ES2335979T3 - Empaquetamiento de cpg inmunoestimuladores en particulas similares a virus: metodo de preparacion y su uso. - Google Patents

Abstract

Una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal que comprende: (a)una partícula similar a virus; y (b)una sustancia inmunoestimuladora; en la que dicha sustancia inmunoestimuladora se empaqueta en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado.

Description

Empaquetamiento de CpG inmunoestimuladores en partículas similares a virus: método de preparación y uso.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a los campos de la vacunología, inmunología y medicina: La invención proporciona composiciones y métodos para potenciar las respuestas inmunológicas frente a partículas similares a virus (VLP) o frente a antígenos acoplados, fusionados o unidos de otro modo a VLP por empaquetamiento de sustancias inmunoestimuladoras, oligonucleótidos que contienen al menos una secuencia CpG no metilada, en las VLP. La invención puede usarse para inducir respuestas de células T potentes y mantenidas, particularmente útiles para el tratamiento de tumores y enfermedades víricas crónicas, así como de alergias y otras enfermedades crónicas.

Técnica relacionada

La esencia del sistema inmune se basa en dos pilares de cimentación separados: uno es la inmunidad específica o adaptativa, que se caracteriza por una cinética de respuesta relativamente lenta y por la capacidad de memoria, la otra es la inmunidad inespecífica o innata, que presenta una cinética de respuesta rápida pero carece de memoria. Los linfocitos son los elementos clave del sistema inmune adaptativo. Cada linfocito expresa receptores de antígenos de especificidad única. Tras el reconocimiento de un antígeno por el receptor, los linfocitos proliferan y desarrollan una función efectora. Pocos linfocitos presentan especificidad por un antígeno o patógeno dado, y habitualmente es necesaria una proliferación masiva antes de que pueda medirse una respuesta efectora -de ahí la cinética lenta del sistema inmune adaptativo. Puesto que una proporción significativa de los linfocitos expandidos sobrevive y puede mantener cierta función efectora después de la eliminación del antígeno, el sistema inmune adaptativo reacciona más rápido cuando se encuentra con el antígeno por segunda vez. Esta es la base de su capacidad de memoria.

Al contrario de lo que ocurre con los linfocitos, en los que la especificidad por un patógeno se limita a unas pocas células que deben expandirse para adquirir una función, las células y moléculas del sistema inmune innato están habitualmente presentes en cantidades masivas y reconocen un número limitado de características invariantes asociadas con patógenos (Medzhitov, R. y Janeway, C. A., Jr., Cell 91: 295-298 (1997)). Los ejemplos de dichos patrones incluyen lipopolisacáridos (LPS), ADN rico en CG no metilado (CpG) o ARN bicatenario, que son específicos de infecciones bacterianas y víricas, respectivamente.

La mayor parte de la investigación en inmunología se ha centrado en el sistema inmune adaptativo y sólo recientemente el sistema inmune innato se ha convertido en el centro de interés. Históricamente, el sistema inmune adaptativo e innato se trataron y analizaron como dos entidades separadas que tenían poco en común. Tal era la disparidad que pocos investigadores se preguntaban por qué los antígenos eran mucho más inmunogénicos para el sistema inmune específico cuando se aplicaban con adyuvantes que estimulasen la inmunidad innata (Sotomayor, E. M., et al., Nat. Med. 5: 780 (1999); Diehl, L, et al., Nat. Med. 5: 774 (1999); Weigle, W. O., Adv. Immunol. 30: 159 (1980)). Sin embargo, la respuesta planteada por esta cuestión es crítica para el entendimiento del sistema inmune y para la comprensión del equilibrio entre inmunidad protectora y autoinmunidad.

Una manipulación racionalizada del sistema inmune innato y, en particular, de la activación de APC implicadas en la sensibilización de células T, para inducir deliberadamente una respuesta de células T autoespecífica proporciona un medio para terapia tumoral basada en células T. Por consiguiente, la mayoría de las terapias actuales se centran en el uso de células dendríticas activadas (DC) como portadores de antígenos para la inducción de respuestas de células T mantenidas (Nestle et al. Nat. Med. 4: 328 (1998)). De forma similar, se aplican activadores del sistema inmune innato in vivo, tales como CpG o anticuerpos anti-CD40 junto con células tumorales para potenciar su inmunogenicidad (Sotomayor, E. M., et al., Nat. Med. 5: 780 (1999); Diehl, L., et al., Nat. Med. 5: 774 (1999)).

Con frecuencia la activación generalizada de APC por factores que estimulen la inmunidad innata puede ser la causa del desencademaniento de linfocitos autoespecíficos y autoinmunidad. La activación puede dar como resultado una expresión aumentada de moléculas coestimuladoras o citocinas tales como IL-12 o IFN\alpha. Este punto de vista es compatible con la observación de que la administración de LPS junto con extractos de tiroides es capaz de superar la tolerancia y desencadenar una tiroiditis autoinmune (Weigle, W. O., Adv. Immunol. 30: 159 (1980)). Además, en un modelo de ratón transgénico se ha demostrado recientemente que la administración de un péptido propio en solitario no causaba autoinmunidad a menos que se activaran las APC por una ruta separada (Garza, K. M., et al., J. Exp. Med. 191: 2021 (2000)). El vínculo entre la inmunidad innata y las enfermedades autoinmunes se subraya adicionalmente por la observación de que la activación de APC por LPS, infecciones víricas o generalizada retrasa o impide el establecimiento de una tolerancia periférica (Vella, A. T., et al., Immunity 2: 261 (1995); Ehl, S., et al., J. Exp. Med. 187: 763 (1998); Maxwell, J. R., et al., J. Immunol. 162: 2024 (1999)). De este modo, la inmunidad innata no sólo potencia la activación de linfocitos autoespecíficos, sino también inhibe su posterior eliminación. Estos descubrimientos pueden extenderse a la biología de tumores y al control de enfermedades víricas crónicas.

La inducción de respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) después de la inmunización con antígenos menores de histocompatibilidad, tales como el antígeno HY, requiere la presencia de células T auxiliares (células Th) (Husmann, L. A., y J. M. Bevan, Ann. NY. Acad. Sci. 532: 158 (1988); Guerder, S., y P. Matzinger, J. Exp. Med. 176: 553 (1992)). También se ha demostrado que las respuestas de CTL inducidas por sensibilización cruzada, es decir, por sensibilización con antígenos exógenos que alcanzaron la ruta de clase I, requieren la presencia de células Th (Bennett, S. R. M., et al., J. Exp. Med. 186: 65 (1997)). Estas observaciones tienen consecuencias importantes para la terapia de tumores en la que las células T auxiliares pueden ser críticas para la inducción de respuestas de CTL protectoras por células tumorales (Ossendorp, F., et al., J. Exp. Med. 187: 693 (1998)).

Una molécula efectora importante en células Th activadas es el ligando CD40 (CD40L) que interacciona con CD40 en células B, macrófagos y células dendríticas (DC) (Foy, T. M., et al., Annu. Rev. Immunol. 14: 591 (1996)). El desencadenamiento de CD40 en células B es esencial para el cambio de isotipo y la generación de una memoria de células B (Foy, T. M., et al., Ann. Rev. Immunol. 14: 591 (1996)). Más recientemente, se demostró que la estimulación de CD40 en macrófagos y DC conduce a su activación y maduración (Cella, M., et al., Curr. Opin. Immunol. 9: 10 (1997); Banchereau, J., y R. M. Steinman Nature 392: 245 (1998)). En concreto, las DC regulan positivamente moléculas coestimuladoras y producen citocinas tales como IL-12 tras su activación. Curiosamente, esta maduración mediada por CD40L de DC parece ser responsable del efecto auxiliar en las respuestas de CTL. De hecho, se ha demostrado recientemente que el desencadenamiento de CD40 por células Th vuelve a las DC capaces de iniciar una respuesta de CTL (Ridge, J. P., et al., Nature 393: 474 (1998); Bennett, S. R. M., et al., Nature 393: 478 (1998); Schoenenberger, S. P., et al., Nature 393: 480 (1998)). Esto concuerda con la observación anterior de que las células Th tienen que reconocer sus ligandos en las mismas APC que los CTL, indicado que es necesaria una interacción afín (Bennett, S. R. M., et al., J. Exp. Med. 186: 65 (1997)). Por lo tanto, la estimulación mediada por CD40L por células Th conduce a la activación de DC que, posteriormente, son capaces de estimular respuestas de CTL. En el ser humano, los interferones tipo I, en particular los interferones \alpha y \beta, pueden ser igual de importantes que
IL-12.

Al contrario que estas respuestas de CTL dependientes de Th, los virus son capaces con frecuencia de inducir respuestas de CTL protectoras en ausencia de células T auxiliares (para una revisión, véase (Bachmann, M. F., et al., J. Immunol 161: 5791 (1998)). En concreto, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) (Leist, T. P., et al., J. Immunol. 138: 2278 (1987); Ahmed, R., et al., J. Virol. 62: 2102 (1988); Battegay, M., et al., Cell Immunol. 167: 115 (1996); Borrow, P., et al., J. Exp. Med. 183: 2129 (1996); Whitmire, J. K., et al., J. Virol. 70: 8375 (1996)), el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Kündig, T. M., et al., Immunity 5: 41 (1996)), el virus de la gripe (Tripp, R. A., et al. J. Immunol. 155: 2955 (1995)), virus vaccinia (Leist, T. P., et al., Scand J Immunol. 30: 679 (1989)) y virus ectromelia (Buller, R, et al., Nature -328: 77 (1987)) eran capaces de estimular respuestas de CTL en ratones con reducción de células T CD4^{+} o deficientes para la expresión de clase IT o CD40. El mecanismo para esta estimulación de CTL independiente de células Th por virus no se entiende en la actualidad. Además, la mayoría de los virus no estimulan respuestas de CTL totalmente independientes de células Th, pero la actividad de CTL específicos de virus se reduce en ratones deficientes en células Th. Por lo tanto, las células Th pueden potenciar las respuestas de CTL antivirales pero el mecanismo de esta ayuda no se entiende totalmente aunque se ha demostrado recientemente que las DC presentan antígenos derivados de influenza por sensibilización cruzada (Albert, M. L., et al., J. Exp. Med. 188: 1359 (1998); Albert, M. L., et al., Nature 392: 86 (1998)). Por lo tanto, es posible que, de forma similar a la mostrada para antígenos menores de histocompatibilidad y antígenos tumorales (Ridge, J. P., et al., Nature 393: 474 (1998); Bennett, S. R. M., et al., Nature 393: 478 (1998); Schoenenberger, S. P., et al., Nature 393: 480 (1998)), las células Th puedan ayudar a la inducción de CTL a través del desencadenamiento de CD40 en DC. Por lo tanto, la estimulación de CD40 usando CD40L o anticuerpos anti-CD40 puede potenciar la inducción de CTL después de la estimulación con virus o células tumorales.

Sin embargo, aunque CD40L es un activador importante de DC, parece haber moléculas adicionales que pueden estimular la maduración y activación de DC durante las respuestas inmunes. De hecho, la CD40 no está implicada de forma medible en la inducción de CTL específica para LCMV o VSV (Ruedl, C., et al., J. Exp. Med. 189: 1875 (1999)). Por lo tanto, aunque las respuestas de CTL específicos de VSV son en parte dependientes de la presencia de células T CD4^{+} (Kundig, T. M., et al., Immunity 5: 41 (1996)) este efecto auxiliar no está mediado por CDL40. Los candidatos para moléculas efectoras que desencadenen la maduración de DC durante las respuestas inmunes incluyen Trance y TNF\alpha (Bachmann, M. F., et al., J. Exp. Med. 189: 1025 (1999); Sallusto, F., y A. Lanzavecchia, J Exp Med 179: 1109 (1994)).

Está bien establecido que la administración de proteínas purificadas en solitario habitualmente no es suficiente para generar una respuesta inmune potente; generalmente el antígeno aislado debe administrarse junto con sustancias auxiliares denominadas adyuvantes. Dentro de estos adyuvantes, el antígeno administrado se protege frente a una degradación rápida y el adyuvante proporciona una liberación prolongada de un bajo nivel de antígeno.

A diferencia de las proteínas aisladas, los virus inducen respuestas inmunes rápidas y eficaces en ausencia de cualquier adyuvante tanto con como sin la ayuda de células T (Bachmann y Zinkemagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)). Aunque con frecuencia los virus están constituidos por pocas proteínas, son capaces de desencadenar respuestas inmunes mucho más potentes que sus componentes aislados. Para respuestas de células B, se sabe que un factor crucial para la inmunogenicidad de virus es la repetitividad y el orden de los epítopos superficiales. Muchos virus presentan una superficie cuasi-cristalina que presenta una matriz regular de epítopos que se entrecruzan eficazmente con inmunoglobulinas específicas de epítopo en células B (Bachmann y Zinkernagel, Immunol Today 17: 553-558 (1996)). Este entrecruzamiento de inmunoglobulinas de superficie en células B es una señal de activación potente que induce directamente la progresión del ciclo celular y la producción de anticuerpos IgM. Además, dichas células B desencadenadas son capaces de activar células T auxiliares que a su vez inducen un cambio de producción de anticuerpos de IgM a IgG en células B y la generación de una memoria de células B de larga vida -el objetivo de cualquier vacunación (Bachmann y Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol 15: 235-270 (1997)). La estructura viral está incluso vinculada a la generación de anti-anticuerpos en enfermedades autoinmunes y como parte de la respuesta natural a patógenos (véase Fehr, T., et al., J. Exp. Med. 185: 1785-1792 (1997)). Por lo tanto, los antígenos en partículas virales que están organizados en una matriz ordenada y repetitiva son altamente inmunogénicos puesto que pueden activar directamente células B.

Además de respuestas de células B potentes, las partículas virales también son capaces de inducir la generación de una respuesta de células T citotóxicas, otro miembro crucial del sistema inmune. Estas células T citotóxicas son particularmente importantes para la eliminación de virus no citopáticos, tales como el VIH o el virus de la hepatitis B y para la erradicación de tumores. Las células T citotóxicas no reconocen antígenos nativos sino que reconocen sus productos de degradación en asociación con moléculas de MHC clase I (Townsend y Bodmer, Ann. Rev. Immunol. 7: 601-624 (1989)). Los macrófagos y células dendríticas son capaces de captar y procesar partículas virales exógenas (pero no sus componentes aislados solubles) y presentar el producto de degradación generado a células T citotóxicas, conduciendo a su activación y proliferación (Kovacsovics-Bankowski et al., Proc. Natl. Acad. USA 90: 4942-4946 (1993); Bachmann et al., Eur. J. Immunol. 26: 2595-2600 (1996)).

Las partículas virales como antígenos presentan dos ventajas sobre sus componentes aislados: (1) debido a su estructura superficial altamente repetitiva, son capaces de activar directamente células B, conduciendo a altos títulos de anticuerpos y a una memoria de células B de larga duración y (2) las partículas virales, pero no las proteínas solubles, tienen el potencial de inducir una respuesta de células T citotóxicas incluso si los virus no son infecciosos y carecen de adyuvantes.

Varias nuevas estrategias vacunales aprovechan la inmunogenicidad intrínseca de los virus. Algunas de estas estrategias se centran en la naturaleza particulada de la partícula viral, por ejemplo, véase Harding, C. V. y Song, R., (J. Immunology 153: 4925 (1994)), que describe una vacuna que consiste en perlas de látex y antígeno; Kovacsovics-Bankowski, M., et al. (Proc Natl. Acad. Sci. USA 90: 4942-4946 (1993)), que describe una vacuna que consiste en perlas de óxido de hierro y antígeno; Patente de Estados Unidos Nº 5.334.394 de Kossovsky, N., et al., que describe partículas de núcleo recubiertas con antígeno; Patente de Estados Unidos Nº 5.871.747 que describe partículas de polímero sintético que llevan en la superficie una o más proteínas unidas covalentemente a las mismas; y una partícula de núcleo con un recubrimiento unido no covalentemente que cubre al menos parcialmente la superficie de dicha partícula de núcleo y al menos un agente biológicamente activo en contacto con dicha partícula de núcleo recubierta (véase, por ejemplo, documento WO 94/15585).

En un desarrollo adicional, las partículas similares a virus (VLP) se están aprovechando en el área de la producción de vacunas debido tanto a sus propiedades estructurales como a su naturaleza no infecciosa. Las VLP son estructuras supermoleculares construidas de forma simétrica a partir de muchas moléculas proteicas de uno o más tipos. Carecen de genoma viral y por lo tanto no son infecciosas. Con frecuencia pueden producirse VLP en grandes cantidades mediante expresión heteróloga y pueden purificarse fácilmente.

Además, el ADN rico en motivos CG no metilados (CPG), como está presente en bacterias y la mayoría de invertebrados, presenta una actividad estimuladora potente sobre células B, células dendríticas y otras APC in vitro así como in vivo. Aunque el ADN bacteriano es inmunoestimulador para muchas especies de vertebrados, los motivos CpG individuales pueden diferir. De hecho, los motivos CpG que estimulan células inmunes de ratón pueden no necesariamente estimular células inmunes humanas y viceversa.

Aunque los oligómeros de ADN ricos en motivos CpG pueden presentar capacidad inmunoestimuladora, su eficacia está con frecuencia limitada, puesto que son inestables in vitro e in vivo. Por lo tanto, presentan una farmacocinética desfavorable. Para hacer que los oligonucleótidos con GpG sean más potentes, habitualmente es necesario por lo tanto estabilizarlos introduciendo modificaciones fosforotioato de la cadena principal de fosfato.

Una segunda limitación para el uso de oligonucleótidos con CpG para estimular respuestas inmunes es su ausencia de especificidad, puesto que se estimulan todas las APC y células B en contacto con oligonucleótidos con CpG. Por lo tanto, la eficacia y especificidad de los oligonucleótidos con CpG puede mejorarse estabilizándolos o empaquetándolos de modo que limite la activación celular a las células que también presenten el antígeno pertinente.

Además, los oligodesoxinucleótidos con CpG inmunoestimuladores inducen efectos secundarios potentes causando una hematopoyesis extramedular acompañada de esplenomegalia y linfadenopatía en ratones (Sparwasser et al., J. Immunol. (1999), 162: 2368-74 y Ejemplo 18).

Se ha demostrado que las VLP se presentan eficazmente en moléculas de MHC clase I ya que, presumiblemente después de su captación por macropinocitosis, se procesan eficazmente y se sensibilizan de forma cruzada sobre moléculas de MHC clase I. El mecanismo de sensibilización cruzada no está claro actualmente, pero se han propuesto rutas dependientes de TAP e independientes de Tarp.

Ioannou, et al., Vaccine 21: 127-137 (2002) compararon diversos adyuvantes de aceite mineral, aceite metabolizable y no oleosos en solitario y en combinación con oligodesoxinucleótidos que contenían dinucleótidos CpG no metilados (CpG ODN) para determinar su capacidad para aumentar las respuestas inmunes contra una forma secretada truncada de glicoproteína D (tgD) de herpesvirus bovino (BHV). Ioannou et al. demuestran que pueden usarse CpG ODN para aumentar la magnitud y el equilibrio de una respuesta inmune al tiempo que se reduce la cantidad de aceite mineral y por lo tanto los efectos secundarios indeseables de adyuvantes de vacunas.

El documento WO 99/29723 describe partículas similares a virus que comprenden proteínas quiméricas en las que están presentes las proteínas de la cápside del Virus del Escarabajo Neozelandés (FHV) junto con segmentos peptídicos heterólogos. Más específicamente, el documento WO 99/29723 describe partículas similares a virus de Virus del Escarabajo Neozelandés (FHV) que presentan péptidos derivados del Virus Respiratorio Sincitial Bovino (BRSV) en su superficie para su uso como inmunógenos para inducir respuestas inmunes contra péptidos de BRSV. Se sugiere la encapsidación de citocinas para potenciar adicionalmente la respuesta inmune. Además, el documento WO 99/29723 describe una partícula similar a virus del Virus del Escarabajo Neozelandés (FHV) que lleva un ligando específico de hepatocitos y que contiene ADN empaquetado que codifica el interferón gamma humano, así como su uso como sistema suministro de genes por direccionamiento a células hepáticas.

Gerber et al, J. Virol. 75: 4752-4760 (2001) se refiere al concepto de inmunización oral frente a la enfermedad del papilomavirus humano anogenital (HPV). Más específicamente, Gerber et al. describe que las partículas similares a virus recombinantes del papilomavirus humano (HPV) específicas, HPV-16 y HPV-18, son inmunogénicas cuando se administran por vía oral y que la coadministración oral de estas VLP con el mutante R192G de la enterotoxina termolábil (LT) de E. coli (LT R192G) o con el ADN con CpG 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' que tiene una cadena principal fosforotioato resistente a nucleasas puede mejorar significativamente las respuestas humorales anti-VLP, al tiempo que se sugiere que LT R192G es superior al ADN con CpG.

Recientemente se han realizado avances extraordinarios en las estrategias de vacunación, aunque continúa existiendo la necesidad de una mejora sobre las estrategias existentes. En particular, continúa existiendo la necesidad en la técnica del desarrollo de vacunas nuevas y mejoradas que promuevan una respuesta inmune de CTL potente y una protección anti- patógenos tan eficaz como la de patógenos naturales en ausencia de una activación generalizada de APC y otras células.

Sumario de la invención

Esta invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que las sustancias inmunoestimuladoras, oligonucleótidos de ADN, pueden empaquetarse en VLP volviéndolas más inmunogénicas. Inesperadamente, los ácidos nucleicos y oligonucleótidos, respectivamente, presentes en VLP pueden sustituirse específicamente por las sustancias inmunoestimuladoras y oligonucleótidos de ADN que contienen motivos CpG, respectivamente. Sorprendentemente, estos ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados tales como oligonucleótidos que contienen CpG no metilados conservaban su capacidad inmunoestimuladora sin una activación generalizada del sistema inmune innato. Las composiciones que comprenden VLP y CpG inmunoestimuladores empaquetados en las mismas de acuerdo con la presente invención son espectacularmente más inmunogénicas que sus homólogas sin CpG e inducen una respuesta de células B y T aumentada. La respuesta inmune frente a antígenos opcionalmente acoplados, fusionados o unidos de otro modo a las VLP se potencia de forma similar a la de la respuesta inmune contra la propia VLP. Además, las respuestas de células T frente a tanto VLP como antígenos se dirigen especialmente al tipo Th1. Los antígenos unidos a VLP cargadas con CpG pueden ser por lo tanto vacunas ideales para la vacunación profiláctica o terapéutica frente a alergias, tumores y otras moléculas propias y enfermedades víricas crónicas.

En una primera realización, la invención proporciona una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal que comprende una partícula similar a virus y una sustancia inmunoestimuladora, en la que dicha sustancia inmunoestimuladora está empaquetada en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado. En otra realización, la composición comprende además un antígeno unido a la partícula similar a virus.

En una realización preferida de la invención, los oligonucleótidos que contienen CpG no metilados están estabilizados mediante modificaciones fosforotioato de la cadena principal de fosfato. En otra realización preferida, los oligonucleótidos que contienen CpG no metilados se empaquetan en las VLP por digestión del ARN en el interior de las VLP y adición simultánea de los oligonucleótidos de ADN que contienen CpG de elección. En una realización igualmente preferida, las VLP pueden desensamblarse antes de que se vuelvan a ensamblar en presencia de CpG.

En una realización preferida adicional, la partícula similar a virus es una partícula similar a virus recombinante. También se prefiere que la partícula similar a virus está libre de una envuelta lipoproteica. Preferiblemente, la partícula similar a virus recombinante comprende, o como alternativa consiste en, proteínas recombinantes del virus de la hepatitis B, virus BK u otros Poliomavirus humanos, virus del sarampión, virus Sindbis, Rotavirus, virus de la glosopeda, Retrovirus, virus Norwalk o Papilomavirus humano, fagos de ARN, fago Q\beta, fago GA, fago fr y Ty. En una realización específica, la partícula similar a virus comprende, o como alternativa consiste en, una o más proteínas del núcleo (cápside) del virus de la hepatitis B diferentes (HBcAg).

En una realización preferida adicional, la partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes o fragmentos de las mismas de un fago de ARN. Los fagos de ARN preferidos son fago Q\beta, fago AP 205, fago GA y fago fr.

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En otra realización, el antígeno es un antígeno recombinante. En otra realización más, el antígeno puede seleccionarse del grupo que consistente en: (1) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune frente a células cancerosas; (2) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune frente a enfermedades infecciosas, (3) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune frente alergenos; (4) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta mejorada frente a autoantígenos; y (5) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune en animales de granja o mascotas.

En otra realización más, el antígeno puede seleccionarse del grupo que consiste en (1) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta inmune frente a células cancerosas; (2) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta inmune frente a enfermedades infecciosas; (3) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta inmune frente a alergenos; (4) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta mejorada frente a autoantígenos; (5) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta inmune en animales de granja o mascotas; y (6) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta frente a un fármaco, una hormona o un compuesto tóxico.

En una realización particular el antígeno comprende, o como alternativa consiste en, un epítopo de célula T citotóxica. En una realización relacionada la partícula similar a virus comprende la proteína de núcleo del virus de la hepatitis B y el epítopo de célula T citotóxica se fusiona al extremo C-terminal de dicha proteína de núcleo del virus de la hepatitis B. En una realización, están fusionados por una secuencia de enlace de leucina.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método de potenciación de una respuesta inmune en un ser humano u otra especie animal que comprende introducir en el animal una composición que comprende una partícula similar a virus y una sustancia inmunoestimuladora, en el que dicha sustancia inmunoestimuladora se empaqueta en dicha partícula similar a virus y en el que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado. En una realización adicional, la composición comprende además un antígeno unido a la partícula similar a virus.

En otra realización más de la invención, la composición se introduce en un animal por vía subcutánea, intramuscular, intranasal, intradérmica, intravenosa o directamente en un ganglio linfático. En una realización igualmente preferida, la composición inmunopotenciadora se aplica localmente, cerca de un tumor o depósito viral local frente al que se querría vacunar.

En un aspecto preferido de la invención, la respuesta inmune es una respuesta de célula T y la respuesta de células T frente al antígeno se potencia. En una realización específica, la respuesta de células T es una respuesta de células T citotóxicas y la respuesta de células T citotóxicas frente al antígeno se potencia.

La presente invención también se refiere a una vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición inmunopotenciadora de la presente invención junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, la vacuna comprende además al menos un adyuvante, tal como adyuvante incompleto de Freund. La invención también proporciona un método de inmunización y/o tratamiento de un animal que comprende administrar al animal una cantidad inmunológicamente eficaz de la vacuna descrita.

En una realización preferida de la invención, las VLP con oligonucleótidos que contienen CpG no metilados se usan para la vacunación de animales o seres humanos frente a la propia VLP o frente a antígenos acoplados, fusionados o unidos de otro modo a la VLP. Las VLP modificadas pueden usarse para vacunar frente a tumores, enfermedades víricas, malestares propios y autoantígenos, respectivamente, o moléculas pequeñas no peptídicas, por ejemplo. La vacunación puede ser con fines profilácticos o terapéuticos o ambos. Además, las VLP modificadas pueden usarse para vacunar frente a alergias para inducir una desviación inmune.

En la mayoría de los casos, la respuesta inmune deseada se dirigirá frente a antígenos acoplados, fusionados o unidos de otro modo a las VLP de oligonucleótidos que contienen CpG no metilados. Los antígenos pueden ser péptidos, proteínas, dominios, carbohidratos o moléculas pequeñas, tales como, por ejemplo, hormonas esteroideas o fármacos tales como nicotina. En algunas condiciones, la respuesta inmune deseada puede dirigirse contra la propia VLP. Esta última aplicación se usará en casos en los que la VLP procede de un virus frente al que se desearía vacunar.

La vía de inyección es preferiblemente subcutánea o intramuscular pero también sería posible aplicar las VLP que contienen CpG por vía intradérmica, intranasal, intravenosa o directamente en el ganglio linfático. En una realización igualmente preferida, las VLP acopladas a antígeno o libres que contienen CpG se aplican localmente, cerca de un tumor o depósito viral local frente al que se desearía vacunar.

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son ejemplares y explicativas solamente y pretenden proporcionar una explicación adicional de la invención que se reivindica.

Breve descripción de los dibujos/figuras

La Figura 1 muestra la secuencia de ADN del oligonucleótido con CpG (A) y la secuencia de ADN de la VLP que contiene péptido p33 derivada del núcleo de la hepatitis B (B). El epítopo p33 nonamérico está fusionado genéticamente al extremo C-terminal de la proteína de núcleo de la hepatitis B en la posición 185 a través de una secuencia de enlace de tres leucinas.

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La Figura 2 muestra la estructura de las p33-VLP como se evalúa por microscopía electrónica (A) y SDS PAGE (B). Se cargaron VLP de tipo silvestre (compuestas por monómeros de HBcAg [aminoácidos 1-185]) y p33-VLP producidas de forma recombinante en una columna de filtración en gel Sephacryl S-400 (Amersham Pharmacia Biotechnology AG) para su purificación. Las fracciones combinadas se cargaron en una columna de hidroxiapatita. Se recogió el flujo a través (que contiene cápsides de HBc purificadas) y se cargó en un gel de SDS-PAGE reductor para análisis de peso molecular del monómero (B).

La Figura 3 muestra p33-VLP en una electroforesis en gel de agarosa nativo (agarosa al 1%) después de una incubación de control o después de la digestión con ARNasa A tras la tinción con bromuro de etidio (A) o azul de Coomassie (B) para evaluar la presencia de ARN o proteína. Las p33-VLP producidas de forma recombinante se diluyeron a una concentración final de 0,5 \mug/\mul de proteína en tampón PBS y se incubaron en ausencia (carril 1) o presencia (carril 2) de ARNasa A (100 \mug/ml) (Sigma, Division of Fluka AG, Suiza) durante 2 h a 37ºC. Las muestras se complementaron posteriormente con tampón de carga de ADN concentrado 6 veces (MBS Fermentas GmbH, Heidelberg, Alemania) y se procesaron durante 30 min a 100 voltios en un gel de agarosa nativo al 1%. El marcador Gene Ruler (MBS Fermentas GmbH, Heidelberg, Alemania) se usó como referencia para determinar la velocidad de migración de las p33-VLP (carril M). Las flechas están indicando la presencia de ARN empaquetado en p33-VLP (A) o las propias cápsides de p33-VLP (B). Se obtuvieron resultados idénticos en 3 experimentos independientes.

La Figura 4 muestra p33-VLP en una electroforesis en gel de agarosa nativo (agarosa al 1%) después de una incubación de control o después de la digestión con ARNasa A en presencia de tampón solamente u oligómeros de ADN que contienen CpG tras la tinción con bromuro de etidio (A) o azul de Coomassie (B) para evaluar la presencia de ARN/ADN o proteína. Las p33-VLP recombinantes se diluyeron a una concentración final de 0,5 \mug/\mul de proteína en tampón PBS y se incubaron en ausencia (carril 1) o presencia (carril 2 y 3) de ARNasa A (100 \mug/ml) (Sigma, Division of Fluka AG, Suiza) durante 2 h a 37ºC. Se añadieron oligonucleótidos con CpG 5 nmol (que contenían una modificación fosforotioato de la cadena principal) a la muestra 3 antes de la digestión con ARNasa (A). El marcador Gene Ruler (MBS Fermentas GmbH, Heidelberg, Alemania) se usó como referencia para determinar la velocidad de migración de las p33-VLP (carril M). Las flechas están indicado la presencia de ARN u oligonucleótidos con CpG en p33-VLP (A) o de las propias cápsides de p33-VLP (B). Se obtuvieron resultados idénticos cuando se usaron los oligonucleótidos con CpG con enlaces fosfodiéster para la coincubación de VLP con ARNasa A.

La Figura 5 muestra p33-VLP en una electroforesis en gel de agarosa nativo (agarosa al 1%) antes y después de la digestión con ARNasa A en presencia de oligómeros de ADN que contienen CpG y posterior diálisis (para la eliminación de ADN con CpG no unido a VLP) tras la tinción con bromuro de etidio (A) o azul de Coomassie (B) para evaluar la presencia de ADN o proteína. Se diluyeron p33-VLP recombinantes a una concentración final de 0,5 \mug/\mul de proteína en tampón PBS y se incubaron en ausencia (carril 1) o presencia (carriles 2 a 5) de ARNasa A (100 \mug/ml) (Sigma, Division of Fluka AG, Suiza) durante 2 h a 37ºC. Se añadieron oligonucleótidos con CpG 50 nmol (que contenían una modificación fosforotioato de la cadena principal de fosfato: carriles 2 y 3, que contenían enlaces fosfodiéster: carriles 4 y 5) a VLP antes de la digestión con ARNasa A. Las muestras tratadas se dializaron exhaustivamente durante 24 horas contra PBS (dilución de 4500 veces) con una membrana de diálisis de límite de peso molecular (MWCO) de 300 kDa (Spectrum Medical Industries Inc., Houston, Estados Unidos) para eliminar el exceso de ADN (carriles 3 y 5). El marcador Gene Ruler (MBS Fermentas GmbH, Heidelberg, Alemania) se usó como referencia para determinar la velocidad de migración de p33-VLP (carril M). Las flechas están indicando la presencia de ARN u oligonucleótidos con CpG en p33 VLP (A) o las propias cápsides de p33-VLP (B).

La Figura 6 muestra p33-VLP en una electroforesis en gel de agarosa nativo (agarosa al 1%) después de una incubación de control o después de la digestión con ARNasa A en la que los oligonucleótidos que contienen CpG se añaden solamente después de completarse la digestión de ARN tras la tinción con bromuro de etidio (A) o azul de Coomassie (B) para evaluar la presencia de ARN/ADN o proteína. Se diluyeron p33-VLP recombinantes a una concentración final de 0,5 \mug/\mul de proteína en tampón PBS y se incubaron en ausencia (carril 1) o presencia (carril 2 y 3) de ARNasa A (100 \mug/ml) (Sigma, Division of Fluka AG, Suiza) durante 2 h a 37ºC. Se añadieron oligonucleótidos con CpG 5 nmol (que contenían una modificación fosforotioato de la cadena principal de fosfato) a la muestra 3 solamente después de la digestión con ARNasa. El marcador Gene Ruler (MBS Fermentas GmbH, Heidelberg, Alemania) se usó como referencia para determinar la velocidad de migración de p33-VLP (carril M). Las flechas están indicando la presencia de ARN u oligonucleótidos con CpG en p33-VLP (A) o las propias cápsides de p33-VLP (B). Se obtuvieron resultados idénticos cuando se usaron oligonucleótidos con CpG con enlaces fosfodiéster para el reensamblaje de VLP.

La Figura 7 muestra que las p33-VLP empaquetadas con oligonucleótidos con CpG (que contienen una modificación fosforotioato de la cadena principal de fosfato) son eficaces para inducir protección viral. Se sensibilizaron ratones por vía subcutánea con 100 \mug de p33-VLP en solitario, mezcladas con oligonucleótidos con CpG 20 nmol (p33-VLP + CpG) o p33-VLP empaquetadas con oligonucleótido con CpG después de la diálisis de oligonucleótidos con CpG libres (p33-VLP/CpG). Ratones sin tratamiento previo sirvieron como control negativo. Veintiún días después, se expuso a los ratones a LCMV (200 ufp, por vía intravenosa) y se evaluaron los títulos virales en los bazos 5 días después como se describe en Bachmann, M. F., "Evaluation of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T cell responses", en Immunology Methods Manual, Lefkowitz, I., ed., Academic Press Ltd., Nueva York, NY (1997) pág. 1921.

La Figura 8 muestra que las p33-VLP empaquetadas con oligonucleótido con CpG (que contiene enlaces fosfodiéster) son eficaces para inducir protección viral. Se sensibilizaron ratones por vía subcutánea con 100 \mug de p33-VLP en solitario, mezcladas con oligonucleótidos con CpG 20 nmol (p33-VLP + CpG) o p33-VLP empaquetadas con oligonucleótidos con CpG después de la diálisis de los oligonucleótidos con CpG libres (p33-VLP/CpG). Ratones sin tratamiento previo sirvieron como control negativo. Veintiún días después, se expuso a los ratones a LCMV (200 ufp por vía intravenosa) y se evaluaron los títulos virales en los bazos 5 días después como se describe en Bachmann, M. F., "Evaluation of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T cell responses", en Immunology Methods Manual, Lefkowitz, I., ed., Academic Press Ltd., Nueva York, NY (1997) pág. 1921.

La Figura 9 muestra que ratones tratados con oligonucleótidos con CpG en solitario no están protegidos frente a la infección vírica. Se sensibilizó por vía subcutánea a ratones con oligonucleótidos con CpG (CpG) 20 nmol o se les dejó sin tratar como control negativo (sin tratamiento previo). Veintiún días después, se expuso los ratones a LCMV (200 ufp por vía intravenosa) y se evaluaron los títulos virales en los bazos 5 días después como se describe en Bachmann, M. F., "Evaluation of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T cell responses", en Immunology Methods Manual, Lefkowitz, I., ed., Academic Press Ltd., Nueva York, NY (1997) pág. 1921.

La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína VP1 de BKV (AS) (GI:332779). Esta secuencia se expresó en levaduras para producir cápsides de BKV (Sasnauskas K. et al., J. Biol Chem 380 (3): 381 (1999); K. et al., Generation of recombinant virus-like particles of different polyomaviruses in yeast. 3rd International Workshop "Virus-like particles as vaccines" Berlín, (2001)).

La Figura 11 muestra la secuencia de ADN del fragmento de ADN bicatenario de 246 pb usado para el empaquetamiento y la estabilización de VLP de BKV.

La Figura 12 muestra VLP de BKV (15 mg) en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% nativo después de una incubación de control o después de la digestión con ARNasa A y posterior incubación con oligonucleótidos con CpG con fosforotioato (pt) fluorescentes. La excitación con UV conduce a la detección de ADN en un gel teñido con bromuro de etidio (A) y a fluorescencia de oligómeros con CpG-FAM en ausencia de bromuro de etidio (B). Carril 1: VLP de BKV sin tratar; carril 2: VLP de BKV tratadas con ARNasa A; carril 3: VLP de BKV tratadas con ARNasa A con CpG(pt)-FAM; carril 4: VLP de BKV tratadas con ARNasa A con CpG(pt)-FAM más tratamiento con ADNasa I; carril M: escalera de ADN de 1 kb Gene Ruler (MBI Fermentas GmbH, Heidelberg, Alemania). Las flechas están indicando la presencia de ARN u oligómeros con CpG-FAM en VLP de BKV.

La Figura 13 muestra VLP de BKV (15 \mug) en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% nativo después de una incubación de control o después de la digestión con ARNasa A y posterior incubación con ADN bicatenario (bc) (246 pb) tras la tinción con bromuro de etidio (A) o Azul de Coomassie (B). Carril 1: VLP de BKV sin tratar; carril 2: VLP de BKV tratadas con ARNasa A; carril 3: VLP de BKV tratadas con ARNasa e incubadas con ADNbc; carril M: escalera de ADN de 1 kb Gene Ruler (MBI Fermentas GmbH, Heidelberg, Alemania). Las flechas indican la presencia de ARN o ADNbc en VLP de BKV.

La Figura 14 muestra VLP de BKV (15 \mug) en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% nativo después de una incubación de control o después de la digestión con ARNasa A y posterior incubación con oligonucleótidos con CPG (con cadena principal fosfato o fosforotioato (pt)) tras la tinción con bromuro de etidio (A) o azul de Coomassie (B). Carril 1: Reserva de VLP de BKV (PBS/glicerol al 50%); carril 2: VLP de BKV sin tratar (tampón PBS); carril 3: VLP de BKV tratadas con ARNasa A; carril 4: VLP de BKV tratadas con ARNasa A después de diálisis; carril 5: VLP de BKV tratadas con ARNasa A con oligonucleótidos con CpG; carril 6: VLP de BKV tratadas con ARNasa A con oligómeros con CpG(pt); carril 7: VLP de BKV tratadas con ARNasa A con oligómeros con CpG(pt) después de diálisis; carril M: escalera de ADN de 1 kb Gene Ruler (MBI Fermentas GmbH, Heidelberg, Alemania). Las flechas indican la presencia de ARN u oligonucleótidos con CpG en VLP de BKV.

La Figura 15 muestra los títulos de anticuerpo de DO50% de IgG1 e IgG2a de ratón contra VLP de BKV el día 14 después de la inmunización con VLP de BKV y oligonucleótidos con CpG con fosforotioato (pt). Carril 1: VLP de BKV tratadas con ARNasa; carril 2: VLP de BKV tratadas con ARNasa en combinación con oligómero con CpG(pt) 0,3 nmol; carril 3: VLP de BKV tratadas con ARNasa en combinación con oligómero con CpG (pt) 20 nmol; carril 4: VLP de BKV tratadas con ARNasa que contienen oligómero con CpG(pt) 0,3 nmol.

La Figura 16 muestra p33-VLP en una electroforesis en gel de agarosa nativo (agarosa al 1%) después de una incubación de control o después de la digestión con ARNasa A en la que se añadió un ADN bicatenario lineal (350 pares de bases de longitud) sólo después de completarse la digestión de ARN tras la tinción con bromuro de etidio (A) o azul de Coomassie (B) para evaluar la presencia de ARN/ADN o proteína. Se diluyeron p33-VLP recombinantes a una concentración final de 0,5 \mug/\mul de proteína en tampón PBS y se incubaron en ausencia (carril 1) o presencia (carriles 2, 3 y 4) de ARNasa A (100 \mug/ml) (Sigma, Division of Fluka AG, Suiza) durante 2 h a 37ºC. Se añadió ADN bicatenario lineal de 350 pb de longitud a la muestra 3 y 4 sólo después de la digestión con ARNasa A a una concentración final de 100 ng/ml y se incubó durante 3 horas a 37ºC. La muestra 4 se digirió adicionalmente con ADNasa I (50 UI/ml) (Sigma, Division of Fluka AG, Suiza) durante 3 horas adicionales a 37ºC. El marcador Gene Ruler (MBS Fermentas GmbH, Heidelberg, Alemania) se usó como referencia para determinar la velocidad de migración de las p33-VLP (carril M). Las flechas están indicando la presencia de ARN/ADNbc libre o incluido en p33-VLP (A) y p33-VLP (B).

La Figura 17 muestra el empaquetamiento de B-CpG en VLP de HBc33.

La Figura 18 muestra el empaquetamiento de NKCpG en VLP de HBc33.

La Figura 19 muestra el empaquetamiento de g10gacga-P0 en VLP de HBc33.

La Figura 20 muestra el empaquetamiento de CyCpG-150 en VLP de HBc33.

La Figura 21 muestra el empaquetamiento de NKCpGpt en VLP de HBcP1A.

La Figura 22 muestra el acoplamiento de p33 a VLP de HBcAg.

La Figura 23 muestra el empaquetamiento de B-CpGpt en VLP de HBx33.

La Figura 24 muestra el acoplamiento de p33 a VLP de Q\beta.

La Figura 25 muestra que la fuerza iónica y la baja concentración de proteína permiten la hidrólisis de ARN por ARNasa A en VLP de Q\beta.

La Figura 26 muestra que la fuerza iónica aumenta el empaquetamiento de ácido nucleico inmunoestimulador en VLP de Q\beta.

La Figura 27 muestra el empaquetamiento de B-CpGpt, g10gacga-PO y dsCyCpG en VLP de Qbx33.

La Figura 28 muestra el análisis de SDS-PAGE de las fracciones de la centrifugación en gradiente de sacarosa después del desensamblaje y reensamblaje de VLP de Q\beta en presencia de ácidos nucleicos inmunoestimuladores.

La Figura 29 muestra micrografías electrónicas de VLP de Q\beta después del desensamblaje y reensamblaje en presencia de oligonucleótido (CpG)_{20}OpA.

La Figura 30 muestra un análisis de Ouchterlony (inmunodifusión) de las VLP de Q\beta desensambladas y reensambladas.

La Figura 31 muestra un análisis electroforético en gel de VLP de Q\beta desensambladas y reensambladas.

La Figura 32 muestra micrografías electrónicas de las VLP de Q\beta desensambladas y reensambladas con el oligonucleótido CyOpA.

La Figura 33 muestra micrografías electrónicas de las VLP de Q\beta desensambladas y reensambladas purificadas con los diferentes ácidos nucleicos inmunoestimuladores.

La Figura 34 muestra un análisis de SDS-PAGE del acoplamiento de VLp de Q\beta reensambladas con el oligodesoxinucleótido CyOpA con el péptido p33GGC.

