de agar de 0,6 cm de diametro y una carga de soporte de 5 a 40 |jg de natamicina.
  8. 8. Natamicina de acuerdo con la reivindicacion 7, caracterizada por que un disolvente miscible en agua esta presente con la natamicina.
  9. 9. Natamicina de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8, caracterizada por que la natamicina se incorpora en un recubrimiento de alimentos.
  10. 10. Natamicina de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8, caracterizada por que la natamicina esta comprendida en una composicion anti-fungica.
  11. 11. Natamicina de acuerdo con la reivindicacion 10, caracterizada por que la composicion anti-fungica comprende, ademas, al menos otro agente antimicrobiano seleccionado del grupo que consiste en un conservante acido debil, dioxido de azufre, sulfito, nitrato, nitrito, dicarbonato de dimetilo, bifenilo, difenilo, ortofenilfenol, tiabendazol, un acido inorganico, un imidazol y una bacteriocina.
  12. 12. Un producto seleccionado del grupo que consiste en queso, embutidos u otro producto carnico tal como aves de corral, marisco y productos de panadena tratados con natamicina de acuerdo con la reivindicacion 7.
  13. 13. Un producto tratado con natamicina de acuerdo con la reivindicacion 10 u 11.
  14. 14. Un producto de acuerdo con la reivindicacion 13, caracterizado por que el producto se selecciona del grupo que consiste en queso, queso rallado, yogur, mantequilla, productos carnicos procesados, embutidos, cereales, verduras, frutas, productos de frutas, comidas listas para usar, legumbres, frutos secos, hierbas, flores, plantas, bulbos de flores, patatas de siembra, y bebidas tales como zumos de frutas, limonadas, tes helados, vino y cerveza.
  15. 15. Metodo para preservar un producto susceptible de descomposicion por hongos, tratando el producto con natamicina de acuerdo con la reivindicacion 10 u 11.
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