JP5167488B2 - 皮膚糸状菌の非加熱検出方法 - Google Patents
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Description
従って、加熱処理などの煩雑な操作が不要で、簡便な白癬菌の検出方法が望まれていた。
[1]非イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤を含有する処理液を用いて、試料から皮膚糸状菌成分を抽出する工程を含むことを特徴とする、皮膚糸状菌の検出方法。
[2]非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである、上記[1]記載の方法。
[3]ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルがポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルである、上記[2]記載の方法。
[4]非イオン性界面活性剤がアルキルグルコシドである、上記[1]記載の方法。
[5]アルキルグルコシドがn-オクチル-β-D-グルコシドである、上記[4]記載の方法。
[6]両イオン性界面活性剤がアルキルベタインである、上記[1]記載の方法。
[7]アルキルベタインが3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチル-アンモニオ] プロパンスルホン酸である、上記[6]記載の方法。
[8]皮膚糸状菌が、Tricophyton rubrum、Tricophyton mentagrophytes、Microsporum canisおよびEpidermophyton floccosumからなる群より選ばれる少なくとも一種である、上記[1]〜[7]のいずれか1項に記載の方法。
[9]下記の工程:
(a)非イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤を含有する処理液を用いて試料から皮膚糸状菌成分を抽出する工程、
(b)上記工程(a)で得られた皮膚糸状菌成分と、該成分を特異的に認識する抗体とを接触させて複合体を形成させる工程、および
(c)上記工程(b)で形成された複合体を検出する工程
を含む、皮膚糸状菌の検出方法。
[10]非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである、上記[9]記載の方法。
[11]ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルがポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルである、上記[10]記載の方法。
[12]非イオン性界面活性剤がアルキルグルコシドである、上記[9]記載の方法。
[13]アルキルグルコシドがn-オクチル-β-D-グルコシドである、上記[12]記載の方法。
[14]両イオン性界面活性剤がアルキルベタインである、上記[9]記載の方法。
[15]アルキルベタインが3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチル-アンモニオ] プロパンスルホン酸である、上記[14]記載の方法。
[16]抗体がハイブリドーマ0014が産生する抗体である、上記[9]〜[15]のいずれか1項に記載の方法。
[17]上記[1]〜[7]のいずれか1項に記載の界面活性剤を含有する処理液、および皮膚糸状菌成分を特異的に認識する抗体を別々の容器に格納してなる、皮膚糸状菌感染診断用キット。
本発明においては、使用する抗体に対する影響が小さく、また皮膚糸状菌成分の変性が少なく、抗原性の高い膜成分を優位に抽出可能なポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルまたはアルキルグルコシドが好ましく用いられる。
本発明においては、使用する抗体に対する影響が小さく、また皮膚糸状菌成分の変性が少なく、抗原性の高い膜成分を優位に抽出可能なアルキルベタインが好ましく用いられる。
「処理液」とは、前記非イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤を含み、試料から皮膚糸状菌成分を抽出する際に用いられる液体のことをいう。溶媒としては通常水が用いられるが、抗原抗体反応を阻害しない溶媒であれば、特に限定されない。また、皮膚糸状菌成分の状態を維持するか、該成分の抽出を容易にすることが可能であれば処理液中にその他の溶媒、添加物(例、可溶化剤、希釈剤、抗原賦活化剤)などを添加して反応させても良い。このような添加物としては、例えばエタノール、メタノール、リン酸バッファー、ホルマリンなどが挙げられるが、それらに限定されない。また必要な界面活性剤の量が確保され、抗原抗体反応を阻害しなければ、添加物の濃度および量なども特に限定されない。
本発明はこの中でもT.rubrum、T.mentagrophytes、M.canis、E.floccosumを検出対象とすることが好ましい。前2種は白癬患者の97%を占めており、後2種は愛玩動物を介して感染するケースが増えているからである。
(a)非イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤を含有する処理液を用いて試料から皮膚糸状菌成分を抽出する工程、
(b)上記工程(a)で抽出された皮膚糸状菌成分と、該成分を特異的に認識する抗体とを接触させて複合体を形成させる工程、および
(c)上記工程(b)で形成された複合体を検出する工程
を含む、皮膚糸状菌の検出方法を提供する。