La Figura 35 muestra oligodesoxinucleótidos empaquetados después del desensamblaje y reensamblaje de VLP de Q\beta y el posterior acoplamiento a péptido p33 GGC.

La Figura 36 muestra la purificación de proteína de cubierta de Q\beta desensamblada por cromatografía de exclusión por tamaño.

La Figura 37 muestra la purificación de VLP de Q\beta reensambladas por cromatografía de exclusión por tamaño.

La Figura 38 muestra micrografías electrónicas de VLP de Q\beta que se reensamblaron en presencia de diferentes oligodesoxinucleótidos.

La Figura 39 muestra el análisis del patrón de enlaces disulfuro en cápsides de Q\beta reensambladas y purificadas.

La Figura 40 muestra el análisis del contenido de ácidos nucleicos de las VLP de Q\beta reensambladas por tratamiento con nucleasa y electroforesis en gel de agarosa.

La Figura 41 muestra el análisis del contenido de ácidos nucleicos de las VLP de Q\beta reensambladas por tratamiento con proteinasa K y electroforesis en gel de poliacrilamida en TBE/urea.

La Figura 42 muestra micrografías electrónicas de VLP de AP205 desensambladas y posteriormente reensambladas en presencia de CyCpG.

La Figura 43 muestra un análisis de electroforesis en gel de agarosa de VLP de AP205 desensambladas y reensambladas en presencia de CyCpG.

La Figura 44 muestra micrografías electrónicas de AP205 desensambladas y reensambladas.

La Figura 45 muestra un análisis de electroforesis en gel de agarosa de VLP de AP205 desensambladas y reensambladas en presencia de CyCpG.

La Figura 46 muestra un análisis de SDS-PAGE de VLP de AP205 desensambladas y reensambladas.

La Figura 47 muestra un análisis de SDS-PAGE del acoplamiento de péptido a VLP de AP205 desensambladas y reensambladas.

La Figura 48 muestra que los ácidos nucleicos inmunoestimuladores libres pero no los ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados en VLP inducen esplenomegalia.

La Figura 49 muestra que diferentes ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados en VLP fusionadas a antígeno dan como resultado una respuesta de CTL específicos de antígeno potente y protección viral.

La Figura 50 muestra que el ácido nucleico inmunoestimulador g10gacga-PS empaquetado en VLP fusionada a antígeno da como resultado una respuesta de CTL específicos de antígeno potente y protección viral.

La Figura 51 muestra que los ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados en VLP de HBcAg y Q\beta dan como resultado una respuesta de CTL específicos de antígeno potente y protección viral.

La Figura 52 muestra que los ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados en VLP son incluso más eficaces para inducir respuestas de CTL que las VLP mezcladas con ácidos nucleicos inmunoestimuladores.

La Figura 53 muestra el análisis de la hidrólisis no enzimática de ARN del ARN en VLP de Q\beta.

La Figura 54 muestra el empaquetamiento de oligodesoxinucleótidos en VLP de Q\beta después de la hidrólisis no enzimática de ARN.

La Figura 55 muestra el análisis del empaquetamiento de oligodesoxinucleótidos en VLP de Q\beta después de la hidrólisis no enzimática de ARN.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente por un especialista en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen a continuación los métodos y materiales preferidos.

1. Definiciones

Enlazador aminoacídico: Un "enlazador aminoacídico" o también sólo denominado "enlazador" en esta memoria descriptiva, como se usa en este documento, asocia el antígeno o determinante antigénico con el segundo sitio de unión o, más preferiblemente, comprende ya o contiene el segundo sitio de unión, típicamente -pero no necesariamente- como un resto aminoacídico, preferiblemente como un resto cisteína. La expresión "enlazador aminoacídico", como se usa en este documento, sin embargo, no pretende implicar que dicho enlazador aminoacídico consiste exclusivamente en restos aminoacídicos, incluso cuando un enlazador aminoacídico que consiste en restos aminoacídicos es una realización preferida de la presente invención. Los restos aminoacídicos del enlazador aminoacídico están preferiblemente compuestos por aminoácidos de origen natural o aminoácidos no naturales conocidos en la técnica, todos L o todos D o mezclas de los mismos. Sin embargo, un enlazador aminoacídico que comprende una molécula con un grupo sulfhidrilo o un resto cisteína también se incluye en la invención. Dicha molécula comprende preferiblemente un resto alquilo C1-C6, cicloalquilo (C5, C6), arilo o heteroarilo. Sin embargo, además de un enlazador aminoacídico, también debería incluirse en el alcance de la invención un enlazador que comprenda preferiblemente un resto alquilo C1-C6, cicloalquilo (C5, C6), arilo o heteroarilo y desprovisto de cualquier aminoácido. La asociación entre el antígeno o determinante antigénico u opcionalmente el segundo sitio de unión y el enlazador aminoacídico es preferiblemente por medio de al menos un enlace covalente, más preferiblemente por medio de al menos un enlace peptídico.

Animal: Como se usa en este documento, el término "animal" pretende incluir, por ejemplo, seres humanos, ovejas, caballos, ganado, cerdos, perros, gatos, ratas, ratones, mamíferos, aves, reptiles, peces, insectos y arácnidos.

Anticuerpo: Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas que son capaces de unirse a un epítopo o determinante antigénico. El término pretende incluir anticuerpos completos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla. Más preferiblemente, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos humanos e incluyen, pero no sin limitación, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fv unidos por disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden un dominio V_{L} o V_{H}. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son humanos, murinos, de conejo, de cabra, de cobaya, de dromedario, de caballo o de pollo. Como se usan en este documento, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5. 939.598 por Kucherlapati et al.

Antígeno: Como se usa en este documento, el término "antígeno" se refiere a una molécula capaz de unirse por un anticuerpo o un receptor de célula T (TCR) si se presenta por moléculas de MHC. El término "antígeno", como se usa en este documento, también incluye epítopos de células T. Un antígeno es además capaz de ser reconocido por el sistema inmune y/o es capaz de inducir una respuesta inmune humoral y/o una respuesta inmune celular que conduzca a la activación de linfocitos B y/o T. Sin embargo, esto puede requerir que, al menos en ciertos casos, el antígeno contenga o esté unido a un epítopo de célula Th y se administre en un adyuvante. Un antígeno puede tener uno o más epítopos (epítopos B y T). La reacción específica a la que se hace referencia anteriormente pretende indicar que el antígeno reaccionará preferiblemente, típicamente de una forma altamente selectiva, con su anticuerpo o TCR correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos o TCR que pueden provocarse por otros antígenos.

Un "antígeno microbiano" como se usa en este documento, es un antígeno de un microorganismo e incluye, pero sin limitación, virus infecciosos, bacterias infecciosas, parásitos y hongos infecciosos. Dichos antígenos incluyen el microorganismo intacto, así como aislados naturales y fragmentos o derivados de los mismos y también compuestos sintéticos o recombinantes que son idénticos a o similares a antígenos de microorganismos naturales e inducen una respuesta inmune específica para ese microorganismo. Un compuesto es similar a un antígeno de microorganismo natural si induce una respuesta inmune (humoral y/o celular) contra un antígeno de microorganismo natural. Dichos antígenos se usan de forma rutinaria en la técnica y son bien conocidos por el especialista.

Los ejemplos de virus infecciosos que se han descubierto en seres humanos incluyen, pero sin limitación: Retroviridae (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana, tales como VIH-1 (también denominado HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV, o VIH-III); y otros aislados tales como VIH-LP); Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus Coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus); Caliciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubeola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo coronavirus); Rhabdoviradae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Bungaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, bungavirus, flebovirus y virus Nairo); Arenaviridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (papilomavirus, poliomavirus); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus herpes simple (HSV) 1 y 2, virus de la varicela zóster, citomegalovirus (CMV), herpesvirus); Poxviridae (virus de la viruela, virus vaccinia, poxvirus); e Iridoviridae (por ejemplo, virus de la fiebre porcina africana); y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiológicos de las encefalopatías espongiformes, el agente de la hepatitis delta (que se piensa que es un satélite defectuoso del virus de la hepatitis B), los agentes de la hepatitis no A, no B (clase 1 = de transmisión interna; clase 2 = de transmisión parenteral (es decir, hepatitis C); virus Norwalk y relacionados y astrovirus).

Tanto las bacterias gram negativas como gram positivas sirven como antígenos en animales vertebrados. Dichas bacterias gram positivas incluyen, pero sin limitación, especies de Pasteurella, especies de estafilococos y especies de estreptococos. Las bacterias gram negativas incluyen, pero sin limitación, Escherichia coli, especies de Pseudomonas y especies de Salmonella. Los ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen, pero sin limitación: Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sp. (por ejemplo M. tuberculosis, M. avium, M. intracellular, M. kansaii, M. gordonlae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (estreptococos de Grupo A), Streptococcus agalactiae (estreptococos de Grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (especies anaerobias), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp. patógenas, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, Actinomyces israelii y Chlamydia.

Los ejemplos de hongos infecciosos incluyen: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis y Candida albicans. Otros organismos infecciosos (es decir, protistas) incluyen: Plasmodium tales como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii y Shistosoma.

Otros microorganismos médicamente relevantes se han descrito exhaustivamente en la bibliografía, por ejemplo, véase C. G. A. Thomas, "Medical Microbiology", Bailliere Tindall, Gran Bretaña 1983, cuyo contenido completo se incorpora por la presente como referencia.

Las composiciones y métodos de la invención también son útiles para tratar el cáncer por estimulación de una respuesta inmune específica de antígeno frente a un antígeno canceroso. Un "antígeno tumoral", como se usa en este documento, es un compuesto, tal como un péptido, asociado con un tumor o cáncer y que es capaz de provocar una respuesta inmune. En particular, el compuesto es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se presenta en el contexto de una molécula de MHC. Pueden prepararse antígenos tumorales a partir de células cancerosas por preparación de extractos brutos de células cancerosas, por ejemplo, como se describe en Cohen, et al., Cancer Research, 54: 1055 (1994), purificando parcialmente los antígenos, por tecnología recombinante o por síntesis de novo de antígenos conocidos. Los antígenos tumorales incluyen antígenos que son porciones antigénicas de o son un tumor completo o un polipéptido canceroso. Dichos antígenos pueden aislarse o prepararse de forma recombinante o por cualquier otro medio conocido en la técnica. Los cánceres o tumores incluyen, pero sin limitación, cáncer de conductos biliares, cáncer cerebral; cáncer de mama; cáncer cervical, coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer endometrial; cáncer esofágico; cáncer gástrico, neoplasias intraepiteliales; linfomas, cáncer hepático; cáncer pulmonar (por ejemplo, microcítico y no microcítico); melanoma; neuroblastomas; cáncer oral; cáncer ovárico; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas; cáncer de piel; cáncer testicular; cáncer de tiroides y cáncer renal así como otros carcinomas y sarcomas.

Determinante Antigénico: Como se usa en este documento, el término "determinante antigénico" pretende referirse a esa porción de un antígeno que se reconoce específicamente por linfocitos B o T. Los linfocitos B responden a determinantes antigénicos extraños a través de la producción de anticuerpos, mientras que los linfocitos T son los mediadores de la inmunidad celular. Por lo tanto, los determinantes antigénicos o epítopos son esas partes de un antígeno que se reconocen por anticuerpos, o en el contexto de una molécula de MHC, por receptores de células T.

Célula presentadora de antígenos: Como se usa en este documento, la expresión "célula presentadora de antígenos" pretende referirse a una población heterogénea de leucocitos o células obtenidas de médula ósea que poseen una capacidad inmunoestimuladora. Por ejemplo, estas células son capaces de generar péptidos unidos a moléculas de MHC que pueden reconocerse por células T. La expresión es sinónima a la expresión "célula accesoria" e incluye, por ejemplo, células de Langerhans, células interdigitantes, células B, macrófagos y células dendríticas. En algunas condiciones, también pueden servir como células presentadoras de antígenos células epiteliales, células endoteliales y otras células no procedentes de la médula ósea.

Asociación: Como se usa en este documento, el término "asociación", como se aplica al primer y segundo sitios de unión, se refiere a la unión del primer y segundo sitios de unión que es preferiblemente por medio de al menos un enlace no peptídico. La naturaleza de la asociación puede ser covalente, iónica, hidrófoba, polar o cualquier combinación de las mismas, preferiblemente la naturaleza de la asociación es covalente.

Primer sitio de unión: Como se usa en este documento, la expresión "primer sitio de unión" se refiere a un elemento de origen no natural o natural con el que puede asociarse el segundo sitio de unión localizado en el antígeno o determinante antigénico. El primer sitio de unión puede ser una proteína, un polipéptido, un aminoácido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fenilmetilsulfonilfluoruro) o una combinación de los mismos o un grupo químicamente reactivo de los mismos. El primer sitio de unión se localiza, típicamente y preferiblemente en la superficie de la partícula similar a virus. Están presentes múltiples primeros sitios de unión en la superficie de una partícula similar a virus, típicamente en una configuración repetitiva.

Segundo sitio de unión: Como se usa en este documento, la expresión "segundo sitio de unión" se refiere a un elemento asociado con el antígeno o determinante antigénico con el que puede asociarse el primer sitio de unión localizado en la superficie de la partícula similar a virus. El segundo sitio de unión del antígeno o determinante antigénico puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fenilmetilsulfonilfluoruro) o una combinación de los mismos o un grupo químicamente reactivo de los mismos. Al menos un segundo sitio de unión está presente en el antígeno o determinante antigénico. La expresión "antígeno o determinante antigénico con al menos un segundo sitio de unión" se refiere, por lo tanto, a un antígeno o construcción antigénica que comprende al menos el antígeno o determinante antigénico y el segundo sitio de unión. Sin embargo, en particular para un segundo sitio de unión, que es de origen no natural, es decir, que no aparece de forma natural en el antígeno o determinante antigénico, estos antígenos o construcciones antigénicas comprenden un "enlazador aminoacídico".

Unido: Como se usa en este documento, el término "unido" se refiere a una unión que puede ser covalente, por ejemplo, por acoplamiento químico o no covalente, por ejemplo, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno, etc. Los enlaces covalentes pueden ser, por ejemplo, éster, éter, fosfoéster, amida, peptídicos, imida, enlaces carbono-azufre, enlaces carbono-fósforo y similares. El término también incluye la inclusión o inclusión parcial de una sustancia. El término "unido" es más amplio que e incluye términos tales como "acoplado" "fusionado", "incluido", "empaquetado" y "adherido". Por ejemplo, la sustancia inmunoestimuladora tal como el oligonucleótido que contiene CpG no metilado puede incluirse en la VLP sin la existencia de una unión real, ni covalente ni no covalente.

Proteína o proteínas de cubierta: Como se usa en este documento, la expresión "proteína o proteínas de cubierta" se refiere a la proteína o proteínas de un bacteriófago o fago de ARN capaces de incorporarse en el interior del ensamblaje de cápside del bacteriófago o del fago de ARN. Sin embargo, cuando se refiere al producto génico específico del gen de la proteína de cubierta de fagos de ARN se usa el término "CP". Por ejemplo, el producto génico específico del gen de la proteína de cubierta del fago de ARN Q\beta se denomina "CP de Q\beta", mientras que las "proteínas de cubierta" del bacteriófago Q\beta comprenden la "CP de Q\beta" así como la proteína A1. La cápside del bacteriófago Q\beta está compuesta principalmente por la CP de Q\beta con un contenido minoritario de la proteína A1. Asimismo, la VLP de proteína de cubierta de Q\beta contiene principalmente CP de Q\beta con un contenido minoritario de proteína A1.

Acoplado: Como se usa en este documento, el término "acoplado" se refiere a la unión por enlaces covalentes o por interacciones no covalentes fuertes. Cualquier método usado normalmente por los especialistas en la técnica para el acoplamiento de materiales biológicamente activos puede usarse en la presente invención.

Fusión: Como se usa en este documento, el término "fusión" se refiere a la combinación de secuencias de aminoácidos de diferente origen en una cadena polipeptídica mediante combinación en fase de lectura de sus secuencias de nucleótidos codificantes. El término "fusión" incluye explícitamente fusiones internas, es decir, inserción de secuencias de diferente origen en el interior de una cadena polipeptídica además de fusión con uno de sus extremos terminales.

CpG: Como se usa en este documento, el término "CpG" se refiere a un oligonucleótido que contiene un secuencia dinucleotídica de citosina y guanina no metilada (por ejemplo, "ADN de CpG" o ADN que contiene una citosina seguido de guanosina y unido por un enlace fosfato) y estimula/activa, por ejemplo, tiene un efecto mitogénico sobre, o induce o aumenta la expresión de citocina por una célula de vertebrado. Por ejemplo, los CpG pueden ser útiles para activar células B, células NK y células presentadoras de antígeno tales como monocitos, células dendríticas y macrófagos y células T. Los CpG pueden incluir análogos de nucleótidos tales como análogos que contienen enlaces fosforotioéster y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Generalmente, las moléculas bicatenarias son más estables in vivo, mientras que las moléculas monocatenarias tienen una actividad inmune aumentada.

Epítopo: Como se usa en este documento, el término "epítopo" se refiere a porciones de un polipéptido que tienen actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente en un ser humano. Un "epítopo inmunogénico", como se usa en este documento, se define como una porción de un polipéptido que genera una respuesta de anticuerpos o induce una respuesta de células T en un animal, como se determina por cualquier método conocido en la técnica. (Véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983)). La expresión "epítopo antigénico" como se usa en este documento se define como una porción de una proteína a la que un anticuerpo puede unir inmunoespecíficamente su antígeno según se determina por cualquier método bien conocido en la técnica. La unión inmunoespecífica excluye la unión inespecífica pero no necesariamente excluye la reactividad cruzada con otros antígenos. Los epítopos antigénicos no tienen que ser necesariamente inmunogénicos. Los epítopos antigénicos también puede ser epítopos de células T, en cuyo caso pueden unirse inmunoespecíficamente por un receptor de célula T en el contexto de una molécula de MHC.

Un epítopo puede comprender 3 aminoácidos en una conformación especial que sea única para el epítopo. Generalmente, un epítopo consiste en al menos aproximadamente 5 amino ácidos de este tipo y, más habitualmente, consiste en al menos aproximadamente 8-10 amino ácidos de este tipo. Si el epítopo es una molécula orgánica puede ser tan pequeña como nitrofenilo.

Respuesta inmune: Como se usa en este documento, la expresión "respuesta inmune" se refiere a una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que conduce a la activación o proliferación de linfocitos B y/o T. En algunos casos, sin embargo, las respuestas inmunes pueden ser de intensidad reducida y hacerse detectables sólo cuando se usa al menos una sustancia de acuerdo con la invención. El término "inmunogénico" se refiere a un agente usado para estimular el sistema inmune de un organismo vivo, de modo que una o más funciones del sistema inmune se potencien y se dirijan contra el agente inmunogénico. Un "polipéptido inmunogénico" es un polipéptido que genera una respuesta inmune celular y/o humoral, ya sea en solitario o unido a un vehículo en presencia o ausencia de un adyuvante.

Inmunización: Como se usan en este documento, los términos "inmunizar" o "inmunización" o términos relacionados se refieren a conferir la capacidad de montar una respuesta inmune sustancial (que comprenda anticuerpos o inmunidad celular tal como CTL efectores) contra un antígeno o epítopo diana. Estos términos no requieren que se genere una inmunidad completa sino que se produzca una respuesta inmune que sea sustancialmente superior a la basal. Por ejemplo, un mamífero puede considerarse inmunizado frente a un antígeno diana si la respuesta inmune celular y/o humoral contra el antígeno diana se produce después de la aplicación de los métodos de la invención.

Ácido nucleico inmunoestimulador: Como se usa en este documento, la expresión "ácido nucleico inmunoestimulador" se refiere a un ácido nucleico capaz de inducir y/o potenciar una respuesta inmune. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores, como se usan en este documento, comprenden ácidos ribonucleicos y en particular ácidos desoxirribonucleicos. Preferiblemente, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores contienen al menos un motivo CpG, por ejemplo, un dinucleótido CG en el que la C no está metilada. El dinucleótido CG puede ser parte de una secuencia palindrómica o puede incluirse en el interior de una secuencia no palindrómica. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores que no contienen motivos CpG como se han descrito anteriormente incluyen, a modo de ejemplo, ácidos nucleicos que carecen de dinucleótidos CpG, así como ácidos nucleicos que contienen motivos CG con un dinucleótido CG metilado. La expresión "ácido nucleico inmunoestimulador" como se usa en este documento debería referirse también a ácidos nucleicos que contengan bases modificadas tales como 4-bromo-citosina.

Sustancia inmunoestimuladora: Como se usa en este documento, la expresión "sustancia inmunoestimuladora" se refiere a una sustancia capaz de inducir y/o potenciar una respuesta inmune. Las sustancias inmunoestimuladoras, como se usan en este documento, incluyen, pero sin limitación, sustancias activadoras de receptores tipo peaje (toll-like) y sustancias que inducen la secreción de citocinas. Las sustancias activadoras de receptores tipo peaje incluyen, pero sin limitación, ácidos nucleicos, peptidoglicanos, lipopolisacáridos, ácidos lipoteicónicos, compuestos de imidazoquinolina, flagelinas y lipoproteínas inmunoestimuladoras y sustancias orgánicas inmunoestimuladoras tales como taxol.

Origen natural: Como se usa en este documento, la expresión "origen natural" se refiere a que la totalidad o partes de la misma no son sintéticas y existen o se producen en la naturaleza.

No natural: Como se usa en este documento, el término significa generalmente que no es natural, más específicamente, el término significa fabricado por el hombre.

Origen no natural: Como se usa en este documento, la expresión "origen no natural" generalmente significa que es sintético o no natural; más específicamente, la expresión significa fabricado por el hombre.

Matriz de antígenos o determinantes antigénicos ordenados y repetitivos: Como se usa en este documento, la expresión "matriz de antígenos o determinantes antigénicos ordenadas y repetitivas" se refiere generalmente a un patrón de repetición de antígenos o determinantes antigénicos caracterizado por una disposición espacial típicamente y preferiblemente uniforme de los antígenos o determinantes antigénicos con respecto a la partícula de núcleo y a la partícula similar a virus, respectivamente. En una realización de la invención, el patrón de repetición puede ser un patrón geométrico. Los ejemplos típicos y preferidos de matrices de antígenos o determinantes antigénicos ordenadas y repetitivas adecuadas son las que poseen órdenes paracristalinos estrictamente repetitivos de antígenos o determinantes antigénicos, preferiblemente con separaciones de 0,5 a 30 nanómetros, más preferiblemente de 5 a 15 nanómetros.

Oligonucleótidos: Como se usan en este documento, los términos "oligonucleótido" u "oligómero" se refieren a una secuencia de ácido nucleico que comprende 2 o más nucleótidos, generalmente de al menos aproximadamente 6 nucleótidos a aproximadamente 100.000 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 2000 nucleótidos y, más preferiblemente, de aproximadamente 6 a aproximadamente 300 nucleótidos, aún más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 300 nucleótidos y, aún más preferiblemente, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nucleótidos. Los términos "oligonucleótido" u "oligómero" también se refieren a una secuencia de ácido nucleico que comprende más de 100 a aproximadamente 2000 nucleótidos, preferiblemente más de 100 a aproximadamente 1000 nucleótidos y, más preferiblemente, más de 100 a aproximadamente 500 nucleótidos. El término "oligonucleótido" también se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. El término "oligonucleótido" incluye, sin limitación, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, un "oligonucleótido" se refiere a regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Además, un oligonucleótido puede ser sintético, genómico o recombinante, por ejemplo, ADN-\lambda, ADN cosmídico, cromosoma bacteriano artificial, cromosoma artificial de levadura y fago filamentoso tal como M13.

El término "oligonucleótido" también incluye ADN o ARN que contienen una o más bases modificadas y ADN o ARN con cadenas principales modificadas por estabilidad o por otras razones. Por ejemplo, las modificaciones/análo-
gos de nucleótidos adecuados incluyen ácidos peptidonucleicos, inosina, bases tritiladas, fosforotioatos, alquilfosforotioatos, 5-nitroindol desoxirribofuranosilo, 5-metildesoxicitosina y 5,6-dihidro-5,6-dihidroxidesoxitimidina. Se han realizado una diversidad de modificaciones en ADN y ARN; por lo tanto, el término "oligonucleótido" incluye formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas de polinucleótidos como se encuentran típicamente en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células. Otros análogos/modificaciones de nucleótido serán evidentes para los especialistas en la técnica.

Empaquetado: El término "empaquetado" como se usa en este documento se refiere al estado de una sustancia inmunoestimuladora, en particular un ácido nucleico inmunoestimulador en relación con la VLP. El término "empaquetado", como se usa en este documento, incluye una unión que puede ser covalente, por ejemplo, por acoplamiento químico, o no covalente, por ejemplo, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno, etc. Los enlaces covalentes pueden ser, por ejemplo, éster, éter, fosfoéster, amida, peptídicos, imida, enlaces carbono-azufre, enlaces carbono-fósforo y similares. El término también incluye la inclusión, o inclusión parcial de una sustancia. El término "empaquetado" incluye términos tales como "acoplado", "incluido" y "adherido". Por ejemplo, la sustancia inmunoestimuladora tal como el oligonucleótido que contiene CpG no metilado puede incluirse en la VLP sin la existencia de una unión real, ni covalente ni no covalente. En realizaciones preferidas, en particular, si los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son las sustancias inmunoestimuladoras, el término "empaquetado" indica que el ácido nucleico en un estado empaquetado no está accesible para hidrólisis por ADNasa o ARNasa. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico inmunoestimulador está empaquetado en el interior de las cápsides de VLP, más preferiblemente de una forma no covalente.

Las composiciones de la invención pueden combinarse, opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se usa en este documento se refiere a una o más cargas, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidas o líquidas compatibles que son adecuadas para la administración en un ser un humano u otro animal. El término "vehículo" denota un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la aplicación.

Molécula orgánica: Como se usa en este documento, la expresión "molécula orgánica" se refiere a cualquier entidad química de origen natural o sintético. En particular, la expresión "molécula orgánica" como se usa en este documento incluye, por ejemplo, cualquier molécula que sea un miembro del grupo de nucleótidos, lípidos, carbohidratos, polisacáridos, lipopolisacáridos, esteroides, alcaloides, terpenos y ácidos grasos que sea de origen natural o sintético. En particular, la expresión "molécula orgánica" incluye moléculas tales como nicotina, cocaína, heroína u otras moléculas farmacológicamente activas contenidas en drogas de abuso. En general, una molécula orgánica contiene o se modifica para que contenga una funcionalidad química que permita su acoplamiento, unión u otro método de adhesión a la partícula similar a virus de acuerdo con la invención.

Polipéptido: Como se en este documento, el término "polipéptido" se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) unidos de forma lineal por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). Indica una cadena molecular de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, se incluyen en la definición de polipéptido, péptidos, oligopéptidos y proteínas. Este término también pretende referirse a modificaciones postexpresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Un polipéptido recombinante o derivado no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. También puede generarse de cualquier forma, incluyendo síntesis química.

Una sustancia que "potencia" una respuesta inmune se refiere a una sustancia en la que se observa una respuesta inmune que es superior o que se intensifica o desvía de cualquier modo con la adición de la sustancia en comparación con la misma respuesta inmune medida sin la adición de la sustancia. Por ejemplo, la actividad lítica de células T citotóxicas puede medirse, por ejemplo, usando un ensayo de liberación de ^{51}Cr con o sin la sustancia. La cantidad de la sustancia a la que se potencia la actividad lítica de CTL en comparación con la actividad lítica CTL sin la sustancia se dice que es una cantidad suficiente para potenciar la respuesta inmune del animal al antígeno. En una realización preferida, la respuesta inmune se potencia en un factor de al menos aproximadamente 2, más preferiblemente en un factor de aproximadamente 3 o más. La cantidad de citocinas secretadas también puede alterarse.

Cantidad eficaz: Como se usa en este documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad necesaria o suficiente para producir un efecto biológico deseado. Una cantidad eficaz de la composición sería la cantidad que logra este resultado seleccionado y dicha cantidad podría determinarse como una cuestión de rutina por un especialista en la técnica. Por ejemplo, una cantidad eficaz para tratar una deficiencia en el sistema inmune podría ser esa cantidad necesaria para provocar la activación del sistema inmune, dando como resultado el desarrollo de una respuesta inmune específica de antígeno tras la exposición al antígeno. El término también es sinónimo de "cantidad suficiente".

La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o afección que se trate, la composición particular que se administre, el tamaño del sujeto y/o la gravedad de la enfermedad o afección. Un especialista en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de una composición particular de la presente invención sin necesitar una experimentación excesiva.

Autoantígeno: Como se usa en este documento, el término "autoantígeno" se refiere a proteínas codificadas por el ADN del hospedador y los productos generados por proteínas o ARN codificado por el ADN del hospedador se definen como propios. Además, las proteínas que son el resultado de una combinación de dos o varias moléculas propias o que representan una fracción de una molécula propia y proteínas que tienen una alta homología con moléculas propias como se ha definido anteriormente (>95%, preferiblemente >97%, más preferiblemente >99%) también pueden considerarse propias. En una realización preferida adicional de la presente invención, el antígeno es un autoantígeno. Se describen realizaciones muy preferidas de autoantígenos útiles para la presente invención en el documento WO 02/056905, cuyas descripciones se incorporan con este documento como referencia en su totalidad.

Tratamiento: Como se usan en este documento, los términos "tratamiento", "tratar", "tratado" o "que trata" se refieren a la profilaxis y/o terapia. Cuando se usan con respecto a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, el término se refiere a un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto a la infección con un patógeno o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto se infecte con el patógeno o demuestre signos de enfermedad atribuibles a la infección, así como a un tratamiento después de que el sujeto se haya infectado para combatir la infección, por ejemplo, reducir o eliminar la infección o prevenir que empeore.

Vacuna: Como se usa en este documento, el término "vacuna" se refiere a una formulación que contiene la composición de la presente invención y que está en una forma que es capaz de administrarse a un animal. Típicamente, la vacuna comprende un medio de solución salina convencional o solución acuosa tamponada en el que la composición de la presente invención se suspende o disuelve. En esta forma, la composición de la presente invención puede usarse convenientemente para prevenir, mejorar o tratar de otro modo una afección. Tras la introducción en un hospedador, la vacuna es capaz de provocar una respuesta inmune incluyendo, pero sin limitación, la producción de anticuerpos, citocinas y/o otras respuestas celulares.

Opcionalmente, la vacuna de la presente invención incluye además un adyuvante que puede estar presente en una proporción minoritaria o mayoritaria respecto al compuesto de la presente invención. El término "adyuvante", como se usa en este documento, se refiere a estimuladores inespecíficos de la respuesta inmune o sustancias que permiten la generación de un depósito en el hospedador que, cuando se combinan con la vacuna de la presente invención, proporcionan una respuesta inmune incluso más potenciada. Pueden usarse una diversidad de adyuvantes. Los ejemplos incluyen adyuvante incompleto de Freund, hidróxido de aluminio y muramildipéptido modificado. El término "adyuvante", como se usa en este documento, también se refiere a estimuladores típicamente específicos de la respuesta inmune que cuando se combinan con la vacuna de la presente invención proporcionan una respuesta inmune incluso más potenciada y típicamente específica. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, GM-CSF, IL-2, IL-12, IFN\alpha. Se incluyen en el conocimiento del especialista en la técnica ejemplos adicionales.

Partícula similar a virus: Como se usa en este documento, la expresión "partícula similar a virus" se refiere a una estructura que se parece a una partícula de virus pero que no se ha demostrado que sea patógena. Típicamente, una partícula similar a virus de acuerdo con la invención no lleva información genética que codifique las proteínas de la partícula similar a virus. En general, las partículas similares a virus carecen de genoma viral y por lo tanto no son infecciosas. Además, las partículas similares a virus pueden producirse con frecuencia en grandes cantidades por expresión heteróloga y pueden purificarse fácilmente. Algunas partículas similares a virus pueden contener un ácido nucleico distinto de su genoma. Como se indica, una partícula similar a virus de acuerdo con la invención no puede replicarse y no es infecciosa puesto que carece de todo o parte del genoma viral, en particular de los componentes de replicación e infecciosos del genoma viral. Una partícula similar a virus de acuerdo con la invención puede contener un ácido nucleico distinto de su genoma. Una realización típica y preferida de una partícula similar a virus de acuerdo con la presente invención es una cápside viral tal como la cápside viral del virus, bacteriófago o fago de ARN correspondiente. Las expresiones "cápside viral" o "cápside", como se usan indistintamente en este documento, se refieren a un ensamblaje macromolecular compuesto por subunidades de proteína viral. Típicamente y preferiblemente, las subunidades de proteína viral se ensamblan en una cápside viral y una cápside, respectivamente, que tiene una estructura con una organización repetitiva intrínseca, en la que dicha estructura es típicamente esférica o tubular. Por ejemplo, las cápsides de fagos de ARN o HBcAg tienen una forma esférica de simetría icosaédrica. La expresión "estructura similar a cápside", como se usa en este documento, se refiere a un ensamblaje macromolecular compuesto por subunidades de proteína viral que se parecen a la morfología de la cápside en el sentido definido anteriormente pero que se desvían del ensamblaje simétrico típico al tiempo que mantienen un grado suficiente de orden y
repetitividad.

Partícula similar a virus de un bacteriófago: Como se usa en este documento, la expresión "partícula similar a virus de un bacteriófago" se refiere a una partícula similar a virus que se parece a la estructura de un bacteriófago, que no puede replicarse y que no es infecciosa y que carece de al menos el gen o genes que codifican la maquinaria de replicación del bacteriófago y, típicamente, también carece del gen o genes que codifican la proteína o proteínas responsables de la adhesión viral a o la entrada en el hospedador. Sin embargo, esta definición debería incluir también partículas similares a virus de bacteriófagos, en las que el gen o genes mencionados anteriormente estén todavía presentes pero inactivos y por lo tanto también conduzcan a partículas similares a virus que no pueden replicarse y no infecciosas de un bacteriófago.

VLP de proteína de cubierta de fago de ARN: La estructura de la cápside formada a partir del autoensamblaje de 180 subunidades de proteína de cubierta de fago de ARN y que contiene opcionalmente ARN de hospedador se denomina "VLP de proteína de cubierta de fago de ARN". Un ejemplo específico es la VLP de la proteína de cubierta de Q\beta. En este caso particular, la VLP de la proteína de cubierta de Q\beta puede ensamblarse exclusivamente a partir de subunidades CP de Q\beta (generadas por expresión de un gen de CP de Q\beta que contiene, por ejemplo, un codón de terminación TAA que impide cualquier expresión de la proteína A1 de mayor tamaño a través de supresión, véase Kozlovska, T. M., et al. Intervirology 39: 9-15 (1996)), o contener adicionalmente subunidades de proteína A1 en el ensamblaje de la cápside.

La expresión "partícula de virus" como se usa en este documento se refiere a la forma morfológica de un virus. En algunos tipos de virus comprende un genoma rodeado por una cápside de proteína; otros tienen estructuras adicionales (por ejemplo, envueltas, colas, etc.)

Las partículas virales sin envuelta están compuestas por una cápside proteica que rodea y protege al genoma viral. Los virus con envuelta también tienen una estructura de cápside que rodea al material genético del virus pero además tienen una envuelta de bicapa lipídica que rodea a la cápside. En una realización preferida de la invención, las VLP están libres de una envuelta lipoproteica o una envuelta que contiene lipoproteína. En una realización preferida adicional, las VLP están totalmente libres de una envuelta.

Un, uno o una: Cuando se usan los términos "un", "uno" o "una" en esta descripción significan "al menos un" o "uno o más", a menos que se indique otra cosa.

Como será evidente para los especialistas en la técnica, ciertas realizaciones de la invención implican el uso de tecnologías de ácido nucleico recombinantes tales como clonación, reacción en cadena de la polimerasa, la purificación de ADN y ARN, la expresión de proteínas recombinantes en células procariotas y eucariotas, etc. Dichas metodologías son bien conocidas por los especialistas en la técnica y pueden encontrarse convenientemente en manuales de métodos de laboratorio publicados (por ejemplo, Sambrook, J. et al., Eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel, F. et al., Eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997)). También se describen adecuadamente en la bibliografía técnicas de laboratorio fundamentales para trabajar con líneas celulares de cultivos tisulares (Celis, J., ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2ª edición, (1998)) y tecnologías basadas en anticuerpos (Harlow, E. y Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988); Deutscher, M. P., "Guide to Protein Purification", Meth. Enzymol. 128, Academic Press, San Diego (1990); Scopes, R. K., "Protein Purification Principles and Practice", 3ª edición., Springer-Verlag, Nueva York (1994)), incorporándose todas en este documento como referencia.

2. Composiciones y métodos para potenciar una respuesta inmune

La invención descrita proporciona composiciones y métodos para potenciar una respuesta inmune contra uno o más antígenos en un animal. Las composiciones de la invención comprenden, o como alternativa consisten en, una partícula similar a virus y una sustancia inmunoestimuladora, empaquetándose dicha sustancia inmunoestimuladora en dicha partícula similar a virus y siendo dicha sustancia inmunoestimuladora un oligonucleótido que contiene CpG no metilado. Además, la invención permite convenientemente al que la practica construir dicha composición con diversos fines de tratamiento y/o prevención profiláctica que incluyen la prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas, así como enfermedades infecciosas crónicas y la prevención y/o tratamiento de cánceres, por ejemplo.

Las partículas similares a virus en el contexto de la presente solicitud se refieren a estructuras que se parecen a partículas de virus pero que no son patógenas. En general, las partículas similares a virus carecen de genoma viral y por tanto no son infecciosas. Además, las partículas similares a virus pueden producirse en grandes cantidades por expresión heteróloga y pueden purificarse fácilmente.

En una realización preferida, la partícula similar a virus es una partícula similar a virus recombinante. El especialista puede producir VLP usando tecnología de ADN recombinante y secuencias codificantes de virus que están fácilmente disponibles para el público. Por ejemplo, la secuencia codificante de una envuelta viral o proteína de núcleo puede modificarse por ingeniería genética para la expresión en un vector de expresión de baculovirus usando un vector de baculovirus disponible en el mercado, bajo el control regulador de un promotor viral con modificaciones apropiadas de la secuencia para permitir el enlace funcional de la secuencia codificante con la secuencia reguladora. La secuencia codificante de una envuelta de virus o proteína de núcleo también puede modificarse por ingeniería genética para la expresión en un vector de expresión bacteriano, por ejemplo.

Los ejemplos de VLP incluyen, pero sin limitación, las proteínas de la cápside del virus de la hepatitis B (Ulrich, et al, virus Res. 50: 141-182 (1998)), virus del sarampión (Warnes, et al., Gene 160: 173-178 (1995)), virus Sindbis, rotavirus (Patentes de Estados Unidos Nº 5.071.651 y 5.374.426), virus de la glosopeda (Twomey, et al., Vaccine 13: 1603-1610, (1995)), virus Norwalk (Jiang, X., et al., Science 250: 1580-1583. (1990); Matsui, S. M., et al., J. Clin. Invest. 87: 1456-1461 (1991)), la proteína GAG retroviral (Solicitud de Patente PCT Nº WO 96/30523), la proteína p1 del retrotransposón Ty, la proteína superficial del virus de la hepatitis B (documento WO 92/11291), el papilomavirus humano (documento WO 98/15631), poliomavirus humano (Sasnauskas K., et al., Biol., Chem., 380 (3): 381-386 (1999 ); Sasnauskas K., et al., Generation of recombinant virus-like particles of different polyomaviruses in yeast. 3rd International Workshop "Virus-like particles as vaccines". Berlín, septiembre 26-29 (2001)), fagos de ARN, Ty, fago fr, fago GA, fago AP 205 y, en particular, fago Q\beta.

Como será fácilmente evidente para los especialistas en la técnica, las VLP de la invención no se limitan a ninguna forma específica. La partícula puede sintetizarse químicamente o a través de un proceso biológico que puede ser natural o no natural. A modo de ejemplo, este tipo de realización incluye una partícula similar a virus o una forma recombinante de la misma. En una realización más específica, la VLP puede comprender, o como alternativa consistir en, polipéptidos recombinantes de Rotavirus; polipéptidos recombinantes de virus Norwalk; polipéptido recombinante de Alphavirus; proteínas recombinantes que forman pili bacterianos o estructuras similares a pili; polipéptidos recombinantes del virus de la glosopeda; polipéptidos recombinantes del virus del sarampión, polipéptidos recombinantes de virus Sindbis, polipéptidos recombinantes de Retrovirus; polipéptidos recombinantes del virus de la hepatitis B (por ejemplo, un HBcAg); polipéptidos recombinantes del virus del mosaico del tabaco; polipéptidos recombinantes del virus del escarabajo neozelandés; polipéptidos recombinantes de papilomavirus humano; polipéptidos recombinantes poliomavirus y, en particular, polipéptidos recombinantes de poliomavirus humano y, en particular, polipéptidos recombinantes de virus BK; polipéptidos recombinantes de bacteriófagos, polipéptidos recombinantes de fagos de ARN; polipéptidos recombinantes de Ty; polipéptidos recombinantes de fago fr, polipéptidos recombinantes de fago GA, polipéptidos recombinantes de fago AP 205 y, en particular, polipéptidos recombinantes de fago Q\beta. La partícula similar a virus puede comprender además, o como alternativa consistir en, uno o más fragmentos de dichos polipéptidos, así como variantes de dichos polipéptidos. Las variantes de polipéptidos pueden compartir, por ejemplo, una identidad de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% a nivel de aminoácido con sus homólogos de tipo silvestre.

En una realización preferida, la partícula similar a virus comprende, consiste esencialmente en o como alternativa consiste en proteínas recombinantes o fragmentos de las mismas de un fago de ARN. Preferiblemente, el fago de ARN se selecciona del grupo que consiste en a) bacteriófago Q\beta; b) bacteriófago R17; c) bacteriófago fr, d) bacteriófago GA; e) bacteriófago SP f) bacteriófago MS2, g) bacteriófago M11; h) bacteriófago MX1; i) bacteriófago NL95; k) bacteriófago f2; y 1) bacteriófago PP7.

En otra realización preferida de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en proteínas recombinantes o fragmentos de las mismas, del bacteriófago de ARN Q\beta o del bacteriófago de ARN fr.

En una realización preferida adicional de la presente invención, las proteínas recombinantes comprenden, o como alternativa consisten esencialmente en, o como alternativa consisten en proteínas de cubierta de fagos de ARN.

Las proteínas de cubierta de fagos de ARN que forman cápsides o VLP o fragmentos de las proteínas de cubierta de bacteriófago compatibles con autoensamblaje en una cápside o una VLP son por tanto realizaciones preferidas adicionales de la presente invención. Las proteínas de cubierta de bacteriófago Q\beta, por ejemplo, pueden expresarse de forma recombinante en E. coli. Además, tras dicha expresión estas proteínas forman espontáneamente cápsides. Además, estas cápsides forman una estructura con una organización repetitiva intrínseca.

Los ejemplos preferidos específicos de proteínas de cubierta de bacteriófagos que pueden usarse para preparar composiciones de la invención incluyen las proteínas de cubierta de bacteriófagos de ARN tales como bacteriófago Q\beta (SEC ID Nº: 10; Base de Datos PIR, Nº de acceso VCBPQ\beta que hace referencia a la CP de Q\beta y SEC ID Nº: 11; Nº de acceso AAA16663 que hace referencia a la proteína A1 de Q\beta), bacteriófago R17 (SEC ID Nº: 12; Nº de acceso PIR VCBPR7), bacteriófago fr (SEC ID Nº: 13; Nº de acceso PIR VCBPFR), bacteriófago GA (SEC ID Nº: 14; Nº de acceso GenBank PN-040754), bacteriófago SP (SEC ID Nº: 15; Nº de acceso GenBank CAA30374 que hace referencia a CP de SP y SEC ID Nº: 16; Nº de acceso que hace referencia a proteína A1 de SP), bacteriófago MS2 (SEC ID Nº: 17; Nº de acceso PIR VCBPM2), bacteriófago M11 (SEC ID Nº: 18; Nº de acceso GenBank AAC06250), bacteriófago MX1 (SEC ID Nº: 19; Nº de acceso GenBank AAC14699), bacteriófago NL95 (SEC ID Nº: 20; Nº de acceso GenBank AAC14704), bacteriófago F2 (SEC ID Nº: 21; Nº de acceso GenBank P03611), bacteriófago PP7 (SEC ID Nº: 22). Además, la proteína A1 del bacteriófago Q\beta, o formas truncadas C-terminales que carecen de tantos como 100, 150 ó 180 aminoácidos en su extremo C-terminal, puede incorporarse en un ensamblaje de cápside de proteínas de cubierta de Q\beta. Generalmente, el porcentaje de proteína A1 de Q\beta respecto a CP de Q\beta en el ensamblaje de cápside estará limitado para asegurar la formación de la cápside.

