CN112673054A - 用于制备干燥多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

尤其提供了用于干燥分离的多糖的方法，其包括喷雾干燥包含所述分离的多糖的液体组合物的步骤。

Description

用于制备干燥多糖的方法
发明领域
本发明涉及用于制备干燥多糖的改进方法。
发明背景
多糖是细菌表面的主要组分。已经显示对荚膜多糖抗原的免疫应答提供针对细菌疾病的保护。已经开发了许多基于荚膜多糖抗原的疫苗，包括例如针对脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、B群链球菌和流感嗜血杆菌的疫苗。
重要的是，从其他细菌组分充分纯化待在疫苗中使用的多糖。另外，为了方便运输和储存，将纯化的多糖合适地干燥。这些可能是在工业规模上困难且昂贵的方法。例如，一种当前方法涉及费力的多步骤过程，其需要至少一个沉淀步骤以将固体多糖与残余纯化缓冲液分离。沉淀需要大体积的溶剂，且随后需要几个洗涤步骤和干燥。
因此，仍然需要允许在工业规模上以更方便的方式生产干燥的多糖抗原的方法。
尽管喷雾干燥是众所周知的干燥技术，但发现其在疫苗领域中的用途有限。生物药物分子(包括蛋白和多糖)的结构和化学性质使它们易于经由包括变性、聚集、脱酰胺和水解的机制而降解。
对于多糖的喷雾干燥的最大忧虑之一是该方法涉及用加热的空气干燥，并且高温可能影响多糖结构的完整性。
使用喷雾干燥来生产疫苗的现有技术的方法已经需要稳定组分来保护抗原免于由喷雾干燥条件引起的损害。例如，Chen等人2010公开了喷雾干燥在生产热稳定的脑膜炎奈瑟氏菌A蛋白-多糖缀合物疫苗中的用途。所有喷雾干燥的脑膜炎奈瑟氏菌制剂都含有海藻糖或乳糖保护剂，以稳定制剂。作者指出，先前还没有报道多糖-蛋白缀合物疫苗的喷雾干燥，并且鉴定了他们声称需要在将该方法按比例放大之前解决的产率的可变性。
Zhu等人2014年公开了使用喷雾干燥方法来稳定作为模型疫苗候选物的流感血凝素肽抗原。制备了八种制剂，其含有一定范围的赋形剂，诸如海藻糖、葡聚糖、蔗糖、精氨酸、水解明胶、PVP-40和水解卵磷脂。并非所有制剂都保护疫苗候选物免于喷雾干燥期间的损害。作者将最佳制剂的高产率归因于选择赋形剂和操作条件。
类似地，US 2005/0266011例举了喷雾干燥的免疫活性剂，诸如流感血凝素肽，其与赋形剂、诸如蔗糖一起配制。作者指出，其中公开的含有蔗糖的制剂受益于没有蛋白损失，也没有从喷雾干燥后的分子量变化。
Ohtake等人2010公开了用于产生热稳定的麻疹疫苗粉末的喷雾干燥方法的用途。在温和的工艺条件下，将活减毒麻疹病毒与独特的稳定剂的组合一起喷雾干燥。所述稳定剂包括海藻糖、蔗糖、肌醇、精氨酸、甘油和普朗尼克F68。
McAdams等人2012提供了喷雾干燥和疫苗稳定化的综述。
发明概述
本发明提供了用于干燥分离的多糖的方法，其包括喷雾干燥包含所述分离的多糖的液体组合物的步骤。还提供了通过所述方法可获得或获得的分离的多糖，包含通过所述方法可获得或获得的分离的多糖的缀合物，包含所述多糖或缀合物的药物组合物或免疫原性组合物，和涉及其的治疗方法和用途。
发明详述
本发明的一个目的是提供用于制备干燥多糖的改进方法。令人惊讶地，本发明的方法以方便的方式获得了高产率的干燥的、基本上完整的多糖。在一些实施方案中，这是在不使用保护剂、沉淀步骤和/或高浓度的进料多糖溶液的情况下实现的。在进一步实施方案中，喷雾干燥的多糖的特性在期望的规格参数内。
多糖