さらに、これらの抗体は間接的または直接的に標識物質により標識されていてもよい。標識物質としては、蛍光物質(例、FITC、ローダミン)、放射性物質(例、13C、3H)、酵素(例、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ)、着色粒子(例、金属コロイド粒子、着色ラテックス)が例示される。
さらに、非特異的吸着や非特異的反応を抑制するために牛血清アルブミン(BSA)や牛ミルク蛋白等のリン酸緩衝溶液を固相と接触させ、抗体によってコートされなかった固相表面部分を前記BSAや牛ミルク蛋白等でブロッキングすることが一般に行なわれる。
この検出には、酵素免疫測定法(EIA法)、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、放射免疫測定法(RIA法)、蛍光免疫測定法(FIA法)、ルミネッセンス免疫測定法、エバネッセンス波分析法などが利用できる。これらの中でも、EIA法やイムノクロマト法が操作の容易性の観点からして好適である。
該ビオチン標識「皮膚糸状菌成分を特異的に認識する抗体」は、ビオチンと「皮膚糸状菌成分を特異的に認識する抗体」とを周知の方法により結合させることにより製造することができる。例えば、市販のビオチン標識化キットを使用して、ビオチンと「皮膚糸状菌成分を特異的に認識する抗体」とを結合させることができる。酵素標識ストレプトアビジンは、市販のものを好ましく使用することができる。
酵素標識抗体は、酵素と「皮膚糸状菌成分を特異的に認識する抗体」とを自体公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、マレイミド法などにより結合(標識)させることにより製造することができる。
該抗体は、抗体溶液として容器に格納された状態でもよく、また、プレート(例えば、ELISAに使用する)上に固相化された状態でもよく、支持体(例えば、イムノクロマト法に使用する)上に塗布された状態でもよい。
該キット中には、非イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤を含有する処理液、および皮膚糸状菌成分を特異的に認識する抗体以外に試薬等が含まれていてもよい。試薬等としては、処理液や抗体を希釈するための緩衝液、標識物質(例、蛍光色素、酵素)、反応容器、陽性対照、陰性対照、検査プロトコールを記載した指示書などが挙げられる。これらの要素は、必要に応じて予め混合しておくこともできる。該キットを使用することにより、皮膚糸状菌感染の診断が簡便となる。
界面活性剤として、陰イオン性界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウム(以下、DOC)、ならびに非イオン性界面活性剤であるNP−40(ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル)およびTNX(ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル)を用いた。
各処理後のサンプルのうち、120μlを、0014抗体を用いて作成した白癬菌診断ストリップテスト試験片に供した。具体的な方法は以下の通りである。
0014抗体を線状に固相化した抗体固相化支持体を作製するために、ニトロセルロースシート(ミリポア社製、HiFlow Plus)を5mm×20mmに裁断し、その下端より10mmの位置に0014抗体の溶液を、バイオジェットQ3000(Biodot社製)を用いて塗布し、室温で2時間乾燥することによって、抗体固相化支持体とした。
a.金コロイド粒子標識0014抗体
0.1%K2CO3溶液にてpHを6.0に調節した40nmの粒径を有する金コロイド分散液100mLへ、モノクローナル抗体0014溶液400μgを加え、室温で混和した。続いて0.1%牛血清アルブミン溶液と混和し、6000rpm、20分間遠心分離を行った。沈渣を、0.1%牛血清アルブミン溶液を含むPBSに再懸濁し、金コロイド粒子標識0014抗体溶液を得た。
上記金コロイド粒子標識抗体をミリポア社製ガラス繊維不織布(GFCP001050)5mm×10mmに25μL含浸させ、通風乾燥した。
抗体固相化支持体の下端から2.5mmの位置まで金コロイド標識物保持担体を重ねた。更に、金コロイド標識物保持担体上に液体試料吸収用担体(3MM Chr、ワットマン社製)を下端から2.5mmの位置まで重ねた。また、抗体固相化支持体の上端から2mmの位置まで吸水性担体(3MM Chr、ワットマン社製)を重ね、最後に透明なテープを上部に貼り固定してイムノクロマトグラフィー試験片とした。
実施例1で調製したものと同様の処理液サンプルを、ELISA法を用いて測定した。その方法は以下の通りである。
2)ブロッキング:雪印ブロックエース25%水溶液を調製し、これを300μlずつ分注し、室温で1時間インキュベートした。
3)洗浄:0.05% Tween20(半井化学薬品社製)含有のPBSを300μlずつ分注し、攪拌後、捨てることを3回繰り返し、洗浄した。
4)サンプルとの抗原抗体反応:サンプルを各ウェルに50μlずつ添加し、室温で1時間インキュベートした。
5)上記3)と同様の洗浄操作を3回行なった。
6)ビオチン化0014抗体を1μg/mlに10%ブロックエース水溶液で希釈調製し、各ウェルに50μl分注し、1時間インキュベートした。
7)上記3)と同様の洗浄操作を3回洗浄した。
8)ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン液(KPL社製)を10%ブロックエースで2000倍希釈し、各ウェルに50μlずつ分注し、30分インキュベートした。
9)上記3)の過程の洗浄を4回行なった。
10)TMB発色液(DAKO社製)を各ウェルに50μlずつ分注し、遮光下で10分間反応させた。
11)1規定硫酸を50μlずつ分注し、反応を停止させた。
12)マイクロタイタープレートリーダーで主波長450nm、副波長650nmで吸光度(OD)を測定した。