También se ha descubierto que la proteína de cubierta de Q\beta se autoensambla en cápsides cuando se expresa en E. coli (Kozlovska TM., et al., GENE 137: 133-1337 (1993)). Las cápsides o partículas similares a virus obtenidas mostraban una estructura de cápside similar a fago icosaédrica con un diámetro de 25 nm y una cuasi-simetría de T = 3. Además, se ha resuelto la estructura cristalina del fago Q\beta. La cápside contiene 180 copias de la proteína de cubierta, que están unidas en pentámeros y hexámeros covalentes mediante puentes disulfuro (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)) conduciendo a una estabilidad notable de la cápside de la proteína de cubierta de Q\beta. Sin embargo, las cápsides o VLP generadas a partir de proteína de cubierta de Q\beta recombinante pueden contener subunidades que no estén unidas por enlaces disulfuro con otras subunidades dentro de la cápside o que estén unidas de forma incompleta. Por lo tanto, tras cargar la cápside de Q\beta recombinante en un SDS-PAGE no reductor, son visibles bandas correspondientes a proteína de cubierta de Q\beta monomérica así como bandas correspondientes al hexámero o pentámero de proteína de cubierta de Q\beta. Las subunidades unidas por disulfuro de forma incompleta podrían aparecer como bandas de dímeros, trímeros o incluso tetrámeros en un SDS-PAGE no reductor. La proteína de la cápside Q\beta también muestra una resistencia poco habitual a disolventes orgánicos y agentes desnaturalizantes. Sorprendentemente, se ha observado que concentraciones de DMSO y acetonitrilo tan altas como del 30% y concentraciones de guanidinio tan altas como de 1 M no afectan a la estabilidad de la cápside. La alta estabilidad de la cápside de la proteína de cubierta de Q\beta es una característica ventajosa, en particular para su uso en la inmunización y vacunación de mamíferos y seres humanos de acuerdo con la presente invención.

Tras la expresión en E. coli, habitualmente se elimina la metionina N-terminal de la proteína de cubierta de Q\beta, como se observó por secuenciación de Edman N-terminal como se describe en Stoll, E. et al. J. Biol. Chem. 252: 990-993 (1977). También se incluyen en el alcance de la presente invención VLP compuestas por proteínas de cubierta de Q\beta en las que no se ha eliminado la metionina N-terminal o VLP que comprenden una mezcla de proteínas de cubierta de Q\beta en las que la metionina N-terminal está escindida o presente.

También se ha demostrado que proteínas de cubierta de fagos de ARN adicionales se autoensamblan tras la expresión en un hospedador bacteriano (Kastelein, RA. et al., Gene 23: 245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad Nauk SSSR 287: 452-455 (1986), Adhin, MR., et al., Virology 170: 238- 242 (1989), Ni, CZ., et al., Protein Sci., 5: 2485-2493 (1996), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249: 283-297 (1995)). La cápside de fago Q\beta contiene además de la proteína de cubierta la denominada proteína ultraleída A1 y la proteína de maduración A2. A1 se genera por supresión en el codón de terminación UGA y tiene una longitud de 329 aminoácidos. La cápside de la proteína de cubierta recombinante de fago Q\beta usada en la invención está desprovista de la proteína de lisis A2 y contiene ARN del hospedador. La proteína de cubierta de fagos de ARN es una proteína de unión a ARN e interacciona con el tallo-bucle del sitio de unión al ribosoma del gen de la replicasa que actúa como un represor de la traducción durante el ciclo vital del virus. Se conocen los elementos de secuencia y estructurales de la interacción (Witherell, GW. y Uhlenbeck, OC. Biochemistry 28: 71-76 (1989); Lim F. et al., J. Biol. Chem., 271: 31839-31845 (1996)). Se sabe en general que el tallo-bucle y el ARN están implicados en el ensamblaje del virus (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)).

En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en proteínas recombinantes o fragmentos de las mismas de un fago de ARN, en la que las proteínas recombinantes comprenden, consisten esencialmente en o consisten como alternativa en proteínas de cubierta mutantes de un fago de ARN, preferiblemente en proteínas de cubierta mutante de los fagos de ARN mencionados anteriormente. En otra realización preferida, las proteínas de cubierta mutantes de los fagos de ARN se han modificado por eliminación de al menos un resto lisina por medio de sustitución o por adición de al menos un resto lisina por medio de sustitución; como alternativa, las proteínas de cubierta mutantes del fago de ARN se han modificado por deleción de al menos un resto lisina o por adición de al menos un resto lisina por medio de inserción.

En otra realización preferida, las partículas similar a virus comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en proteínas recombinantes o fragmentos de las mismas, del bacteriófago de ARN Q\beta, en la que las proteínas recombinantes comprenden, o como alternativa consisten esencialmente en, o como alternativa consisten en proteínas de cubierta que tienen una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 o una mezcla de proteínas de cubierta que tienen secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 y de la SEC ID Nº: 11 o mutantes de la SEC ID Nº: 11 y en la que la metionina N-terminal está preferiblemente escindida.

En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, consiste esencialmente en o como alternativa consiste en proteínas recombinantes de Q\beta, o fragmentos de las mismas, en la que las proteínas recombinantes comprenden, o como alternativa consisten esencialmente en o como alternativa consisten en proteínas de cubierta de Q\beta mutantes. En otra realización preferida, estas proteínas de cubierta mutantes se han modificado por eliminación de al menos un resto lisina por medio de sustitución o por adición de al menos un resto lisina por medio de sustitución. Como alternativa, estas proteínas de cubierta mutantes se han modificado por deleción de al menos un resto lisina o por adición de al menos un resto lisina por medio de inserción.

Están expuestos cuatro restos lisina en la superficie de la cápside de la proteína de cubierta de Q\beta. También pueden usarse para la presente invención mutantes de Q\beta para que los restos lisina expuestos se sustituyen por argininas. Por lo tanto, pueden usarse en la práctica de la invención los siguientes mutantes de proteínas de cubierta de Q\beta y VLP de Q\beta mutantes: "Q\beta-240" (Lys13-Arg; SEC ID Nº: 23), "Q\beta-243" (Asn^{-}10-Lys, SEC ID Nº: 24), "Q\beta-250" (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; SEC ID Nº: 25), "Q\beta-251" (SEC ID Nº: 26) y "Q\beta-259 "(Lys 2-Arg, Lys16-Arg; SEC ID Nº: 27). Por lo tanto, en una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, consiste esencialmente en o como alternativa consiste en proteínas recombinantes de proteínas de cubierta de Q\beta mutantes que comprenden proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de a) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 23; b) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 24, c) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 25; d) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 26; y e) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 27. La construcción, expresión y purificación de las proteínas de cubierta de Q\beta, VLP y cápsides de proteína de cubierta de Q\beta mutantes indicadas anteriormente, respectivamente, se describe en la Solicitud de Estados Unidos en trámite Nº 10/050.902 presentada el 18 de enero 2002. En particular se hace referencia por la presente al Ejemplo 18 de la solicitud mencionada anteriormente.

En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, o como alternativa cosiste esencialmente en, o como alternativa consiste en proteínas recombinantes de Q\beta o fragmentos de las mismas, en los que las proteínas recombinantes comprenden, consisten esencialmente en o como alternativa consisten en una mezcla de uno cualquiera de los mutantes de Q \beta anteriores y la proteína A1 correspondiente.

En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, o como alternativamente consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en proteínas recombinantes o fragmentos de las mismas de fago de ARN AP205.

El genoma de AP205 consiste en una proteína de maduración, una proteína de cubierta, una replicasa y dos fases de lectura abierta que no están presentes en fagos relacionados; un gen de lisis y una fase de lectura abierta que desempeña un papel en la traducción del gen de maduración (Klovins, J., et al., J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002)). La proteína de cubierta de AP205 puede expresarse a partir del plásmido pAP283-58 (SEC ID Nº: 79), que es un derivado de pQb10 (Kozlovska, T. M. et al., Gene 137: 133-37 (1993)), y que contiene un sitio de unión al ribosoma AP205. Como alternativa, la proteína de cubierta AP205 puede clonarse en pQb185, cadena abajo del sitio de unión al ribosoma presente en el vector. Ambas estrategias conducen a la expresión de la proteína y a la formación de cápsides como se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos en trámite junto con la presente con el título "Molecular Antigen Arrays" (solicitud Nº 60/396.126) y que se ha presentado el 17 de julio de 2002, que se incorpora como referencia en su totalidad. Los vectores pQb10 y pQb185 son vectores derivados del vector pGEM y la expresión de los genes clonados en estos vectores se controla mediante el promotor trp (Kozlovska, T. M. et al., Gene 137:133-37 (1993)). El plásmido pAP283-58 (SEC ID Nº: 79) comprende un supuesto sitio de unión al ribosoma de AP205 en la siguiente secuencia, que está cadena abajo del sitio XbaI, e inmediatamente cadena arriba del codón de inicio ATG de la proteína de cubierta de AP205: tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAG GAAAATCACatg. El vector pQb185 comprende una secuencia de Shine Delagarno cadena abajo del sitio XbaI y cadena arriba del codón de inicio (tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg, subrayada la secuencia de Shine Delagarno).

En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula similar a virus comprende o como alternativa consiste esencialmente en o como alternativa consiste en proteínas de cubierta recombinantes, o fragmentos de las mismas, del fago de ARN AP205.

Esta realización preferida de la presente invención comprende por lo tanto proteínas de cubierta de AP205 que forman cápsides. Dichas proteínas se expresan de forma recombinante o se preparan a partir de fuentes naturales. Las proteínas de cubierta de AP205 producidas en bacterias forman espontáneamente cápsides, como se demuestra por microscopía electrónica (EM) e inmunodifusión. Las propiedades estructurales de la cápside formada por la proteína de cubierta de AP205 (SEC ID Nº: 80) y las formadas por la proteína de cubierta del fago de ARN AP205 son casi indistinguibles cuando se observan en EM. Las VLP de AP205 son altamente inmunogénicas y pueden unirse con antígenos y/o determinantes antigénicos para generar construcciones de vacunas que presenten los antígenos y/o determinantes antigénicos orientados de una forma repetitiva. Se generan altos títulos contra los antígenos presentados de este modo demostrando que los antígenos y/o determinantes antigénicos unidos son accesibles para interaccionar con moléculas de anticuerpos y son inmunogénicos.

En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en proteínas de cubierta mutantes recombinantes, o fragmentos de las mismas, del fago de ARN AP205.

También pueden usarse en la práctica de la invención formas mutantes que pueden esamblarse de VLP de AP205 incluyendo la proteína de cubierta de AP205 con la sustitución de la prolina en el aminoácido 5 con treonina (SEC ID Nº: 81) y conducen a una realización preferida adicional de la invención. Estas VLP, VLP de AP205 obtenidas de fuentes naturales o partículas virales de AP205 pueden unirse a antígenos para producir matrices repetitivas ordenadas de los antígenos de acuerdo con la presente invención.

La proteína de cubierta mutante P5-T de AP205 puede expresarse a partir del plásmido pAP281-32 (SEC ID Nº: 82), que se obtiene directamente de pQb185 y que contiene el gen de la proteína de cubierta de AP205 mutante en lugar del gen de la proteína de cubierta de Q\beta. Los vectores para la expresión de la proteína de cubierta de AP205 se usan para transfectar E. coli para la expresión de la proteína de cubierta de AP205.

Se describen métodos para la expresión de la proteína de cubierta y de la proteína de cubierta mutante, respectivamente, que conducen al autoensamblaje en VLP en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos en trámite junto con la presente con el título "Molecular Antigen Arrays" (solicitud Nº 60/396.126) y que se ha presentado el 17 de julio de 2002, que se incorpora como referencia en su totalidad. Las cepas de E. coli adecuadas incluyen, pero sin limitación, E. coli K802, JM 109, RR1. Pueden identificarse vectores y cepas adecuadas y combinaciones de los mismos por ensayo de la expresión de la proteína de cubierta y de la proteína de cubierta mutante, respectivamente, mediante SDS-PAGE y formación de cápsides y ensamblaje purificando primero opcionalmente las cápsides por filtración en gel y posteriormente ensayándolas en un ensayo de inmunodifusión (ensayo de Ouchterlony) o Microscopía Electrónica (Kozlovska, T. M. et al., Gene 137: 133-37 (1993)).

Las proteínas de cubierta de AP205 expresadas a partir de los vectores pAP283-58 y pAP281-32 pueden estar desprovistas del aminoácido metionina inicial debido al procesamiento en citoplasma de E. coli. Son realizaciones preferidas adicionales de la invención formas escindidas y no escindidas de VLP de AP205 o mezclas de las
mismas.

En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en una mezcla de proteínas de cubierta recombinantes o fragmentos de las mismas del fago de ARN AP205 y de proteínas de cubierta mutantes recombinantes o fragmentos de las mismas del fago de ARN AP205.

En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en fragmentos de proteínas de cubierta recombinantes o proteínas de cubierta mutantes recombinantes del fago de ARN AP205.

Los fragmentos de proteína de cubierta de AP205 recombinantes capaces de ensamblarse en una VLP y una cápside, respectivamente, también son útiles en la práctica de la invención. Estos fragmentos pueden generarse por deleción, internamente o en el extremo terminal de la proteína de cubierta y la proteína de cubierta mutante, respectivamente. Las inserciones en la secuencia de la proteína de cubierta y la proteína de cubierta mutante o fusiones de secuencias antigénicas con la secuencia de proteína de cubierta y proteína de cubierta mutante y compatibles con el ensamblaje en una VLP son realizaciones adicionales de la invención y conducen a proteínas de cubierta de AP205 quiméricas y partículas, respectivamente. El resultado de las inserciones, deleciones y fusiones con la secuencia de proteína de cubierta y si es compatible con el ensamblaje en una VLP puede determinarse por microscopía electrónica.

Las partículas formadas por la proteína de cubierta de AP205, fragmentos de proteína de cubierta y proteínas de cubierta quiméricas descritas anteriormente pueden aislarse en forma pura mediante una combinación de etapas de fraccionamiento por precipitación y de etapas de purificación por filtración en gel usando, por ejemplo, columnas de Sepharose CL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose CL-6B y combinaciones de las mismas como se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos en trámite junto con la presente con el título "Molecular Antigen Arrays" (solicitud Nº 60/396.126) y que se ha presentado el 17 de julio de 2002, que se incorpora como referencia en su totalidad. Se conocen en la técnica otros métodos de aislamiento de partículas similares a virus y pueden usarse para aislar las partículas similares a virus (VLP) de bacteriófago AP205. Por ejemplo, el uso de ultracentrifugación para aislar VLP del retrotransposón de levadura Ty se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.918.166 que se incorpora como referencia en este documento en su totalidad.

Se ha determinado la estructura cristalina de varios bacteriófagos de ARN (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-554 (1996)). Usando dicha información, pueden identificarse los restos expuestos en superficie y por lo tanto pueden modificarse las proteínas de cubierta de fagos de ARN de modo que pueden insertarse uno o más restos aminoacídicos reactivos por medio de inserción o sustitución. Como consecuencia, las formas modificadas de proteínas de cubierta de bacteriófagos también pueden usarse para la presente invención. Por lo tanto, también pueden usarse variantes de proteínas que forman cápsides o estructuras similares a cápsides (por ejemplo, proteínas de cubierta de bacteriófago Q\beta, bacteriófago R17, bacteriófago fr, bacteriófago GA, bacteriófago SP y bacteriófago MS2, bacteriófago AP205) para preparar composiciones de la presente invención.

Aunque la secuencia de las proteínas variantes analizadas anteriormente diferirá de sus homólogos de tipo silvestre, estas proteínas variantes conservarán generalmente la capacidad para formar cápsides o estructuras similares a cápsides. Por lo tanto, la invención incluye además composiciones y composiciones vacunales, respectivamente, que incluyen además variantes de proteínas que forman cápsides o estructuras similares a cápsides, así como métodos para preparar dichas composiciones y composiciones vacunales, respectivamente, subunidades proteicas individuales usadas para preparar dichas composiciones y moléculas de ácido nucleico que codifican estas subunidades proteicas. Por lo tanto, se incluyen en el alcance de la invención formas variantes de proteínas de tipo silvestre que forman cápsides o estructuras similares a cápsides y que conservan la capacidad para asociarse y formar cápsides o estructuras similares a cápsides.

Como resultado, la invención incluye además composiciones y composiciones vacunales, respectivamente, que comprenden proteínas que comprenden, o como alternativa consisten esencialmente en, o como alternativa consisten en secuencias de aminoácidos que tienen una identidad de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% con proteínas de tipo silvestre que forman matrices ordenadas y tienen una estructura repetitiva intrínseca, respectivamente.

Se incluyen además en el alcance de la invención moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas usadas para preparar composiciones de la presente invención.

En otras realizaciones, la invención incluye además composiciones que comprenden proteínas, que comprenden o como alternativa consisten esencialmente en, o como alternativa consisten en secuencias de aminoácidos que tienen una identidad de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se muestra en las SEC ID Nº: 10-27.

Las proteínas adecuadas para usar en la presente invención también incluyen mutantes de truncamiento C-terminal de proteínas que forman cápsides o estructuras similares a cápsides o VLP. Los ejemplos específicos de dichos mutantes de truncamiento incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID Nº: 10-27, en las que se han eliminado 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 ó 17 aminoácidos del extremo C-terminal. Típicamente, estos mutantes de truncamiento C-terminal conservarán la capacidad para formar cápsides o estructuras similares a cápsides.

Las proteínas adicionales adecuadas para usar en la presente invención también incluyen mutantes de truncamiento N-terminal de proteínas que forman cápsides o estructuras similares a cápsides. Los ejemplos específicos de dichos mutantes de truncamiento incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID Nº: 10-27 en las que se han eliminado 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 ó 17 aminoácidos del extremo N-terminal. Típicamente, estos mutantes de truncamiento N-terminal conservarán la capacidad para formar cápsides o estructuras similares a cápsides.

Las proteínas adicionales adecuadas para usar en la presente invención incluyen mutantes de truncamiento N- y C-terminal que forman cápsides o estructuras similares a cápsides. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID Nº: 10-27, en la que se han eliminado 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 ó 17 aminoácidos del extremo N-terminal y se han eliminado 1, 2, 7, 9, 10, 12, 14, 15 ó 17 aminoácidos del extremo C-terminal. Típicamente, estos mutantes de truncamiento N-terminal y C-terminal conservarán la capacidad para formar cápsides o estructuras similares a cápsides.

La invención incluye además composiciones que comprenden proteínas que comprenden, o como alternativa consisten esencialmente en, o como alternativa consisten en secuencias de aminoácidos que tienen una identidad de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% con los mutantes de truncamiento descritos anteriormente.

La invención incluye por lo tanto composiciones y composiciones vacunales preparadas a partir de proteínas que forman cápsides o VLP, métodos para preparar estas composiciones a partir de subunidades proteicas individuales y VLP o cápsides, métodos para preparar estas subunidades proteicas individuales, moléculas de ácido nucleico que codifican estas subunidades y métodos para vacunar y/o generar respuestas inmunológicas en individuos usando estas composiciones de la presente invención.

Los fragmentos de VLP que conservan la capacidad para inducir una respuesta inmune pueden comprender, o como alternativa consistir en polipéptidos que tienen una longitud de aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ó 500 aminoácidos, pero obviamente dependerá de la longitud de la secuencia de la subunidad que compone la VLP. Los ejemplos de dichos fragmentos incluyen fragmentos de proteínas analizados en este documento que son adecuadas para la preparación de la composición potenciadora de la respuesta inmune.

En otra realización preferida de la invención, las VLP están libres de una envuelta lipoproteica o una envuelta que contiene lipoproteína. En una realización preferida adicional, las VLP están totalmente libres de una envuelta.

La ausencia de una envuelta lipoproteica o una envuelta que contiene lipoproteína y, en particular, la ausencia completa de una envuelta conduce a una partícula similar a virus más definida en su estructura y composición. Dichas partículas similares a virus más definidas pueden minimizar por lo tanto los efectos secundarios. Además, la ausencia de una envuelta que contiene lipoproteína o, en particular, la ausencia completa de una envuelta evita o minimiza la incorporación de moléculas potencialmente tóxicas y pirógenos en el interior de la partícula similar a virus.

Como se ha indicado anteriormente, la invención incluye partículas similares a virus o formas recombinantes de las mismas. Los especialistas tienen los conocimientos para producir dichas partículas y unir antígenos a las mismas. A modo de proporcionar otros ejemplos, la invención proporciona en este documento la producción de partículas similares al virus de la hepatitis B como partículas similares a virus (Ejemplo 1).

En una realización, las partículas usadas en composiciones de la invención están compuestas por una proteína de la cápside (de núcleo) de la hepatitis B (HBcAg) o un fragmento de un HBcAg que se ha modificado para eliminar o reducir el número de restos cisteína libres. Zhou et al. (J. Virol. 66: 5393-5398 (1992)) demostraron que los HBcAg que se habían modificado para eliminar los restos cisteína existentes de forma natural conservan la capacidad para asociarse y formar estructuras multiméricas. Por lo tanto, las partículas de núcleo adecuadas para usar en composiciones de la invención incluyen las que comprenden HbcAg modificados o fragmentos de los mismos, en los que uno o más de los restos cisteína existentes de forma natural se han delecionado o sustituido con otro resto aminoacídico (por ejemplo, un resto serina).

El HBcAg es una proteína generada por el procesamiento de una proteína precursora de antígeno de núcleo de hepatitis B. Se han identificado varios isotipos del HBcAg y sus secuencias de aminoácidos están fácilmente disponibles para los especialistas en la técnica. Por ejemplo, la proteína HBcAg que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1 tiene una longitud de 185 aminoácidos y se genera por el procesamiento de una proteína precursora de antígeno de núcleo de hepatitis B de 212 aminoácidos. Este procesamiento da como resultado la eliminación de 29 aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína precursora de antígeno de núcleo de hepatitis B. De forma similar, la proteína HBcAg que tiene 185 aminoácidos de longitud se genera por el procesamiento de una proteína precursora de antígeno de núcleo de hepatitis B de 214 aminoácidos.

En realizaciones preferidas, se prepararán composiciones vacunales de la invención usando la forma procesada de un HBcAg (es decir, un HBcAg del que se ha eliminado la secuencia líder N-terminal de la proteína precursora del antígeno de núcleo de hepatitis B).

Además, cuando se producen HBcAg en condiciones en las que no se producirá el procesamiento, los HBcAg se expresarán generalmente en forma "procesada". Por ejemplo, los sistemas bacterianos, tales como E. coli, generalmente no eliminan las secuencias líder, también denominadas "péptidos señal", de proteínas que se expresan normalmente en células eucariotas. Por lo tanto, cuando se usa un sistema de expresión en E. coli que dirige la expresión de la proteína al citoplasma para producir HBcAg de la invención, estas proteínas se expresarán generalmente de modo que la secuencia líder N-terminal de la proteína precursora de antígeno de núcleo de hepatitis B no esté presente.

La preparación de partículas similares a virus de hepatitis B que pueden usarse para la presente invención se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/32227 y por la presente en particular en los Ejemplos 17 a 19 y 21 a 24, así como en el documento WO 01/85208 y por la presente en particular en los Ejemplos 17 a 19, 21 a 24, 31 y 41 y en la solicitud de Estados Unidos en trámite Nº 10/050.902 presentada el 18 de enero de 2002. Para la última solicitud, se hace referencia en particular a los Ejemplos 23, 24, 31 y 51. Los tres documentos se incorporan explícitamente en este documento como referencia.

La presente invención también incluye variantes de HBcAg que se han modificado para delecionar o sustituir uno o más restos cisteína adicionales. Por lo tanto, las composiciones vacunales de la invención incluyen composiciones que comprenden HBcAg en los que se han delecionado los restos cisteína que no están presentes en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1.

Es bien conocido en la técnica que los restos cisteína libres pueden estar implicados en varias reacciones químicas secundarias. Estas reacciones secundarias incluyen intercambios de disulfuro, reacción con sustancias químicas o metabolitos que, por ejemplo, se inyectan o se forman en una terapia de combinación con otras sustancias, u oxidación directa y reacción con nucleótidos tras la exposición a luz UV. Por lo tanto, podrían generarse aductos tóxicos, especialmente considerando el hecho de que los HBcAg tienen una fuerte tendencia a unirse a ácidos nucleicos. Por lo tanto, los aductos tóxicos se distribuirían entre una multiplicidad de especies, cada una de las cuales puede estar presente individualmente a baja concentración, pero que alcanzan niveles tóxicos cuando se juntan.

En vista de lo anterior, una ventaja del uso de HBcAg en composiciones vacunales que se han modificado para eliminar restos de cisteína presentes de forma natural es que los sitios a los que pueden unirse especies tóxicas cuando están unidos antígenos o determinantes antigénicos se reducirían en número o se eliminarían por completo.

Se han identificado varias variantes de HBcAg de origen natural adecuadas para el uso en la práctica de la presente invención. Yuan et al., (J. Virol. 73: 10122-10128 (1999)), por ejemplo, describen variantes en las que el resto isoleucina en la posición correspondiente a la posición 97 de la SEC ID Nº: 28 se sustituye con un resto leucina o un resto fenilalanina. Las secuencias de aminoácidos de varias variantes de HBcAg, así como de varias variantes de precursor de antígeno de núcleo de hepatitis B se describen en los informes de GenBank AAF121240 (SEC ID Nº: 29), AF121239 (SEC ID Nº: 30), X85297 (SEC ID Nº: 31), X02496 (SEC ID Nº: 32), X85305 (SEC ID Nº: 33), X85303 (SEC ID Nº: 34), AF151735 (SEC ID Nº: 35), X85259 (SEC ID Nº: 36), X85286 (SEC ID Nº: 37), X85260 (SEC ID Nº: 38), X85317 (SEC ID Nº: 39), X85298 (SEC ID Nº: 40), AF043593 (SEC ID Nº: 41), M20706 (SEC ID Nº: 42), X85295 (SEC ID Nº: 43), X80925 (SEC ID Nº: 44), X85284 (SEC ID Nº: 45), X85275 (SEC ID Nº: 46), X72702 (SEC ID Nº: 47), X85291 (SEC ID Nº: 48), X65258 (SEC ID Nº: 49), X85302 (SEC ID Nº: 50), M32138 (SEC ID Nº: 51), X85293 (SEC ID Nº: 52), X85315 (SEC ID Nº: 53), U95551 (SEC ID Nº: 54), X85256 (SEC ID Nº: 55 ), X85316 (SEC ID Nº: 56), X85296 (SEC ID Nº: 57), AB033559 (SEC ID Nº: 58), X59795 (SEC ID Nº: 59), X85299 (SEC ID Nº: 60), X85307 (SEC ID Nº: 61), X65257 (SEC ID Nº: 62), X85311 (SEC ID Nº: 63), X85301 (SEC ID Nº: 64), X85314 (SEC ID Nº: 65), X85287 (SEC ID Nº: 66), X85272 (SEC ID Nº: 67), X85319 (SEC ID Nº: 68), AB010289 (SEC ID Nº: 69), X85285 (SEC ID Nº: 70), AB010289 (SEC ID Nº: 71), AF121242 (SEC ID Nº: 72), M90520 (SEC ID Nº: 73), P03153 (SEC ID Nº: 74), AF110999 (SEC ID Nº: 75), y M95589 (SEC ID Nº: 76), incorporándose las descripciones de cada una de las mismas en este documento como referencia. Estas variantes de HBcAg difieren en la secuencia de aminoácidos en varias posiciones, incluyendo los restos aminoacídicos que se corresponden con los restos aminoacídicos localizados en las posiciones 12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33, 35, 38, 40, 42, 44, 45, 49, 51, 57, 58, 59, 64, 66, 67, 69, 74, 77, 80, 81, 87, 92, 93, 97, 98, 100, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 121, 126, 130, 133, 135, 141, 147, 149, 157, 176, 178, 182 y 183 en la SEC ID Nº: 77. Además, se describen variantes de HBcAg adecuadas para el uso en las composiciones de la invención y que pueden modificarse adicionalmente de acuerdo con la descripción de esta memoria descriptiva en los documentos WO 00/198333, WO 00/177158 y WO 00/214478.

Los HBcAg adecuados para usar en la presente invención pueden proceder de cualquier organismo siempre que sean capaces de incluir o de acoplarse o unirse de otro modo a, en particular, siempre que sean capaces de empaquetar un oligonucleótido que contiene CpG no metilado e inducir una respuesta inmune.

Como se ha indicado anteriormente, se usarán HBcAg procesados de forma general, (es decir, los que carecen de secuencias líder) en las composiciones vacunales de la invención. La presente invención incluye composiciones vacunales, así como métodos para usar estas composiciones que emplean los HBcAg variantes descritos anteriormente.

Se incluyen adicionalmente en el alcance de la invención variantes de HBcAg adicionales que son capaces de asociarse para formar estructuras diméricas o multiméricas. Por lo tanto, la invención incluye además composiciones vacunales que comprenden polipéptidos HBcAg que comprenden, o como alternativa consisten en, secuencias de aminoácidos que tienen una identidad de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de tipo silvestre y formas de estas proteínas que se han procesado, cuando sea apropiado, para eliminar la secuencia líder N-terminal.

Puede determinarse convencionalmente si la secuencia de aminoácidos de un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% con una de las secuencias de aminoácidos de tipo silvestre, o con una subporción de las mismas, usando programas informáticos conocidos tales como el programa Bestfit. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular tiene una identidad, por ejemplo, del 95% con una secuencia de aminoácidos de referencia, los parámetros se ajustan de modo que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y que se permitan huecos en la homología de hasta el 5% del número total de restos aminoacídicos en la secuencia de referencia.

Las variantes de HBcAg y precursores que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 29-72 y 73-76 son relativamente similares entre sí. Por lo tanto, la referencia a un "resto aminoacídico" de una variante de HBcAg localizado en una posición que se corresponde con una posición particular en la SEC ID Nº: 77, se refiere al resto aminoacídico que está presente en esa posición en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 77. La homología entre estas variantes de HBcAg es para la mayor parte lo bastante alta entre virus de la hepatitis B que infectan a mamíferos como para que un especialista en la técnica tenga escasas dificultades al revisar tanto la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 77 y en la Figura 1, respectivamente, como la de una variante de HBcAg particular e identificar los restos aminoacídicos "correspondientes". Además, la secuencia de aminoácidos de HBcAg que se muestra en la SEC ID Nº: 73 que muestra la secuencia de aminoácidos de un HBcAg obtenido de un virus que infecta a marmotas, tiene una homología suficiente con el HBcAg que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 77 para que sea fácilmente evidente que está presente un inserto de tres restos aminoacídicos en la SEC ID Nº: 73 entre los restos aminoacídicos 155 y 156 de la SEC ID Nº: 77.

La invención también incluye composiciones vacunales que comprenden variantes de HBcAg de virus de la hepatitis B que infectan a aves, así como composiciones vacunales que comprenden fragmentos de estas variantes de HBcAg. Como reconocerá un especialista en la técnica podrían sustituirse uno, dos, tres o más de los restos cisteína presentes de forma natural en estos polipéptidos con otro resto aminoacídico o delecionarse antes de su inclusión en composiciones vacunales de la invención.

Como se ha analizado anteriormente, la eliminación de restos cisteína libres reduce el número de sitios en los que pueden unirse componentes tóxicos al HBcAg y también elimina sitios en los que puede producirse el entrecruzamiento de restos lisina y cisteína de la misma molécula de HBcAg o de moléculas de HbcAg vecinas. Por lo tanto, en otra realización de la presente invención, se ha delecionado o sustituido uno o más restos cisteína de la proteína de la cápside del virus de la Hepatitis B con otro resto aminoacídico.

En otras realizaciones, las composiciones y composiciones vacunales, respectivamente, de la invención contendrán HBcAg en los que se ha eliminado la región C-terminal (por ejemplo, restos aminoacídicos 145-185 ó 150-185 de la SEC ID Nº: 77). Por lo tanto, los HBcAg modificados adicionales adecuados para el uso en la práctica de la presente invención incluyen mutantes de truncamiento C-terminal. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen HbcAg en los que se han eliminado 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35 aminoácidos del extremo C-terminal.

Los HBcAg adecuados para el uso en la práctica de la presente invención también incluyen mutantes de truncamiento N-terminal. Los mutantes de truncamiento adecuado incluyen HBcAg modificados en los que se han eliminado 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 ó 17 aminoácidos del extremo N-terminal.

Los HBcAg adicionales adecuados para el uso en la práctica de la presente invención incluyen mutantes de truncamiento N- y C-terminal. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen HbcAg en los que se han eliminado 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 y 17 aminoácidos del extremo N-terminal y en los que se han eliminado 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35 aminoácidos del extremo C-terminal.

La invención incluye además composiciones y composiciones vacunales, respectivamente, que comprenden polipéptidos HBcAg que comprenden, o como alternativa consisten esencialmente en, o como alternativa consisten en secuencias de aminoácidos que tienen una identidad de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% con los mutantes de truncamiento descritos anteriormente.

En ciertas realizaciones de la invención, se introduce un resto lisina en un polipéptido de HBcAg para mediar la unión del antígeno o determinante antigénico con la VLP de HBcAg. En realizaciones preferidas, se preparan composiciones de la invención usando un HBcAg que comprende, o como alternativa consiste en, los aminoácidos 1-144 ó 1-149, 1-185 de la SEC ID Nº: 77, que se modifica de modo que los aminoácidos correspondientes a las posiciones 79 y 80 se sustituyen con un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (SEC ID Nº: 78). Estas composiciones son particularmente útiles en las realizaciones en las que se acopla un determinante antigénico con una VLP de HBcAg. En realizaciones preferidas adicionales, los restos cisteína en las posiciones 48 y 107 de la SEC ID Nº: 77 se mutan a serina. La invención incluye además composiciones que comprenden los polipéptidos correspondientes que tienen secuencias de aminoácidos que se muestran en cualquiera de las SEC ID Nº: 29-74, que también tienen las alteraciones de aminoácidos indicadas anteriormente. Se incluyen adicionalmente en el alcance de la invención variantes de HBcAg adicionales que son capaces de asociarse para formar una cápside o VLP y que tienen las alteraciones de aminoácidos indicadas anteriormente. Por lo tanto, la invención incluye además composiciones y composiciones vacunales, respectivamente, que comprenden polipéptidos HBcAg que comprenden, o como alternativa consisten en, secuencias de aminoácidos que tienen una identidad de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de tipo silvestre y formas de estas proteínas que se han procesado, cuando sea apropiado, para eliminar la secuencia líder N-terminal y que se han modificado con las alteraciones indicadas anteriormente.

Las composiciones o composiciones vacunales de la invención pueden comprender mezclas de diferentes HBcAg. Por lo tanto, estas composiciones vacunales pueden estar compuestas por HbcAg que difieran en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, podrían prepararse composiciones vacunales que comprenden una HBcAg de "tipo silvestre" y un HBcAg modificado en el que se han alterado uno o más restos aminoacídicos (por ejemplo, delecionado, insertado o sustituido). Además, las composiciones vacunales preferidas de la invención son los que presentan matrices de antígenos altamente ordenadas y repetitivas.

Como se ha descrito anteriormente, la invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que ácidos nucleicos inmunoestimuladores e incluso más preferiblemente oligonucleótidos de ADN pueden empaquetarse en VLP. Inesperadamente, los ácidos nucleicos presentes en VLP pueden sustituirse específicamente por las sustancias inmunoestimuladoras, preferiblemente por los ácidos nucleicos inmunoestimuladores y, aún más preferiblemente, por los oligonucleótidos de ADN que contienen motivos CpG. Como ejemplo, las VLP con CpG son radicalmente más inmunogénicas y generan efectos más específicos que sus homólogos sin CpG e inducen respuestas de células B y T aumentadas. La respuesta inmune contra antígenos acoplados, fusionados o unidos de otro modo a las VLP se potencia de forma similar a la respuesta inmune contra la propia VLP. Además, las respuestas de células T contra tanto las VLP como los antígenos se dirigen especialmente al tipo Th1. Además, los ácidos nucleicos y CpG empaquetados, respectivamente, están protegidos de la degradación, es decir, son más estables. Además, se reduce drásticamente la activación inespecífica de células del sistema inmune innato.

El sistema inmune innato tiene la capacidad de reconocer un patrón molecular invariable compartido por patógenos microbianos. Estudios recientes han puesto de manifiesto que este reconocimiento es una etapa crucial en la inducción de respuestas inmunes eficaces. El mecanismo principal por el que los productos microbianos aumentan las respuestas inmunes consiste en estimular APC, especialmente células dendríticas, para producir citocinas proinflamatorias y para expresar altos niveles de moléculas coestimuladoras para células T. Estas células dendríticas activadas inician posteriormente respuestas de células T primarias y determinan el tipo de función efectora mediada por célula T.

Dos clases de ácidos nucleicos, en concreto 1) ADN bacteriano que contiene secuencias inmunoestimuladoras, en particular dinucleótidos CpG no metilados en el interior de bases flanqueantes específicas (denominadas motivos CpG) y 2) ARN bicatenario sintetizado por diversos tipos de virus, representan miembros importantes de los componentes microbianos que potencian respuestas inmunes. El ARN bicatenario (bc) sintético tal como ácido poliinosínico-policitidílico (poli I:C) es capaz de inducir que células dendríticas produzcan citocinas proinflamatorias y expresen altos niveles de moléculas coestimuladoras.

Una serie de estudios por Tokunaga y Yamamoto et al. han demostrado que el ADN bacteriano u oligodesoxinucleótidos sintéticos inducen que PBMC humanas y células de bazo de ratón produzcan interferón tipo I (IFN) (revisado en Yamamoto et al., Springer Semin Immunopathol. 22: 11-19). Originariamente se sintetizó poli (I:C) como un inductor potente de IFN tipo I, pero también induce otras citocinas tales como IL-12.

Los ácidos ribonucleicos preferidos incluyen el ARN bicatenario ácido poliinosínico-policitidílico (poli I:C). Se han descrito ácidos ribonucleicos y modificaciones de los mismos, así como métodos para su producción por Levy, H. B. (Methods Enzymol. 1981, 78: 242-251), Declercq, E (Methods Enzymol. 1981, 78:2 27-236) y Torrence, P. F.
(Methods Enzymol 1981; 78: 326-331) y referencias en los mismos. Pueden aislarse ácidos ribonucleicos de organismos. Los ácidos ribonucleicos también incluyen ácidos ribonucleicos sintéticos adicionales, en particular, oligonucleótidos poli (I:C) sintéticos que se han vuelto resistentes a nucleasas por modificación de la cadena principal fosfodiéster, en particular por modificaciones fosforotioato. En una realización adicional la cadena principal de ribosa de poli (I:C) se sustituye por una desoxirribosa. Los especialistas en la técnica conocen procedimientos de cómo sintetizar oligonucleótidos sintéticos.

En otra realización preferida de la invención, se incluyen moléculas que activan receptores tipo peaje (TLR). Hasta la fecha se conocen diez receptores tipo peaje humanos. Se activan por una diversidad de ligandos. El TLR2 se activa por peptidoglicanos, lipoproteínas, ácido lipoteicónico y zimosán; el TLR3 se activa por ARN bicatenario tal como poli (I:C); el TLR4 se activa por lipopolisacárido, ácidos lipoteicoicos y taxol; el TLR5 se activa por flagelos bacterianos, especialmente la proteína flagelina; el TLR6 se activa por peptidoglicanos, el TLR7 se activa por imiquimod y compuestos de imidazoquinolina tales como R418 y el TLR9 se activa por ADN bacteriano en particular ADN con CpG. Hasta ahora no se conocen ligandos para TLR1, TLR8 y TLR10. Sin embargo, informes recientes indican que los mismos receptores pueden reaccionar con diferentes ligandos y que están presentes receptores adicionales. La lista anterior de ligandos no es exhaustiva y se incluyen ligandos adicionales en el cocimiento del especialista en la técnica.

Preferiblemente, el oligonucleótido que contiene CpG no metilado comprende la secuencia:

5'X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}\ 3'

en la que X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son cualquier nucleótido. Además, el oligonucleótido puede comprender de aproximadamente 6 a aproximadamente 100.000 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 2000 nucleótidos, más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 2000 nucleótidos y aún más preferiblemente comprende de aproximadamente 20 a aproximadamente 300 nucleótidos. Además, el oligonucleótido puede comprender más de 100 a aproximadamente 2000 nucleótidos, preferiblemente más de 100 a aproximadamente 1000 nucleótidos y, más preferiblemente, más de 100 a aproximadamente 500 nucleótidos.

En una realización preferida, el oligonucleótido que contiene CpG contiene una o más modificaciones fosforotioato de la cadena principal fosfato. Por ejemplo, se incluye en el alcance de la presente invención un oligonucleótido que contiene CpG que tiene una o más modificaciones de la cadena principal fosfato o que tiene toda la cadena principal fosfato modificada y un oligonucleótido que contiene CpG en el que una, algunas o todas las modificaciones de la cadena principal fosfato de nucleótidos son modificaciones fosforotioato.

El oligonucleótido que contiene CpG también puede ser recombinante, genómico, sintético, ADNc, de origen plasmídico y monocatenario o bicatenario. Para el uso en la presente invención, los ácidos nucleicos pueden sintetizarse de novo usando cualquiera de varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el método de b-cianoetil fosforamidita (Beaucage, S. L. y Caruthers, M. H., Tet. Let. 22: 1859 (1981); el método de nucleósido H-fosfonato (Garegg et al., Tet. Let. 27: 4051-4054 (1986); Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14: 5399-5407 (1986); Graregg et al., Tet. Let. 27: 4055-4058 (1986), Gaffney et al., Tet. Let. 29: 2619-2622 (1988)). Estas reacciones químicas pueden realizarse mediante una diversidad de sintetizadores de oligonucleótidos automáticos disponibles en el mercado. Como alternativa, pueden producirse CpG a gran escala en plásmidos (véase Sambrook, T., et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989), que después de administrarse a un sujeto se degradan en oligonucleótidos. Pueden preparase oligonucleótidos a partir de secuencias de ácidos nucleicos existentes (por ejemplo, genómico o ADNc) usando técnicas conocidas, tales como las que emplean enzimas de restricción, exonucleasas o endonucleasas.

Las sustancias inmunoestimuladoras, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores así como el oligonucleótido que contiene CpG no metilado pueden unirse a la VLP de cualquier modo conocido en la técnica con tal de que la composición potencie una respuesta inmune en un animal. Por ejemplo, el oligonucleótido puede unirse covalentemente o no covalentemente. Además, la VLP puede incluir, total o parcialmente, las sustancias inmunoestimuladoras, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores así como el oligonucleótido que contiene CpG no metilado. Preferiblemente, el ácido nucleico inmunoestimulador, así como el oligonucleótido que contiene CpG no metilado pueden unirse a un sitio de VLP tal como un sitio de unión a oligonucleótido (de origen natural o no natural), un sitio de unión a ADN o un sitio de unión a ARN. En otra realización, el sitio de VLP comprende una repetición rica en arginina.

Un uso específico para las composiciones de la invención consiste en activar células dendríticas con el fin de potenciar una respuesta inmune específica contra antígenos. La respuesta inmune puede potenciarse usando técnicas ex vivo o in vivo. El procedimiento ex vivo puede usarse en células autólogas o heterólogas, pero se usa preferiblemente en células autólogas. En realizaciones preferidas, las células dendríticas se aíslan de sangre periférica o médula ósea, pero pueden aislarse de cualquier fuente de células dendríticas. Se ha descrito la manipulación ex vivo de células dendríticas con el fin de una inmunoterapia del cáncer en varias referencias en la técnica, incluyendo Engleman, E. G., Cytotechnology 25: 1 (1997); Van Schooten, W., et al., Molecular Medicine Today, Junio, 255 (1997); Steinman, R. M., Experimental Hematology 24: 849 (1996); y Gluckman, J. C., Cytokines, Cellular and Molecular Therapy 3: 187 (1997).