术语“多糖”是指由通过糖苷键结合在一起的多个单糖单元组成的聚合碳水化合物分子。在一个实施方案中，所述单糖单元可以是修饰的单糖，例如通过添加一个或多个脂质修饰，导致产生脂糖。因此，本发明中使用的多糖可以包括例如脂多糖(包括脂寡糖)。还可以通过添加官能团、诸如o-乙酰基、糖醛酸、己糖胺和甲基戊糖来修饰单糖。
单糖包括戊糖、己糖、脱氧己糖、氨基脱氧己糖、二氨基二脱氧己糖、二氨基三脱氧基己糖、己糖醛酸、氨基脱氧己糖醛酸、庚糖、辛酮糖酸、壬酮糖酸(nonulosonic acid)、支链单糖、具有非碳水化合物取代基(例如，O-甲基、O-(1-羧基乙基)、O-乙酰基、O-乳酸基、O-(2-羟基丙酰基)、O-(2,4-二羟基丁酰基)、磷酸酯、硫酸酯、N-乙酰基、N-羟乙酰基、N-(2-氨基丙酰基)、丙酮酸酯)的单糖。
根据本发明的多糖是分离的。术语“分离的”意指多糖从其正常的自然环境分离，但未进行化学修饰。化学修饰包括缀合至不是糖或分离的多糖的物质(诸如蛋白)。术语蛋白、肽和多肽在本文中可互换使用。因此，根据本发明的分离的多糖未缀合至其他分子，尤其是蛋白。
在一个实施方案中，所述分离的多糖具有约0%至约40% O-乙酰化、诸如小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%或小于约1% O-乙酰化。在一个实施方案中，所述分离的多糖每mM糖重复单元具有至少约0.1、0.2、0.3、0.35或约0.4 mM O-乙酸酯。在另一个实施方案中，所述分离的多糖每mM糖重复单元具有小于约0.01、0.02、0.03、0.04或0.05 mM O-乙酸酯。
在一个替代实施方案中，单糖单元可以是未修饰的。
合适地，所述分离的多糖是分离的荚膜多糖。更合适地，是荚膜分离多糖抗原。荚膜分离多糖抗原是在施用于受试者后能够引发免疫应答的荚膜分离多糖。
荚膜多糖是在细菌细胞的荚膜内天然发现的多糖。因此，它们可以被称为细菌荚膜多糖。荚膜多糖合适地是水溶性的，合适地是酸性或中性的(最合适地是酸性的)，并且合适地具有大约100-2000 kDa的分子量。它们合适地是线性的并且合适地由一至六个单糖的重复亚基组成。
合适地，所述分离的多糖具有约5 kDa至约2,000kDa、更合适地约50 kDa至约1800kDa、更合适地约80 kDa至约1500 kDa、更合适地约100 kDa至约1400 kDa、更合适地约150kDa至约1300 kDa或最合适地约200 kDa至约1200 kDa的分子量。
技术人员将理解，增加分子量有助于增加溶液中多糖的粘度连同多种其他参数。技术人员将理解，当使用太低或太高的粘度时，喷雾干燥效率将降低，并且将调整参数以相应地改变粘度。
合适地，本发明的分离的多糖源自细菌，合适地革兰氏阳性细菌。
在一个实施方案中，所述分离的多糖源自属于选自以下的属的细菌：嗜血杆菌属(诸如流感嗜血杆菌，诸如b型流感嗜血杆菌(Hib))，链球菌属(诸如肺炎链球菌(肺炎球菌))，A群链球菌(GAS，诸如化脓性链球菌)和B群链球菌(GBS))，奈瑟氏菌属(诸如脑膜炎奈瑟氏菌(脑膜炎球菌，血清群A、B、C、W135和/或Y)，克雷伯氏菌属(肺炎克雷伯氏菌)，艰难梭菌，白色假丝酵母，铜绿假单胞菌，沙门氏菌属(诸如伤寒沙门氏菌)，无乳链球菌(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和/或IX型，金黄色葡萄球菌(来自例如血清型5和8)，粪肠球菌或屎肠球菌(三糖重复序列)，小肠结肠炎耶尔森氏菌，霍乱弧菌。在本发明的组合物中可以包括的其他多糖包括葡聚糖(例如真菌葡聚糖，诸如白色假丝酵母中的那些)和真菌荚膜多糖，例如来自新型隐球菌的荚膜。可以包括的另一种多糖是化脓性链球菌群特异性抗原(GAS碳水化合物)。更合适地，所述分离的多糖源自属于链球菌属的细菌，诸如B群链球菌或肺炎链球菌。