加熱処理との比較を行うために、白癬菌患者からの爪5例と、健常者からの爪5例について、加熱処理と室温下での2重量%NP−40処理とを行い、ストリップテストで検討を行なった。
加熱処理との比較を行うために、実施例4と同様に、白癬菌患者からの爪5例と、健常者からの爪5例について、加熱処理と室温下での2重量%NP−40処理とを行い、ELISA法で検討した。なお、ELISA法は実施例3と同じ方法で行った。
以下の3つの界面活性剤について検討した:
1. 両イオン性界面活性剤: 3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチル-アンモニオ] プロパンスルホン酸 (CHAPS)
2. 陽イオン性界面活性剤: 1-ドデシルピリジニウムクロライド (DPC)
3. 非イオン性界面活性剤: n-オクチル-β-D-グルコシド(Glucoside)
それぞれ1%(w/v)と5%(w/v)との濃度の溶液を調製した。陽性コントロールとして2% NP−40を用いた。爪白癬患者(Case 29)の爪をほぼ7等分して、それぞれの溶液に入れて20分間攪拌した。その後、ELISA法にて抗原量を測定した。ELISA法は実施例3と同じ方法で行った。
結果を図6に示す。非イオン性界面活性剤のGlucosideではNP−40に次ぐ良好な検出感度が得られ、両イオン性界面活性剤のCHAPSでも陽性の結果を得ることができた。しかし、イオン性界面活性剤でのDPCでは、皮膚糸状菌を検出することはできなかった。
本願は、2006年3月20日に日本で出願された特願2006−077639を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。
Claims (16)
- ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、n−オクチル−β−D−グルコシド及び3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチル−アンモニオ]プロパンスルホン酸からなる群より選択される界面活性剤を含有する処理液を用いて、試料から皮膚糸状菌成分を4℃〜45℃の温度で抽出する工程を含むことを特徴とする、皮膚糸状菌の非加熱検出方法。
- ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルを1.0〜5.0重量%で含有する処理液を用いる、請求項1記載の方法。
- ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルを1.0〜3.0重量%で含有する処理液を用いる、請求項2記載の方法。
- n−オクチル−β−D−グルコシドを0.5〜5.0重量%で含有する処理液を用いる、請求項1記載の方法。
- n−オクチル−β−D−グルコシドを0.5〜2.0重量%で含有する処理液を用いる、請求項4記載の方法。
- 3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチル−アンモニオ]プロパンスルホン酸を0.5〜5.0重量%で含有する処理液を用いる、請求項1記載の方法。
- 3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチル−アンモニオ]プロパンスルホン酸を0.5〜2.0重量%で含有する処理液を用いる、請求項6記載の方法。
- 皮膚糸状菌が、Tricophyton rubrum、Tricophyton mentagrophytes、MicrosporumcanisおよびEpidermophyton floccosumからなる群より選ばれる少なくとも一種である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 下記の工程:
(a)ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、n−オクチル−β−D−グルコシド及び3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチル−アンモニオ]プロパンスルホン酸からなる群より選択される界面活性剤を含有する処理液を用いて試料から皮膚糸状菌成分を4℃〜45℃の温度で抽出する工程、
(b)上記工程(a)で得られた皮膚糸状菌成分と、該成分を特異的に認識する抗体とを接触させて複合体を形成させる工程、および
(c)上記工程(b)で形成された複合体を検出する工程
を含む、皮膚糸状菌の非加熱検出方法。 - ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルを1.0〜5.0重量%で含有する処理液を用いる、請求項9記載の方法。
- ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルを1.0〜3.0重量%で含有する処理液を用いる、請求項10記載の方法。
- n−オクチル−β−D−グルコシドを0.5〜5.0重量%で含有する処理液を用いる、請求項9記載の方法。
- n−オクチル−β−D−グルコシドを0.5〜2.0重量%で含有する処理液を用いる、請求項12記載の方法。
- 3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチル−アンモニオ]プロパンスルホン酸を0.5〜5.0重量%で含有する処理液を用いる、請求項9記載の方法。
- 3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチル−アンモニオ]プロパンスルホン酸を0.5〜2.0重量%で含有する処理液を用いる、請求項14記載の方法。
- 抗体がハイブリドーマ0014(FERM P−19057)が産生する抗体である、請求項9〜15のいずれか1項に記載の方法。
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