Las células dendríticas también pueden ponerse en contacto con las composiciones de la invención usando métodos in vivo. Para conseguirlo, los CpG se administran en combinación con la VLP opcionalmente acoplada, fusionada o unida de otro modo a un antígeno directamente a un sujeto que necesite inmunoterapia. En algunas realizaciones, se prefiere que las VLP/CpG se administren en la región local del tumor, que puede conseguirse de cualquier modo conocido en la técnica, por ejemplo, inyección directa en el tumor.

La composición de la invención puede comprender además un antígeno o determinante antigénico unido a la partícula similar a virus. La invención proporciona composiciones que varían de acuerdo con el antígeno o determinante antigénico seleccionado en consideración al efecto terapéutico deseado. Se describen antígenos o determinantes antigénicos muy preferidos adecuados para el uso en la presente invención en el documento WO 00/32227, en el documento WO 01/85208 y en el documento WO 02/056905, cuyas descripciones se incorporan con la presente como referencia en su totalidad.

El antígeno puede ser cualquier antígeno de procedencia conocida o todavía desconocida. Puede aislarse de bacterias, virus u otros patógenos o puede ser un antígeno recombinante obtenido a partir de la expresión de un ácido nucleico codificante del mismo adecuado. También puede aislarse de priones, tumores, moléculas propias, moléculas de haptenos no peptídicos, alergenos y hormonas. En una realización preferida, el antígeno es un antígeno recombinante. La selección del antígeno depende por supuesto de la respuesta inmunológica deseada y del hospedador.

En una realización de la composición inmunopotenciadora de la presente invención, la respuesta inmune se induce contra la propia VLP. En otra realización de la invención, una partícula similar a virus se acopla, fusiona o une de otro modo a un antígeno/inmunógeno contra el que se desea una respuesta inmune aumentada.

En una realización preferida adicional de la invención, el al menos un antígeno o determinante antigénico se fusiona con la partícula similar a virus. Como se ha indicado anteriormente, una VLP está típicamente compuesta por al menos una subunidad que se ensambla en una VLP. Por lo tanto, de nuevo en una realización preferida adicional de la invención, el antígeno o determinante antigénico se fusiona con al menos una subunidad de la partícula similar a virus o de una proteína capaz de incorporarse en una VLP que genera una fusión de antígeno-subunidad de VLP quimérica.

La fusión del antígeno o determinante antigénico puede efectuarse por inserción en la secuencia de la subunidad de VLP o por fusión con el extremo N- o C-terminal de la subunidad de VLP o proteína capaz de incorporarse en una VLP. En lo sucesivo, cuando se hace referencia a proteínas de fusión de un péptido con una subunidad de VLP, se incluye la fusión con cualquier extremo de la secuencia de la subunidad o la inserción interna del péptido en el interior de la secuencia de la subunidad.

La fusión también puede efectuarse por inserción de secuencias de antígenos o determinantes antigénicos en una variante de una subunidad de VLP en la que se ha delecionado parte de la secuencia de la subunidad, que se denominan además mutantes de truncamiento. Los mutantes de truncamiento pueden tener deleciones N- o C-terminales o internas de parte de la secuencia de la subunidad de VLP. Por ejemplo, el HBcAg de VLP específico con, por ejemplo, deleción de los restos aminoacídicos 79 a 81 es un mutante de truncamiento con una deleción interna. La fusión de antígenos o determinantes antigénicos con cualquiera de los extremos N- o C-terminales de las subunidades de VLP mutantes de truncamiento también condujo a realizaciones de la invención. Asimismo, la fusión de un epítopo en la secuencia de la subunidad de VLP también puede efectuarse por sustitución, en la que, por ejemplo, para el HBcAg de VLP específico, los aminoácidos 79- 81 se sustituyen con un epítopo extraño. Por lo tanto, la fusión, como se denomina en lo sucesivo, puede efectuarse por inserción de la secuencia de antígeno o determinante antigénico en la secuencia de una subunidad de VLP, por sustitución de parte de la secuencia de la subunidad de VLP con el antígeno o determinantes antigénicos o por una combinación de deleción, sustitución o inserciones.

El antígeno o determinante antigénico-subunidad de VLP quimérico será en general capaz de autoensamblarse en una VLP. Las VLP que presentan epítopos fusionados con sus subunidades también se denominan en este documento VLP quiméricas. Como se indica, la partícula similar a virus comprende o como alternativa está compuesta por al menos una subunidad de VLP. En una realización adicional de la invención, la partícula similar a virus comprende o como alternativa está compuesta por una mezcla de subunidades de VLP quiméricas y subunidades de VLP no quiméricas, es decir, subunidades de VLP que no tienen un antígeno fusionado con las mismas, conduciendo a las denominadas partículas de mosaico. Esto puede ser ventajoso para asegurar la formación de y el ensamblaje en una VLP. En esas realizaciones, la proporción de subunidades de VLP quiméricas puede ser del 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% o superior.

Pueden añadirse restos aminoacídicos flanqueantes a cualquier extremo de la secuencia del péptido o epítopo que se fusionará con cualquier extremo de la secuencia de la subunidad de una VLP, o para la inserción interna de dicha secuencia peptídica en la secuencia de la subunidad de una VLP. Los restos glicina y serina son aminoácidos particularmente preferidos para usarse en las secuencias flanqueantes añadidas al péptido que se va a fusionar. Los restos glicina confieren una flexibilidad adicional que puede disminuir el efecto potencialmente desestabilizante de la fusión de una secuencia extraña en la secuencia de una subunidad de VLP.

En una realización específica de la invención, la VLP es una VLP de antígeno de núcleo de hepatitis B. Se han descrito proteínas de fusión del antígeno o determinante antigénico con el extremo N-terminal de un HBcAg (Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5: 1157-1163 (1999)) o inserciones en la denominada región inmunodominante principal (MIR) (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)), documento WO 01/98333) y son realizaciones preferidas de la invención. También se han descrito variantes de origen natural de HBcAg con deleciones en la MIR (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001), que se incorpora expresamente como referencia en su totalidad) y las fusiones con el extremo N- o C-terminal, así como inserciones en la posición de la MIR correspondiente al sitio de deleción en comparación con un HBcAg de tipo silvestre son realizaciones adicionales de la invención. También se han descrito fusiones con el extremo C-terminal (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). Un especialista en la técnica encontrará fácilmente instrucciones sobre cómo construir proteínas de fusión usando técnicas de biología molecular clásicas (Sambrook, J. et al., eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), Ho et al., Gene 77: 51 (1989)). Se han descrito vectores y plásmidos que codifican HBcAg y proteínas de fusión con HBcAg y útiles para la expresión de un HBcAg y proteínas de fusión con HBcAg (Pumpens, P. y Grens, E. Intervirology 44: 98-114 (2001), Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5: 1157-1163 (1999)) y pueden usarse en la práctica de la invención. Un factor importante para la optimización de la eficacia del autoensamblaje y de la presentación del epítopo que se va a insertar en la MIR de HBcAg es la selección del sitio de inserción, así como del número de aminoácidos que se va a delecionar de la secuencia de HBcAg dentro de la MIR (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); documento EP 0 421.635; Patente de Estados Unidos Nº 6.231.864) tras la inserción o, en otras palabras, qué aminoácidos del HBcAg deben sustituirse con el nuevo epítopo. Por ejemplo, se ha descrito la sustitución de los aminoácidos de HBcAg 76-80, 79-81, 79-80, 75-85 u 80-81 con epítopos extraños (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); documentos EP0421635; 6.231.864). El HBcAg contiene una cola de arginina larga (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)), que es prescindible para el ensamblaje de la cápside y capaz de unir ácidos nucleicos (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). Los HBcAg que comprenden o carecen de esta cola de arginina son ambos realizaciones de la invención.

En una realización preferida adicional de la invención, la VLP es una VLP de un fago de ARN. Las proteínas de cubierta principales de fagos de ARN se ensamblan espontáneamente en VLP tras la expresión en bacterias y, en particular, en E. coli. Los ejemplos específicos de proteínas de cubierta de bacteriófagos que pueden usarse para preparar composiciones de la invención incluyen las proteínas de cubierta de bacteriófagos de ARN tales como bacteriófago Q\beta (SEC ID Nº: 10; Base de Datos PIR, nº de acceso VCBPQ\beta, que hace referencia a CP de Q\beta y SEC ID Nº: 11; nº de acceso AAA16663 que hace referencia a la proteína A1 de Q\beta) y bacteriófago fr (SEC ID Nº: 13; nº acceso PIR VCBPFR).

En una realización más preferida, el al menos un antígeno o determinante antigénico se fusiona con una proteína de cubierta de Q\beta. Se han descrito construcciones de proteínas de fusión en las que se han fusionado epítopos con el extremo C-terminal de una forma truncada de la proteína A1 de Q\beta o en las que se han insertado en el interior de la proteína A1 (Kozlovska, T. M., et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996)). La proteína A1 se genera por supresión del codón de terminación UGA y tiene una longitud de 329 aminoácidos o de 328 aminoácidos si se tiene en cuenta la escisión de la metionina N-terminal. La escisión de la metionina N-terminal antes de una alanina (el segundo aminoácido codificado por el gen de CP de Q\beta) tiene lugar habitualmente en E. coli, y tal es el caso para el extremo N-terminal de las proteínas de cubierta de Q\beta. La parte del gen de A1 3' del codón ámbar UGA codifica la extensión de CP, que tiene una longitud de 195 aminoácidos. La inserción del al menos un antígeno o determinante antigénico entre la posición 72 y 73 de la extensión CP conduce a realizaciones adicionales de la invención (Kozlovska, T. M., et al. Intervirology 39: 9-15 (1996)). La fusión de un antígeno o determinante antigénico en el extremo C-terminal de una proteína A1 de Q\beta truncada C-terminalmente conduce a realizaciones preferidas adicionales de la invención. Por ejemplo, Kozlovska et al., (Intervirology, 39: 9-15 (1996)) describen fusiones de proteína A1 de Q\beta en las que el epítopo se fusiona en el extremo C-terminal de la extensión CP de Q\beta truncada en posición 19.

Como se describe por Kozlovska et al. (Intervirology, 39: 9-15 (1996)), el ensamblaje de las partículas que presentan los epítopos fusionados requiere típicamente la presencia tanto de la fusión de proteína A1-antígeno como de la CP de tipo silvestre para formar una partícula de mosaico. Sin embargo, también se incluyen en el alcance de la presente invención realizaciones que comprenden partículas similares a virus y por la presente en particular las VLP de la proteína de cubierta del fago de ARN Q\beta, que está compuesta exclusivamente por subunidades de VLP que tienen al menos un antígeno o determinante antigénico fusionado con las mismas.

La producción de partículas de mosaico puede efectuarse de varias formas. Kozlovska et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996) describen tres métodos, pudiendo todos usarse en la práctica de la invención. En la primera estrategia, la presentación eficaz del epítopo fusionado en las VLP está mediada por la expresión del plásmido que codifica la proteína fusión de A1 de Q\beta que tiene un codón de terminación UGA entre CP y la extensión de CP en una cepa de E. coli que alberga un plásmido que codifica un ARNt supresor de UGA clonado que conduce a la traducción del codón UGA en Trp (plásmido pISM3001 (Smiley B. K., et al., Gene 134: 33-40 (1993)). En otra estrategia, el codón de terminación del gen de CP se modifica a UAA y se cotransforma un segundo plásmido que expresa la fusión de proteína A1-antígeno. El segundo plásmido codifica una resistencia a antibióticos diferente y el origen de replicación es compatible con el primer plásmido (Kozlovska, T. M., et al. Intervirology 39: 9- 15 (1996)). En una tercera estrategia, la CP y la fusión de proteína A1-antígeno están codificadas de forma bicistrónica, unidas operativamente a un promotor tal como el promotor Trp como se describe en la Figura 1 de Kozlovska et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996).

En una realización adicional, el antígeno o determinante antigénico se inserta entre los aminoácidos 2 y 3 (numeración de la CP escindida, es decir, en la que está escindida la metionina N-terminal) de la CP de fr, conduciendo de este modo a una proteína de fusión de antígeno o determinante antigénico-CP de fr. Se han descrito vectores y sistemas de expresión para la construcción y expresión de proteínas de fusión con CP de fr que se autoensamblen en VLP y útiles en la práctica de la invención (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)). En una realización específica, la secuencia de antígeno o determinante antigénico se inserta en una variante de deleción de la CP de fr después del aminoácido 2, habiéndose delecionado los restos 3 y 4 de la CP de fr (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)).

También se ha descrito la fusión de epítopos en la horquilla \beta protuberante N-terminal de la proteína de cubierta del fago de ARN MS-2 y la posterior presentación del epítopo fusionado en la VLP autoensamblada de fago de ARN MS-2 (documento WO 92/13081) y también se incluye en el alcance de la invención la fusión de un antígeno o determinante antigénico por inserción o sustitución en la proteína de cubierta del fago de ARN MS-2.

En otra realización de la invención, el antígeno o determinante antigénico se fusiona con una proteína de la cápside de papilomavirus. En una realización más específica, el antígeno o determinante antigénico se fusiona con la proteína de la cápside principal L1 del papilomavirus bovino tipo 1 (BPV-1). Se han descrito vectores y sistemas de expresión para la construcción y expresión de proteínas de fusión de BPV-1 en sistemas de baculovirus/células de insecto
(Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 2373-2378 (1999), documento WO 00/23955). La sustitución de los aminoácidos 130-136 de L1 de BPV-1 con un antígeno o determinante antigénico conduce a una proteína de fusión de L1 de BPV-1-antígeno que es una realización preferida de la invención. La clonación en un vector de baculovirus y la expresión en células Sf9 infectadas con baculovirus se ha descrito y puede usarse en la práctica de la invención (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. USA. 96: 2373- 2378 (1999), documento WO 00/23955). La purificación de las partículas ensambladas que presentan el antígeno o determinante antigénico fusionado puede realizarse de varias formas, tales como por ejemplo filtración en gel o ultracentrifugación en gradiente de sacarosa (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 2373-2378 (1999), documento WO 00/23955).

En una realización adicional de la invención, el antígeno o determinante antigénico se fusiona con una proteína Ty capaz de incorporarse en una VLP de Ty. En una realización más específica, el antígeno o determinante antigénico se fusiona con la proteína p1 o de la cápside codificada por el gen TYA (Roth, J. F., Yeast 16: 785-795 (2000)). Se han aislado los retrotransposones de levadura Ty1, 2, 3 y 4 a partir de Saccharomyces cerevisiae, mientras que el retrotransposón Tfl se ha aislado de Schizosaccharomyces pombae (Boeke, J. D. y Sandmeyer, S. B., "Yeast Transposable elements", en The molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, pág. 193, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991)). Los retrotransposones Ty1 y 2 están relacionados con la clase copia de elementos vegetales y animales mientras que Ty3 pertenece a la familia gitana de retrotransposones, que está relacionada con retrovirus vegetales y animales. En el retrotransposón Ty1, la proteína p1, también denominada Gag o proteína de la cápside, tiene una longitud de 440 aminoácidos. P1 se escinde durante la maduración de la VLP en la posición 408, lo que conduce a la proteína p2, el componente esencial de la VLP.

Se han descrito proteínas de fusión con p1 y vectores para la expresión de dichas proteínas de fusión en levaduras (Adams, S. E., et al., Nature 329: 68-70 (1987)). Así, por ejemplo, puede fusionarse un antígeno o determinante antigénico con p1 por inserción de una secuencia codificante del antígeno o determinante antigénico en el sitio BamH1 del plásmido pMA5620 (Adams, S. E., et al., Nature 329: 68-70 (1987)). La clonación de secuencias que codifican epítopos extraños en el vector pMA5620 conduce a la expresión de proteínas de fusión que comprenden los aminoácidos 1-381 de p1 de Tyl-15 fusionados C-terminalmente con el extremo N-terminal del epítopo extraño. Asimismo, la fusión N-terminal de un antígeno o determinante antigénico, o la inserción interna en la secuencia de p1 o la sustitución de parte de la secuencia de p1 también pretenden incluirse en el alcance de la invención. En particular, la inserción de un antígeno o determinante antigénico en la secuencia Ty entre los aminoácidos 30-31, 67-68, 113-114 y 132-133 de la proteína p1 de Ty (documento EP0677111) conduce a realizaciones preferidas de la invención.

Son VLP adicionales adecuadas para la fusión de antígenos o determinantes antigénicos, por ejemplo, partículas similares a retrovirus (documento WO9630523), Gag de VIH2 (Kang, Y. C., et al, Biol. Chem. 380: 353-364 (1999)), virus del mosaico del frijol (Taylor, KM et al., Biol. Chem. 380: 387-392 (1999)), VLP de VP2 de parvovirus (Rueda, P. et al., Virology 263: 89- 99 (1999)), HBsAg (documentos US 4.722.840, EP0020416B1).

Los ejemplos de VLP quiméricas adecuadas para la práctica de la invención también son los descritos en Intervirology 39: 1 (1996). Son ejemplos adicionales de VLP contempladas para el uso en la invención: HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV, COPV, GAG de VIH, virus del mosaico del tabaco. También se han generado partículas similares a virus de SV-40, poliomavirus, adenovirus, virus herpes simple, rotavirus y virus Norwalk y también se incluyen en el alcance de la presente invención VLP quiméricas de las VLP que comprenden un antígeno o determinante antigénico.

Como se indica, también se incluyen en el alcance de la presente invención realizaciones que comprenden antígenos fusionados con la partícula similar a virus por inserción en el interior de la secuencia del monómero básico de la partícula similar a virus. En algunos casos, pueden insertarse antígenos en una forma del monómero básico de la partícula similar a virus que contiene deleciones. En estos casos, el monómero básico de la partícula similar a virus puede no ser capaz de formar estructuras similares a virus en ausencia del antígeno insertado.

En algunos casos, puede utilizarse tecnología de ADN recombinante para fusionar una proteína heteróloga con una proteína de VLP (Kratz, P. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1915 (1999)). Por ejemplo, la presente invención incluye VLP fusionadas de forma recombinante o conjugadas químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) con un antígeno (o porción del mismo, preferiblemente de al menos, 10, 20 ó 50 aminoácidos) de la presente invención para generar proteínas de fusión o conjugados. La fusión no tiene que ser necesariamente directa pero puede suceder a través de secuencias enlazadoras. Más generalmente, en el caso de que se usen epítopos fusionados, conjugados o unidos de otro modo a la partícula similar a virus como antígenos de acuerdo con la invención, típicamente se añaden secuencias espaciadoras o enlazadoras en uno o ambos extremos de los epítopos. Dichas secuencias enlazadoras comprenden preferiblemente secuencias reconocidas por el proteosoma, proteasas de los endosomas u otro compartimento vesicular de la célula.

Un modo de acoplamiento es mediante un enlace peptídico, en el que el conjugado puede ser un polipéptido contiguo, es decir, una proteína de fusión. En una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención, se unen diferentes péptidos o polipéptidos en fase de lectura entre sí para formar un polipéptido contiguo. Por lo tanto, una primera porción de la proteína de fusión comprende un antígeno o inmunógeno y una segunda porción de la proteína de fusión, N-terminal o C-terminal a la primera porción, comprende una VLP. Como alternativa, también puede usarse una inserción interna en la VLP con secuencias de enlace opcionales en ambos extremos del antígeno de acuerdo con la presente invención.

Cuando se usa un HBcAg como la VLP se prefiere que el antígeno se una al extremo C-terminal de la partícula de HBcAg. El antígeno de núcleo de la hepatitis B (HBcAg) que presenta una fusión C-terminal del péptido restringido por MHC clase I p33 procedente de la glicoproteína del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) se usó como antígeno modelo (HBcAg-p33). La proteína de HBc de tipo silvestre de 185 aminoácidos de longitud se ensambla en partículas altamente estructuradas compuestas por 180 subunidades que asumen una geometría icosaédrica. La flexibilidad del HBcAg y otras VLP para aceptar inserciones relativamente grandes de secuencias extrañas en diferentes posiciones al tiempo que conservan la capacidad de formar cápsides estructuradas está bien documentada en la bibliografía. Esto hace a las VLP de HBc candidatos atractivos para el diseño de vacunas no replicantes.

Puede insertarse una secuencia enlazadora flexible (por ejemplo, una secuencia que contiene poliglicina/poliserina tal como [Gly_{4} Ser]_{2} (Huston et al., Meth. Enzymol 203: 46-88 (1991)) en la proteína de fusión entre el antígeno y el ligando. Además, la proteína de fusión puede construirse para que contenga un "marcador epitópico" que permita que la proteína de fusión se una a un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal), por ejemplo, con fines de marcaje o purificación. Un ejemplo de un marcador epitópico es un tripéptido Glu-Glu-Phe que se reconoce por el anticuerpo monoclonal YL1/2.

La invención también se refiere al ADN quimérico que contiene una secuencia que codifica la VLP y una secuencia que codifica el antígeno/inmunógeno. El ADN puede expresarse, por ejemplo, en células de insecto transformadas con baculovirus, en levaduras o en bacterias. No existen restricciones en lo que respecta al sistema de expresión, estando disponible una amplia selección para uso rutinario. Preferiblemente, se usa un sistema que permite la expresión de las proteínas en grandes cantidades. En general, se prefieren sistemas de expresión bacterianos debido a su eficacia. Un ejemplo de un sistema de expresión bacteriano adecuado para el uso dentro del alcance de la presente invención es el descrito por Clarke et al., J. Gen. Virol. 71: 1109-1117 (1990); Borisova, et al., J. Virol. 67: 3696-3701 (1993), y Studier et al., Methods Enzymol. 185: 60-89 (1990). Un ejemplo de un sistema de expresión en levaduras adecuado es el descrito por Emr, Methods Enzymol. 185: 231-3 (1990); también son adecuados sistemas de baculovirus que se han usado anteriormente para preparar proteínas de la cápside. Pueden usarse sistemas de expresión constitutiva o inducible. Mediante la selección y posible modificación de los sistemas de expresión disponibles es posible controlar la forma en que se obtienen las proteínas.

En una realización específica de la invención, el antígeno contra el que se desea una respuesta inmune aumentada se acopla, fusiona o une de otro modo en fase de lectura con la proteína de la cápside (de núcleo) del virus de la Hepatitis B (HBcAg). Sin embargo, será evidente para todos los especialistas en la técnica que pueden utilizarse otras partículas similares a virus en la construcción de la proteína de fusión de la invención.

En una realización preferida adicional de la presente invención, el al menos un antígeno o determinante antigénico se une a la partícula similar a virus mediante al menos un enlace covalente. Preferiblemente, el al menos un antígeno o determinante antigénico se une a la partícula similar a virus mediante al menos un enlace covalente, siendo dicho enlace covalente un enlace no peptídico que conduce a una matriz de antígenos o determinantes antigénicos y a un conjugado de antígeno o determinante antigénico-VLP, respectivamente. Esta matriz de antígenos o determinantes antigénicos y conjugado, respectivamente, tienen típicamente y preferiblemente una estructura repetitiva y ordenada puesto que el al menos un antigénico o determinante antigénico se une a la VLP de una forma orientada. La formación de una matriz de antígenos o determinantes antigénicos repetitiva y ordenada y de un conjugado con VLP, respectivamente, se asegura mediante una unión y adhesión orientada y dirigida así como definida, respectivamente, del al menos un antígeno o determinante antigénico con la VLP, como será evidente en lo siguiente. Además, la estructura altamente repetitiva y organizada intrínseca típica de las VLP contribuye ventajosamente a la presentación del antígeno o determinante antigénico de una forma altamente ordenada y repetitiva que conduce a una matriz de antígenos o determinantes antigénicos repetitiva y ordenada y de un conjugado con VLP, respectivamente.

Por lo tanto, los conjugados y matrices de la invención preferidos, respectivamente, difieren de los conjugados de la técnica anterior en su estructura altamente organizada, sus dimensiones y en la repetitividad del antígeno en la superficie de la matriz. La realización preferida de esta invención, además, permite la expresión de la partícula en un hospedador de expresión que garantice un plegamiento y ensamblaje apropiado de la VLP, con la que después se acopla adicionalmente el antígeno.

La presente invención describe métodos de unión de antígenos o determinantes antigénicos a VLP. Como se indica en un aspecto de la invención, el al menos un antígeno o determinante antigénico se une a la VLP por medio de entrecruzamiento químico, típicamente y preferiblemente por uso de un entrecruzante heterobifuncional. Se conocen en la técnica varios entrecruzantes heterobifuncionales. En realizaciones preferidas, el entrecruzante heterobifuncional contiene un grupo funcional que puede reaccionar con primeros sitios de unión preferidos, es decir, con el grupo amino de cadena lateral de restos lisina de la VLP o al menos una subunidad de VLP y un grupo funcional adicional que puede reaccionar con un segundo sitio de unión preferido, es decir, un resto cisteína fusionado con el antígeno o determinante antigénico y opcionalmente hecho disponible también para la reacción mediante reducción. La primera etapa del procedimiento, típicamente denominado derivatización, es la reacción de la VLP con el entrecruzante. El producto de esta reacción es una VLP activada, también denominada vehículo activado. En la segunda etapa, se elimina el entrecruzante sin reaccionar usando métodos habituales tales como filtración en gel o diálisis. En la tercera etapa, el antígeno o determinante antigénico se hace reaccionar con la VLP activada y esta etapa se denomina típicamente la etapa de acoplamiento. El antígeno o determinante antigénico sin reaccionar pueden eliminarse opcionalmente en una cuarta etapa, por ejemplo, mediante diálisis. Se conocen en la técnica varios entrecruzantes heterobifuncionales. Estos incluyen los entrecruzantes preferidos SMPH (Pierce), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, sulfo-SMCC, SVSB, SIA y otros entrecruzantes disponibles, por ejemplo, en la Pierce Chemical Company (Rockford, IL, Estados Unidos) y que tienen un grupo funcional reactivo hacia grupos amino y un grupo funcional reactivo hacia restos cisteína. Los entrecruzantes mencionados anteriormente conducen todos a la formación de un enlace tioéter. Otra clase de entrecruzantes adecuados en la práctica de la invención se caracteriza por la introducción de un enlace disulfuro entre el antígeno o determinante antigénico y la VLP tras el acoplamiento. Los entrecruzantes preferidos que pertenecen a esta clase incluyen, por ejemplo, SPDP y Sulfo-LC-SPDP (Pierce). Puede influirse en el grado de derivatización de la VLP con entrecruzante variando condiciones experimentales tales como la concentración de cada uno de los compañeros de reacción, el exceso de un reactivo sobre el otro, el pH, la temperatura y la fuerza iónica. El grado de acoplamiento, es decir, la cantidad de antígenos o determinantes antigénicos por subunidades de la VLP puede ajustarse variando las condiciones experimentales descritas anteriormente para que se ajuste a las necesidades de la vacuna.

Un método particularmente preferido de unión de antígenos o determinantes antigénicos a la VLP es la formación de un enlace entre un resto lisina en la superficie de la VLP con un resto cisteína en el antígeno o determinante antigénico. En algunas realizaciones, puede ser necesaria la fusión de un enlazador aminoacídico que contiene un resto cisteína como un segundo sitio de unión, o como parte del mismo, con el antígeno o determinante antigénico para el acoplamiento con la VLP.

En general, se prefieren enlazadores aminoacídicos flexibles. Los ejemplos del enlazador aminoacídico se seleccionan del grupo que consiste en (a) CGG; (b) enlazador gamma 1 N-terminal, (c) enlazador gamma 3 N-terminal, (d) regiones de bisagra de Ig; (e) enlazadores de glicina N-terminal; (f) (G)_{k}C(G)_{n} con n = 0-12 y k = 0-5; (g) enlazadores de glicina-serina N-terminales; (h) (G)_{k}C(G)_{m}(S)_{l}(GGCPS)_{n} con n = 0-3, k = 0-5, m = 0-10, l = 0-2; (i) GGC; (k) GGC-NH2; (1) enlazador gamma 1 C-terminal; (m) enlazador gamma 3 C-terminal; (n) enlazadores de glicina C-terminales; (o) (G)_{n}C(G)_{k}, con n = 0-12 y k = 0-5; (p) enlazadores de glicina-serina C-terminales; (q) (G)_{m}(S)_{l}(GGGGS)_{n}(G)_{o}C(G)_{k}, con n = 0-3, k = 0-5, m = 0-10, l = 0-2, y o = 0-8.

Son ejemplos adicionales de enlazadores aminoacídicos la región de bisagra de inmunoglobulinas, enlazadores de glicina-serina (GGGGS)_{n} y enlazadores de glicina (G)_{n}, conteniendo todos además un resto cisteína como segundo sitio de unión y opcionalmente restos glicina adicionales. Los ejemplos típicamente preferidos de dichos enlazadores aminoacídicos son gamma 1 N-terminal: CGDKTHTSPP; gamma 1 C-terminal: DKTHTSPPCG; gamma 3 N-terminal: CGGPKPSTPPGSSGGAP; gamma 3 C-terminal: PKPSTPPGSSGGAPGGCG; enlazador de glicina N-terminal: GCGGGG y enlazador de glicina C-terminal: GGGGCG.

Otros enlazadores aminoacídicos particularmente adecuados en la práctica de la invención cuando se une antígeno o determinante antigénico hidrófobo a una VLP son CGKKGG o CGDEGG para enlazadores N-terminales o GGKKGC y GGEDGC, para los enlazadores C-terminales. Para los enlazadores C-terminales, la cisteína terminal está opcionalmente amidada C-terminalmente.

En realizaciones preferidas de la presente invención, se prefieren enlazadores GGCG, GGC o GGC-NH2 ("NH2" representa amidación) en el extremo C-terminal del péptido o CGG en su extremo N-terminal como enlazadores aminoacídicos. En general, se insertarán restos glicina entre aminoácidos voluminosos y la cisteína que se usará como segundo sitio de unión para evitar el impedimento estérico potencial del aminoácido más voluminoso en la reacción de acoplamiento. En la realización más preferida de la invención, el enlazador aminoacídico GGC-NH2 se fusiona con el extremo C-terminal del antígeno o determinante antigénico.

El resto cisteína presente en el antígeno o determinante antigénico tiene que estar en su estado reducido para reaccionar con el entrecruzante heterobifuncional en la VLP activada, es decir, tiene que estar disponible una cisteína libre o un resto cisteína con un grupo sulfhidrilo libre. En el caso en el que el resto cisteína que funcionará como sitio de unión esté en una forma oxidada, por ejemplo, esté formando un puente disulfuro, es necesaria la reducción de este puente disulfuro con, por ejemplo, DTT, TCEP o \beta-mercaptoetanol. Son compatibles bajas concentraciones de agente reductor con el acoplamiento como se describe en el documento WO 02/05690, concentraciones mayores inhiben la reacción de acoplamiento, como sabrá un especialista en la técnica, en cuyo caso tiene que eliminarse el agente reductor o disminuirse su concentración antes del acoplamiento, por ejemplo, mediante diálisis, filtración en gel o HPLC de fase inversa.

La unión del antígeno o determinante antigénico a la VLP mediante el uso de un entrecruzante heterobifuncional de acuerdo con los métodos preferidos descritos anteriormente permite el acoplamiento del antígeno o determinante antigénico con la VLP de una forma orientada. Otros métodos de unión del antígeno o determinante antigénico con la VLP incluyen métodos en los que el antígeno o determinante antigénico se entrecruza con la VLP usando la carbodiimida EDC y NHS. En métodos adicionales, el antígeno o determinante antigénico se une a la VLP usando un entrecruzante homobifuncional tal como glutaraldehído, DSG, BM[OPE]_{4}, BS^{3}, (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, Estados Unidos) u otros entrecruzantes homobifuncionales conocidos con grupos funcionales reactivos hacia grupos amina o grupos carboxilo de la VLP.

Otros métodos de unión de la VLP a un antígeno o determinante antigénico incluyen métodos en los la VLP está biotinilada y el antígeno o determinante antigénico expresado como una proteína de fusión con estreptavidina, o métodos en los que tanto el antígeno o determinante antigénico como la VLP están biotinilados, por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/23955. En este caso, el antígeno o determinante antigénico pueden unirse primero a estreptavidina o avidina por ajuste de la proporción de antígeno o determinante antigénico respecto a estreptavidina de modo que los sitios de unión libres estén todavía disponibles para la unión de la VLP, que se añade en la siguiente etapa. Como alternativa, todos los componentes pueden mezclarse en una reacción de "un recipiente". Pueden usarse otros pares de ligando-receptor en los que esté disponible una forma soluble del receptor y del ligando y que sean capaces de entrecruzarse con la VLP o con el antígeno o determinante antigénico como agentes de unión para unir un antígeno o determinante antigénico a la VLP. Como alternativa, el ligando o el receptor pueden fusionarse con el antígeno o determinante antigénico y, de este modo, mediar la unión a la VLP unida químicamente o fusionada al receptor o al ligando respectivamente. La fusión también puede efectuarse por inserción o sustitución.

Como ya se ha indicado, en una realización preferida de la presente invención, la VLP es la VLP de un fago de ARN, y en una realización más preferida, la VLP es la VLP de la proteína de cubierta del fago de ARN Q\beta.

Pueden unirse una o varias moléculas de antígeno, es decir, uno o varios antígenos o determinantes antigénicos a una subunidad de la cápside o VLP de proteínas de cubierta de fagos de ARN, preferiblemente a través de los restos lisina expuestos de la VLP de fagos de ARN, si puede permitirse estéricamente. Una característica específica de la VLP de la proteína de cubierta de fagos de ARN y en particular de la VLP de la proteína de cubierta de Q\beta es por tanto la posibilidad de acoplar varios antígenos por subunidad. Esto permite la generación de una matriz de antígenos densa.

En una realización preferida de la invención, la unión y adhesión, respectivamente, del al menos un antígeno o determinante antigénico con la partícula similar a virus es por medio de interacción y asociación, respectivamente, entre al menos un primer sitio de unión de la partícula similar a virus y al menos una segunda unión del antígeno o determinante antigénico.

Las VLP o cápsides de proteína de cubierta de Q\beta presentan un número definido de restos lisina en su superficie, con una topología definida con tres restos de lisina señalando dirigidos hacia el interior de la cápside y que interaccionan con el ARN y otros cuatro restos lisina expuestos hacia el exterior de la cápside. Estas propiedades definidas favorecen la unión de antígenos en el exterior de la partícula más que en el interior de la partícula, donde los restos lisina interaccionan con el ARN. Las VLP de otras proteínas de cubierta de fagos de ARN también tienen un número definido de restos lisina en su superficie y una topología definida de estos restos lisina.

En realizaciones preferidas adicionales de la presente invención, el primer sitio de unión es un resto lisina y/o la segunda unión comprende un grupo sulfhidrilo o un resto cisteína. En una realización muy preferida de la presente invención, el primer sitio de unión es un resto lisina y la segunda unión es un resto cisteína.

En realizaciones muy preferidas de la invención, el antígeno o determinante antigénico se une mediante un resto cisteína a restos lisina de la VLP de la proteína de cubierta de fagos de ARN y en particular a la VLP de la proteína de cubierta de Q\beta.

Otra ventaja de las VLP procedentes de fagos ARN su alto rendimiento de expresión en bacterias que permite la producción en grandes cantidades de material a un coste razonable.

Como se indica, los conjugados y matrices de la invención, respectivamente, difieren de los conjugados de la técnica anterior en su estructura altamente organizada, sus dimensiones y en la repetitividad del antígeno en la superficie de la matriz. Además, el uso de las VLP como vehículos permite la formación de matrices de antígenos robustas y conjugados, respectivamente, con una densidad de antígenos variable. En particular, el uso de VLP de fagos de ARN y por la presente en particular el uso de la VLP de la proteína de cubierta del fago de ARN Q\beta permite conseguir una densidad de epítopos muy elevada. En particular, podría alcanzarse una densidad de más de 1,5 epítopos por subunidad por acoplamiento del péptido A\beta1-6 humano con la VLP de la proteína de cubierta de Q\beta. La preparación de composiciones de VLP de proteínas de cubierta de fagos de ARN con una alta densidad de epítopos puede efectuarse usando los contenidos de esta solicitud. En una realización preferida de la invención, cuando un antígeno o determinante antigénico se acopla con la VLP de la proteína de cubierta de Q\beta, se prefiere un número promedio de antígenos o determinantes antigénicos por subunidad de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 o superior.

El segundo sitio de unión, como se define en este documento, puede estar presente de forma natural o no natural con el antígeno o el determinante antigénico. En el caso de la ausencia de un segundo sitio de unión de origen natural adecuado en el antígeno o determinante antigénico, como tal, entonces la segunda unión no natural tiene que generarse por ingeniería genética en el antígeno.

Como se ha descrito anteriormente, se exponen cuatro restos lisina en la superficie de la VLP de la proteína de cubierta de Q\beta. Típicamente, estos restos se derivatizan tras la reacción con una molécula entrecruzante. En el caso en el que no todos los restos lisina expuestos puedan acoplarse con un antígeno, los restos lisina que han reaccionado con el entrecruzante se quedan con una molécula entrecruzante unida al grupo \varepsilon-amino después de la etapa de derivatización. Esto conduce a la desaparición de una o varias cargas positivas que puede ser perjudicial para la solubilidad y estabilidad de la VLP. Por sustitución de algunos de los restos lisina con argininas, como en los mutantes de proteína de cubierta de Q\beta descritos que se describen a continuación, se evita la desaparición excesiva de cargas positivas puesto que los restos arginina no reaccionan con el entrecruzante. Además, la sustitución de restos lisina por argininas puede conducir a matrices de antígenos más definidas ya que están disponibles un menor número de sitios para la reacción con el antígeno.

Por consiguiente, los restos de lisina expuestos se sustituyen por argininas en los siguientes mutantes de proteína de cubierta de Q\beta y las VLP de Q\beta mutantes descritas en esta solicitud: Q\beta-240 (Lys13-Arg; SEC ID Nº: 23), Q\beta-250 (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; SEC ID Nº: 25) y Q\beta-259 (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; SEC ID Nº: 27). Las construcciones se clonaron, las proteínas se expresaron, las VLP se purificaron y se usaron para acoplarse con antígenos peptídicos y proteicos. También se construyó Q\beta-251 (SEC ID Nº: 26) y pueden encontrarse instrucciones sobre cómo expresar, purificar y acoplar la VLP de la proteína de cubierta de Q\beta-251 por toda la solicitud.

En una realización adicional, se describe una proteína de cubierta mutante de Q\beta con un resto lisina adicional, adecuado para obtener matrices de antígenos de incluso mayor densidad. Esta proteína de cubierta de Q\beta mutante, Q\beta-243 (Asn 10-Lys, SEC ID Nº: 24) se clonó, la proteína se expresó y la cápside o VLP se aisló y purificó, demostrando que la introducción del resto lisina adicional es compatible con el autoensamblaje de las subunidades en una cápside o VLP. Por lo tanto, pueden prepararse matrices de antígenos o determinantes antigénicos y conjugados, respectivamente, usando VLP de mutantes de la proteína de cubierta de Q\beta. Un método particularmente preferido de unión de antígenos a VLP y en particular a VLP de proteínas de cubierta de fagos de ARN es la unión de un resto lisina presente en la superficie de la VLP de proteínas de cubierta de fagos de ARN con un resto cisteína añadido al antígeno. Para que un resto cisteína sea eficaz como segundo sitio de unión, debe estar disponible un grupo sulfhidrilo para el acoplamiento. Por lo tanto, un resto cisteína debe estar en su estado reducido, es decir, tiene que estar disponible una cisteína libre o un resto cisteína con un grupo sulfhidrilo libre. En el caso en el que el resto cisteína que va a funcionar como segundo sitio de unión esté en una forma oxidada, por ejemplo, si está formando un puente disulfuro, es necesaria la reducción de este puente disulfuro con, por ejemplo, DTT, TCEP o \beta-mercaptoetanol. La concentración de agente reductor y el exceso molar de agente reductor sobre el antígeno tiene que ajustarse para cada antígeno. Si es necesario se ensaya un intervalo de valoración, partiendo de concentraciones tan bajas como de 10 \muM o inferiores hasta de 10 a 20 mM o superiores de agente reductor y se evalúa el acoplamiento del antígeno al vehículo. Aunque bajas concentraciones de agente reductor son compatibles con la reacción de acoplamiento que se describe en el documento WO 02/056905, concentraciones mayores inhiben la reacción de acoplamiento, como sabrá un especialista, en cuyo caso el agente reductor tiene que eliminarse o disminuirse su concentración, por ejemplo, mediante diálisis, filtración en gel o HPLC de fase de inversa. Ventajosamente, el pH del tampón de diálisis o equilibrado es inferior a 7, preferiblemente de 6. La compatibilidad del tampón de pH reducido con la actividad o estabilidad antigénica debe ensayarse.

La densidad de epítopos en la VLP de proteínas de cubierta de fagos de ARN puede modularse mediante la selección de entrecruzante y otras condiciones de reacción. Por ejemplo, los entrecruzantes Sulfo-GMBS y SMPH permiten típicamente alcanzar una alta densidad de epítopos. La derivatización está influenciada positivamente por una alta concentración de agentes reactivos y la manipulación de las condiciones de reacción puede usarse para controlar el número de antígenos acoplados con VLP de proteínas de cubierta de fagos de ARN y en particular con VLP de la proteína de cubierta de Q\beta.

Antes del diseño de un segundo sitio de unión no natural tiene que seleccionarse la posición en la que debería fusionarse, insertarse o en general generarse por ingeniería genética. La selección de la posición del segundo sitio de unión puede basarse, a modo de ejemplo, en una estructura cristalina del antígeno. Dicha estructura cristalina del antígeno puede proporcionar información sobre la disponibilidad de los extremos C- o N-terminales de la molécula (determinada, por ejemplo, a partir de su accesibilidad a disolvente) o sobre la exposición a disolvente de restos adecuados para usar como segundos sitios de unión, tales como restos cisteína. Los puentes disulfuro expuestos, como en el caso de fragmentos Fab también pueden ser una fuente de un segundo sitio de unión, ya que generalmente pueden convertirse en restos cisteína sencillos por reducción suave con, por ejemplo, 2-mercaptoetilamina, TCEP, \beta-mercaptoetanol o DTT. Se seleccionarán condiciones de reducción suaves que no afecten a la inmunogenicidad del antígeno. En general, en el caso en el que la inmunización con un autoantígeno tiene como objetivo inhibir la interacción de este autoantígeno con sus ligandos naturales, el segundo sitio de unión se añadirá de modo que permita la generación de anticuerpos contra el sitio de interacción con los ligandos naturales. Por lo tanto, la localización del segundo sitio de unión se seleccionará de modo que se evite el impedimento estérico del segundo sitio de unión o de cualquier enlazador aminoacídico que lo contenga. En realizaciones adicionales, se desea una respuesta de anticuerpos dirigida a un sitio diferente del sitio de interacción del autoantígeno con su ligando natural. En dichas realizaciones, el segundo sitio de unión puede seleccionarse de modo que evite la generación de anticuerpos contra el sitio de interacción del autoantígeno con sus ligandos naturales.

Otros criterios para seleccionar la posición del segundo sitio de unión incluyen el estado de oligomerización del antígeno, el sitio de oligomerización, la presencia de un cofactor y la disponibilidad de pruebas experimentales que describan sitios en la estructura o secuencia antigénica en los que la modificación del antígeno sea compatible con la función del autoantígeno o con la generación de anticuerpos que reconozcan el autoantígeno.

En realizaciones muy preferidas, el antígeno o determinante antigénico comprende un solo segundo sitio de unión o un solo sitio de unión reactivo capaz de la asociación con los primeros sitios de unión en la partícula de núcleo y las VLP o subunidades de VLP, respectivamente. Esto asegura además una unión y asociación definida y uniforme, respectivamente, del al menos un, pero típicamente más de un, preferiblemente más de 10, 20, 40, 80, 120 antígenos con la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente. El suministro de un solo segundo sitio de unión o un solo sitio de unión reactivo en el antígeno, por lo tanto, asegura un tipo único y uniforme de unión y asociación, respectivamente, conduciendo a una matriz muy altamente ordenada y repetitiva. Por ejemplo, si la unión y asociación, respectivamente, se efectúan por medio de una interacción con lisina (como el primer sitio de unión) y cisteína (como un segundo sitio de unión), se asegura de acuerdo con esta realización preferida de la invención que sólo un resto cisteína por antígeno, independientemente de si este resto cisteína está presente de forma natural o no natural en el antígeno, es capaz de unirse y asociarse respectivamente con la VLP y el primer sitio de unión de la partícula de núcleo,
respectivamente.