所述分离的多糖最合适地源自肺炎链球菌。合适地，在一个实施方案中，所述分离的多糖是肺炎球菌多糖血清型1 (PS1)、肺炎球菌多糖血清型4 (PS4)、肺炎球菌多糖血清型5 (PS5)、肺炎球菌多糖血清型6B (PS6B)、肺炎球菌多糖血清型7F (PS7F)、肺炎球菌多糖血清型9V (PS9V)、肺炎球菌多糖血清型14 (PS14)、肺炎球菌多糖血清型18C (PS18)、肺炎球菌多糖血清型19F (PS19F)、肺炎球菌多糖血清型23F (PS23F)。在一个实施方案中，所述分离的多糖源自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F，更合适地7F或14。
或者，所述分离的多糖选自B群链球菌血清型Ia荚膜分离多糖(CPS Ia)、B群链球菌血清型Ib荚膜分离多糖(CPS Ib)、B群链球菌血清型II荚膜分离多糖(CPS II)、B群链球菌血清型III荚膜分离多糖(CPS III)、B群链球菌血清型IV荚膜分离多糖(CPS IV)和B群链球菌血清型V荚膜分离多糖(CPS V)。更具体地，所述分离的多糖选自B群链球菌血清型Ia荚膜分离多糖(CPS Ia)、B群链球菌血清型Ib荚膜分离多糖(CPS Ib)和B群链球菌血清型IIIa荚膜分离多糖(CPS III)。
通过根据本文所述的任何方法可获得(诸如通过其获得)的分离的多糖形成本发明的一个进一步方面。
多糖产生
分离的多糖可以使用一定范围的方式从细菌获得。例如，可以使所述细菌在发酵容器中生长。在发酵周期结束时，细菌细胞可以被苯酚化学灭活。可以通过例如如下将特定的目标分离多糖与细菌细胞碎片分离：进行一个至惰性硅藻土(例如硅藻土545)上的与CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)的杂质络合步骤，以消除细胞碎片、核酸和蛋白。这随后为超滤步骤，其旨在消除小核酸和苯酚并改变缓冲液用于下一步骤。这然后随后为至惰性硅藻土(例如硅藻土512)上的与CTAB的络合步骤以消除CPS(C-多糖)。
如上所讨论，多糖纯化经常基于使用季铵盐(诸如CTAB或Cetavlon)的沉淀。这种阳离子去垢剂根据其等电点与几种聚阴离子(诸如酸性多糖、核酸和蛋白)形成不溶性复合物。硅藻土用作分散剂(且因此用作助滤剂)，以避免形成不溶性物质。
合适地，本发明的方法在喷雾干燥步骤之前包括至少一个过滤液体组合物的步骤。过滤合适地实现了基本上纯的分离的多糖液体组合物，诸如至少90%纯的，诸如至少95%纯的，诸如至少98%纯的，诸如至少99%纯的，诸如至少99.5%纯的，诸如至少99.8%纯的，诸如至少99.9%纯的，诸如至少99.95%纯的，诸如至少99.99%纯的多糖溶液(w/w)。如本文所用的百分比纯度是指分离的多糖相对于组合物中的其他溶解或悬浮的组分的比例。100%纯的分离的多糖液体组合物由液体溶剂和分离的多糖组成。在这种组合物中不存在其他溶解或悬浮的组分。
可以使用达到适合于喷雾干燥的多糖纯度水平的任何过滤方法。此类方法包括膜过滤，诸如超滤和切向流过滤。
合适地，通过在喷雾干燥步骤之前的至少一个切向流过滤(TFF)步骤，诸如至少两个切向流过滤步骤，来实现过滤。该步骤的目的是从液体组合物除去小的蛋白污染物。合适地，所述方法包括在喷雾干燥步骤之前的至少一个使用硅藻土和CTAB的TFF过滤步骤，诸如至少两个此类过滤步骤。
缀合物
在已经使用本文所述的喷雾干燥方法产生多糖之后，可以将它们与蛋白(例如蛋白载体或抗原性蛋白)或另一种多糖缀合。这将产生本发明的缀合物。