En algunas realizaciones, la generación por ingeniería genética de un segundo sitio de unión sobre el antígeno requiere la fusión de un enlazador aminoacídico que contiene un aminoácido adecuado como segundo sitio de unión de acuerdo con las descripciones de esta invención. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención, un enlazador aminoacídico se une al antígeno o al determinante antigénico por medio de al menos un enlace covalente. Preferiblemente, el enlazador aminoacídico comprende o como alternativa consiste en el segundo sitio de unión. En una realización preferida adicional, el enlazador aminoacídico comprende un grupo sulfhidrilo o un resto cisteína. En otra realización preferida, el enlazador aminoacídico es cisteína. Algunos criterios de selección del enlazador aminoacídico así como realizaciones preferidas adicionales del enlazador aminoacídico de acuerdo con la invención se han mencionado ya anteriormente.

En otra realización específica de la invención, el sitio de unión se selecciona para que sea un resto lisina o cisteína que esté fusionando en fase de lectura con el HBcAg. En una realización preferida, el antígeno se fusiona con el extremo C-terminal de HBcAg a través de un enlazador de tres leucinas.

Cuando un antígeno o determinante antigénico se une con la VLP a través de un resto de lisina, puede ser ventajoso sustituir o delecionar uno o más de los restos lisina presentes de forma natural, así como otros restos lisina presentes en variantes de HBcAg.

En muchos casos, cuando se eliminan los restos lisina presentes de forma natural, se introducirá otra lisina en el HBcAg como sitio de unión para un antígeno o determinante antigénico. Se conocen en la técnica métodos para insertar dicho resto lisina. También pueden añadirse restos lisina sin eliminar los restos lisina existentes.

Se ha demostrado que el extremo C-terminal del HBcAg dirige la localización nuclear de esta proteína. (Eckhardt et al., J. Virol. 65: 575-582 (1991)). Además, también se piensa que esta región de la proteína confiere en el HBcAg la capacidad para unir ácidos nucleicos.

Como se indican, los HBcAg adecuados para el uso en la práctica de la presente invención también incluyen mutantes de truncamiento N-terminal. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen HbcAg modificados en los que se han eliminado 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 ó 17 aminoácidos del extremo N-terminal. Sin embargo, también son adecuados de acuerdo con la presente invención variantes de partículas similares a virus que contienen deleciones internas dentro de la secuencia de la subunidad que compone la partícula similar a virus dada su compatibilidad con la estructura ordenada o particulada de la partícula similar a virus. Por ejemplo, son adecuadas deleciones internas dentro de la secuencia del HBcAg (Preikschat, P., et al., J Gen. Virol. 80: 1777- 1788
(1999)).

Los HBcAg adicionales adecuados para usar en la práctica de la presente invención incluyen mutantes de truncamiento N- y C-terminal. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen HBcAg en los que se han eliminado 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 y 17 aminoácidos del extremo N-terminal y en los que se han eliminado 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35, 36, 37, 38, 39 40, 41, 42 ó 48 aminoácidos del extremo C-terminal.

Las composiciones vacunales de la invención pueden comprender mezclas de HBcAg diferentes. Por lo tanto, estas composiciones vacunales pueden estar compuestas por HBcAg que difieren en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, podrían prepararse composiciones vacunales que comprendan un HBcAg de "tipo silvestre" y un HBcAg modificado en el que se han alterado uno o más restos aminoacídicos (por ejemplo, delecionado, insertado o sustituido). En la mayoría de aplicaciones, sin embargo, se usará sólo un tipo de HBcAg.

La presente invención es aplicable a una amplia diversidad de antígenos. En una realización preferida, el antígeno es una proteína, polipéptido o péptido. En otra realización, el antígeno es ADN. El antígeno también puede ser un lípido, carbohidrato o una molécula orgánica, en particular, una molécula orgánica pequeña tal como nicotina.

Pueden seleccionarse antígenos de la invención del grupo que consiste en los siguientes: (a) polipéptidos apropiados para inducir una respuesta inmune contra células cancerosas; (b) polipéptidos apropiados para inducir una respuesta inmune contra enfermedades infecciosas; (c) polipéptidos apropiados para inducir una respuesta inmune contra alergenos; (d) polipéptidos apropiados para inducir una respuesta inmune en animales de granja o mascotas; y (e) fragmentos (por ejemplo, un dominio) de cualquiera de los polipéptidos expuestos en (a)-(d).

Los antígenos preferidos incluyen los de un patógeno (por ejemplo, virus, bacteria, parásito, hongo) y tumores (especialmente antígenos asociados a tumores o "marcadores tumorales"). Otros antígenos preferidos son autoantígenos.

En las realizaciones específicas descritas en los Ejemplos, el antígeno es el péptido p33 obtenido del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV). El péptido p33 representa uno de los epítopos de CTL mejor estudiados (Pircher et al., "Tolerance induction in double specific T-cell receptor transgenic mice varies with antigen", Nature 342: 559 (1989); Tissot et al., "Characterizing the functionality of recombinant T-cell receptors in vitro: a pMHC tetramer based approach", J Immunol Methods 236: 147 (2000); Bachmann et al., "Four types of Ca2+-signals after stimulation of naive T cells with T cell agonists, partial agonists and antagonists, "Eur. J. Immunol. 27: 3414 (1997); Bachmann et al., "Functional maturation of an anti-viral cytotoxic T cell response", J. Virol. 71: 5764 (1997); Bachmann et al., "Peptide induced TCR-down regulation on naive T cell predicts agonist/partial agonist properties and strictly correlates with T cell activation", Eur. J. Immunol. 27: 2195 (1997); Bachmann et al., "Distinct roles for LFA-1 and CD28 during activation of naive T cells: adhesion versus costimulation", Immnunity 7: 549 (1997)). Se ha demostrado que las células T específicas de p33 inducen una enfermedad diabética letal en ratones transgénicos (Ohashi et al., "Ablation of ``tolerance'' and induction of diabetes by virus infection in viral antigen transgenic mice", Cell 65: 305 (1991)) así como que son capaces de impedir el crecimiento de células tumorales que expresen p33 (Kündig et al., "Fibroblasts act as efficient antigen-presenting cells in lymphoid organs", Science 268: 1343 (1995); Speiser et al., "CTL tumor therapy specific for an endogenous antigen does not cause autoimmune disease", J. Exp. Med. 186: 645 (1997)). Este epítopo específico, por lo tanto, es particularmente muy apropiado para el estudio de la autoinmunidad, la inmunología tumoral así como de las enfermedades víricas.

En una realización específica de la invención, el antígeno o determinante antigénico es uno que es útil para la prevención de una enfermedad infecciosa. Dicho tratamiento será útil para tratar una amplia diversidad de enfermedades infecciosas que afectan a una amplia variedad de hospedadores, por ejemplo, seres humanos, vacas, ovejas, cerdos, perros, gatos, otras especies de mamíferos y especies de no mamíferos también. Los especialistas en la técnica conocen bien enfermedades infecciosas tratables y los ejemplos incluyen infecciones de etiología vírica tales como VIH, influenza, Herpes, hepatitis vírica, Epstein Bar, poliovirus, encefalitis vírica, sarampión, viruela aviar, papilomavirus, etc.; o infecciones de etiología bacteriana tales como neumonía, tuberculosis, sífilis, etc.; o infecciones de etiología parasitaria tales como malaria, tripanosomiasis, leismaniasis, tricomoniasis, amebiasis, etc. Por lo tanto, los especialistas en la técnica conocerán bien antígenos o determinantes antigénicos seleccionados para las composiciones de la invención; los ejemplos de antígenos o determinantes antigénicos incluyen los siguientes: los antígenos del VIH gp140 y gp160; los antígenos de influenza hemaglutinina, proteína M2 y neuraminidasa, antígeno de superficie o núcleo de hepatitis B o proteína del circumsporozoíto de malaria o fragmentos de los mismos.

Como se ha analizado anteriormente, los antígenos incluyen microbios infecciosos tales como virus, bacterias y hongos y fragmentos de los mismos, obtenidos de fuentes naturales o de forma sintética. Los virus infecciosos tanto de seres humanos como de vertebrados no humanos incluyen retrovirus, virus de ARN y virus de ADN. El grupo de retrovirus incluye tanto retrovirus simples como retrovirus complejos. Los retrovirus simples incluyen los subgrupos de retrovirus tipo B, retrovirus tipo C y retrovirus tipo D. Un ejemplo de un retrovirus tipo B es el virus del tumor mamario de ratón (MMTV). Los retrovirus tipo C incluyen los subgrupos de tipo C grupo A (incluyendo virus del sarcoma de Rous (RSV), virus de la leucemia aviar (ALV) y virus de la mieloblastosis aviar (AMV)) y de tipo C grupo B (incluyendo el virus de la leucemia murina (MLV), virus de la leucemia felina (FeLV), virus del sarcoma murino (MSV), virus de la leucemia del mono gibón (GALV), virus de la necrosis esplénica (SNV), virus de la reticuloendoteliosis (RV) y virus del sarcoma de los simios (SSV)). Los retrovirus tipo D incluyen virus del mono Mason-Pfizer (MPMV) y retrovirus de los simios tipo 1 (SRV-1). Los retrovirus complejos incluyen los subgrupos de lentivirus, virus de leucemia de células T y los virus espumosos. Los lentivirus incluyen VIH-1, pero también incluyen VIH-2, SIV, virus Visna, virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y virus de la anemia infecciosa equina (EIAV). Los virus de leucemia de células T incluyen HTLV-1, HTLV-II, virus de la leucemia de células T de los simios (STLV) y virus de la leucemia bovina (BLV). Los virus espumosos incluyen el virus espumoso humano (HFV), el virus espumoso de los simios (SFV) y el virus espumoso bovino (BFV).

Los ejemplos de virus de ARN que son antígenos en animales vertebrados incluyen, pero sin limitación, los siguientes: miembros de la familia Reoviridae, incluyendo el género Orthoreovirus (múltiples serotipos de retrovirus tanto de mamíferos como de aves), el género Orbivirus (virus de la lengua azul, virus Eugenangee, virus Kemerovo, virus de la enfermedad del caballo africano y virus de la fiebre por garrapatas de Colorado), el género Rotavirus (rotavirus humano, virus de la diarrea del ternero de Nebraska, rotavirus murino, rotavirus de los simios, rotavirus bovino u ovino, rotavirus aviar); la familia Picomaviridae, incluyendo el género Enterovirus (poliovirus, virus Coxsackie A y B, virus huérfano citopático entérico humano (ECHO), virus de la hepatitis A, C, D, E y G, enterovirus de los simios, virus de la encefalomielitis Mmrina (ME), poliovirus murinos, enterovirus ovinos, enterovirus porcinos, el género Cardiovirus (virus de la encefalomiocarditis (EMC), Mengovirus), el género Rhinovirus (rinovirus humanos que incluyen al menos 113 subtipos; otros rinovirus), el genéro Apthovirus (glosopeda (FMDV); la familia Caliciviridae, incluyendo el virus del exantema vesicular porcino, virus del león marino de San Miguel, picornavirus felino y virus Norwalk; la familia Togaviridae, incluyendo el género Alphavirus (virus de la encefalitis equina del Este, virus del bosque de Semliki, virus Sindbis, virus Chikungunya, virus O'Nyong-Nyong, virus del río Ross, virus de la encefalitis equina venezolana, virus de la encefalitis equina del Oeste), el género Flavivirus (virus de la fiebre amarilla transmitido por mosquitos, virus del Dengue, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis del Valle Murray, virus del Nilo Occidental, virus Kunjin, virus transmitido por garrapatas centroeuropeo, virus transmitido por garrapatas del Lejano Oriente, virus del bosque Kyasanur, virus Louping III, virus Powassan, virus de la fiebre hemorrágica de Omsk), el género Rubivirus (virus de la rubeola), el género Pestivirus (virus de la enfermedad de las mucosas, virus del cólera porcino, virus de la enfermedad de la frontera), la familia Bunyaviridae, incluyendo el género Bunyavirus (virus Bunyamwera y relacionados, virus del grupo de la encefalitis de California), el género Phlebovirus (virus siciliano de la fiebre por flebotomos, virus de la fiebre del Valle del Rift), el género Nairovirus (virus de la fiebre hemorrágica de Crimean-Congo, virus de la enfermedad ovina de Nairobi) y el género Uukuvirus (virus Uukuniemi y relacionados); la familia Orthomyxoviridae, incluyendo el género del virus de la gripe (virus de la gripe tipo A, muchos subtipos humanos); virus de la gripe porcina y virus de la gripe aviar y equina; gripe tipo B (muchos subtipos humanos) y gripe tipo C (posiblemente un género distinto); la familia Paramyxoviridae, incluyendo el género Paramyxovirus (virus Parainfluenza tipo 1, virus Sendai, virus de hemadsorción, virus Parainfluenza tipos 2 a 5, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de las paperas), el género Morbillivirus (virus del sarampión, virus de la panencefalitis esclerosante subaguda, virus del moquillo, virus de la peste bovina), el género Pneumovirus (virus sincitial respiratorio (RSV), virus sincitial respiratorio bovino y virus de la neumonía de ratones); virus del bosque de Semliki, virus Sindbis, virus Chikungunya, virus O'Nyong-Nyong, virus del río Ross, virus de la encefalitis equina venezolana, virus de la encefalitis equina del Oeste), el género Flavivirus (virus de la fiebre amarilla transmitido por mosquitos, virus del Dengue, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis del Valle Murray, virus del Nilo Occidental, virus Kunjin, virus transmitido por garrapatas centroeuropeo, virus transmitido por garrapatas del Lejano Oriente, virus del bosque Kyasanur, virus Louping III, virus Powassan, virus de la fiebre hemorrágica de Omsk), el género Rubivirus (virus de la rubeola), el género Pestivirus (virus de la enfermedad de las mucosas, virus del cólera porcino, virus de la enfermedad de la frontera), la familia Bunyaviridae, incluyendo el género Bunyavirus (virus Bunyamwera y relacionados, virus del grupo de la encefalitis de California), el género Phlebovirus (virus siciliano de la fiebre por flebotomos, virus de la fiebre del Valle del Rift), el género Nairovirus (virus de la fiebre hemorrágica de Crimean-Congo, virus de la enfermedad ovina de Nairobi) y el género Uukuvirus (virus Uukuniemi y relacionados); la familia Orthomyxoviridae, incluyendo el género del virus de la gripe (virus de la gripe tipo A, muchos subtipos humanos); virus de la gripe porcina y virus de la gripe aviar y equina; gripe tipo B (muchos subtipos humanos) y gripe tipo C (posiblemente un género distinto); la familia Paramyxoviridae, incluyendo el género Paramyxovirus (virus Parainfluenza tipo 1, virus Sendai, virus de hemadsorción, virus Parainfluenza tipos 2 a 5, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de las paperas), el género Morbillivirus (virus del sarampión, virus de la panencefalitis esclerosante subaguda, virus del moquillo, virus de la peste bovina), el género Pneumovirus (virus sincitial respiratorio (RSV), virus sincitial respiratorio bovino y virus de la neumonía de ratones); la familia Rhabdoviridae, incluyendo el género Vesiculovirus (VSV), virus Chandipura, virus Flandes-Hart Park), el género Lyssavirus (virus de la rabia), Rhabdovirus de peces y filovirus (virus Marburg y virus del ébola); la familia Arenaviridae, incluyendo virus de la coriomeningitis linfocítica (LCM), complejo de virus Tacaribe y virus Lassa; la familia Coronoaviridae, incluyendo virus de la bronquitis infecciosa (IBV), virus de la hepatitis del ratón, coronavirus entérico humano y virus de la peritonitis infecciosa felina (coronavirus
felino).

Los virus de ADN Ilustrativos que son antígenos en animales vertebrados incluyen, pero sin limitación: la familia Poxviridae, incluyendo el género Orthopoxvirus (viruela mayor, viruela menor, virus Vaccinia de la viruela del mono, viruela de la vaca, viruela del búfalo, viruela del conejo, Ectromelia), el género Leporipoxvirus (mixoma, fibroma), el género Avipoxvirus (viruela aviar, otros poxvirus aviares), el género Capripoxvirus (viruela ovina, viruela caprina), el género Suipoxvirus (viruela porcina), el género Parapoxvirus (virus de la dermatitis pustular contagiosa, pseudoviruela de la vaca, virus de la estomatitis papular bovina); la familia Iridoviridae (virus de la fiebre porcina africana, virus de la rana 2 y 3, virus de la linfocistis de peces), la familia Herpesviridae, incluyendo los Herpesvirus alfa (Herpes Simple tipos 1 y 2, Varicela-Zóster, virus del aborto equino, herpesvirus equino 2 y 3, virus de la pseudorrabia, virus de la queratoconjuntivitis bovina infecciosa, virus de la rinotraqueítis bovina infecciosa, virus de la rinotraqueítis felina, virus de la laringotraqueítis infecciosa), los herpesvirus beta (citomegalovirus humanos y citomegalovirus de porcinos, monos y roedores), los herpesvirus gamma (virus de Epstein-Barr (EBV), virus de la enfermedad de Marek, Herpes saimiri, Herpesvirus ateles, Herpesvirus sylvilagus; herpesvirus de la cobaya, virus del tumor de Lucke); la familia Adenoviridae, incluyendo el género Mastadenovirus (subgrupos humanos A, B, C, D y E y sin agrupar; adenovirus de los simios (al menos 23 serotipos), hepatitis infecciosa canina y adenovirus de ganado bovino, cerdos, ovejas, ranas y muchas otras especies, el género Aviadenovirus (adenovirus aviares); y adenovirus no cultivables; la familia Papoviridae, incluyendo el género Papilomavirus (papilomavirus humanos, papilomavirus bovinos, virus del papiloma de Shope del conejo y diversos papilomavirus patógenos de otras especies), el género Polyomavirus (poliomavirus, agente vacuolizante de los simios (SV-40), agente vacuolizante del conejo (RKV), virus K, virus BK, virus JC y otros poliomavirus de primates tales como virus del papiloma linfotrófico); la familia Parvoviridae incluyendo el género de virus adenoasociados, el género Parvovirus (virus de la panleucopenia felina, parvovirus bovino, parvovirus canino, virus de la enfermedad aleutiana del visón, etc.). Por último, los virus de ADN pueden incluir virus que no encajen en las familias anteriores tales como virus del Kuru y de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob y agentes neuropáticos infecciosos crónicos (virus CHINA).

Cada una de las listas anteriores es ilustrativa y no pretende ser limitante.

En una realización específica de la invención, el antígeno comprende uno o más epítopos de células T citotóxicas, epítopos de células Th o una combinación de los dos epítopos.

Además de potenciar una respuesta inmune específica de antígeno en seres humanos, los métodos de las realizaciones preferidas son particularmente muy apropiados para el tratamiento de otros mamíferos u otros animales, por ejemplo, aves tales como gallinas, pollos, pavos, patos, gansos, codornices y faisanes. Las aves son las dianas principales para muchos tipos de infecciones.

Un ejemplo de una infección común en pollos es el virus de la anemia infecciosa del pollo (CIAV). El CIAV se aisló por primera vez en Japón en 1979 durante una investigación de un brote de vacunación de la enfermedad de Marek (Yuasa et al., Avian Dis. 23: 366-385 (1979)). Desde ese momento, el CIAV se ha detectado en aves de corral comerciales en todos los países principales productores de aves de corral (van Bulow et al., págs. 690-699 en "Diseases of Poultry", 9ª edición, Iowa State University Press 1991).

La vacunación de las aves, como la de otros animales vertebrados puede realizarse a cualquier edad. Normalmente, las vacunaciones se realizan hasta las 12 semanas de edad para un microorganismo vivo y entre las 14-18 semanas para un microorganismo inactivado u otro tipo de vacuna. Para la vacunación in ovo, la vacunación puede realizarse en el último cuarto del desarrollo embrionario. La vacuna puede administrarse por vía subcutánea, por pulverización, por vía oral, por vía intraocular, por vía intratraqueal, por vía nasal, in ovo o por otros métodos descritos en este documento.

El ganado bovino y el ganado en general también son susceptibles a la infección. La enfermedad que afecta a estos animales puede producir pérdidas económicas graves, especialmente entre el ganado bovino. Los métodos de la invención pueden usarse para proteger frente a la infección en ganado, tal como en vacas, caballos, cerdos, ovejas y cabras.

Las vacas pueden infectarse por virus bovinos. El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) es un virus de ARN de cadena positiva pequeño con envuelta y se clasifica, junto con el virus del cólera porcina (HOCV) y el virus de la enfermedad de la frontera ovina (BKV) en el género pestivirus. Aunque los Pestivirus se clasificaron anteriormente en la familia Togaviridae, algunos estudios han sugerido su reclasificación en la familia Flaviviridae junto con los grupos flavivirus y virus de la hepatitis C (HCV).

Los herpesvirus equinos (EHV) comprenden un grupo de agentes biológicos antigénicamente diferentes que causan una diversidad de infecciones en caballos que varían de enfermedad subclínica a mortal. Estos incluyen herpesvirus equino 1 (EHV-1), un patógeno ubicuo en caballos. El EHV-1 se asocia con olas de abortos, enfermedad del tracto respiratorio y trastornos del sistema nervioso central. Otros EHV incluyen EHV-2 o citomegalovirus equino, EHV-3, virus del exantema coital equino y EHV-4, previamente clasificado como EHV-1 subtipo 2.

Las ovejas y cabras pueden infectarse por una diversidad de microorganismos peligrosos incluyendo maedi-visna.

Los primates, tales como monos, simios y macacos pueden infectarse por el virus de la inmunodeficiencia de los simios. Se han descrito vacunas de la inmunodeficiencia de los simios de virus inactivado con células y completo sin células para proporcionar protección en macacos (Stott et al., Lancet 36: 1538-1541 (1990); Desrosiers et al., PNAS USA 86: 6353-6357 (1989); Murphey-Corb et al., Science 246: 1293-1297 (1989); y Carlson et al., AIDS Res. Human Retroviruses 6: 1239-1246 (1990)). Se ha descrito una vacuna de gp120 del VIH recombinante para proporcionar protección en chimpancés (Berman et al., Nature 345: 622-625 (1990)).

Los felinos, tanto domésticos como salvajes son susceptibles a la infección con una diversidad de microorganismos. Por ejemplo, la peritonitis infecciosa felina es una enfermedad que se da tanto en felinos domésticos como salvajes tales como leones, leopardos, guepardos y jaguares. Cuando es deseable prevenir una infección con este y otros tipos de organismos patógenos en felinos, los métodos de la invención pueden usarse para vacunar felinos para protegerlos frente a infección.

Los gatos domésticos pueden infectarse con varios retrovirus, incluyendo pero sin limitación el virus de la leucemia felina (FeLV), virus del sarcoma felino (FeSV), oncomavirus endógeno tipo C (RD-114) y virus formador de sincitios felino (FeSFV). El descubrimiento del lentivirus linfotrópico T felino (también denominado de la inmunodeficiencia felina) se describió por primera vez en Pedersen et al., Science 235: 790-793 (1987). La peritonitis infecciosa felina (FIP) es una enfermedad esporádica que aparece de forma impredecible en félidos domésticos y salvajes. Aunque la FIP es principalmente una enfermedad de gatos domésticos, se ha diagnosticado en leones, pumas, leopardos, guepardos y el jaguar. Los felinos salvajes más pequeños que se han visto afectados por FIP incluyen el lince y el caracal, el gato de las arenas y el gato de Pallas.

Las enfermedades víricas y bacterianas en peces de aletas, mariscos u otras formas de vida acuática representan un problema grave para la industria de la acuicultura. Debido a la alta densidad de animales en los tanques de vivero o áreas de cría marina cerradas, las enfermedades infecciosas pueden erradicar una gran proporción de la reserva, por ejemplo, en una instalación de peces de aletas, marisco u otras formas de vida acuática. La prevención de enfermedades es un remedio más deseado para estas amenazas para peces que la intervención una vez que la enfermedad está en evolución. La vacunación de peces es el único método de prevención que puede ofrecer una protección a largo plazo a través de inmunidad.

Se describen vacunaciones basadas en ácidos nucleicos de peces, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 5.780.448.

El sistema inmune de peces tiene muchas características similares al sistema inmune de mamíferos, tales como la presencia de células B, células T, linfocinas, complemento e inmunoglobulinas. Los peces tienen subclases de linfocitos con papeles que parecen similares en muchos aspectos a los de células B y T de mamíferos. Pueden administrarse vacunas por vía oral o por inmersión o por inyección.

Las especies de acuicultura incluyen, pero sin limitación, peces de aletas, mariscos y otros animales acuáticos. Los peces de aletas incluyen todos los peces vertebrados que pueden ser peces óseos o cartiloginosos tales como, por ejemplo, salmónidos, carpas, bagre, brema de cola amarilla, besugo y corvina. Los salmónidos son una familia de peces de aletas que incluyen la trucha (incluyendo la trucha arcoiris), el salmón y la trucha alpina. Los ejemplos de marisco incluyen, pero sin limitación, almejas, langosta, camarón, cangrejo y ostras. Otros animales acuáticos cultivados incluyen, pero sin limitación, anguilas, calamares y pulpos.

Los polipéptidos de patógenos víricos de la acuicultura incluyen, pero sin limitación, glicoproteínas o nucleoproteínas del virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV); proteínas G o N del virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV); proteínas estructurales VP1, VP2, VP3 o N del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV); proteína G de la viremia primaveral de la carpa (VPC); y una proteína asociada a membrana, tegumina o proteína de la cápside o glicoproteína del virus del bagre de canal (CCV).

Los polipéptidos de patógenos bacterianos incluyen, pero sin limitación, una proteína de membrana externa regulada por hierro (IROMP), una proteína de membrana externa (OMP) y una proteína A de Aeromonis salmonicida que causa forunculosis, proteína p57 de Renibacterium salmoninarum que causa enfermedad renal bacteriana (BKD), antígeno asociado a superficie principal (msa), una citotoxina expresada en superficie (mpr), una hemolisina expresada en superficie (ish) y un antígeno flagelar de yersiniosis; una proteína extracelular (ECP), una proteína de membrana externa regulada por hierro (IROMP) y una proteína estructural de pasteurelosis; una OMP y una proteína flagelar de Vibrosis anguillarum y V. ordalii; una proteína flagelar, una proteína OMP, aroA y purA de Edwardsiellosis ictaluri y E. tarda; y antígeno superficial de Ichthyophthirius; y una proteína estructural y reguladora de Cytophaga columnari; y una proteína estructural y reguladora de Rickettsia.

Los polipéptidos de un patógeno parasitario incluyen, pero sin limitación, los antígenos superficiales de
Ichthyophthirius.

En otro aspecto de la invención, se proporcionan composiciones vacunales adecuadas para usar en métodos para prevenir y/o atenuar enfermedades o afecciones que están causadas o exacerbadas por productos génicos "propios" (por ejemplo, factores de necrosis tumoral). Por lo tanto, las composiciones vacunales de la invención incluyen composiciones que conducen a la producción de anticuerpos que previenen y/o atenúan enfermedades o afecciones causadas o exacerbadas por productos génicos "propios". Los ejemplos de dichas enfermedades o afecciones incluyen enfermedad de injerto frente a huésped, reacciones alérgicas mediadas por IgE, anafilaxis, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad de Crohn, asma alérgica, leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma no Hodgkin (NHL), enfermedad de Graves, lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedades autoinmunes inflamatorias, miastenia grave, linfadenopatía de enfermedad inmunoproliferativa (IPL), linfadenopatía angioimmunoproliferativa (AIL), linfadenopatía inmunoblástica (IBL), artritis reumatoide, diabetes, enfermedades priónicas, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y osteoporosis.

En realizaciones específicas relacionadas, las composiciones de la invención son un compuesto inmunoterapéutico que puede usarse para el tratamiento y/o la prevención de alergias, cáncer o adicción a fármacos.

La selección de antígenos o determinantes antigénicos para la preparación de composiciones y para el uso en métodos de tratamiento para alergias sería conocida para los especialistas en las técnicas médicas que tratan dichos trastornos. Los ejemplos representativos de dichos antígenos o determinantes antigénicos incluyen los siguientes: fosfolipasa A_{2} de veneno de abeja, Bet v I (alergeno de polen de abedul), 5 Dol m V (alergeno de veneno de avispas chaqueta amarilla) y Der p I (alergeno del ácaro del polvo doméstico), así como fragmentos de cada que pueden usarse para generar respuestas inmunológicas.

La selección de antígenos o determinantes antigénicos para composiciones y métodos de tratamiento para el cáncer sería conocida para los especialistas en las técnicas médicas que tratan dichos trastornos (véase Renkvist et al., Cancer. Immuno/.Immunother. 50: 3-15 (2001) que se incorpora como referencia) y dichos antígenos o determinantes antigénicos se incluyen en el alcance de la presente invención. Los ejemplos representativos de dichos tipos de antígenos o determinantes antigénicos incluyen los siguientes: Her2 (cáncer de mama); GD2 (neuroblastoma); EGF-R (glioblastoma maligno); CEA (cáncer medular tiroideo); CD52 (leucemia); proteína gp100 de melanoma humano; epítopos de proteína gp100 de melanoma humano tales como los aminoácidos 154-162 (secuencia: KTWGQYWQV), 209-217 (ITDQVPFSV), 280-288 (YLEPGPVTA), 457-466 (LLDGTATLRL) y 476-485 (VLYRYGSFSV); proteína melan-A/MART-1 de melanoma humano; epítopos de proteína melan-A/MART-1 de melanoma humano tales como los aminoácidos 27-35 (AAGIGILTV) y 32-40 (ILTVILGVL); tirosinasa y proteínas relacionadas con tirosinasa (por ejemplo, TRP-1 y TRP-2); epítopos de tirosinasa tales como los aminoácidos 1-9 (MLLAVLYCL) y 369-377 (YMDGTMSQV); proteína NA17-A nt; epítopos de proteína NA17-A nt tales como los aminoácidos 38-64 (VLPDV
FIRC); proteína MAGE-3; epítopos de proteína MAGE-3 tales como los aminoácidos 271-279 (FLWGPRALV); otros antígenos tumorales humanos, por ejemplo, epítopos de CEA tales como los aminoácidos 571-579 (YLSGANLNL); proteína p53, epítopos de proteína p53 tales como los aminoácidos 65-73 (RN2EAAPPV), 149-157 (STPPPGTRV) y 264-272 (LLGRNSFEV); epítopos Her2/neu tales como los aminoácidos 369-377 (KIFGSLAFL) y 654-662 (IISAW
GIL); los péptidos de NY-ESO-1 157-165 y 157-167, 159-167; proteína E7 de HPV16; epítopos de la proteína E7 de VPH 16 tales como los aminoácidos 86-93 (TLGIVCPI, así como fragmentos de cada que pueden usarse para generar respuestas inmunológicas).

La selección de antígenos o determinantes antigénicos para composiciones y métodos de tratamiento para la adicción a fármacos, en particular la adicción a drogas de abuso, sería conocida para los especialistas en las técnicas médicas que tratan dichos trastornos. Los ejemplos representativos de dichos antígenos o determinantes antigénicos incluyen, por ejemplo, opioides y derivados de morfina tales como codeína, fentanilo, heroína, morfina y opio; estimulantes tales como anfetamina, cocaína, MDMA (metilendioximetanfetamina), metanfetamina, metilfenidato y nicotina, alucinógenos tales como LSD, mescalina y psilocibina, así como canabinoides tales como hachís y marihuana.

La selección de antígenos o determinantes antigénicos para composiciones y métodos de tratamiento para otras enfermedades o afecciones asociadas con autoantígenos también se conocería por los especialistas en las técnicas médicas que tratan dichos trastornos. Los ejemplos representativos de dichos antígenos o determinantes antigénicos son, por ejemplo, linfotoxinas (por ejemplo, Linfotoxina \alpha (LTa), Linfotoxina \beta (LT \beta)) y receptores de linfotoxinas, ligando del receptor activador de factor nuclear kappaB (RANKL), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-R), interleucina 17 y péptido beta amiloide (A\beta_{1-42}), TNF\alpha, MIF, MCP-1, SDF-1, Rank-L, M-CSF, Angiotensina II, Endoglina, Eotaxina, Grelina, BLC, CCL21, IL-13, IL-17, IL-5, IL-8, IL-15, bradiquinina, resistina, LHRH, GHRH, GIH, CRH, TRH y Gastrina así como fragmentos de cada que pueden usarse para generar respuestas inmunológicas.

En una realización particular de la invención, el antígeno o determinante antigénico se selecciona del grupo que consistente en: (a) un polipéptido recombinante de VIH, (b) un polipéptido recombinante de virus de la gripe (por ejemplo, polipéptido M2 del virus de la gripe o un fragmento del mismo); (c) un polipéptido recombinante del virus de la hepatitis C; (d) un polipéptido recombinante del virus de la hepatitis B; (e) un polipéptido recombinante de Toxoplasma; (f) un polipéptido recombinante de Plasmodium falciparum; (g) un polipéptido recombinante de Plasmodium vivax; (h) un polipéptido recombinante de Plasmodium ovale, (i) un polipéptido recombinante de Plasmodium malariae; (j) un polipéptido recombinante de células de cáncer de mama; (k) un polipéptido recombinante de células de cáncer de riñón; (l) un polipéptido recombinante de células de cáncer de próstata; (m) un polipéptido recombinante de células de cáncer de piel; (n) un polipéptido recombinante de células de cáncer cerebral; (o) un polipéptido recombinante de células de leucemia; (p) generación de perfiles recombinantes; (q) un polipéptido recombinante de alergia a la picadura de abeja; (r) un polipéptido recombinante de alergia a nueces; (s) un polipéptido recombinante de polen; (t) un polipéptido recombinante de polvo doméstico; (u) un polipéptido recombinante de alergia a gatos o pelo de gato, (v) una proteína recombinante de alergias alimentarias; (w) una proteína recombinante de asma; (x) una proteína recombinante de Chlamydia e (y) un fragmento de cualquiera de las proteínas expuestas en (a)-(x).

En otra realización de la presente invención, el antígeno que está acoplado, fusionado o unido de otro modo a la partícula similar a virus, es un epítopo de célula citotóxica o Th. En una realización preferida, el antígeno es una combinación de al menos dos, preferiblemente diferentes, epítopos en la que los al menos dos epítopos se unen directamente o por medio de una secuencia de enlace. Estos epítopos se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en epítopos de células citotóxicas y Th.

Debería entenderse también que una partícula similar a virus de mosaico, por ejemplo, una partícula similar a virus compuesta por subunidades unidas a diferentes antígenos y epítopos, respectivamente, se incluye en el alcance de la presente invención. Dicha composición de la presente invención puede obtenerse, por ejemplo, por transformación de E. coli con dos plásmidos compatibles que codifican la subunidades que componen la partícula similar a virus fusionada con diferentes antígenos y epítopos, respectivamente. En este caso, la partícula similar a virus de mosaico se ensambla directamente en la célula o después de la lisis celular. Además, dicha composición de la invención también puede obtenerse uniendo una mezcla de diferentes antígenos y epítopo, respectivamente, a la partícula similar a virus aislada.

El antígeno de la presente invención y en particular el epítopo o epítopos indicados pueden sintetizarse o expresarse de forma recombinante y acoplarse con la partícula similar a virus o fusionarse con la partícula similar a virus usando técnicas de ADN recombinante. Se describen procedimientos ejemplares que describen la unión de antígenos a partículas similares a virus en los documentos WO 00/32227, WO 01/85208 y WO 02/056903, cuyas descripciones se incorporan con este documento como referencia en su totalidad.

La invención también proporciona un método de producción de una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal que comprende una VLP y una sustancia inmunoestimuladora empaquetada en dicha partícula similar a virus, y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado que comprende incubar la VLP con la sustancia inmunoestimuladora y el oligonucleótido, respectivamente, añadir ARNasa y purificar dicha composición. En una realización igualmente preferida, el método comprende incubar la VLP con ARNasa, añadir la sustancia inmunoestimuladora y el oligonucleótido, respectivamente, y purificar la composición. En una realización, la VLP se produce en un sistema de expresión bacteriano. En otra realización, la ARNasa es ARNasa A.

La invención proporciona además un método de producción de una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal que comprende una VLP en la que se empaqueta una sustancia inmunoestimuladora y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado que comprende desensamblar la VLP, añadir la sustancia inmunoestimuladora y el oligonucleótido, respectivamente y reensamblar la VLP. El método puede comprender además eliminar ácidos nucleicos de la VLP desensamblada y/o purificar la composición después del reensamblaje.

La invención también proporciona composiciones vacunales que pueden usarse para prevenir y/o atenuar enfermedades o afecciones. Las composiciones vacunales de la invención comprenden o como alternativa consisten en una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición inmunopotenciadora de la invención junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La vacuna también puede comprender opcionalmente un adyuvante.

La invención proporciona además métodos de vacunación para prevenir y/o atenuar enfermedades o afecciones en animales. En una realización, la invención proporciona vacunas para la prevención de enfermedades infecciosas en una amplia variedad de especies animales, particularmente especies de mamíferos tales como seres humanos, monos, vacas, perros, gatos, caballos, cerdos, etc. Pueden diseñarse vacunas para tratar infecciones de etiología vírica tales como VIH, gripe, Herpes, hepatitis vírica, Epstein Bar, polio, encefalitis vírica, sarampión, viruela aviar, etc.; o infecciones de etiología bacteriana, tales como neumonía, tuberculosis, sífilis, etc.; o infecciones de etiología parasitaria tales como malaria, tripanosomiasis, leismaniasis, tricomoniasis, amebiasis, etc.

En otra realización, la invención proporciona vacunas para la prevención del cáncer en una amplia variedad de especies, particularmente especies de mamíferos tales como seres humanos, monos, vacas, perros, gatos, caballos, cerdos, etc. Pueden diseñarse vacunas para tratar todos los tipos de cáncer incluyendo, pero sin limitación, linfomas, carcinomas, sarcomas y melanomas.

Como debería entender un especialista en la técnica, cuando se administran composiciones de la invención a un animal, puede ser en una composición que contenga sales, tampones, adyuvantes u otras sustancias que sean deseables para mejorar la eficacia de la composición. Los ejemplos de materiales adecuados para usar en la preparación de composiciones farmacéuticas se proporcionan en numerosas fuentes incluyendo REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990)).

Pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica dependiendo de la especie hospedadora e incluyen pero sin limitación Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plúmbicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocioninas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Dichos adyuvantes son también bien conocidos en la técnica. Los adyuvantes adicionales que pueden administrarse con las composiciones de la invención incluyen, pero sin limitación, monofosforil lípido A inmunomodulador, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sales de aluminio, MF-59 y tecnología de adyuvante virosomal. Los adyuvantes también pueden comprender una mezcla de estas sustancias.

Se dice que las composiciones de la invención son "farmacéuticamente aceptables" y su administración puede tolerarse por un individuo receptor. Además, las composiciones de la invención se administrarán en una "cantidad terapéuticamente eficaz" (es decir, una cantidad que produzca un efecto fisiológico deseado).

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por diversos métodos conocidos en la técnica. El modo particular seleccionado dependerá por supuesto de la composición particular seleccionada, la gravedad de la afección que se trate y la dosificación necesaria para la eficacia terapéutica. Los métodos de la invención, hablando en general, pueden realizarse usando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, refiriéndose a cualquier modo que produzca niveles eficaces de los compuestos activos sin causar efectos adversos clínicamente inaceptables. Dichos modos de administración incluyen administración por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como mediante polvos, pomadas, gotas o parche transdérmico), bucal o como un pulverizador oral o nasal. El término "parenteral" como se usa en este documento se refiere a modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular. La composición de la invención también puede inyectarse directamente en un ganglio linfático.

Los componentes de composiciones para administración incluyen soluciones y suspensiones estériles acuosas (por ejemplo, solución salina fisiológica) o no acuosas. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Pueden usarse vehículos o vendajes oclusivos para aumentar la permeabilidad cutánea y potenciar la absorción de antígeno.

Pueden administrarse combinaciones simultáneamente, por ejemplo, como una mezcla, por separado pero simultáneamente o al mismo tiempo; o de forma secuencial. Esto incluye presentaciones en las que los agentes combinados se administran juntos como una mezcla terapéutica y también procedimientos en los que los agentes combinados se administran por separado pero simultáneamente, por ejemplo, como por vías intravenosas separadas en el mismo individuo. La administración "en combinación" incluye además la administración separada de uno de los compuestos o agentes que se administra primero, seguido del segundo.

Los niveles de dosificación dependen del modo de administración, de la naturaleza del sujeto y de la calidad de la formulación de vehículo/adyuvante. Son cantidades típicas en el intervalo de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 20 mg por sujeto. Son cantidades preferidas de al menos aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 100 \mug por sujeto. Se prefiere una administración múltiple para inmunizar al sujeto y los protocolos son los convencionales en la técnica adaptados al sujeto en cuestión.

Las composiciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Los métodos incluyen la etapa de asociar las composiciones de la invención con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan asociando uniformemente e íntimamente las composiciones de la invención con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido o ambos y, después, si es necesario, conformando el producto.

Las composiciones adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, comprimidos o grageas, conteniendo cada una cantidad predeterminada de las composiciones de la invención. Otras composiciones incluyen suspensiones en líquidos acuosos o líquidos no acuosos, tales como un jarabe, un elixir o una emulsión.

Otros sistemas de suministro pueden incluir sistemas de suministro de liberación temporalizada, liberación retardada o liberación sostenida. Dichos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de las composiciones de la invención descritas anteriormente, aumentando la comodidad para el sujeto y el médico. Están disponibles y los especialistas en la técnica conocen muchos tipos de sistemas de suministro de liberación prolongada.

Otras realizaciones de la invención incluyen procesos para la producción de las composiciones de la invención y métodos de tratamiento médico para el cáncer y alergias usando dichas composiciones.

Se harán evidentes aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención en los siguientes ejemplos y en las reivindicaciones adjuntas.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención que se define por las reivindicaciones adjuntas. Por lo tanto, se pretende que la presente invención abarque las modificaciones y variaciones de esta invención siempre que se incluyan en el alcance de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

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Ejemplo 1

Generación de VLP de HBcAg de p33

La secuencia de ADN de HBcAg que contiene péptido P33 de LCMV se proporciona en la Figura 1B. Las VLP de p33-HBcAg (p33-VLP) se generaron de la forma siguiente: se adquirió el clon de Hepatitis B pEco63 que contenía el genoma viral completo del virus de la Hepatitis B en la ATCC. El gen que codifica HBcAg se introdujo en los sitios de restricción EcoR1/HindIII del vector de expresión pkk223.3 (Pharmacia) bajo el control de un promotor tac fuerte. El péptido p33 (KAVYNFATM) obtenido del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) se fusionó con el extremo C-terminal de HBcAg (1-185) a través de un enlazador de tres leucinas por métodos de PCR convencionales. Un clon de E. coli K802 seleccionado por su buena expresión se transfectó con el plásmido y las células se cultivaron y se resuspendieron en 5 ml de tampón de lisis (Na_{2}BPO_{4} 10 mM, NaCl 30 mM, EDTA 10 mM, Tween-20 al 0,25%, pH 7,0). Se añadieron 200 \mul de solución de lisozima (20 mg/ml). Después de la sonicación, se añadieron 4 \mul de Benzonasa y MgCl_{2} 10 mM y la suspensión se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, se centrifugó durante 15 minutos a 15.000 rpm a 4ºC y se retuvo el sobrenadante.

A continuación, se añadió sulfato de amonio al 20% (p/v) (0,2 g/ml de lisado) al sobrenadante. Después de la incubación durante 30 minutos en hielo y de la centrifugación durante 15 minutos a 20.000 rpm a 4ºC se desechó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 2-3 ml de PBS. Se cargaron 20 ml de la solución en PBS en una columna de filtración en gel Sephacryl S-400 (Amersham Pharmacia Biotechnology AG), se cargaron las fracciones en un gel de SDS-Page y se combinaron las fracciones con cápsides de p33-VLP purificadas. Las fracciones combinadas se cargaron en una columna de Hidroxiapatita. Se recogió el flujo a través (que contiene cápsides de p33-VLP purificadas) (Figura 2B). Se realizó microscopía electrónica de acuerdo con protocolos convencionales. Se muestra un ejemplo representativo en la Figura 2A.

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Ejemplo 2

Los oligonucleótidos que contienen CpG pueden empaquetarse en VLP de HBcAg

Se procesaron p33-VLP recombinantes en una electroforesis en gel de agarosa nativo (1%) y se tiñeron con bromuro de etidio o azul de Coomassie para la detección de ARN/ADN o proteínas (Figura 3). Las VLP producidas en bacterias contienen altos niveles de ARN monocatenario que está presumiblemente unido a las repeticiones de arginina que aparecen cerca del extremo C-terminal de la proteína HBcAg y que se localizan geográficamente en el interior de las VLP como se muestra por cristalografía de rayos X. El ARN contaminante puede digerirse fácilmente y eliminarse de este modo por incubación de las VLP con ARNasa A. La enzima ARNasa A altamente activa tiene un peso molecular de aproximadamente 14 kDa y es presumiblemente lo bastante pequeña para introducirse en las VLP para eliminar los ácidos ribonucleicos no deseados.

Las p33-VLP recombinantes se complementaron con oligonucleótidos con CpG (Figura 1 A) antes de la digestión con ARNasa A. Como se muestra en la Figura 4, la presencia de oligonucleótidos con CpG preservaba la estructura de la cápside como se muestra por una migración similar en comparación con p33-VLP no tratadas. Las VLP que contienen oligonucleótidos con CpG se purificaron de los oligonucleótidos no unidos mediante diálisis (dilución de 4500 veces en PBS durante 24 horas usando una membrana de diálisis de límite de peso molecular (MWCO) de 300 kDa) (Figura 5).

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Ejemplo 3

Los oligonucleótidos con CpG pueden empaquetarse en VLP por eliminación del ARN con ARNasa y posterior empaquetamiento de los oligonucleótidos en VLP

Las p33-VLP (que contenían ARN monocatenario bacteriano) se incubaron primero con ARNasa A para eliminar el ARN y en una segunda etapa los oligonucleótidos con CpG inmunoestimulantes (con enlaces fosfodiéster normales pero también con modificación fosforotioato de la cadena principal fosfato) se complementaron con las muestras (Figura 6). Este experimento demuestra claramente que los oligonucleótidos con CpG no son absolutamente necesarios al mismo tiempo durante la reacción de degradación de ARN sino que pueden añadirse en un momento
posterior.

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Ejemplo 4

Las VLP que contienen oligonucleótidos con CpG (con modificación fosforotioato de la cadena principal fosfato o enlaces fosfodiéster normales) inducen una protección antiviral aumentada

Se sensibilizaron ratones por vía subcutánea con 100 \mug de p33-VLP que contenían oligonucleótido con CpG. Antes de la inmunización, las preparaciones de p33-VLP se purificaron exhaustivamente de los oligonucleótidos con CpG no unidos mediante diálisis (véase el Ejemplo 2 y la Figura 5). Como controles se sensibilizaron ratones por vía subcutánea con 100 \mug de p33-VLP en solitario, mezcladas con oligonucleótido con CpG 20 nM, con oligonucleótido con CpG 20 nM en solitario o se dejaron sin tratar. Veintiún días después, los ratones se expusieron a LCMV (200 ufp por vía intravenosa) y se evaluaron los títulos virales en los bazos 5 días después como se describe en Bachmann, M. F., "Evaluation of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T cell responses", en Immunology Methods Manual, Lefkowitz, I., ed., Academic Press Ltd., Nueva York, NY (1997) pág. 1921. Los resultados se muestran en las Figuras 7, 8 y 9.

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Ejemplo 5

Generación de cápsides de polioma BKV

El virus BK (BKV) es un virus de ADN bicatenario sin envuelta que pertenece a la subfamilia de poliomavirus de los papovaviridae. La VP1 es la proteína de la cápside principal. La VLP tiene 362 aminoácidos (Figura 10) y tiene un tamaño de 42 kDa. Cuando se produce en E. coli, células de insecto o levadura la VP 1 forma espontáneamente estructuras de cápside (Salunke D. M., et al., Cell 46 (6): 895-904 (1986); Sasnauskas, K., et al., Biol. Chem. 380 (3): 381-6 (1999); Sasnauskas, K, et al., 3rd Internacional. Workshop "Virus-like particles as vaccines" Berlín, 26-29 septiembre (2001)); Touze, A., et al., J Gen Virol. 82 (Parte 12): 3005-9 (2001). La cápside se organiza en 72 pentámeros de VP1 que forman una estructura icosaédrica. Las cápsides tienen un diámetro de aproximadamente 45 nm.

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Ejemplo 6

Los oligonucleótidos que contienen CpG marcados con fluoresceína pueden empaquetarse en VLP de BKV

Las VLP producidas en levaduras contienen pequeñas cantidades de ARN que puede digerirse fácilmente y de este modo eliminarse por incubación de las VLP con ARNasa. La enzima ARNasa altamente activa tiene un peso molecular de aproximadamente 14 kDa y es lo bastante pequeña para introducirse en las VLP para eliminar los ácidos ribonucleicos no deseados. Se concentraron VLP de BKV producidas de forma recombinante a 1 mg/ml en tampón PBS pH 7,2 y se incubaron en ausencia o presencia de ARNasa a (200 \mug/ml, Roche Diagnostics Ltd, Suiza) durante 3 h a 37ºC. Después de la digestión con ARNasa las VLP de BKV se complementaron con oligonucleótido con CpG-FAM con fosforotioato marcado con fluoresceína 75 nmol/ml y se incubaron durante 3 h a 37ºC. Posteriormente, las VLP de BKV se sometieron a digestión con ADNasa I durante 3 h a 37ºC (AMPD1 40 u/ml Sigma, Division of Fluka AG, Suiza) o se cargaron sin digestión con ADNasa I. Las muestras se complementaron con tampón de carga de ADN concentrado 6 veces (Tris 10 mM pH 7,5, glicerol al 10% v/v, naranja G al 0,4%) y se procesaron durante 1 h a 65 voltios en un gel de agarosa nativo en tris acetato al 0,8% a pH
7,5.

La Figura 12 muestra VLP de BKV en una electroforesis en gel de agarosa nativo al 0,8% después de una incubación de control o después de la digestión con ARNasa A y posterior incubación con oligonucleótidos con CpG-FAM fluorescentes (oligonucleótido de la Figura 1A con un marcador de 5'-fluoresceína) tras la tinción con bromuro de etidio o sin tinción con bromuro de etidio. En presencia de bromuro de etidio se detectaron los ácidos nucleicos mientras que en su ausencia la excitación con UV conduce a fluorescencia del marcador de fluoresceína en el CpG-FAM.

La digestión con ARNasa conduce a un cambio en la migración de la VLP, visible en un gel de agarosa teñido con Coomassie, presumiblemente debido a la ausencia de cargas negativas del ARN (Figuras 13 y 14). La adición de oligonucleótido con CpG restaura la migración de VLP de BKV y da como resultado una banda fluorescente con la misma migración que la banda de ARN presente en VLP sin tratar. Esto demuestra claramente que los oligonucleótidos con CpG-FAM se han empaquetado en VLP.

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Ejemplo 7

Los oligonucleótidos bicatenarios de gran tamaño pueden empaquetarse en VLP de BEY

Para introducir secuencias de nucleótidos bicatenarias (bc), las VLP de BKV recombinantes tratadas con ARNasa (Ejemplo 6) se complementaron con fragmentos de ADN (bc) 50 pg/ml (de 246 pb de longitud, Figura 11) y se incubaron durante 3 h a 37ºC. Las muestras se complementaron con tampón de carga de ADN concentrado 6 veces (Tris 10 mM pH 8,0, glicerol al 10% v/v, naranja G al 0,4%) y se procesaron durante 1 h a 65 voltios en una electroforesis en gel de agarosa nativo en tris-acetato al 0,8% a pH8,0.

La Figura 13 muestra VLP de BKV (15 \mug) en una electroforesis en gel de agarosa nativo al 0,8% después de una incubación de control o después de la digestión con ARNasa y posterior incubación con ADN (bc) tras la tinción con bromuro de etidio o Azul de Coomassie para evaluar la presencia de ARN/ADN o proteína. Las moléculas de ADN empaquetadas son visibles en presencia de bromuro de etidio como una banda con la misma migración que la banda de VLP visualizada con Azul de Coomassie.

La adición de ADN (bc) restaura la migración de VLP de BKV y da como resultado una banda de ADN con la misma migración que las VLP teñidas con Azul de Coomassie. Esto demuestra claramente que el ADN (bc) se ha empaquetado en VLP de BKV.

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Ejemplo 8

Los oligonucleótidos que contienen CpG pueden empaquetarse en VLP de BKV

Para introducir oligonucleótidos con CpG inmunoestimuladores, las VLP de BKV recombinantes tratadas con ARNasa A (Ejemplo 6) se complementaron con 150 nmol/ml de oligonucleótidos con CpG con cadena principal fosfodiéster o con cadena principal fosforotioato y se incubaron durante 3 h a 37ºC. Las preparaciones de VLP para inmunización de ratones se dializaron exhaustivamente (diluidas 10.000 veces) durante 24 h contra PBS a pH 7,2 con una membrana de diálisis de límite de peso molecular (MWCO) de 300 kDa (Spectrum Medical industries Inc., Houston, Estados Unidos) para eliminar la ARNasa y el exceso de oligonucleótidos con CpG. Las muestras se complementaron con tampón de carga de ADN concentrado 6 veces (Tris 10 mM pH 7,5, glicerol al 10% v/v, naranja G al 0,4%) y se procesaron durante 1 h a 65 voltios en un gel de agarosa nativo en tris acetato al 0,8% pH
7,5.

La Figura 14 muestra VLP de BKV (15 \mug) en una electroforesis en gel de agarosa nativo al 0,8% después de una incubación de control o después de la digestión con ARNasa y posterior incubación con oligonucleótidos con CpG (con cadena principal fosfodiéster o fosforotioato) tras la tinción con bromuro de etidio (A) o Azul de Coomassie (B) para evaluar la presencia de ARN/ADN o proteína y la reducción de oligonucleótidos con CpG no unidos después de la diálisis. Los oligonucleótidos con CpG no unidos son visibles como una banda teñida con bromuro de etidio de bajo peso molecular.

La adición de oligonucleótidos con CpG restaura la migración de las VLP de BKV y da como resultado una banda de ADN con la misma migración que las VLP teñidas con Azul de Coomassie. Esto demuestra claramente que los oligonucleótidos con CpG se empaquetan en VLP de BKV.

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Ejemplo 9

Las VLP que contienen oligonucléotidos con CpG (con modificaciones fosforotioato de la cadena principal fosfato) inducen una respuesta inmune dirigida a Th1 aumentada

Se inyectaron por vía subcutánea 10 \mug de VLP de BKG que contenían oligonucleótido con CpG con fosforotioato (Figura 1A) en ratones BALB/c hembra (tres ratones por grupo). Como controles, los ratones recibieron inyecciones por vía subcutánea de 10 \mug de VLP de BKV tratada con ARNasa en solitario o VLP de BKV mezcladas con oligonucleótidos con CpG con fosforotioato 0,3 nmol o 20 nmol en 200 \mul de PBS a pH 7,2, o se dejaron sin tratar. Se prepararon VLP de BKV como se describe en el Ejemplo 8 y antes de la inmunización se purificaron exhaustivamente del oligonucleótido con CpG no unido mediante diálisis. El día 14 después de la inmunización se extrajo sangre y se determinó la respuesta de anticuerpos IgG1 e IgG2a contra VLP de BKV.

La Figura 15 muestra la respuesta de anticuerpos IgG1 e IgG2a contra VLP de BKV el día 14 después de la inmunización. La inmunización con VLP de BKV tratadas con ARNasa A que contienen oligonucleótidos con CpG con fosforotioato da como resultado un título de IgG1 disminuido y de IgG2a anti-VLP de BKV aumentado en comparación con la inmunización con la misma cantidad (0,3 nmol) de oligonucleótidos con CpG mezclados con VLP de BKV o VLP de BKV en solitario. Los ratones inmunizados con VLP de BKV mezcladas con oligonucleótidos con CpG con fosforotioato 20 nmol muestran títulos de IgG1 muy reducidos y de IgG2a elevados. La disminución en el título de IgG1 y el aumento en el título de IgG2a en comparación con los controles demuestra una respuesta inmune dirigida a células Th1 inducida por oligonucleótidos con CpG con fosforotioato empaquetados en VLP de BKV. La Figura 15 muestra claramente la mayor potencia de las VLP de BKV que contienen oligonucleótidos con CpG empaquetados en el interior de las partículas en comparación con VLP de BKV mezcladas simplemente con oligonucleótidos con
CpG.

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Ejemplo 10

El ADN bicatenario lineal (ADNbc) puede empaquetarse en VLP por digestión primero con ARNasa y posterior adición de ADNbc

Las preparaciones de p33-VLP (que contienen ARN bacteriano) (Ejemplo 1) se incubaron primero con ARNasa para eliminar el ARN y en una segunda etapa el ADNbc lineal (de 350 pb de longitud) se usó para complementar las muestras (Figura 16). La migración de las p33-VLP empaquetadas con el ADNbc era similar a la de una p33-VLP que contenía ARN. Este experimento demuestra que el ADNbc lineal de al menos 350 pares de bases de longitud puede empaquetarse en las partículas similares a virus.

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Ejemplo 11

Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden empaquetarse en VLP de HBcAg que comprenden proteínas de fusión con antígenos

Cuando las VLP de HBcAg se producen en E. coli por expresión de la proteína de fusión de antígeno de núcleo de hepatitis B HBc33 (Ejemplo 1) o la proteína de fusión con el péptido PI A (HBcP1A), contienen ARN que puede digerirse y de este modo eliminarse por incubación de las VLP con ARNasa A.

El gen P1A codifica una proteína que se expresa por la línea de células tumorales de mastocitoma P815. El epítopo de CTL dominante, denominado péptido P1A, se une a MHC clase I (Ld) y el complejo se reconoce por clones de CTL específicos (Brandle et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 4010-4019). La fusión del péptido P1A-1 (LPYLGWLVF) con el extremo C-terminal de HBcAg (aminoácido 185, véase el Ejemplo 1) se realizó mediante PCR usando cebadores apropiados usando técnicas de biología molecular convencionales. Se clonó un enlazador de tres leucinas entre el HBcAg y la secuencia peptídica. La expresión se realizó como se describe en el Ejemplo 1. La proteína de fusión de HBcAg con P 1 A denominada HBcP1A formaba cápsides cuando se expresaba en E. coli que podían purificarse de forma similar al procedimiento descrito en el Ejemplo 1.

Hidrólisis enzimática de ARN: Se incubaron VLP de HBcAg-p33 (HBc33) y HBcAg-P1A (HBcP1A) producidas de forma recombinante a una concentración de 1,0 mg/ml en tampón PBS 1x (KCl 0,2 g/l, KH_{2}PO_{4} 0,2 g/l, NaCl 8 g/l, Na_{2}HPO_{4} 1,15 g/l) pH 7,4 en presencia de ARNasa (Qiagen AG, Suiza) 300 \mug/ml durante 3 h a 37ºC en un termomezclador a 650 rpm.

Empaquetamiento de ácidos nucleicos inmunoestimuladores: Después de la digestión de ARN con ARNasa A se complementaron VLP de HBcAg-p33 con oligonucleótidos con CpG B-CpG, NKCpG, G10-PO 130 nmol/ml (Tabla I). De forma similar, el Cy150-1 monocatenario de 150 nucleótidos y el dsCyCpG-253 bicatenario de 253 nucleótidos, conteniendo ambos múltiples copias de motivos CpG, se añadieron a 130 nmol/ml o 1,2 nmol/ml, respectivamente, y se incubaron en un termomezclador durante 3 h a 37ºC. Se produjo ADN de CyCpG-253 bicatenario por clonación de un multímero bicatenario de CyCpG en el sitio EcroRV de pBluescript KS-. El plásmido resultante, producido en E. coli XL1-blue y aislado usando el Qiagen Endofree plasmid Giga Kit, se digirió con las endonucleasas de restricción XhoI y XbaI y los productos de restricción resultantes se separaron mediante electroforesis en agarosa. El inserto de 253 pb se aisló por electroelución y precipitación con etanol. La secuencia se verificó por secuenciación de ambas cadenas.

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TABLA I Secuencias de ácidos nucleicos inmunoestimuladores usados en los Ejemplos

1

2

Tratamiento con ADNasa I: VLP de HBcAg-p33 empaquetadas se sometieron posteriormente a digestión con ADNasaI (5 U/ml) durante 3 h a 37ºC (ADNasaI, sin ARNasa Fluka AG, Suiza) y se dializaron exhaustivamente (2 veces contra un volumen de 200 veces) durante 24 h contra PBS a pH 7,4 con una membrana de diálisis de límite de peso molecular (MWCO) de 300 kDa (Spectrum Medical industries Inc., Houston, Estados Unidos) para eliminar la ARNasa A y el exceso de oligonucleótidos con CpG.

Tratamiento con benzonasa: Puesto que algunos oligodesoxinucleótidos monocatenarios eran parcialmente resistentes al tratamiento con ADNasaI, se usó un tratamiento con Benzonasa para eliminar los oligonucleótidos libres de la preparación. Se añadieron Benzonasa 100-120 U/ml (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y MgCl_{2} 5 mM y se incubaron durante 3 h a 37ºC antes de la diálisis.

Diálisis: Las preparaciones de VLP empaquetadas con ácidos nucleicos inmunoestimuladores usados en experimentos de inmunización de ratones se dializaron exhaustivamente (2 veces contra un volumen de 200 veces) durante 24 h contra PBS a pH 7,4 con una membrana de diálisis de límite de peso molecular (MWCO) de 300 kDa (Spectrum Medical industries Inc., Houston, Estados Unidos) para eliminar las enzimas añadidas y los ácidos nucleicos libres.

Análisis del empaquetamiento: liberación de ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados: A 50 \mul de solución de cápside se añadieron 1 \mul de proteinasa K (600 U/ml, Roche, Mannheim, Alemania), 3 \mul de solución de SDS al 10% y 6 \mul de tampón de proteinasa 10x (NaCl 0,5 M, EDTA 50 mM, Tris 0,1 M pH 7,4) y posteriormente se incubó durante una noche a 37ºC. Las VLP se hidrolizan completamente en estas condiciones. La proteinasa K se inactivó por calentamiento durante 20 min a 65ºC. Se añadió 1 \mul de ARNasa A (Qiagen, 100 \mug/ml, diluida 250 veces) a 25 \mul de cápside. Se mezclaron 2-30 \mug de cápside con 1 volumen de tampón de carga 2x (TBE 1x, urea al 42% p/v, Ficoll al 12% p/v, Azul de bromofenol al 0,01%), se calentó durante 3 min a 95ºC y se cargó en un gel de poliacrilamida en TBE/urea al 10% (para oligonucleótidos de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud) o al 15% (para ácidos nucleicos de más de 40 nucleótidos) (Invitrogen). Como alternativa las muestras se cargaron en un gel de agarosa al 1% con colorante de carga 6x (Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 50 mM, glicerol al 10% v/v, naranja G al 0,4%). Los geles en TBE/urea se tiñeron con CYBRGold y los geles de agarosa se tiñeron con bromuro de etidio.

Las Figuras 17, 18 y 19 muestran el empaquetamiento de los oligonucleótidos B-CpG, NKCpG y G10-PO en HBc33. El contenido de ARN en las VLP se redujo enormemente después del tratamiento con ARNasa (Figuras 17A, 18A, 19A) mientras que la mayor parte de la cápside migraba como una mancha de migración lenta, presumiblemente debido a la eliminación del ARN cargado negativamente (Figuras 17B, 18B, 19B). Después de la incubación con un exceso oligonucleótido las cápsides contenían una mayor cantidad de ácido nucleico que las cápsides tratadas con ARNasaA y por lo tanto migraban a una velocidad similar a la de las cápsides sin tratar. El tratamiento adicional con ADNasa I o Benzonasa degradaba los oligonucleótidos libres mientras que los oligonucleótidos empaquetados en las cápsides no se degradaban, demostrando claramente el empaquetamiento de los oligonucleótidos. En algunos casos el empaquetamiento de los oligonucleótidos se confirmó mediante digestión con proteinasa K (como se describe en los Ejemplos 15 y 16) después del tratamiento con ADNasaI/Benzonasa y diálisis. El descubrimiento de que los oligonucleótidos liberados de la cápside con el procedimiento descrito anteriormente eran del mismo tamaño que el oligonucleótido usado para el empaquetamiento demuestra claramente el empaquetamiento de los oligonucleótidos (Figuras 17C, 18C).

La Figura 20 muestra el empaquetamiento de un oliginucleótido monocatenario de gran tamaño Cy150-1 en HBc33. El Cy150-1 contiene 7,5 repeticiones de CyCpG y se sintetizó de acuerdo con métodos de síntesis de oligonucleótidos convencionales (IBA, Göttingen, Alemania). El contenido de ARN en la cápside se redujo enormemente después del tratamiento con ARNasaA mientras que la mayor parte de la cápside migraba como una mancha de migración lenta (Figuras 20A, B). La cápside se diluyó con 4 volúmenes de agua y se concentró hasta 1 mg/ml. Después de la incubación con un exceso de Cy150-1, la cápside contenía una mayor cantidad de ácido nucleico por lo tanto migraba a una velocidad similar a la de las cápsides sin tratar. El tratamiento adicional con ADNasaI degradaba los oligonucleótidos libres no empaquetados mientras que los oliginucleótidos en cápsides no se degradaban (Figura 20A). La liberación del ácido nucleico resistente a ADNasaI de las VLP empaquetadas por calentamiento durante 3 min a 95ºC en tampón de carga en TBE/urea puso de manifiesto la presencia de los 150 nucleótidos (Figura 20 C).

La Figura 21 muestra el empaquetamiento del oligonucleótido NKCpGpt en HBcP1A. El tratamiento con ARNasa reducía el contenido de ácido nucleico y ralentizaba la migración de las cápsides. La adición de NKCpGpt restauraba el contenido de ácidos nucleicos en las cápsides y la migración rápida.

La Figura 17 representa el análisis del empaquetamiento de B-CpG en VLP de HBc33 en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (A) y Azul de Coomassie (B). Se cargan en el gel 50 \mug de las siguientes muestras: 1. VLP de HBc33 sin tratar; 2. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A; 3. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A y empaquetadas con B-CpG; 4. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con B-CpG y tratadas con ADNasaI; 5. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con B-CpG, tratadas con ADNasaI y dializadas; 6. escalera de ADN de MBI Fermentas de 1 kb. La (C) representa el análisis de la cantidad de oligonucleótido empaquetado extraído de la VLP en un gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio: se cargan en el gel las siguientes muestras: 1. control de B-CpG 0,5 nmol; 2. control de B-CpG 0,5 nmol; 3. contenido de oligonucleótido B-CpG en HBc33 después de la extracción con fenol/cloroformo; 4. contenido de oligonucleótido B-CpG en HBc33 después de la extracción con fenol/cloroformo y tratamiento con ARNasa A; 5. contenido de oligonucleótido B-CpG en HBc33 después de la extracción con fenol/cloroformo y tratamiento con ADNasaI; 6. vacío; 7. escalera de ADN de 100 pb de MBI Fermentas.

La Figura 18 representa el análisis del empaquetamiento de NKCpG en VLP de HBc33 en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (A) y Azul de Coomassie (B). Se cargaron en el gel 15 \mug de las siguientes muestras: 1. VLP de HBc33 sin tratar; 2. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A; 3. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A y empaquetadas con NKCpG; 4. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con NKCpG, tratadas con ADNasaI y dializadas; 5. escalera de ADN de MBI Fermentas de 1 kb. La (C) representa el análisis de la cantidad de oligonucleótido empaquetado extraído de la VLP en un gel de TBE/urea al 15% teñido con CYBR Gold. Se cargaron en el gel las siguientes muestras: 1. contenido de oligonucleótido NKCpG en HBc33 después de la digestión con proteinasa K y tratamiento con ARNasa A; 2. control de NKCpG 20 pmol; 3. control de NKCpg 10 pmol; 4. control de NKCpG 40 pmol.

La Figura 19 representa el análisis del empaquetamiento de g10gacga-PO en VLP de HBc33 en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (A) y Azul de Coomassie (B). Se cargaron en el gel 15 \mug de las siguientes muestras: 1. escalera de ADN de MBI Fermentas de 1 kb; 2. VLP de HBc33 sin tratar; 3. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A; 4. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A y empaquetadas con g10gacga-P0; 5. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con g10gacga-P0, tratadas con Benzonasa y dializadas.

La Figura 20 representa el análisis del empaquetamiento de CyCpG-150 en VLP de HBc33 en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (A) y Azul de Coomassie (B). Se cargan en el gel 15 \mug de las siguientes muestras: 1. escalera de ADN de MBI Fermentas de 1 kb; 2. VLP de HBc33 sin tratar; 3. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A; 4. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A y empaquetadas con CyCpG-150; 5. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con CyCpG-150, tratadas con ADNasaI y dializadas; 6. VLP de HBc33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con CyCpG-150, tratadas con ADNasaI y dializadas. La (C) representa el análisis de la cantidad de oligonucleótido empaquetado extraído de las VLP en un gel de TBE/urea al 10% teñido con CYBR Gold. Se cargan en el gel las siguientes muestras: 1. control de CyCpG-150 20 pmol; 2. control de CyCpG-150 10 pmol; 3. control de CyCpG-150 4 pmol; 4. contenido de oligonucleótido CyCpG-150 de 4 \mug de HBc33 después de 3 min a 95ºC con 1 volumen de tampón de muestra TBE/urea.

La Figura 21 representa el análisis del empaquetamiento de NKCpGpt en VLP de HBcP1A en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (A) y Azul de Coomassie (B). Se cargan en el gel 15 \mug de las siguientes muestras: 1. escalera de ADN de MBI Fermentas de 1 kb; 2. VLP de HBcP1A sin tratar; 3. VLP de HBcP1A tratadas con ARNasa A; 4. VLP de HBcP1A tratadas con ARNasa A y empaquetadas con NKCpGpt.

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Ejemplo 12

Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden empaquetarse en HBcAg-wt acoplados con antígenos

Se empaquetaron VLP de HBcAg-wt producidas de forma recombinante después del acoplamiento con péptido p33 (CGG-KAVYNFATM) obtenido del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV). Para el acoplamiento las VLP de HBcAg-wt (2 mg/ml) se derivatizaron con un exceso molar 25x de SMPH (Succinimidil-6-[(\beta-maleimido-propionamido)hexanoato], Pierce) durante 1 h a 25ºC en un termomezclador. Las VLP derivatizadas se dializaron contra tampón Mes (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) a pH 7,4 durante 2 x 2 h usando membranas de diálisis de 10.000 kD de límite de peso molecular (MWCO) a 4ºC. Las VLP (50 \muM) se acoplaron posteriormente a la cisteína N-terminal del péptido p33 (250 \muM) durante una ecuación de 2 h en un termomezclador a 25ºC. Las muestras se dializaron (300.000 de límite de peso molecular (MWCO)) exhaustivamente contra PBS 1x a pH 7,4 para eliminar el péptido libre no deseado.

La Figura 22 muestra un análisis de SDS-PAGE de la derivatización de VLP de HBcAg wt con SMPH y del acoplamiento con péptido p33. Las muestras se analizaron mediante SDS PAGE al 16% y se tiñeron con Azul de Coomassie. El HBcAg-wt era visible como una banda proteica de 21 kD. Debido al bajo peso molecular del SMPH el producto derivatizado sólo es ligeramente mayor y no puede distinguirse mediante SDS-PAGE. El péptido en solitario era visible como una banda de 3 kD y el producto acoplado, denominado HBx33, mostraba una banda secundaria intensa a aproximadamente 24 kD que representa más del 50% del HBcAg-wt total.

Hidrólisis enzimática de ARN: Se diluyeron VLP de HBx33 (0,5-1,0 mg/ml, tampón PBS 1x pH 7,4) en presencia de ARNasa A (300 \mug/ml, Qiagen AG, Suiza) con 4 volúmenes de H_{2}O para disminuir la concentración salina hasta una concentración final de PBS 0,2x y se incubaron durante 3 h a 37ºC en un temomezclador a 650 rpm.

Empaquetamiento de ácidos nucleicos inmunoestimuladores: Después de la digestión con ARNasa A las VLP de HBx33 se concentraron usando concentradores Microcon o Centriplus de Millipore, después se complementaron con oligonucleótidos con CpG B-CpGpt 130 nmol/ml y se incubaron en un termomezclador durante 3 h a 37ºC en PBS 0,2x a pH 7,4. Posteriormente, las mezclas de reacción se sometieron a digestión con ADNasaI (5 U/ml) durante 3 h a 37ºC (ADNasaI, sin ARNasa Fluka AG, Suiza). Las preparaciones de VLP para inmunización de ratones se dializaron exhaustivamente (2 veces contra un volumen de 200 veces) durante 24 h contra PBS a pH 7,4 con una membrana de diálisis de límite de peso molecular (MWCO) de 300 kDa (Spectrum Medical industries Inc., Houston, Estados Unidos) para eliminar la ARNasa A y el exceso de oligonucleótidos con CpG. La Figura 23 muestra que el tratamiento con ARNasa reducía el contenido de ácido nucleico de las cápsides y ralentizaba su migración. La adición de B-CpGpt restauraba el contenido de ácido nucleico y la migración rápida de las cápsides. La ADNasaI sólo digería los oligonucleótidos libres mientras que los oligonucleótidos empaquetados permanecían en la VLP también después de la diálisis (Figura 23).

La Figura 22 representa el análisis de SDS-PAGE del acoplamiento de p33 con VLP de HBc después de la tinción con Azul de Coomassie. Se cargan en el gel las siguientes muestras: 1. Marcador de proteínas preteñido NEB, Amplio Intervalo (Nº 7708S), 10 \mul; 2. CGG-péptido p33; 3. VLP de HBc derivatizadas con SMPH, antes de la diálisis; 4. VLP de HBc derivatizadas con SMPH después de la diálisis; 5. VLP de HBc acopladas con CGG-p33, sobrenadante; 6. VLP de HBc acopladas con CGG-p33, sedimento.

La Figura 23 representa el análisis del empaquetamiento de B-CpGpt en VLP de HBx33 en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (A) y Azul de Coomassie (B). Se cargan en el gel 50 \mug de las siguientes muestras: 1. VLP de HBx33 sin tratar; 2. VLP de HBx33 tratadas con ARNasa A; 3. VLP de HBx33 tratadas con ARNasa A y empaquetadas con B-CpGpt; 4. VLP de HBx33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con B-CpGpt y tratadas con ADNasaI; 5. VLP de HBx33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con B-CpGpt, tratadas con ADNasaI y dializadas; 6. escalera de ADN de MBI Fermentas de 1 kb.

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Ejemplo 13

Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden empaquetarse en VLP de Q\beta acopladas con antígenos Acoplamiento de péptidos p33 con VLP de Q\beta

Se usaron VLP de Q\beta producidas de forma recombinante después del acoplamiento con péptidos p33 que contenían una extensión de CGG N-terminal o una extensión de GGC C-terminal (CGG-KAVYNFATM y KAVYNFATM-GGC). Se derivatizaron VLP de Q\beta producidas de forma recombinante con un exceso 10 molar de SMPH (Pierce) durante 0,5 h a 25ºC, seguido de diálisis contra HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC para eliminar el SMPH sin reaccionar. Los péptidos se añadieron en un exceso molar de 5 veces y se dejó que reaccionaran durante 2 h en un termomezclador a 25ºC en presencia de acetonitrilo al 30%. La Figura 24 muestra el análisis de SDS-PAGE que demuestra múltiples bandas de acoplamiento que consisten en uno, dos o tres péptidos acoplados con el monómero de Q\beta (Flechas, Figura 24).

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Cuando se producen VLP de Q en E. coli por expresión de la proteína de la cápside del bacteriófago Q\beta, contienen ARN que puede digerirse y de este modo eliminarse por incubación de las VLP con ARNasa.

Una fuerza iónica reducida y una concentración de Q\beta reducida permiten la hidrólisis de ARN de VLP de Q\beta por ARNasa A

Se digirieron directamente VLP de Q\beta a una concentración de 1,0 mg/ml en tampón Hepes 20 mM/NaCl 150 mM (HBS) a pH 7,4 por adición de ARNasa A (300 \mug/ml, Qiagen AG, Suiza) o se diluyeron con 4 volúmenes de H_{2}O a una concentración final de HBS 0,2x y después se incubaron con ARNasa A (60 \mug/ml, Qiagen AG, Suiza). Se permitió la incubación durante 3 h a 37ºC en un termomezclador a 650 rpm. La Figura 25 demuestra que en HBS 1x sólo se observaba una reducción muy débil del contenido de ARN mientras que en HBS 0,2x la mayor parte del ARN se hidrolizaba. De acuerdo con esto, la migración de la cápside no cambiaba después de la adición de ARNasa A en HBS 1x mientras que la migración era más lenta después de la adición de ARNasa A en HBS 0,2x (Figura 25B,
D).

Una fuerza iónica reducida aumenta el empaquetamiento de ácido nucleico en VLP de Q\beta

Después de la digestión con ARNasa A en HBS 0,2x las VLP de Q\beta se concentraron hasta 1 mg/ml usando concentradores Microcon o Centriplus de Millipore y las alícuotas se dializaron contra HBS 1x o HBS 0,2x. Las VLP de Q\beta se complementaron con oligonucleótido con CpG B-CpG 130 nmol/ml y se incubaron en un termomezclador durante 3 h a 37ºC. Posteriormente, las VLP de Q\beta se sometieron a digestión con Benzonasa (100 U/ml) durante 3 h a 37ºC. Las muestras se analizaron en geles de agarosa al 1% después de tinción con bromuro de etidio o Azul de Coomassie. La Figura 26 muestra que en HBS 1x sólo podían empaquetarse una cantidad muy pequeña de oligonucleótidos mientras que en HBS 0,2x era detectable una banda teñida con bromuro de etidio intensa que se colocalizaba con la tinción de azul de Coomassie de las cápsides.

Ácidos nucleicos inmunoestimuladores diferentes pueden empaquetarse en VLP de Q\beta

Después de la digestión con ARNasa A en HBS 0,2x las VLP de Q\beta se concentraron hasta 1 mg/ml usando concentradores Microcon o Centriplus de Millipore y se complementaron con oligonucleótidos con CpG B-CpGpt, G10gacga y el dsCyCpG-253 de 253 nucleótidos 130 nmol/ml (Tabla I) y se incubaron en un termomezclador durante 3 h a 37ºC. Posteriormente, las VLP de Q\beta se sometieron a digestión con ADNasaI (5 U/ml) o digestión con Benzonasa (100 U/ml) durante 3 h a 37ºC. Las muestras se analizaron en geles de agarosa al 1% después de la tinción con bromuro de etidio o Azul de Coomassie. La Figura 27 muestra que los ácidos nucleicos diferentes B-CpGpt, g10gacga y el ADNbc 253 nucleótidos podían empaquetarse en Q\betax33. Los ácidos nucleicos empaquetados eran resistentes a la digestión con ADNasaI y permanecían empaquetadas durante la diálisis (Figura 27). El empaquetamiento de B-CpGpt se confirmó por liberación del ácido nucleico mediante digestión con proteinasa K seguida de electroforesis en agarosa y tinción con bromuro de etidio (Figura 27C).

La Figura 24 representa el análisis de SDS-PAGE del acoplamiento de p33 con VLP de Q\beta después de la tinción con Azul de Coomassie. Se cargan las siguientes muestras: (A) 1. Marcador de proteínas preteñido NEB, Amplio Intervalo (Nº 7708S), 10 \mul; 2. VLP de Q\beta, 14 \mug; 3. VLP de Q\beta derivatizadas con SMPH, después de la diálisis; 4. VLP de Q\beta acopladas con CGG-p33, sobrenadante; (B) 1. Marcador de proteínas preteñido NEB, Amplio Intervalo (Nº 7708S), 10 \mul; 2. VLP de Q\beta, 10 \mug; 3. VLP de Q\beta acopladas con GGC-p33, sobrenadante.

La Figura 25 representa el análisis de la hidrólisis de ARN de VLP de Q\beta mediante ARNasa A a fuerza iónica reducida y elevada en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (A, C) y Azul de Coomassie (B, D). Se cargan en el gel las siguientes muestras: (A, B) 1. escalera de ADN de 1 kb de MBI Fermentas; 2. VLP de Q\beta sin tratar; 3. VLP de Q\beta tratadas con ARNasa A en tampón HBS 1x pH 7,2. (C, D) 1. Escalera de ADN de 1 kb de MBI Fermentas; 2. VLP de Q\beta sin tratar; 3. VLP de Q\beta tratadas con ARNasa A en tampón HBS 0.2x a pH 7,2.

La Figura 26 representa el análisis del empaquetamiento de B-CpG en VLP de Q\beta a fuerza iónica reducida y elevada en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (A) y Azul de Coomassie (B). Se cargan en el gel las siguientes muestras: 1. VLP de Q\beta sin tratar; 2. VLP de Q\beta tratadas con ARNasa A; 3. VLP de Q\beta tratadas con ARNasa A y empaquetadas con B-CpG en tampón HBS 0,2x a pH 7,2 y tratadas con Benzonasa; 4. VLP de HBx33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con B-CpG en tampón HBS 1x a pH 7,2 y tratadas con Benzonasa.

La Figura 27 representa el análisis del empaquetamiento B-CpGpt en VLP de Qbx33 en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (A) y Azul de Coomassie (B). Se cargan en el gel 50 \mug de las siguientes muestras: 1. VLP de Qbx33 sin tratar; 2. VLP de Qbx33 tratadas con ARNasa A; 3. VLP de Qbx33 tratadas con ARNasa A y empaquetadas con B-CpGpt; 4. VLP de Qbx33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con B-CpGpt, tratadas con ADNasaI y dializadas; 5. Escalera de ADN de MBI Fermentas de 1 kb. La (C) representa el análisis de la cantidad de oligonucleótido empaquetado extraído de la VLP en TBR/urea al 15% teñido con CYBR Gold. Se cargan en el gel las siguientes muestras: 1. Contenido de oligonucleótido BCpGpt de 2 \mug de VLP de Qbx33 después de la digestión con proteinasa K y del tratamiento con ARNasa A; 2. Control de BCpGpt 20 pmol; 3. Control de BCpGpt 10 pmol; 4. Control de BCpGpt 5 pmol.

Las Figuras 27D y E representan el análisis del empaquetamiento de g10gacga-P0 en VLP de Qbx33 en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (D) y Azul de Coomassie (E). Se cargan en el gel 15 \mug de las siguientes muestras: 1. Escalera de ADN de 1 kb de MBI Fermentas; 2. VLP de Qbx33 sin tratar; 3. VLP de Qbc33 tratadas con ARNasa A; 4. VLP de Qbx33 tratadas con ARNasa A y empaquetas con g10gacga-P0; 5. VLP de Qbx33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con g10gacga-P0, tratadas con Benzonasa y dializadas.

Las Figuras 27E y F representan el análisis del empaquetamiento de dsCyCpG-253 en VLP de Qbx33 en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (E) y Azul de Coomassie (F). Se cargan en el gel 15 \mug de las siguientes muestras: 1. Escalera de ADN de 1 kb de MBI Fermentas; 2. VLP de Qbx33 sin tratar; 3. VLP de Qbx33 tratadas con ARNasa A; 4. VLP de Qbx33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con dsCyCpG-253 y tratadas con ADNasaI; 5. VLP de Qbx33 tratadas con ARNasa A, empaquetadas con dsCyCpG-253, tratadas con ADNasaI y dializa-
das.

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Ejemplo 14

Desensamblaje, Reensamblaje y Empaquetamiento de Ácidos Nucleicos Inmunoestimuladores en Q\beta Desensamblaje y Reensamblaje de VLP de Q\beta

Desensamblaje: 70 mg de VLP de Q\beta liofilizadas puras dieron un contenido de proteína de aproximadamente 35 mg de acuerdo con la determinación espectrofotométrica usando el resultado promedio obtenido con las tres fórmulas siguientes: 1. (183 * DO^{230\ nm} - 75,8 * DO^{260\ nm}) * volumen (ml) -2. ((DO^{235\ nm} - DO^{280\ nm})/2,51) x volumen -3. ((DO^{228.5\ nm} - DO^{234.5\ nm}) * 0,37) x volumen. Las VLP de Q\beta liofilizadas puras se solubilizaron en 7 ml de GuHCl 6 M y se incubaron durante una noche a 4ºC. La solución se aclaró durante 15 minutos a 6000 rpm (Eppendorf 5810 R, en rotor de ángulo fijo F34-6-38, usado en todas las etapas siguientes). Se desechó un sedimento insignificante y el sobrenadante se dializó 5 veces contra 200-300 ml de tampón NET (Tris-HCl 20 mM, pH 7,8 con EDTA 5 mM y NaCl 150 mM) durante 3 días. Como alternativa, el sobrenadante se dializó de un modo continuo contra 1,5 l de tampón NET durante 3-4 días. La suspensión resultante se centrifugó a 12000 rpm durante 20 minutos. El sedimento se volvió a solubilizar en 2-3 ml de urea 8 M mientras que el sobrenadante se precipitó con sulfato de amonio sólido a una saturación del 60%. Se añadió solución de sulfato de amonio saturado al sedimento previamente vuelto a solubilizar en urea hasta una saturación del 60% y la solución se dejó precipitar 4 días a 4ºC, con posterior centrifugación a 12000 rpm durante 20 minutos. Este sedimento y el sedimento del sobrenadante inicial se volvieron a solubilizar y se unieron en un volumen total de 3 ml de urea 7 M, DTT 10 mM. Este material se cargó en una columna de Sephadex G75, se eluyó a 2 ml/h con urea 7 M, DTT 10 mM. Se aislaron dos picos. Un pico de alto peso molecular precedía a un pico de menor peso molecular aparente. El calibrado de la columna con quimiotripsina en el mismo tampón de elución puso de manifiesto que el peso molecular aparente del segundo pico concuerda con que la proteína de cubierta de Q\beta esté en forma dimérica. Las fracciones que contenían este material dimérico se combinaron y se precipitaron con sulfato de amonio (2 días, a 4ºC). El sedimento se lavó con unas pocas gotas de agua, se centrifugó de nuevo y se solubilizó en 2 ml de urea 7 M, DTT 10 mM. Este material se purificó después en una columna de Sepharose 4B corta (1,5 X 27 cm). Se eluyó un pico de la columna y las fracciones se combinaron, conduciendo una preparación de proteína con un volumen de 10 ml y una relación de absorbancia a 280 nm frente a 260 nm de 0,68/0,5, dando aproximadamente 450 nmol de proteína de cubierta de Q\beta (dando un máximo de 2,5 nmol de VLP después del reensamblaje, considerando que hay 180 subunidades en la VLP) y una concentración de proteína de 630 \mug/ml (calculada usando los métodos espectrofotométricos descritos anteriormente).

Reensamblaje: Se añadió \beta-mercaptoetanol a la fracción de dímero de 10 ml hasta una concentración final del 10% y se añadieron 300 \mul de una solución de oligodesoxinucleótido (CpG)_{20}OpA que contenía 12,3 nmol de oligonucleótido. La mezcla de reensamblaje se dializó primero contra 30 ml de tampón NET que contenía beta-mercaptoetanol al 10% durante 2 horas a 4ºC y después se dializó de modo continuo con un flujo de tampón NET de 8 ml/h durante 4 días a 4ºC. La mezcla de reensamblaje se desalinizó después contra agua mediante diálisis, con 6 intercambios de tampón (4 x 100 ml, 2 x 1 litro).

La relación de absorbancia a 280 nm frente a 260 nm era de 0,167/0,24. La proteína se secó por liofilización. La proteína seca se volvió a solubilizar en agua y se purificó por ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa en una centrífuga Beckman L 8-80 con el rotor SW 50.1 a 22000 rpm durante 17 h a +4ºC. La purificación en gradiente de sacarosa se realizó de la forma siguiente. Se dispensaron 5 fases de 1 ml de las siguientes concentraciones de sacarosa (p/v) en un tubo de centrífuga: 50%, 43%, 36%, 29% y 22%. La sucesión de fases formada de este modo se dejó reposar durante una noche a 4ºC. Se estratificaron 0,5 ml de la muestra de proteína en el gradiente y se centrifugaron durante 17 h como se ha indicado anteriormente. El gradiente se eluyó desde el fondo del tubo de centrífuga y los 5 ml del gradiente se dividieron en 16 fracciones de aproximadamente 300 \mul. Las fracciones del gradiente se analizaron mediante SDS-PAGE (Figura 28) y ensayo de Ouchterlony. Las fracciones 6-9 contenían proteína de cubierta de Q\beta y proporcionaban la banda de precipitación típica de VLP de Q\beta en un ensayo de Ouchterlony. Las fracciones 11-15, con una menor densidad aparente y que contenían proteína de Q\beta no dieron banda de cápside en el ensayo de Ouchterlony. La Q\beta reensamblada tenía la misma densidad aparente que la Q\beta wt dentro del margen de error experimental. Las fracciones 6-9 del gradiente de sacarosa se combinaron, se dializaron contra agua y se liofilizaron. Este material se volvió a solubilizar después para análisis de microscopía electrónica (EM) (Figura 29) y ensayo de Ouchterlony (Figuras 30 A y B). El procedimiento de EM era el siguiente: Se absorbió una suspensión de las proteínas sobre rejillas recubiertas con carbono-formvar y se tiñó con ácido fosfotúngstico al 2% (pH 6,8). Las rejillas se examinaron con un microscopio electrónico JEM 100C (JEOL, Japón) a un voltaje de aceleración de 80 kV. Se realizaron registros fotográficos (negativos) en una película de imagen electrónica Kodak y se obtuvieron micrografías electrónicas por impresión de negativos en papel Polymax de Kodak. Ambos métodos indican que las VLP reensambladas tienen las mismas propiedades macromoleculares que la VLP de Q\beta intacta. Además, el patrón de enlaces disulfuro presentado por la VLP de Q\beta reensamblada purificada es indistinguible del patrón de enlaces disulfuro presentado por la VLP de Q\beta sin tratar con el patrón típico de pentámeros y hexámeros (Figura 31
A).