蛋白载体可以是任何蛋白。其可以包含一个或多个T-辅助表位。在本发明的一个实施方案中，所述蛋白载体选自：TT，DT，CRM197，TT的片段C，流感嗜血杆菌的蛋白D，肺炎球菌PhtD和肺炎球菌肺炎球菌溶血素。所述载体蛋白可以是破伤风类毒素(TT)，破伤风类毒素片段C，破伤风毒素的无毒突变体，白喉类毒素(DT)，CRM197，白喉毒素的其他无毒突变体(诸如CRM176, CRM 197, CRM228, CRM9, CRM45, CRM102, CRM103和CRM107以及由Nicholls和Youle于Genetically Engineered Toxins, 编: Frankel, Maecel DekkerInc, 1992中描述的包含其他突变的那些；Glu-148缺失或突变为Asp、Gln或Ser和/或Ala158缺失或突变为Gly和US 4709017或US 4950740中公开的其他突变；至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变以及US 5917017或US 6455673中公开的其他突变；或US 5843711中公开的片段)，肺炎球菌肺炎球菌溶血素(Kuo等人1995)，OMPC (脑膜炎球菌外膜蛋白–通常从脑膜炎奈瑟氏菌血清群B提取 – EP0372501)，合成肽(EP0378881，EP0427347)，热休克蛋白(WO 93/17712， WO 94/03208)，百日咳蛋白(WO 98/58668，EP0471177)，细胞因子，淋巴因子，生长因子或激素(WO 91/01146)，包含来自各种病原体来源的抗原的多种人CD4+ T细胞表位的人工蛋白(Falugi等人2001)，所述抗原诸如N19蛋白(Baraldoi等人2004)肺炎球菌表面蛋白PspA (WO 02/091998)，铁摄取蛋白(WO01/72337)，艰难梭菌的毒素A或B (WO 00/61761)，流感嗜血杆菌蛋白D (EP594610和WO00/56360)，肺炎球菌PhtA (WO 98/18930，也称为Sp36)，肺炎球菌PhtD (在WO 00/37105中公开，并且也称为Sp036D)，肺炎球菌PhtB(在WO 00/37105中公开，并且也称为Sp036B)或PhtE (在WO00/30299中公开，并且称为BVH-3)。最合适地，所述蛋白载体是CRM 197。
所述分离的多糖可以通过任何已知方法(例如，通过Likhite，美国专利4,372,945和Armor等人，美国专利4,474,757的方法)，用任何合适的接头(在必要的情况下)，与载体蛋白连接。分离的多糖可以例如通过使用碳二亚胺(例如EDAC)缩合化学的方法与载体蛋白缀合。
可以使用任何已知的程序，例如在US 4,882,317和US 4,695,624中描述的程序，进行经由接头基团的连接。一种类型的连接涉及将分离的多糖还原胺化，将所得的氨基与己二酸接头基团的一端偶联(EP 0477508, Porro等人 1985, EP 0208375)，且然后将蛋白与己二酸接头基团的另一端偶联。作为使用接头的替代方案，可以使用直接连接。与蛋白的直接连接可以包括将分离的多糖氧化，随后用蛋白进行还原胺化，如例如US 4,761,283和US 4,356,170中所述，或直接CDAP反应。最合适地，所述分离的多糖通过ADH(己二酸二酰肼)接头与蛋白缀合。
所述分离的多糖将通常在缀合之前被活化或官能化。活化可以涉及例如氰化剂，诸如CDAP (1-氰基-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐)(WO 95/08348 & WO 96/29094)。其他合适的技术使用酰肼、活性酯、降硼烷(norborane)、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC或TSTU。