Análisis del contenido de ácido nucleico: Se digirieron VLP de Q\beta reensambladas con ADNasa I pancreática de la forma siguiente. A 200 \mul de una solución de 0,5 mg/ml de VLP de Q\beta reensambladas con oligodesoxinucleótido (CpG)_{20}OpA se añadieron 20 \mul de una solución de ADNasa I (Fluka) 1 U/\mul y 22 \mul de tampón de ADNasa I (MgCl_{2} 20 mM, Tris 200 mM, pH 8,3). La mezcla de reacción se incubó durante 2 h 30 min a 37ºC. El contenido de ácido nucleico de la muestra se aisló posteriormente mediante extracción con fenol/cloroformo y se cargó en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio (Figura 31B). Se detectó en el gel una banda del tamaño del oligodesoxinucleótido empaquetado. También era visible una banda que migraba a un peso molecular aparente superior. No se puede excluir la presencia de multímeros del oligodesoxinucleótido (CpG)_{20}OpA que conducirían a una banda a esta altura. El gel muestra por lo tanto que estaban presentes oligodesoxinucleótidos protegidos frente a ADNasa I del tamaño correcto en las VLP de Q\beta reensambladas puesto que los oligodesoxinucleótidos podían digerirse posteriormente mediante ADNasa I pero no mediante ARNasa A. Por lo tanto, podían empaquetarse con éxito oligodesoxinucleótidos en VLP de Q\beta después del desensamblaje inicial de la VLP, de la purificación de la proteína de cubierta desensamblada de ácidos nucleicos y del posterior reensamblaje de la VLP en presencia de oligodesoxinu-
cleótido.

La Figura 28 muestra el análisis de SDS-PAGE de las fracciones de la centrifugación en gradiente de sacarosa. Se cargaron en los geles las siguientes muestras. Carriles 1-10: fracciones 6-15 de la ultracentrifugación en gradiente de sacarosa.

La Figura 29 muestra las fotografías de EM de (A) VLP de Q\beta intactas y (B) VLP de Q\beta después del desensamblaje y reensamblaje en presencia de oligonucleótido (CpG)_{20}OpA y de la posterior purificación mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. Se observa un denso revestimiento de cápsides y esas cápsides presentan las mismas características estructurales y propiedades que las VLP de Q\beta intactas.

La Figura 30 muestra el análisis de Ouchterlony (inmunodifusión) de la VLP de Q\beta reconstruida. En la Figura 30A, las VLP de Q\beta reensambladas con oligonucleótido (CpG)20OpA se cargaron al lado de VLP de Q\beta intactas. Las dos bandas de precipitación características se indican mediante flechas negras. Las dos bandas de precipitación son concurrentes indicando que la VLP de Q\beta reensamblada difunde igual que la VLP de Q\beta intacta. En la Figura 30B, la muestra 1 es VLP de Q\beta reensamblada en presencia de ARN ribosómico mientras que la muestra 2 es VLP de Q\beta intacta y la muestra 3 es VLP de Q\beta reensamblada con oligonucleótido (CpG)20OpA. Las bandas de precipitación se indican mediante flechas blancas.

La Figura 31A muestra el análisis de la VLP de Q\beta sin tratar y reensamblada mediante SDS-PAGE no reductor. Los pentámeros y hexámeros de VLP de Q\beta se indican mediante flechas.

La Figura 31B muestra el análisis de electroforesis en gel de agarosa del contenido de nucleótidos extraídos después de la digestión con ADNasa I de VLP de Q\beta reensambladas con oligonucleótido (CpG)200pA. El contenido de ácido nucleico era sin tratar (carril 1) o digeridas posteriormente con ADNasa I (carril 2) o ARNasa A (carril 3); se cargaron 33 \mug de VLP de Q\beta reensambladas en cada carril. Se cargaron 300 ng de un oligonucleótido de 50 pb en el carril 4 mientras que se cargaron 10 \mul de la escalera de ADN de 100 pb de GeneRuler + marcador (MBI Fermentas) en el carril 5.

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Ejemplo 15

Desensamblaje y Reensamblaje de Q\beta con diferentes ácidos nucleicos inmunoestimuladores Desensamblaje y Reensamblaje de VLP de Q\beta con oligodesoxinucleótidos de diversas secuencias

El desensamblaje de VLP de Q\beta se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, excepto por el uso de urea 8 M en lugar de urea 7 M para resuspender los sedimentos de sulfato de amonio.

El reensamblaje de VLP de Q\beta con los oligonucleótidos CyOpA, CyCyCy, (CpG)20-OpA y CyCpG se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, excepto por las variaciones siguientes. Se añadió una etapa de diálisis contra \beta-mercaptoetanol al 10% en tampón NET (Tris-HCl 20 mM, pH 7,8 con EDTA 50 mM y NaCl 150 mM) durante 1 hora a 4ºC al procedimiento antes de la adición de la solución de oligodesoxinucleótido a la solución de dímero en la bolsa de diálisis. Después se añadieron los desoxioligonucleótidos a las soluciones de dímeros dando como resultado aproximadamente un exceso molar de diez veces de oligonucleótido respecto a cápside (180 subunidades), como se ha descrito anteriormente. La mezcla de reensamblaje se dializó primero contra 30 ml de tampón NET que contenía \beta-mercaptoetanol al 10% durante 1 hora a 4ºC y después se dializó de modo continuo con un flujo de tampón NET de 8 ml/h durante 4 días a 4ºC. Se tomó una muestra de la reacción de reensamblaje de VLP de Q\beta con oligodesoxinucleótido CyOpA para análisis de EM (Figura 32) al final de la reacción de reensamblaje. Se usó el procedimiento de EM que usa ácido fosfotúngstico y se ha descrito anteriormente. Las mezclas de reensamblaje se desalinizaron después contra agua mediante diálisis y se secaron.

La proteína seca se volvió a solubilizar en agua y se purificó mediante ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa. Las VLP de Q\beta reensambladas purificadas también se analizaron mediante EM (Figura 33A-D). Las micrografías electrónicas indican que las VLP reensambladas tienen las mismas propiedades macromoleculares que la VLP de Q\beta intacta. La purificación enriquece notablemente las preparaciones para partículas reensambladas. Por lo tanto, las VLP de Q\beta se reensamblaron con éxito con oligodesoxinucleótidos de diversas longitudes y secuencias.

Acoplamiento del péptido p-33 con VLP de Q\beta reensamblada: se hizo reaccionar VLP de Q\beta reensambladas con el oligodesoxinucleótido CyOpA a una concentración de 1,5 mg/ml con el entrecruzante SMPH diluido a partir de una solución madre en DMSO a una concentración final de entrecruzante de 536 \muM durante 35 minutos a 26ºC en Hepes 20 mM a pH 7,4. La VLP de Q\beta derivatizada se dializó 2 x 2 horas contra mil volúmenes de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. La VLP de Q\beta derivatizada dializada a una concentración de 1,4 mg/ml se hizo reaccionar posteriormente con el péptido p33GGC (secuencia: KAVYNFATMGGC) a una concentración final de péptido de 250 \muM durante 2 horas a 15ºC en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. El gel de la Figura 34 indica el acoplamiento con éxito del péptido p33 con VLP de Q\beta. Las bandas de acoplamiento correspondientes a uno, respectivamente dos péptidos acoplados por su unidad se indican mediante una flecha en la Figura.

Análisis del contenido de ácido nucleico: El contenido de ácido nucleico de VLP de Q\beta reensamblada y acoplada se analizó mediante digestión con proteinasa K, extracción con fenol cloroformo y posterior carga del oligonucleótido extraído en un gel de PAGE en TBE/urea. El procedimiento de análisis era el siguiente. Se complementaron 25 \mul de VLP de Q\beta reensambladas (0,5-1 mg/ml) con 0,5 \mul de proteinasa K, 1,5 \mul de SDS al 10% y 3 \mul de tampón de proteinasa 10x (NaCl 0,5 M, EDTA 50 mM, Tris 0,1 M pH 7,4). Después de la incubación durante una noche a 37ºC se inactivó la proteinasa K por calentamiento 20 min a 65ºC y el contenido de ácido nucleico se extrajo de las muestras mediante extracción con fenol 1x y cloroformo 1x. Posteriormente, las muestras se incubaron 2 h a 37ºC con 1 \mul de ARNasa A (Qiagen, 100 \mul/ml, diluida 250x). El equivalente de 2 \mug de proteína de partida se calentó 3 min a 95ºC con 1 volumen de tampón de carga 2x (1 ml de TBE 10x, 4,2 g de Urea, 1,2 g de Ficoll, 1 ml de azul de Bromofenol al 0,1%, H_{2}O hasta 10 ml) y se cargó en un gel de poliacrilamida en TBE/urea al 15% (Invitrogen). El gel se procesó durante 1,5 h a 180 V y se fijó en ácido acético al 10%/etanol al 20% y se tiñó con CYBR Gold (Molecular Probes, Eugene ,OR, Estados Unidos). Para la cuantificación, se aplicaron 10 y 20 pmol del oligonucleótido usado para el reensamblaje en el gel como referencia. La resistencia del contenido de ácido nucleico a ARNasa y su tamaño y su tamaño demostraron que el ácido nucleico empaquetado era el oligonucleótido usado para el reensamblaje. La cuantificación del oligodesoxinucleótido empaquetado se realizó por comparación de la intensidad de banda del oligonucleótido extraído con la intensidad de banda de una cantidad de referencia del mismo oligonucleótido cargado en el mismo gel. Se obtuvo una cifra de 1,75 nmol de CyOpA/100 \mug de VLP de Q\beta, dando una proporción de 44 oligonucleótidos por VLP de
promedio.

La Figura 32 representa micrografías electrónicas de la reacción de reensamblaje de la VLP de Q\beta con el oligonucleótido CyOpA antes de la purificación. Los aumentos eran de 200000 veces.

Las Figuras 33 A-D muestran las micrografías electrónicas de las reacciones de reensamblaje purificadas de VLP de Q\beta con los oligodesoxinucleótidos Cy(CpG)20 (A), CyCyCy (B), CyCpG (C) y CyOpA (D). Los aumentos eran de 200000 veces.

La Figura 34 representa el análisis de SDS-PAGE del acoplamiento de VLP de Q\beta reensambladas con el oligodesoxinucleótido CyOpA con el péptido p33GGC. Se cargan en el gel la siguientes muestras: 1. Marcador de proteínas preteñido, Amplio Intervalo (Nº 7708S) 10 \mul; 2. VLP de Q\beta reensambladas con CyOpA [1,5 mg/ml], 10 \mul; 3. VLP de Q\beta reensambladas con CyOpA [1,5 mg/ml] y derivatizadas con SMPH, 10 \mul; 4. VLP de Q\beta reensambladas con CyOpA [1,5 mg/ml], derivatizadas con SMPH y acopladas con péptido p33, 10 \mul; 5. VLP de Q\beta reensambladas con CyOpA [1,5 mg/ml], derivatizadas con SMPH y acopladas con péptido p33, 1/5 del volumen del sedimen-
to.

La Figura 35 representa el análisis de los oligodesoxinucleótidos empaquetados extraídos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con urea teñido con CYBR Gold. Los siguientes ejemplos se cargaron en el gel: 1. VLP de Q\beta reensambladas con oligonucleótido CyOpA y acopladas con péptido p33 GGC, 2 \mug de proteína cargados en el gel. 2. VLP de Q\beta reensambladas con oligonucleótido CyOpA y acopladas con péptido p33GGC, congeladas y descongeladas antes de la carga en el gel, 2 \mug de proteína. 3. VLP de Q\beta reensambladas con oligonucleótido Cy(CpG)_{20} y acopladas con péptido p33GGC, congeladas y descongeladas antes de la carga en el gel; 2 \mug de proteína. 4. Oligonucleótido CyOpA, 20 pmol. 5. Oligonucleótido CyOpA, 10 pmol.

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Ejemplo 16

Desensamblaje, Reensamblaje y Empaquetamiento de Q\beta Desensamblaje y Reensamblaje de VLP de Q\beta

Desensamblaje: Se precipitaron 10 mg de VLP de Q\beta (como se determinó por análisis de Bradford) en HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM con sulfato de amonio sólido a una saturación final del 60%. La precipitación se realizó durante una noche a 4ºC y las VLP precipitadas se sedimentaron mediante centrifugación durante 60 minutos a 4ºC (rotor SS-34). Los sedimentos se resuspendieron en 1 ml de clorhidrato de guanidina 6 M (GuHCl) que contenía DTT 100 mM (concentración final) y se incubaron durante 8 h a 4ºC.

Purificación de proteína de cubierta de Q\beta mediante cromatografía de exclusión por tamaños: La solución se aclaró durante 10 minutos a 14000 rpm (Eppendorf 5417 R, en rotor de ángulo fijo, F45-30-11, usado en todas las etapas siguientes) y se dializó contra un tampón que contenía urea 7 M, Tris HCl 100 mM, pH 8,0, DTT 10 mM (2000 ml) durante una noche. El tampón de diálisis se intercambió una vez y se continuó con la diálisis durante otras 2 h. La suspensión resultante se centrifugó a 14000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Se desechó un sedimento insignificante y el sobrenadante se mantuvo como "fracción de carga" que contenía proteína de cubierta desensamblada y ARN. Se determinó la concentración de proteína mediante análisis de Bradford y se aplicaron 5 mg de proteína total en una columna de calidad de 75 preparaciones HiLoad^{TM} Superdex^{TM} (26/60, Amersham Biosciences) equilibrada con urea 7 M, Tris HCl 100 mM y DTT 10 mM. Se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño con el tampón de equilibrado (urea 7 M, Tris HCl 100 mM a pH 8,0, DTT 10 mM) a 12ºC con un caudal de 0,5 ml/min. Durante la elución se controló la absorbancia a 254 nm y 280 nm. Se aislaron dos picos. Un pico de alto peso molecular precedía a un pico de menor peso molecular aparente. Los picos se recogieron en fracciones de 1,5 ml y se analizaron las alícuotas mediante SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie así como tinción con SYBR®Gold (Figura
36).

Purificación de proteína de cubierta de Q\beta mediante cromatografía de intercambio iónico: Como alternativa, el sobrenadante aclarado se dializó contra un tampón que contenía urea 7 M, MES 20 mM, DTT 10 mM, pH 6,0 (2000 ml) durante una noche. El tampón de diálisis se intercambió una vez y se continuó con la diálisis durante otras 2 h. La suspensión resultante se centrifugó a 14000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Se desechó un sedimento insignificante y el sobrenadante se mantuvo como "fracción de carga" que contenía proteína de cubierta desensamblada y ARN. Se determinó la concentración de proteína mediante análisis de Bradford y se diluyeron 10 mg de proteína total a un volumen final de 10 ml con tampón A (véase a continuación) y se aplicó con un caudal de 1 ml/min a una columna HiTrap^{TM} SP HP de 1 ml (Amersham Biosciences, Nº Cat. 17-1151-01) equilibrada con tampón A: urea 7 M, MES 20 mM, DTT 10 mM, pH 6,0. El flujo a través que contenía el ARN se recogió como una fracción. Después, la columna se lavó exhaustivamente con tampón A (30 CV), se eluyó la proteína de cubierta de Q\beta unida en un gradiente lineal de tampón B del 0%-100% (la longitud de gradiente era de 5 CV; tampón A: véase anteriormente, tampón B: urea 7 M, MES 20 mM, DTT 10 mM, NaCl 2 M, pH 6,0). Durante la carga, el lavado y la elución se controló la absorbancia a 254 nm y 280 nm. Se recogieron fracciones de picos de 1 ml y se analizaron mediante SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie así como tinción con SYBR®Gold. Se identificaron las fracciones que contenían la proteína de cubierta de Q\beta pero no el ARN y se ajustó el pH por adición de 100 \mul de Tris HCl 1 M, pH
8,0.

Las muestras que contenían la proteína de cubierta de Q\beta pero no ARN se combinaron y se dializaron contra urea 0,87 M, Tris HCl 100 mM, DTT 10 mM (2000 ml) durante una noche y el tampón se intercambió una vez y se continuó con la diálisis durante otras 2 h. La suspensión resultante se centrifugó a 14000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Se desechó un sedimento insignificante y el sobrenadante se mantuvo como "proteína de cubierta desensamblada". La concentración de proteína se determinó mediante análisis de Bradford.

Reensamblaje: Se usó proteína de cubierta de Q\beta purificada con una concentración de 0,5 mg/ml para el reensamblaje de VLP en presencia de un oligodesoxinucleótido. Para la reacción de reensamblaje, se usó el oligodesoxinucleótido en un exceso de diez veces sobre la cantidad teórica calculada de cápsides de VLP de Q\beta (concentración de monómero dividida por 180). Después de que la proteína de cubierta de Q\beta se mezclara con el oligodesoxinucleótido a empaquetar durante la reacción de reensamblaje, esta solución (volumen de hasta 5 ml) se dializó primero durante 2 h contra 500 ml de tampón NET que contenía \beta-mercaptoetanol al 10% a 4ºC, después se dializó de modo continuo con un flujo de tampón NET de 8 ml/h durante 72 h a 4ºC y por último durante otras 72 h con el mismo modo continuo con un tampón compuesto por Tris HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM. La suspensión resultante se centrifugó a 14000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Se desechó un sedimento insignificante y el sobrenadante contenía las VLP reensambladas y empaquetadas. Se determinó la concentración de proteína mediante análisis de Bradford y si era necesario se concentraron las VLP reensambladas y empaquetadas con dispositivos de centrífuga con filtro (Millipore, UFV4BCC25, 5K NMWL) a una concentración de proteína final de 3 mg/ml.

Purificación de VLP reensambladas y empaquetadas: Se cargaron hasta 10 mg de proteína total en una columna de Sepharose^{TM} CL-4B (16/70, Amersham Biosciences) equilibrada con HEPES 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM. Se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño con el tampón de equilibrado (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM) a temperatura ambiente con un caudal de 0,4 ml/min. Durante la elución se controló la absorbancia a 254 nm y 280 nm. Se aislaron dos picos. Un pico de alto peso molecular precedía a un pico de menor peso molecular aparente. Se recogieron fracciones de 0,5 ml y se analizaron mediante SDS-PAGE seguido de tinción con Azul de Coomassie (Figura 37). El calibrado de la columna con cápsides de Q\beta intactas y altamente purificadas de E. coli puso de manifiesto que el peso molecular aparente del primer pico principal concuerda con cápsides de Q\beta.

Análisis de VLP de Q\beta que se habían reensamblado en presencia de oligonucleótidos

A) Estructura global de las cápsides: Se analizaron VLP de Q\beta que se reensamblaron en presencia de uno de los siguientes oligodesoxinucleótidos (CyOpA, Cy(CpG)200pA, Cy(CpG)20, CyCyCy, (CpG)200pA) o en presencia de ARNt de E. coli (Roche Molecular Biochemicals, Nº Cat. 109541) mediante microscopía electrónica (tinción negativa con uranilacetato a pH 4,5) y se compararon con VLP de Q\beta intactas purificadas a partir de E. coli. Como control negativo sirvió una reacción de reensamblaje en la que se omitió el ácido nucleico. Las cápsides reensambladas presentan las mismas características estructurales y propiedades que las VLP de Q\beta intactas (Figura 38).

B) Tamaño hidrodinámico de cápsides reensambladas: Se analizaron cápsides de Q\beta que se habían reensamblado en presencia de oligodesoxinucleótidos mediante dispersión de luz dinámica (DLS) y se compararon con VLP de Q\beta intactas que se habían purificado a partir de E. coli. Las cápsides reensambladas mostraban el mismo tamaño hidrodinámico (que depende tanto de la masa como de la conformación) que las VLP de Q\beta intactas.

C) Formación de enlaces disulfuro en cápsides reensambladas: Se analizaron VLP de Q\beta reensambladas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativo y se compararon con VLP de Q\beta intactas que se habían purificado a partir de E. coli. Las cápsides reensambladas presentaban el mismo patrón de enlaces disulfuro que las VLP de Q\beta intactas (Figura 39).

D) Análisis del contenido de ácido nucleico de las VLP de Q\beta que se habían reensamblado en presencia de oligodesoxinucleótidos mediante electroforesis en gel de agarosa: Se incubaron 5 \mug de VLP de Q\beta reensambladas en un volumen de reacción total de 25 \mul con 0,35 unidades de ARNasa A (Qiagen, Nº Cat. 19101), 15 unidades de ADNasa I (Fluka, Nº Cat. 31136) o sin ninguna adición adicional de enzimas durante 3 h a 37ºC. Las VLP de Q\beta intactas que se habían purificado a partir de E. coli sirvieron como control y se incubaron en las mismas condiciones que las descritas para las cápsides que se habían reensamblado en presencia de oligodesoxinucleótidos. Después las reacciones se cargaron en un gel de agarosa al 0,8% que se tiñó primero con bromuro de etidio (Figura 40A) y posteriormente con Azul de Coomassie (Figura 40B). La tinción con bromuro de etidio muestra que ninguna de las enzimas añadidas podía digerir el contenido de ácido nucleico en las cápsides de Q\beta reensambladas, demostrando que el contenido de ácido nucleico (es decir, los oligodesoxinucleótidos) estaba protegido. Este resultado indica que los oligodesoxinucleótidos añadidos se empaquetaron en las cápsides recién formadas durante la reacción de reensamblaje. Por el contrario, el contenido de ácido nucleico en las VLP de Q\beta intactas que se habían purificado a partir de E. coli se degradaba tras la adición de ARNasa A, indicando que el contenido de ácido nucleico en estas VLP consiste en ARN. Además, tanto la tinción con bromuro de etidio como la tinción con Azul de Coomassie del gel de agarosa muestra que las VLP de Q\beta que contienen ácido nucleico (reensambladas y purificadas a partir de E. coli, respectivamente) están migrando a aproximadamente al mismo tamaño, lo que indica que la reacción de reensamblaje conducía a VLP de Q\beta de un tamaño comparable a las VLP de Q\beta intactas que se habían purificado a partir de E. coli. Por lo tanto, el gel muestra que estaban presentes oligodesoxinucleótidos protegidos frente a ADNasa I en las VLP de Q\beta reensambladas. Además, después de que se hubieran extraído los oligodesoxinucleótidos empaquetados mediante fenol/cloroformo podían digerirse mediante ADNasa I, pero no mediante ARNasa A. Por lo tanto, los oligodesoxinucleótidos podían empaquetarse con éxito en VLP de Q\beta después del desensamblaje inicial de la VLP, de la purificación de la proteína de cubierta desensamblada de ácidos nucleicos y del posterior reensamblaje de las VLP en presencia de oligodesoxinucleótidos.

E) Análisis del contenido de ácido nucleico de las VLP de Q\beta que se habían reensamblado en presencia de oligodesoxinucleótidos por electroforesis en gel de poliacrilamida en TBE-Urea desnaturalizante: Se incubaron 40 \mug de VLP de Q\beta reensambladas (0,8 mg/ml) en un volumen de reacción total de 60 \mul con proteinasa K 0,5 mg/ml (calidad de PCR, Roche Molecular Biochemicals, Nº Cat. 1964364) y un tampón de reacción de acuerdo con las instrucciones del fabricante durante 3 h a 37ºC. Las VLP de Q\beta intactas que se habían purificado a partir de E. coli sirvieron como control y se incubaron con proteinasa K en las mismas condiciones que las descritas para las cápsides que se habían reensamblado en presencia de oligodesoxinucleótidos. Después las reacciones se mezclaron con un tampón de muestras de TBE-Urea y se cargaron en un gel de poliacrilamida en TBE-Urea al 15% (Novex®, Invitrogen Nº Cat. EC6885). Como patrón cualitativo así como cuantitativo, se cargaron 1 pmol, 5 pmol y 10 pmol del oligodesoxinucleótido que se usó para la reacción de reensamblaje en el mismo gel. Este gel se fijó con ácido acético al 10%, metanol al 20%, se equilibró a pH neutro y se tiñó con SYBR®-Gold (Molecular Probes Nº Cat. S-11494). La tinción con SYBR®-Gold mostraba (Figura 41) que las cápsides de Q\beta reensambladas contenían ácido nucleico que comigraba con los oligodesoxinucleótidos que se usaron en la reacción de reensamblaje. Obsérvese que las VLP de Q\beta intactas (que se habían purificado a partir de E. coli) no contenían un ácido nucleico de tamaño similar. En su conjunto, el análisis del contenido del ácido nucleico de las VLP de Q\beta que se habían reensamblado en presencia de oligodesoxinucleótidos mostraba que los oligodesoxinucleótidos estaban protegidos frente a la digestión con ADNasa I, lo que significa que estaban empaquetados y que los oligodesoxinucleótidos añadidos podían volver a aislarse por medios apropiados (por ejemplo, digestión con proteinasa K de la VLP de Q\beta).

La Figura 36 muestra la purificación de proteína de cubierta de Q\beta desensamblada mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Se mezclaron 5 \mul de las fracciones indicadas (Nº) con tampón de muestras y se cargaron en geles de Tris-Glicina al 16% (Novex® por Invitrogen, Nº Cat. EC64952). Después de terminarse el procesamiento los geles se tiñeron primero con azul de Coomassie (A) y después de documentarse los mismos geles se tiñeron con SYBR®-Gold (B). Obsérvese que el primer pico de alto peso molecular (fracciones Nº 15-Nº 20) no contenía proteínas sino ácidos nucleicos. Por otro lado, el segundo pico de menor peso molecular aparente contenía proteína de cubierta desensamblada que de este modo se separó de los ácidos nucleicos.

La Figura 37 muestra la purificación de VLP de Q\beta reensambladas mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Se mezclaron 10 \mul de las fracciones indicadas (Nº) con tampón de muestra y se cargaron en un gel de Tris-Glicina al 16% (Novex® por Invitrogen, Nº Cat. EC64952). Después de terminarse el procesamiento el gel se tiñó con azul de Coomassie. Debido a las condiciones reductoras, se redujeron los enlaces disulfuro y el monómero proteico de las VLP ensambladas es visible como una proteína de cubierta de 14 kDa.

La Figura 38 muestra micrografías electrónicas de VLP de Q\beta que se reensamblaron en presencia de diferentes oligodesoxinucleótidos. Las VLP se habían reensamblado en presencia de los oligodesoxinucleótidos indicados o en presencia de ARNt pero no se habían purificado hasta una suspensión homogénea mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Como control positivo sirvió una preparación de VLP de Q\beta "intactas" que se habían purificada a partir de E. coli. De forma importante, por adición de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados durante la reacción de reensamblaje, podían formarse VLP del tamaño y de la conformación correctas en comparación con el control "positivo". Esto implica que el proceso de reensamblaje en general es independiente de la secuencia de nucleótidos y de la longitud de los oligodesoxinucleótidos usados. Obsérvese que la adición de ácidos nucleicos durante la reacción de reensamblaje es necesaria para la formación de VLP de Q\beta puesto que no se habían formado partículas cuando se omitieron los ácidos nucleicos de la reacción de reensamblaje.

La Figura 39 muestra el análisis del patrón de enlaces disulfuro en cápsides de Q\beta reensambladas y purificadas. Se mezclaron 5 \mug de las cápsides indicadas con tampón de muestras que contenía o no un agente reductor y se cargaron en un gel de Tris-Glicina al 16%. Después de terminarse el procesamiento el gel se tiñó con azul de Coomassie. Cuando se comparaban con cápsides "intactas" purificadas a partir de E. coli, las VLP de Q\beta reensambladas presentaban el mismo patrón de enlaces disulfuro.

La Figura 40 muestra el análisis del contenido de ácido nucleico de las VLP de Q\beta reensambladas mediante tratamiento con nucleasa y electroforesis en gel de agarosa: se trataron como se indica 5 \mug de VLP de Q\beta reensambladas y purificadas y 5 \mug de VLP de Q\beta que se habían purificado a partir de E. coli, respectivamente. Después de este tratamiento, las muestras se mezclaron con colorante de carga y se cargaron en un gel de agarosa al 0,8%. Después del procesamiento el gel se tiñó primero con bromuro de etidio (A) y después de documentarse el mismo gel se tiñó con azul de Coomassie (B). Obsérvese que el contenido de ácido nucleico de las VLP de Q\beta reensambladas y purificadas era resistente frente a la digestión con ARNasa A mientras que el contenido de ácido nucleico de VLP de Q\beta purificadas a partir de E. coli se digirió tras la incubación con ARNasa A. Esto indica que el contenido de ácido nucleico de las cápsides de Q\beta reensambladas consistía en los oligodesoxinucleótidos que por supuesto estaban protegidos de la digestión con ARNasa A. Por lo tanto, los oligodesoxinucleótidos se empaquetaron en VLP de Q\beta durante la reacción de reensamblaje.

La Figura 41 muestra el análisis del contenido de ácido nucleico de las VLP de Q\beta reensambladas mediante tratamiento con proteinasa K y electroforesis en gel de poliacrilamida en TBE/Urea: El equivalente de 1 \mug de VLP de Q\beta que se habían digerido mediante tratamiento con proteinasa K se mezcló con un tampón de muestras de TBE-Urea y se cargó en un gel de poliacrilamida al 15% en TBE-Urea (Novex®, Invitrogen Nº Cat. EC6885). Como patrón cualitativo así como cuantitativo, se cargaron 1 pmol, 5 pmol y 10 pmol del oligodesoxinucleótido que se usó para la reacción de reensamblaje en el mismo gel. Después de completarse el procesamiento, el gel se fijó, se equilibró a un pH neutro y se tiñó con SYBR®-Gold (Molecular Probes Nº Cat. S-11494). Obsérvese que las VLP de Q\beta intactas (que se habían purificado a partir de E. coli) no contenían ácido nucleicos de un tamaño similar a los que se habían extraído de cápsides de Q\beta reensambladas. Además, los ácidos nucleicos aislados a partir de VLP reensambladas comigraban con los oligodesoxinucleótidos que se habían usado en la reacción de reensamblaje. Estos resultados confirmaban que los oligodesoxinucleótidos usados estaban empaquetados en cápsides de Q\beta reensambladas.

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Ejemplo 17

Desensamblaje-Purificación-Reensamblaje y Empaquetamiento de ácido nucleicos inmunoestimuladores en AP205 A. Desensamblaje y Reensamblaje de VLP de AP205 a partir de material capaz de reensamblarse sin la adición de oligonucleótido

Desensamblaje: Se volvieron a solubilizar 40 mg de VLP de AP205 purificadas liofilizadas en 4 ml de GuHCl 6 M y se incubaron durante una noche a 4ºC. La mezcla de desensamblaje se centrifugó a 8000 rpm (Eppendorf 5810 R, rotor de ángulo fijo F34-6-38, usado en todas las etapas siguientes). El sedimento se volvió a solubilizar en urea 7 M mientras que el sobrenadante se dializó 3 días contra tampón NET (Tris-HCl 20 mM, pH 7,8, EDTA 5 mM y NaCl 150 mM) con 3 cambios de tampón. Como alternativa, se realizó una diálisis de modo continuo durante 4 días. La solución dializada se centrifugó a 8000 rpm durante 20 minutos y el sedimento se volvió a solubilizar en urea 7 M mientras que el sobrenadante se sedimentó con sulfato de amonio (saturación del 60%) y se volvió a solubilizar en un tampón de urea 7 M que contenía DTT 10 mM. Los sedimentos anteriores vueltos a solubilizar todos en urea 7 M se unieron y se precipitaron con sulfato de amonio (saturación del 60%) y se volvieron a solubilizar en un tampón de urea 7 M que contenía DTT 10 mM. Los materiales vueltos a solubilizar en el tampón de urea 7 M que contenía DTT 10 mM se unieron y se cargaron en una columna Sephadex G75 equilibrada y se eluyeron con el tampón de urea 7 M que contenía DTT 10 mM a 2 ml/h. Se eluyó un pico de la columna. Se recogieron fracciones de 3 ml. Las fracciones de picos que contenían proteína de cubierta de AP205 se combinaron y se precipitaron con sulfato de amonio (saturación del 60%). El sedimento se aisló por centrifugación a 8000 rpm durante 20 minutos. Se volvió a solubilizar en urea 7 M, DTT 10 mM y se cargó en una columna de Sepharose 4B corta (Sepharose 4B de 1,5 X 27 cm, 2 ml/h, urea 7 M, DTT 10 mM como tampón de elución). Se eluyó de la columna principalmente un pico con un hombro pequeño. Se identificaron las fracciones que contenían la proteína de cubierta de AP205 mediante SDS-PAGE y se combinaron excluyendo el hombro. Esto produjo una muestra de 10,3 ml. La concentración de proteína se estimó espectrofotométricamente por medición de una alícuota de proteína diluida 25 veces para la medición usando la siguiente fórmula: (1,55 x DO280 - 0,76 x DO260) x volumen. La concentración media era de 1 nmol/ml de VLP (2,6 mg/ml). La relación de absorbancia 280 nm frente a 260 nm era de 0,12/0,105.

Reensamblaje: Se añadieron 1,1 ml de beta-mercaptoetanol a la muestra y se prepararon las siguientes reacciones de reensamblaje:

1.

1 ml de cubierta de AP205 sin ácidos nucleicos

2.

1 ml de proteína de cubierta de AP205, ARNr (aproximadamente 200 unidades DO260, 10 nmol)

3.

9 ml de proteína de cubierta de AP205, CyCpG (370 \mul de una solución 225 pmol/\mul, es decir 83 nmol).

Estas mezclas se dializaron 1 hora contra 30 ml de tampón NET que contenía beta-mercaptoetanol al 10%. La mezcla que no contenía ácidos nucleicos se dializó por separado. Después se prosiguió con la diálisis de un modo continuo y se intercambiaron 11 de tampón NET durante 3 días. Las mezclas de reacción se dializaron posteriormente exhaustivamente contra agua (5 cambios de tampón) y se liofilizaron. Se volvieron a solubilizar en agua y se analizaron mediante EM. Todas las mezclas contenían cápsides, demostrando que el reensamblaje de VLP de AP205 es independiente de la presencia de ácidos nucleicos detectables, como se midió mediante electroforesis en gel de agarosa usando tinción con bromuro de etidio. El análisis de EM de AP205 reensambladas con CyCpG se muestra en la Figura 42B. El procedimiento de EM era el siguiente: se absorbió una suspensión de las proteínas sobre rejillas recubiertas con carbono-formvar y se tiñó con ácido fosfotungstíco al 2% (pH 6,8). Las rejillas se examinaron con un microscopio electrónico JEM 100C (JEOL, Japón) a un voltaje de aceleración de 80 kV. Se realizaron registros fotográficos (negativos) en una película de imagen electrónica de Kodak y se obtuvieron micrografías electrónicas por impresión de los negativos en papel Polymax de Kodak. Las VLP reensambladas en presencia del CyCpG se purificaron sobre una columna de Sepharose 4B (1 X 50 cm) eluida con tampón NET (1 ml/h). Las fracciones se analizaron mediante ensayo de Ouchterlony y se combinaron las reacciones que contenían VLP. Esto dio como resultado una muestra de 8 ml que se desalinizó contra agua mediante diálisis y se secó. La producción de cápside era de 10 mg. El análisis del material vuelto a solubilizar en un gel de agarosa al 0,6% teñido con bromuro de etidio mostraba que las cápsides estaban vacías de ácidos nucleicos. Las muestras de la reacción de reensamblaje que contenía CyCpG tomadas después de la etapa de reensamblaje y antes de la diálisis exhaustiva se analizaron en un gel de agarosa al 0,6% y se muestra en las Figuras 43A y B. Podía obtenerse una banda que migraba a la misma altura que la VLP de AP205 intacta y que se teñía tanto con bromuro de etidio como con tinción con azul de Coomassie, demostrando que se habían reensamblado VLP de AP205 que contenían oligodesoxinucleótidos. Es probable que las etapas de diálisis exhaustiva después del procedimiento de reensamblaje hayan conducido a la difusión del oligodesoxinucleótido fuera de las VLP. De forma significativa, las VLP de AP205 también podían reensamblarse en ausencia de oligodesoxinucleótido detectable, como se midió mediante electroforesis en gel de agarosa usando tinción con bromuro de etidio. Por lo tanto, los oligodesoxinucleótidos podían unirse con éxito a VLP de AP205 después del desensamblaje inicial de las VLP, de la purificación de la proteína de cubierta desensamblada de ácidos nucleicos y del posterior reensamblaje de la VLP en presencia de oligodesoxinucleótido.

La Figura 42 muestra micrografías electrónicas de VLP de AP205 recombinantes intactas usadas para la etapa de desensamblaje (A) o VLP de A205 desensambladas y posteriormente reensambladas en presencia de CyCpG (B).

La Figura 43 muestra el análisis de electroforesis en gel de agarosa de la muestra de VLP de AP205 reensambladas en presencia de CyCpG y tomada directamente después de la etapa de reensamblaje antes de la diálisis. El gel en la Figura 43A se tiñó con bromuro de etidio. Las VLP de AP205 reensambladas con CyCpG se cargaron en el carril 1 mientras que las VLP de AP205 puras sin tratar se cargaron en el carril 2. La flecha indica la banda de las VLP de AP205 reensambladas. El gel de la Figura 43B se tiñó con azul brillante de Coomassie. Las VLP de AP205 sin tratar se cargaron en el carril 1 mientras que las VLP de AP205 reensambladas con CyCpG se cargaron en el carril 2.

B. Reensamblaje de VLP de jap205 usando material desensamblado que no se reensambla en ausencia de oligonucleótido añadido

Desensamblaje: Se usaron 100 mg de VLP de AP205 recombinante purificada y secada (patente Cytos) para el desensamblaje como se ha descrito anteriormente. Todas las etapas se realizaron esencialmente como se describe en el desensamblaje de la parte A, excepto por el uso de urea 8 M para solubilizar los sedimentos de las etapas de precipitación con sulfato de amonio y la omisión de la etapa de filtración en gel usando una columna CL-4B antes del reensamblaje. Las fracciones combinadas de la columna de Sephadex G-75 contenían 21 mg de proteína como se determinó por espectroscopía usando la fórmula descrita en la parte A. La relación de la absorbancia a 280 nm respecto a la absorbancia a 260 nm de la muestra era de 0,16 respecto a 0,125. La muestra se diluyó 50 veces para la medición.

Reensamblaje: La preparación de proteína resultado de la etapa de purificación por filtración en gel Sephadex G-75 se precipitó con sulfato de amonio a una saturación del 60% y el sedimento resultante se solubilizó en 2 ml de urea 7 M, DTT 10 mM. La muestra se diluyó con 8 ml de 2-mercaptoetanol al 10% en tampón NET y se dializó durante 1 hora contra 40 ml de 2-mercaptoetanol al 10% en tampón NET. El reensamblaje se inició por adición de 0,4 ml de una solución de CyCpG (109 nmol/ml) a la muestra de proteína en la bolsa de diálisis. Se preparó una diálisis en modo continuo y se usó tampón NET como tampón de elución. Se prosiguió con la diálisis durante dos días y se tomó una muestra para análisis de EM después de la finalización de esta etapa de diálisis (Figura 44B). La solución de reensamblaje dializada se dializó posteriormente contra Glicerol al 50% v/v en tampón NET para conseguir la concentración. Se efectuó un cambio de tampón después de un día de diálisis. Se prosiguió con la diálisis durante un total de tres días.

La solución de reensamblaje dializada y concentrada se purificó mediante filtración en gel sobre una columna de Sepharose 4-B (1 X 60 cm) a un caudal de 1 ml/hora en tampón NET. Las fracciones se ensayaron en un ensayo de Ouchterlony y se secaron las fracciones que contenían cápsides, se resuspendieron en agua y se volvieron a someter a cromatografía en la columna 4-B equilibrada en Hepes 20 mM a pH 7,6. Usando cada una de las tres fórmulas siguientes:

(183 * DO^{230\ nm} - 75.8 * DO^{260\ nm}) * volumen\ (ml)

1.

((DO^{235\ nm} - DO^{280\ nm})/2.51)\ x\ volumen

2.

((DO^{228.5\ nm} - DO^{234.5\ nm}) * 0.37)\ x\ volumen,

3.

se determinaron cantidades de proteína de 6-26 mg de VLP reensambladas.

Las VLP de AP205 reensambladas se analizaron mediante EM como se ha descrito anteriormente, electroforesis en gel de agarosa y SDS-PAGE en condiciones no reductoras.

El análisis de EM de material desensamblado muestra que el tratamiento de VLP de AP205 con cloruro de guanidinio altera esencialmente el ensamblaje de la cápside de la VLP. El reensamblaje de este material desensamblado con un oligonucleótido producía cápsides (Figura 44B) que se purificaron y se enriquecieron adicionalmente mediante filtración en gel (Figura 44C). Se obtuvieron dos tamaños de partículas; eran visibles partículas de aproximadamente 25 nm de diámetro y partículas más pequeñas en la micrografía electrónica de la Figura 44C. No se obtuvo reensamblaje en ausencia de oligonucleótidos. La carga de las partículas reensambladas en electroforesis en agarosa mostraba que las partículas reensambladas contenían ácidos nucleicos. La extracción del contenido de ácido nucleico mediante extracción con fenol y posterior carga en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio puso de manifiesto que las partículas contenían el oligonucleótido usado para el reensamblaje (Figura 45A). La identidad del oligonucleótido empaquetado se controló por carga de una muestra de este oligonucleótido al lado del material de ácido nucleico extraído de las partículas. El gel de agarosa en el que se habían cargado VLP de AP205 reensambladas y previamente teñido con bromuro de etidio se tiñó posteriormente con azul de Coomassie poniendo de manifiesto la comigración del contenido de oligonucleótido con el contenido de proteína de las partículas (Figura 45B), demostrando que el oligonucleótido se había empaquetado en las partículas.

La carga de las VLP de AP205 reensambladas en un gel de SDS-PAGE y el procesamiento en ausencia de agente reductor (Figura 46B) demostró que las partículas reensambladas habían formado puentes disulfuro, como es el caso de la VLP de AP205 sin tratar. Además, el patrón de puentes disulfuro es idéntico al de las partículas sin tratar.

En la Figura 44A se representa una micrografía electrónica de la proteína VLP de AP205 desensamblada mientras que la Figura 44B muestra las partículas reensambladas antes de la purificación. La Figura 3C muestra una micrografía electrónica de las VLP de AP205 reensambladas purificadas. Los aumentos de las Figuras 3A-C son 200000X.

Las Figuras 45A y B muestran las VLP de AP205 reensambladas analizadas mediante electroforesis en gel de agarosa. Las muestras cargadas en el gel de ambas figuras eran, de izquierda a derecha: VLP de AP205 sin tratar, 3 muestras con diferente cantidad de VLP de AP205 reensamblada con CyCpG y purificada y VLP de Q\beta sin tratar. El gel de la Figura 45A se tiñó con bromuro de etidio mientras que el mismo gel se tiñó con azul de Coomassie en la Figura 45B.

La Figura 46 representa un análisis de SDS-PAGE de VLP de AP205 reensambladas cargadas en condiciones no reductoras. Se cargaron 5 muestras en el gel. Las muestras cargadas en el gel eran, de izquierda a derecha: marcador de proteínas, Q\beta wt sin tratar, Q\beta wt reensambladas, VLP de AP205 sin tratar, VLP de AP205 reensambladas. El peso molecular de la subunidad de VLP de AP205 es de 14,0 kDa mientras que el peso molecular de la subunidad de Q\beta es de 14,3 kDa (ambos pesos moleculares calculados con la metionina N-terminal). Cada uno de los multímeros unidos por disulfuro se indica mediante una flecha en la figura.

C. Acoplamiento de epítopo p33 (secuencia: H2N-KAVYNFATMGGC-COOH, con extremos N- y C-terminales libres) con VLP de AP205 reensambladas con CyCpG

Las VLP de AP205 reensambladas obtenidas como se describe en la parte B y en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hicieron reaccionar a una concentración de 1,4 mg/ml con un exceso de 5 veces del entrecruzante SMPH diluido a partir de una solución madre 50 mM en DMSO durante 30 minutos a 15ºC. Las denominadas VLP de AP205 derivatizadas obtenidas se dializaron 2 x 2 horas contra al menos un volumen de 1000 veces de tampón Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. La AP205 derivatizada se hizo reaccionar a una concentración de 1 mg/ml con un exceso de 2,5 veces o un exceso de 5 veces de péptido, diluido a partir de una solución madre 20 mM en DMSO, durante 2 horas a 15ºC. La muestra se congeló de forma instantánea posteriormente en nitrógeno líquido para su almacena-
miento.

El resultado de la reacción de acoplamiento se muestra en la Figura 6. Podía conseguirse un mayor grado de acoplamiento mediante el uso de un exceso de 5 veces de péptido más que un exceso de 2,5 veces de péptido en la reacción de acoplamiento.

En la Figura 47 se representa el análisis de SDS-PAGE de la reacción de acoplamiento. Las siguientes muestras (de izquierda a derecha) se cargaron en el gel: marcador de proteínas, VLP de AP205 derivatizada (d); VLP de AP205 acoplada con un exceso de 2,5 veces de péptido, sobrenadante (s); VLP de AP205 acoplada con un exceso de 2,5 veces de péptido, sedimento (p); VLP de AP205 acoplada con un exceso de 5 veces de péptido, sobrenadante (s); VLP de AP205 acoplada con un exceso de 5 veces de péptido, sedimento (p).

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Ejemplo 18

Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores libres pero no los ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados en VLP inducen esplenomegalia

Ratones se dejaron sin tratar o se inmunizaron s. c. con 100 \mug de HBc33 en solitario, CyCpGpt 20 nmol, 100 \mug de HBc33 mezcladas con CyCpGpt 20 nmol o 100 \mug de HBc33 empaquetadas con CyCpGpt. Doce días después se aislaron los bazos y se determinaron los pesos de los bazos y la celularidad esplénica. El CyCpGpt inducía un aumento masivo en el peso del bazo y varias células cuando se administraba en solitario (Figura 48). No se observó dicho efecto con CyCpGpt empaquetado en HBc33 aunque esta composición era capaz de inducir protección frente a la exposición viral (véase el Ejemplo 4).

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Ejemplo 19

Ensayos de protección frente a virus in vivo Ensayo de protección frente a Vaccinia

Se inmunizaron por vía s. c. grupos de tres ratones C57B1/6 hembra con 100 \mug de VLP acoplada o fusionada con p33 en solitario, mezclada con ácido nucleico inmunoestimulador 20 nmol o empaquetada con ácido nucleico inmunoestimulador. Para evaluar la inmunidad antiviral en tejidos periféricos, se infectó a los ratones 7-9 días después i. p. con 1,5 x 10^{6} ufp de virus vaccinia recombinante que expresaba la glicoproteína de LCMV (que incluye el péptido p33). Cinco días después los ovarios se recogieron y se determinaron los títulos virales. Por lo tanto, los ovarios se trituraron con un homogeneizador en medio esencial mínimo (Gibco) que contenía suero bovino fetal al 5% y complementado con glutamina, sales de Earl y antibióticos (penicilina/estreptomicina/anfotericina). La suspensión se tituló en etapas de dilución de diez veces sobre células BSC40. Después de una incubación durante una noche a 37ºC, la capa de células adherentes se tiñó con una solución que consistía en etanol al 50%, cristal violeta al 2% y NaCl 150 mM para la visualización de placas virales. Se usaron como control ratones sin tratamiento previo no inmunizados.

Ensayo de protección frente a LCMV

Se inmunizaron por vía s. c. grupos de tres ratones C57B1/6 hembra con 100 \mug de VLP acopladas o fusionadas con p33 en solitario o mezcladas con adyuvante/oligonucleótido con CpG 20 nmol. Para examinar la inmunidad antiviral sistémica se infectaron ratones i. p. 11-13 días después con 200 ufp de LCMV-WE. Cuatro días después se aislaron los bazos y se determinaron los títulos virales. Los bazos se trituraron con un homogeneizador en Medio Esencial Mínimo (Gibco) que contenía suero bovino fetal al 2% y complementado con glutamina, sales de Earl y antibióticos (penicilina/estreptomicina/anfotericina). La suspensión se tituló en etapas de dilución de diez veces sobre células MC57. Después de la incubación durante una hora las células se cubrieron con DMEM que contenía suero bovino fetal al 5%, metilcelulosa al 1% y antibióticos (penicilina/estreptomicina/anfotericina). Después de la incubación durante 2 días a 37ºC las células se evaluaron para determinar la infección por LCMV mediante el procedimiento de tinción intracelular (que tiñe la nucleoproteína viral): Las células se fijaron con formaldehído al 4% durante 30 min seguido de una etapa de lisis de 20 min con Tritón X-100 al 1%. La incubación durante 1 hora con suero bovino fetal al 10% bloqueaba la unión inespecífica. Las células se tiñeron con un anticuerpo anti-LCMV de rata (VL-4) durante 1 hora. Se usó un anticuerpo de cabra anti-IgG de rata conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc) como anticuerpo secundario seguido de una reacción de color con sustrato ODP de acuerdo con procedimientos convencionales.

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Ejemplo 20

Diferentes ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados en VLP fusionadas con antígeno dan como resultado una respuesta de CTL específicos de antígeno potente y protección frente a virus

La proteína de fusión de HBcAg con el péptido p33 (HBc33) se produjo como se describe en el Ejemplo 1 y se empaquetó con diferentes ácidos nucleicos con CpG como se describe en el Ejemplo 11.

Se inyectaron 100 \mug de vacunas en ratones y se detectaron los títulos de vaccinia en los ovarios después de la exposición a vaccinia recombinante como se describe en el Ejemplo 19. Se produjo CyCpGpt bicatenario (dsCyCpGpt) por hibridación de 0,5 mM de oligonucleótidos de ADN CyCpGpt y CyCpG-rev-pt (Tabla I) en Tris 15 mM pH 7,5 mediante una etapa de calentamiento de 10 min a 80ºC y el posterior enfriamiento a temperatura ambiente. Se comprobó la hibridación del oligonucleótido en un gel de poliacrilamida en TBE al 20% (Novex).

Las cápsides de HBc33 que contenían CyCpG, NKCpG, B-CpG y g10gacga-PS inducían respuestas de CTL capaces de inhibir completamente la infección vírica (Figura 49, Figura 50). Se observó protección con ácidos nucleicos que contenían enlaces fosfodiéster o fosforotioato (pt o PS). Incluso un oligonucleótido bicatenario, dsCyCpGpt, inducía protección frente a la exposición con vaccinia (Figura 49).

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Ejemplo 21

Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados en VLP de HBcAg y Q\beta dan como resultado una respuesta de CTL específicos de antígeno potente y protección frente a virus

La proteína de fusión de HBcAg con el péptido p33 (HBc33) se produjo como se describe en el Ejemplo 1 y se empaquetó con oligonucleótido B-CpGpt como se describe en el Ejemplo 11. El péptido p33 se acopló con el fago de ARN Q\beta y el oligonucleótido B-CpGpt se empaquetó como se describe en el Ejemplo 13. Se inyectaron 100 \mug, 30 \mug, 10 \mug o 3 \mug de cada vacuna en ratones y se detectaron los títulos de vaccinia en los ovarios después de la exposición con vaccinia recombinante como se describe en el Ejemplo 19. 100 \mug y 30 \mug de HBc33 y Qbx33 con B-CpG empaquetado inducían una protección completa frente a la exposición viral mientras que a menores concentraciones se observaba una protección parcial o ninguna protección (Figura 51).

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Ejemplo 22

Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados en VLP que se acoplan con autoantígenos pueden superar la tolerancia a autoantígenos

Se inmunizaron ratones transgénicos que expresaban glicoproteína de LCMV en células de los islotes \beta pancreáticos (Ohasi et al., Cell 65, 305-317 (1991)) con 200 ufp de LCMV, 100 \mug de HBc33 mezclada con CyCpGpt 20 nM, 100 \mug de HBc33 empaquetada con CyCpGpt o 100 \mug de péptido p33 mezclado con CyCpGpt 20 nM como control. Se midieron los niveles de glucosa en sangre cada cuatro días con el kit de ensayo de glucosa Glucotrend Plus (Roche). Se consideraron diabéticos los ratones con niveles de glucosa en sangre superiores a 12 mM. La inmunización con LCMV inducía diabetes en 4/4 animales el día 12. El CyCpGpt mezclado con HBc33 sólo causaba diabetes en 1/3 ratones. Dos de los tres ratones inmunizados con HBc33 en la que se había empaquetado CyCpGpt desarrollaron diabetes el día 12, el tercer ratón el día 16. La inmunización con péptido p33 mezclado con CyCpGpt no inducía diabetes en los tres ratones. Esto demuestra claramente que el ácido nucleico inmunoestimulador empaquetado en VLP con la que se fusionan antígenos es mucho más eficaz para aumentar una respuesta de CTL potente que una mezcla de ácido nucleico y antígeno. Incluso inducía una respuesta más potente que el antígeno fusionado con VLP y mezclado con el ácido nucleico inmunoestimulador.

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Ejemplo 23

Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados en VLP acopladas a antígenos son incluso más eficaces para inducir células T CD8^{+} específicas de antígeno que las VLP mezcladas con ácidos nucleicos inmunoestimuladores

Se inmunizaron por vía subcutánea ratones C57BL/6 con 100 \mug de HBc33 en solitario, mezclada con CyCpGpt o como alternativa empaquetada con CyCpGpt. Ratones sin tratar sirvieron como controles.

8 días después de la inmunización se realizó una tinción doble de los linfocitos sanguíneos con tetrámeros de p33 marcados con PE y anticuerpos monoclonales anti-CD8 acoplados con FITC para la detección de células T CD8^{+} específicas de p33 y se determinó el porcentaje de células específicas de p33 en la población total de células T CD8+ mediante análisis de FACS.

Tabla II. Inducción de células T CD8+ específicas de p33 después de la vacunación con p33-VLP mezcladas o empaquetadas con CpG. Los números se corresponden con las medias de frecuencias (en porcentaje) y desviaciones típicas.

Las HBc33 con CyCpGpt empaquetado inducían una mayor frecuencia de células T CD8^{+} específicas de p33 que las HBc33 mezcladas con CyCpGpt (Tabla II). Como la cantidad de oligonucleótido empaquetado es mucho menor (aproximadamente 1/20) que la cantidad de oligonucleótido usado en la preparación mezclada esto demuestra claramente que las VLP con ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados son incluso más eficaces para inducir altos números de células T CD8^{+} específicas de antígeno.

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Ejemplo 24

Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores empaquetados en VLP son incluso más eficaces para inducir respuestas de CTL que las VLP mezcladas con ácidos nucleicos inmunoestimuladores

Se sensibilizaron por vía subcutánea grupos de ratones C57BL16 con 100 \mug de p33-VLP administrada en solitario, mezclada con CyCpGpt 20 nmol o como alternativa empaquetada con CyCpGpt. Para la detección de citotoxicidad primaria ex vivo, se prepararon suspensiones de células efectoras a partir de bazos de ratones vacunados 9 días después de la sensibilización. Se estimularon células EL-4 con péptido p33 (10^{-6} M, 2 h a 37ºC en medio MEM con FCS al 2%) y se usaron en un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 5 h.

3

La Figura 52 muestra la citotoxicidad primaria ex vivo de grupos de ratones C57BL/6 que se sensibilizaron por vía subcutánea con 100 \mug de p33-VLP administrada en solitario (A), mezclada con CyCpGpt 20 nmol (B) o como alternativa empaquetada con CyCpGpt (C). Nueve días después se ensayaron las células de bazo para determinar la actividad de CTL ex vivo directa en un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 5 h en células diana EL-4 estimuladas con p33 (símbolos oscuros) o sin estimular (símbolos en blanco) a las proporciones de células efectoras respecto a dianas indicadas. Se midió la radiactividad en los sobrenadantes de cultivo celular en un Contador Cobra II (Canberra Packard, Downers Growe, IL). La liberación espontánea era siempre <10%. Se realizaron dos series de diluciones de células efectoras por ratón. En (A) se usaron dos ratones por grupo mientras que en (B) y (C) se muestran datos de cuatro ratones por grupo.

La Figura 52 demuestra claramente que 100 \mug de HBc33 en solitario no inducían una respuesta primaria de CTL in vivo mientras que la misma cantidad de HBc33 mezcladas con CyCpGpt 20 nmol inducía una citotoxicidad significativa. Sin embargo, aunque la cantidad de oligonucleótido empaquetado era mucho menor (aproximadamente 1/20) que la cantidad de oligonucleótido usado en la preparación mezclada la citotoxicidad se aumentaba cuando se usaron 100 \mug de HBc33 con CyCpGpt empaquetado para la inmunización (Figura 52).

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Ejemplo 25

Hidrólisis no enzimática del contenido de ARN de VLP y empaquetamiento de ácidos nucleicos inmunoestimuladores Degradación dependiente de ZnSO_{4} del contenido de ácido nucleico de una VLP

Se dializaron 5 mg de VLP de Q\beta (según se determinó por análisis de Bradford) en HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM contra 2000 ml de TrisHCl 50 mM pH 8,0, NaCl 50 mM, glicerol al 5%, MgCl_{2} 10 mM o 2000 ml de HEPES 4 mM, pH 7,4, NaCl 30 mM durante 2 h a 4ºC en un tubo de diálisis plegado SnakeSkin^{TM} (Pierce, Nº Cat. 68035). Cada uno de los tampones de diálisis se intercambió una vez y se permitió que la diálisis continuara durante otras 16 h a 4ºC. La solución dializada se aclaró durante 10 minutos a 14000 rpm (Eppendorf 5417 R, en rotor de ángulo fijo F45-30-11, usado en todas las etapas siguientes) y de nuevo se determinó la concentración de proteína mediante análisis de Bradford. Se diluyeron VLP de Q\beta en TrisHCl 50 mM pH 8,0, NaCl 50 mM, glicerol al 5%, MgCl_{2} 10 mM con el tampón correspondiente a una concentración de proteína final de 1 mg/ml mientras que se diluyeron VLP de Q13 en HEPES 4 mM pH 7,4, NaCl 30 mM con el tampón correspondiente a una concentración de proteína final de 0,5 mg/ml. Estas soluciones que contenían cápside se centrifugaron de nuevo durante 10 minutos a 14000 rpm a 4ºC. Los sobrenadantes se incubaron después con ZnSO_{4} que se añadió a una concentración final de 2,5 mM durante 24 h a 60ºC en un Termomezclador comfort de Eppendorf a 550 rpm. Después de 24 h las soluciones se aclararon durante 10 minutos a 14000 rpm y el sedimento se desechó. La eficacia de la degradación de ácidos nucleicos dependiente de ZnSO_{4} se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 53). Los sobrenadantes se dializaron contra 5000 ml de HEPES 4 mM a pH 7,4, NaCl 30 mM durante 2 h a 4ºC. Se intercambiaron 500 ml de tampón una vez y se continuó con la diálisis durante una noche a 4ºC. La solución dializada se aclaró durante 10 minutos a 14000 rpm y 4ºC, se desechó un sedimento insignificante y la concentración de proteína de los sobrenadantes se determinó mediante análisis de Bradford.

Se obtuvieron resultados similares con tratamiento de las cápsides con cloruro de cobre/fenantrolina/peróxido de hidrógeno. Los especialistas en la técnica conocen procedimientos no enzimáticos alternativos para la hidrólisis de ARN.

Empaquetamiento de oligodesoxinucléotidos en VLP tratadas con ZnSO_{4}

Se usaron cápsides de Q\beta tratadas con ZnSO_{4} y dializadas con una concentración de proteína (según se determinó mediante análisis de Bradford) de entre 0,4 mg/ml y 0,9 mg/ml (que se corresponde con una concentración de cápsides de 159 nM y 357,5 nM, respectivamente) para el empaquetamiento de los oligodesoxinucleótidos. Los oligodesoxinucleótidos se añadieron en un exceso molar de 300 veces a las cápsides de VLP de Q\beta y se incubaron durante 3 h a 37ºC en un Termomezclador comfort de Eppendorf a 550 rpm. Después de 3 h, las reacciones se centrifugaron durante 10 minutos a 14 000 rpm y 4ºC. Los sobrenadantes se dializaron en Spectra/Por®CE DispoDialyzer con un límite de peso molecular (MWCO) de 300000 (Spectrum, Nº Cat. 135526) frente a 5000 ml de HEPES 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM durante 8 h a 4ºC. Se intercambiaron 5000 ml de tampón una vez y se continuó con la diálisis durante una noche a 4ºC. La concentración de proteína de las muestras dializadas se determinó mediante análisis de Bradford. Las cápsides de Q\beta y sus contenidos de ácido nucleico se analizaron como se describe en los Ejemplos 11 y
13.

La Figura 53 muestra el análisis de VLP de Q\beta tratadas con ZnSO_{4} mediante electroforesis en gel de agarosa: se incubaron VLP de Q\beta que se habían purificado a partir de E. coli y dializadas contra tampón 1 (TrisHCl 50 mM pH 8,0, NaCl 50 mM, glicerol al 5%, MgCl_{2} 10 mM) o tampón 2 (HEPES 4 mM, pH 7,4, NaCl 30 mM) sin o en presencia de sulfato de cinc (ZnSO_{4}) 2,5 mM durante 24 h a 60ºC. Después de este tratamiento se mezclaron cantidades equivalentes de las muestras indicadas (5 \mug de proteína) con colorante de carga y se cargaron en un gel de agarosa al 0,8%. Después del procesamiento el gel se tiñó con bromuro de etidio. Obsérvese que el tratamiento de VLP con ZnSO_{4} provoca la degradación del contenido de ácido nucleico mientras que los controles con tratamiento simulado no se vieron afectados.

La Figura 54 muestra el empaquetamiento de oligodesoxinucleótidos en VLP tratadas con ZnSO_{4} y el análisis de los mismos mediante electroforesis en gel de agarosa. Se dializaron VLP de Q\beta que se habían tratado con sulfato de cinc (+ZnSO_{4}) 2,5 mM contra HEPES 4 mM, pH 7,4, NaCl 30 mM y se incubaron durante 3 h a 37ºC con un exceso de oligodesoxinucleótidos (debido a la diálisis la concentración de ZnSO_{4} se disminuyó del orden de 10^{6}, por lo tanto se indica solamente entre paréntesis). Después de esta incubación en presencia de oligodesoxinucleótidos, se mezclaron cantidades equivalentes de las muestras indicadas (5 \mug de proteína) con colorante de carga y se cargaron en un gel de agarosa al 0,8%. Después del procesamiento el gel se tiñó con bromuro de etidio. Obsérvese que la adición de oligodesoxinucleótidos a VLP de Q\beta tratadas con ZnSO_{4} podía restaurar el comportamiento electroforético de las cápsides tratadas de este modo cuando se comparaba con cápsides de Q\beta sin tratar que se habían purificado a partir de E. coli.

La Figura 55 muestra el análisis del contenido de ácido nucleico de VLP de Q\beta tratadas con ZnSO_{4} y oligodesoxinucleótido mediante digestión con Benzonasa y proteinasa K y electroforesis en gel de poliacrilamida en TBE/Urea: Se empaquetaron oligodesoxinucleótidos en VLP de Q\beta tratadas con ZnSO_{4} como se ha descrito anteriormente. Se digirieron 25 \mug de estas VLP con 25 \mul de Benzonasa (Merck, Nº Cat. 1.01694.0001) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Después de la inactivación térmica de la nucleasa (30 minutos a 80ºC) las VLP se trataron con proteinasa K (la concentración final de la enzima era de 0,5 mg/ml) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Después de 3 h se mezcló el equivalente de 2 \mug de VLP de Q\beta que se habían digerido mediante Benzonasa y proteinasa K con tampón de muestras de TBE-Urea y se cargó en un gel de poliacrilamida al 15% en TBE-Urea (Novex®, Invitrogen Nº Cat. EC6885). Las cápsides cargadas en el carril 2 se trataron con ZnSO_{4} 2,5 mM en presencia de tampón 1 (véase anteriormente) mientras que las cápsides cargadas en el carril 3 se trataron con ZnSO_{4} 2,5 mM en presencia de tampón 2 (véase anteriormente). Como patrón cualitativo así como cuantitativo, se cargaron 1 pmol, 5 pmol y 10 pmol del oligodesoxinucleótido que se usó para la reacción de reensamblaje en el mismo gel (carriles 4-6). Como control, se trataron cápsides de Q\beta que se habían purificado a partir de E. coli exactamente del mismo modo y se analizaron en el mismo gel de poliacrilamida en TBE-Urea (carril 1). Después de que se completase el procesamiento, el gel se fijó, se equilibró a pH neutro y se tiñó con SYBR-Gold (Molecular Probes Nº Cat. S-11494). Obsérvese que las VLP de Q\beta intactas (que se habían purificado a partir de E. coli) no contenían ácidos nucleicos de un tamaño similar a los que se habían extraído a partir de cápsides de Q\beta tratadas con ZnSO_{4} y oligodesoxinucleótido. Además, los ácidos nucleicos aislados de las últimas VLP comigraban con los oligodesoxinucleótidos que se habían usado en la reacción de reensamblaje. Estos resultados confirmaban que los oligodesoxinucleótidos usados se empaquetaron en cápsides de Q\beta tratadas con ZnSO_{4}.

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Ejemplo 26

Las VLP que contienen ácidos nucleicos inmunoestimuladores inducen respuestas de células T que pueden reforzarse mediante vectores virales: LCMV

Se sensibilizaron por vía subcutánea ratones con 20 \mug de p33-VLP que contenían ácidos nucleicos inmunoestimuladores. Antes de la inmunización, las preparaciones de p33-VLP se purificaron exhaustivamente de oligonucleótidos con CpG no unidos mediante diálisis (véanse el Ejemplo 2 y la Figura 5). 12 días después, se extrajo sangre y se determinaron las frecuencias de células T específicas de p33 mediante tinción con tetrámero. Los ratones se reforzaron con 200 ufp de LCMV vivo cepa WE y se determinaron las frecuencias de células T específicas 5 días después. Las frecuencias antes del refuerzo eran del 3,5% +/-1,8% después del refuerzo del 15,5% +/-1,9%.

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Ejemplo 27

Las VLP que contienen ácidos nucleicos inmunoestimuladores inducen respuestas de células T que pueden reforzarse mediante vectores virales: virus vaccinia recombinante

Se sensibilizaron por vía subcutánea ratones con 20 \mug de p33-VLP que contenían ácidos nucleicos inmunoestimuladores. Antes de la inmunización, las preparaciones de p33-VLP se purificaron exhaustivamente de los oligonucleótidos con CpG no unidos mediante diálisis (véanse el Ejemplo 2 y la Figura 5). 12 días después, se extrajo sangre y se determinaron las frecuencias de células T específicas de p33 mediante tinción con tetrámero. Los ratones se reforzaron con 10^{6} ufp de virus vaccinia recombinante que expresaba GP de LCMV y se determinaron las frecuencias de células T específicas 5 días después.

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Ejemplo 28

Las VLP que contienen ácidos nucleicos inmunoestimuladores inducen respuestas de células T que pueden reforzarse mediante vectores virales: virus de la viruela del canario recombinante

Se sensibilizaron por vía subcutánea ratones con 20 \mug de p33-VLP que contenían ácidos nucleicos inmunoestimuladores. Antes de la inmunización, las preparaciones de p33-VLP se purificaron exhaustivamente de los oligonucleótidos con CpG no unidos mediante diálisis (véanse el Ejemplo 2 y la Figura 5). 12 días después, se extrajo sangre y se determinaron las frecuencias de células T específicas de p33 mediante tinción con tetrámero. Los ratones se reforzaron con 10^{7} ufp de virus de la viruela del canario recombinante que expresaba GP de LCMV y se determinaron las frecuencias de células T específicas 5 días después.

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Ejemplo 29

Las VLP que contienen ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden reforzar respuestas de células T

Se infectaron por vía intravenosa ratones con virus vaccinia recombinante que expresaba GP de LCMV. 20 días después, se extrajo sangre y se determinaron las frecuencias de células T específicas de p33 mediante tinción con tetrámero. Los ratones se reforzaron el mismo día con preparaciones de p33-VLP que contenían ácidos nucleicos inmunoestimuladores (véanse el Ejemplo 2 y la Figura 5) y se determinaron las frecuencias de células T específicas 5 días después.

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Ejemplo 30

Empaquetamiento de ácido ribonucleico inmunoestimulador en VLP

Se disolvieron en agua ácidos ribonucleicos inmunoestimuladores tales como poli (l:C) (Sigma) o 30 nucleótidos bicatenarios sintéticos de ácido poliinosínico y ácido policitidílico con cadena principal fosfodiéster o fosforotioato. Como alternativa, se usó ácido polidesoxiinosínico y ácido polidesoxiinosínico para preparar un análogo de poli(I:C) bicatenario. Se trataron VLP de HBc33 y VLP de Q\beta con ARNasa como se describe en los Ejemplos 11, 13 ó 25 y se añadieron ácidos nucleicos a 1, 10 y 100 nmol/ml en HBS 0,2x y se incubaron durante 3 h a 37ºC en un termomezclador. Se eliminó el exceso de ácidos nucleicos mediante hidrólisis enzimática o diálisis y se analizó como se describe en los Ejemplos 11, 13 y 25.

Como alternativa, se empaquetaron ácidos ribonucleicos inmunoestimuladores y sus análogos durante el reensamblaje de proteínas de cubierta de Q\beta como se describe en los Ejemplos 14, 15 y 16. El reensamblaje se realizó por adición de \beta-mercaptoetanol a la fracción de dímero de 10 ml a una concentración final del 10% y se añadieron 300 \mul de una solución de ácido nucleico que daba como resultado un exceso molar de 1, 10 y 100 sobre la concentración de cápside. Las mezclas de reensamblaje se dializaron primero contra 30 ml de tampón NET que contenía \beta-mercaptoetanol al 10% durante 2 horas a 4ºC y después se dializó de un modo continuo con un flujo de tampón NET de 8 ml/h durante 4 días a 4ºC. Las mezclas de reensamblaje se desalinizan después contra agua mediante diálisis, con 6 intercambios de tampón (4 x 100 ml, 2 x 1 litro). Después se aíslan VLP de Q\beta reensambladas mediante centrifugación en gradiente de sacarosa como se describe en el Ejemplo 14 o por filtración en gel como se describe en el Ejemplo 16.

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<110> Cytos Biotechnology AG

\hskip1cm

Bachmann, Martin F.

\hskip1cm

Storni, Tazio

\hskip1cm

Maurer, Patrick

\hskip1cm

Tissot, Alain

\hskip1cm

Schwarz, Katrin

\hskip1cm

Meijerink, Edwin

\hskip1cm

Lipowsky, Gerad

\hskip1cm

Pumpens, Paul

\hskip1cm

Cielens, Indulis

\hskip1cm

Renhofa, Regina

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<120> Empaquetamiento de sustancias inmunoestimuladoras en partículas similares a virus: método de preparación y uso

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<130> 1700.022PC02

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<140> Por asignar

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<141> Con la presente

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<150> 60/314.145

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<151> 22-04-2002

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<150> 60/318.994

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<151> 14-09-2001

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<160> 73

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 10

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<211> 132

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago Q-beta

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<400> 10

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\hskip0,8cm

4

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<210> 11

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<211> 328

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago Q-beta

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<400> 11

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\hskip0,8cm

5

\hskip0,8cm

6

\hskip0,8cm

7

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<210> 12

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<211> 129

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago R17

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<400> 12

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\hskip0,8cm

8

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<210> 13

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<211> 130

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago fr

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<400> 13

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\hskip0,8cm

9

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<210> 14

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<211> 130

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago GA

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<400> 14

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\hskip1cm

10

\hskip0,8cm

11

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<210> 15

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<211> 132

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago SP

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<400> 15

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\hskip0,8cm

12

\hskip0,8cm

13

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<210> 16

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<211> 329

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago SP

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<400> 16

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\hskip0,8cm

14

\hskip0,8cm

15

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<210> 17

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<211> 130

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago MS2

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<400> 17

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\hskip0,8cm

16

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<210> 18

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<211> 133

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago M11

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<400> 18

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\hskip0,8cm

17

\hskip0,8cm

18

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<210> 19

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<211> 133

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago MX1

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<400> 19

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\hskip0,8cm

19

\hskip0,7cm

20

\newpage

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<210> 20

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<211> 330

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago NL95

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

21

\hskip0,8cm

22

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<210> 21

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<211> 129

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago f2

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<400> 21

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\hskip0,8cm

23

\hskip0,8cm

24

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<210> 22

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<211> 128

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago PP7

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<400> 22

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\hskip0,8cm

25

\hskip0,8cm

26

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<210> 23

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<211> 132

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago Q-beta

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<400> 23

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\hskip0,8cm

27

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<210> 24

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<211> 132

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago Q-beta

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<400> 24

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\hskip0,8cm

28

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<210> 25

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<211> 132

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago Q-beta

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<400> 25

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\hskip0,8cm

29

\hskip0,8cm

30

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<210> 26

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<211> 132

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago Q-beta

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<400> 26

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\hskip0,8cm

31

\hskip0,8cm

32

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<210> 27

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<211> 132

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<212> PRT

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<213> Bacteriófago Q-beta

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<400> 27

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\hskip0,8cm

33

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<210> 28

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<211> 184

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 28

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\hskip0,8cm

34

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<210> 29

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

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<400> 29

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\hskip0,8cm

35

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<210> 30

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

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<400> 30

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\hskip0,8cm

36

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<210> 31

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

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\hskip0,8cm

37

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

38

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<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 33

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

39

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<210> 34

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\hskip0,8cm

40

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<210> 35

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 35

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\hskip0,8cm

41

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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42

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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43

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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44

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<210> 39

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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45

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 40

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46

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\hskip0,8cm

47

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<210> 42

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gen de la proteína de núcleo del virus de la Hepatitis B humano sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

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48

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 43

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<213> Virus de la Hepatitis B

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54

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 49

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55

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 50

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56

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<210> 51

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..(28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

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\hskip0,8cm

57

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 52

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\hskip0,8cm

58

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<210> 53

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 53

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 54

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\hskip0,8cm

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 55

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\hskip0,8cm

61

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\hskip0,8cm

62

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 57

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<210> 58

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\hskip0,8cm

64

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<210> 59

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\hskip0,8cm

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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66

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\hskip0,8cm

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 62

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

68

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\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

69

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

70

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

72

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

73

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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<400> 70

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

76

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

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\hskip0,8cm

77

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

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\hskip0,8cm

78

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

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<211> 188

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

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\hskip0,8cm

79

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 217

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

80

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

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<211> 262

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

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\hskip0,8cm

81

\hskip0,8cm

82

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 305

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

83

\hskip0,8cm

84

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

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<211> 185

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

85

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

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<211> 152

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<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

86

\hskip0,8cm

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3635

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> plásmido pAP283-58

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

88

\hskip0,8cm

89

\hskip0,8cm

90

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 131

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> proteína de cubierta de AP205

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

91

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 131

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> proteína de cubierta de AP205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

92

\hskip0,8cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3607

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> plásmido pAP281-32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

94

\hskip0,8cm

95

\hskip0,8cm

96

Claims (67)

1. Una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal que comprende:

(a)

una partícula similar a virus; y

(b)

una sustancia inmunoestimuladora;

en la que dicha sustancia inmunoestimuladora se empaqueta en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado.

\vskip1.000000\baselineskip

2. La composición de la reivindicación 1 que comprende además al menos un antígeno, en la que dicho antígeno está unido a dicha partícula similar a virus.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha partícula similar a virus es una partícula similar a virus recombinante.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes seleccionadas del grupo que consiste en:

(a)

proteínas recombinantes del virus de la Hepatitis B;

(b)

proteínas recombinantes del virus del sarampión;

(c)

proteínas recombinantes del virus Sinbis;

(d)

proteínas recombinantes de Rotavirus;

(e)

proteínas recombinantes del virus de la glosopeda;

(f)

proteínas recombinantes de Retrovirus;

(g)

proteínas recombinantes de virus Norwalk;

(h)

proteínas recombinantes de Papilomavirus humano;

(i)

proteínas recombinantes de virus BK;

(j)

proteínas recombinantes de bacteriófagos;

(k)

proteínas recombinantes de fagos de ARN;

(l)

proteínas recombinantes de Ty; y

(m)

fragmentos de cualquiera de las proteínas recombinantes de (a) a (l).

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5. La composición de la reivindicación 4, en la que dicha partícula similar a virus es la proteína de núcleo del virus de la Hepatitis B o la proteína VP1 del virus BK.

6. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes, o fragmentos de las mismas, de un fago de ARN.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que dicho fago de ARN se selecciona del grupo que consiste en:

(a)

bacteriófago Q\beta;

(b)

bacteriófago R17;

(c)

bacteriófago fr;

(d)

bacteriófago GA;

(e)

bacteriófago SP;

(f)

bacteriófago MS2;

(g)

bacteriófago M11;

(h)

bacteriófago MX1;

(i)

bacteriófago NL95;

(k)

bacteriófago f2;

(l)

bacteriófago PP7; y

(m)

bacteriófago AP205.

\vskip1.000000\baselineskip

8. La composición de la reivindicación 6, en la que dicho fago de ARN es bacteriófago Q\beta.

9. La composición de la reivindicación 6, en la que dicho fago de ARN es bacteriófago AP205.

10. La composición de la reivindicación 1, en la dicha partícula similar a virus es una partícula similar a virus de un fago de ARN.

11. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado comprende la secuencia:

5'\ X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}\ 3'

en la que X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son cualquier nucleótido.

12. La composición de la reivindicación 11, en la que al menos uno de dichos nucleótidos X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} tiene una modificación de la cadena principal fosfato.

13. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado comprende, o como alternativa consiste esencialmente en o como alternativa consiste en la secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

TCCATGACGTTCCTGAATAAT;

(b)

TCCATGACGTTCCTGACGTT;

(c)

GGGGTCAACGTTGAGGGGG;

(d)

GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG; y

(e)

SEC ID Nº: 83.

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14. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en la secuencia GGGGGGGGGG
GACGATCGTCGGGGGGGGGG.

15. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado es palindrómico.

16. La composición de la reivindicación 15, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado palindrómico comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en la secuencia GGGGTCAACGTTGAGGGGG.

17. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado contiene una o más modificaciones fosforotioato de la cadena principal fosfato o en la que cada resto fosfata de dicha cadena principal fosfato de dicho oligonucleótido es una modificación de fosforotioato.

18. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado comprende de aproximadamente 6 a aproximadamente 300 nucleótidos.

19. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho al menos un antígeno o determinante antigénico está unido a dicha partícula similar a virus por al menos un enlace covalente no peptídico.

\newpage

20. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho al menos un antígeno o determinante antigénico está fusionado a dicha partícula similar a virus.

21. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho antígeno se selecciona del grupo que consiste en:

(a)

polipéptidos;

(b)

carbohidratos;

(c)

hormonas esteroideas; y

(d)

moléculas orgánicas.

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22. La composición de la reivindicación 21, en la que dicho antígeno es una molécula orgánica y en la que dicha molécula orgánica se selecciona del grupo que consiste en:

(a)

codeína;

(b)

fentanilo;

(c)

heroína;

(d)

morfina;

(e)

anfetamina;

(f)

cocaína;

(g)

metilendioximetanfetamina;

(h)

metanfetamina;

(i)

metilfenidato;

(j)

nicotina;

(k)

LSD;

(l)

mescalina;

(m)

psilocibina; y

(n)

tetrahidrocanabinol.

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23. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho antígeno procede del grupo que cosiste en:

(a)

virus;

(b)

bacterias;

(c)

parásitos;

(d)

priones;

(e)

tumores;

(f)

moléculas propias;

(g)

moléculas de haptenos no peptídicos;

(h)

alergenos; y

(i)

hormonas.

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24. La composición de la reivindicación 23, en la que dicho antígeno es un antígeno tumoral.

25. La composición de la reivindicación 24, en la que dicho antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en:

(a)

Her2;

(b)

GD2;

(c)

EGF-R;

(d)

CEA;

(e)

CD52;

(f)

CD21;

(g)

proteína gp100 de melanoma humano;

(h)

proteína melan-A/MART-1 de melanoma humano;

(i)

tirosinasa;

(j)

proteína NA17-A nt;

(k)

proteína MAGE-3;

(l)

proteína p53;

(m)

proteína E7 de HPV16; y

(n)

fragmentos antigénicos de cualquiera de los antígenos tumorales de (a) a (m).

\vskip1.000000\baselineskip

26. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho antígeno se une a dicha partícula similar a virus por medio de una secuencia de enlace.

27. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho antígeno es un epítopo de célula T citotóxica, un epítopo de célula Th o una combinación de al menos dos de dichos epítopos, en la que dichos al menos dos epítopos se unen directamente o por medio de una secuencia de enlace y en la que dicho epítopo de célula T citotóxica es un epítopo de célula T citotóxica viral o tumoral.

28. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado no está accesible para la hidrólisis por ADNasa.

29. Una composición que comprende:

(a)

una partícula similar a virus; y

(b)

una sustancia inmunoestimuladora;

en la que dicha sustancia inmunoestimuladora está empaquetada en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado; para el uso en un método para potenciar una respuesta inmune en un animal que comprende introducir dicha composición en dicho animal.

\vskip1.000000\baselineskip

30. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 29, en la que dicha composición se define como en cualquiera de las reivindicaciones 2-28.

31. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 29, en la que dicha respuesta inmune es una respuesta de células B potenciada o una respuesta de células T potenciada.

32. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 31, en la que dicha respuesta de células T es una respuesta de CTL o una respuesta de células Th.

33. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 32, en la que dicha respuesta de células Th es una respuesta de células Th1.

34. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 29, en la que dicho animal es un mamífero.

35. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 34, en la que dicho mamífero es un ser humano.

36. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 29, en la que dicha composición se introduce en dicho animal por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal o directamente en el ganglio linfático.

37. Uso de una composición que comprende:

(a)

una partícula similar a virus; y

(b)

una sustancia inmunoestimuladora;

en la que dicha sustancia inmunoestimuladora está empaquetada en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado;

para la fabricación de una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal, en el que dicha composición se va a introducir en dicho animal.

\vskip1.000000\baselineskip

38. El uso de la reivindicación 37, en el que dicha composición se define como en cualquiera de la reivindicaciones 2-28.

39. El uso de la reivindicación 37, en el que dicha respuesta inmune es una respuesta de células B potenciada o una respuesta de células T potenciada.

40. El uso de la reivindicación 39, en el que dicha respuesta de células T es una respuesta de CTL o una respuesta de células Th.

41. El uso de la reivindicación 40, en el que dicha respuesta de células Th es una respuesta de células Th1.

42. El uso de la reivindicación 37, en el que dicho animal es un mamífero.

43. El uso de la reivindicación 42, en el que dicho mamífero es un ser humano.

44. El uso de la reivindicación 37, en el que dicha composición se introduce en dicho animal por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal o directamente en el ganglio linfático.

45. Un método de producción de una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal, comprendiendo dicha composición:

(i)

una partícula similar a virus; y

(ii)

una sustancia inmunoestimuladora empaquetada en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado;

\vskip1.000000\baselineskip

comprendiendo dicho método:

(a)

incubar dicha partícula similar a virus con dicha sustancia inmunoestimuladora;

(b)

añadir ARNasa; y

(c)

purificar dicha composición.

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46. Un método de producción de una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal, comprendiendo dicha composición:

(i)

una partícula similar a virus; y

(ii)

una sustancia inmunoestimuladora empaquetada en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado;

\vskip1.000000\baselineskip

comprendiendo dicho método:

(a)

incubar dicha partícula similar a virus con ARNasa;

(b)

añadir dicha sustancia inmunoestimuladora; y

(c)

purificar dicha composición.

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47. El método de la reivindicación 45 ó 46, en el que dicha partícula similar a virus se produce en un sistema de expresión bacteriano.

48. El método de la reivindicación 45 ó 46, en el que dicha ARNasa es ARNasa A.

49. El método de la reivindicación 45 ó 46, en el que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado no está accesible para la hidrólisis por ADNasa.

50. Un método de producción de una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal, comprendiendo dicha composición:

(i)

una partícula similar a virus; y

(ii)

una sustancia inmunoestimuladora empaquetada en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado;

\vskip1.000000\baselineskip

comprendiendo dicho método:

(a)

desensamblar dicha partícula similar a virus;

(b)

añadir dicha sustancia inmunoestimuladora; y

(c)

reensamblar dicha partícula similar a virus.

\vskip1.000000\baselineskip

51. El método de la reivindicación 50, que comprende además eliminar los ácidos nucleicos de dicha partícula similar a virus desensamblada.

52. El método de la reivindicación 50, que comprende además purificar dicha composición después del reensamblaje (c).

53. El método de la reivindicación 50, en el que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado no está accesible para la hidrólisis por ADNasa.

54. Un método de producción de una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal, comprendiendo dicha composición:

(i)

una partícula similar a virus; y

(ii)

una sustancia inmunoestimuladora empaquetada en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado;

\vskip1.000000\baselineskip

comprendiendo dicho método:

(a)

incubar dicha partícula similar a virus con soluciones que comprenden iones metálicos capaces de hidrolizar los ácidos nucleicos de dicha partícula similar a virus;

(b)

añadir dicha sustancia inmunoestimuladora; y

(c)

purificar dicha composición.

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55. El método de la reivindicación 54, en el que dichos iones metálicos se seleccionan del grupo que consiste en:

(a)

iones de cinc (Zn);

(b)

iones de cobre (Cu);

(c)

iones de hierro (Fe); y

(d)

cualquier mezcla de al menos un ión de (a), (b) y/o (c).

\vskip1.000000\baselineskip

56. El método de la reivindicación 54, en el que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado no está accesible para la hidrólisis por ADNasa.

57. Una vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición de la reivindicación 1 ó 2 o cualquiera de las reivindicaciones 3-28 junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

58. La vacuna de la reivindicación 57, en la que dicha vacuna comprende además un adyuvante.

59. Una cantidad inmunológicamente eficaz de la vacuna de acuerdo con la reivindicación 57 para usar en un método de inmunización o tratamiento de un animal que comprende administrar dicha cantidad a dicho animal.

60. La vacuna para el uso de la reivindicación 59, en la que dicho animal es un mamífero.

61. La vacuna para el uso de la reivindicación 60, en la que dicho mamífero es un ser humano.

62. Una cantidad inmunológicamente eficaz de la vacuna de la reivindicación 57 para el uso en un método de inmunización o tratamiento de un animal que comprende estimular una respuesta de células T en dicho animal por administración de dicha cantidad.

63. La vacuna para el uso de la reivindicación 62, que comprende además la etapa de reforzar la respuesta inmune en dicho animal, en la que dicho refuerzo se efectúa por administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna de la reivindicación 57 o una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna heteróloga.

64. Una cantidad inmunológicamente eficaz de la vacuna de la reivindicación 57 para usar en un método de inmunización o tratamiento de un animal que comprende reforzar una respuesta de células T en dicho animal por administración de dicha cantidad.

65. La vacuna para el uso de la reivindicación 64, que comprende además la etapa de estimular una respuesta de células T en dicho animal, en la que dicha estimulación se efectúa por administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna de la reivindicación 57 o una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna heteróloga.

66. La vacuna para el uso de la reivindicación 63 o de la reivindicación 65, en la que dicha vacuna comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición de la reivindicación 1 junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y en la que dicha vacuna heteróloga es una vacuna de ADN.

67. La vacuna para el uso de la reivindicación 63 o de la reivindicación 65, en la que dicha vacuna comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición de la reivindicación 2 junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y en la que dicha vacuna heteróloga es una vacuna de ADN o una vacuna viral o una vacuna de la viruela del canario.