另外，所述分离的多糖可以通过包括以下的技术缀合：(1)经由蛋白官能团{例如，硫醇-硫醇键，胺-羧基键，胺-醛键；酶直接偶联)的直接偶联；(2)胺的同双官能偶联{例如，使用双醛)；(3)硫醇的同双官能偶联{例如，使用双马来酰亚胺)；(4)经由光活化试剂的同双官能偶联，(5)胺与硫醇的异双官能偶联{例如，使用马来酰亚胺)；(6)经由光活化试剂{例如，β-羰基二偶氮家族)的异双官能偶联；(7)经由溴化氰活化或羧甲基化将胺反应性基团引入多糖或寡糖中；(8)经由杂双官能化合物、诸如马来酰亚胺-酰肼将硫醇反应性基团引入多糖或寡糖中；(9)经由将疏水性基团引入蛋白的蛋白-脂质缀合，以及(10)经由将反应性基团引入脂质的蛋白-脂质缀合。还考虑异双官能“非共价偶联”技术，诸如生物素-抗生物素蛋白相互作用。
在一个实施方案中，通过用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯来获得多糖-蛋白缀合物。活化的多糖可以直接或经由间隔基(接头)基团与载体蛋白上的氨基偶联。例如，所述间隔基可以是胱胺或半胱胺，以得到硫醇化的多糖，其可以经由与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如使用GMBS)或卤代乙酰化的载体蛋白(例如，使用碘乙酰亚胺、SIB、SIAB、磺基-SIAB、SIA或SBAP)反应后获得的硫醚键与载体偶联。
在一个方面，将氰酸酯(任选地通过CDAP化学法制得)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联，并且使用碳二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学法将氨基衍生的糖与载体蛋白经由蛋白载体上的羧基缀合。此类缀合物例如描述于国际专利申请公开号WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/29094。
药物组合物
本发明的分离的多糖和缀合物适合用于药物组合物、诸如免疫原性组合物(诸如疫苗组合物)中。
所述分离的多糖可以以1至100 ug/人剂量的药物组合物的量使用。所述分离的多糖可以以约50 ug、例如40至60 ug、合适地45至55 ug或49至51 ug或50 ug的水平使用。在一个进一步实施方案中，人剂量的药物组合物包含水平为约25 ug、例如20至30 ug、合适地21至29 ug或22至28 ug或23至27 ug或24至26 ug或25 ug的分离的多糖。
在一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含本发明的分离的多糖或缀合物以及药学上可接受的赋形剂。
药学上可接受的赋形剂包括本身不诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体产生的任何赋形剂。合适的赋形剂包括水、盐水、甘油、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集物。
在本发明的范围内的药物组合物还可以含有其他化合物，其可以是生物活性的或无活性的。例如，在所述药物组合物内可以存在其他多糖或多肽抗原的一个或多个免疫原性部分，其经由上述缀合方法并入以形成缀合物或作为分开的化合物。
将显而易见的是，药物组合物可以含有药学上可接受的盐。此类盐可以由药学上可接受的无毒碱制备，所述碱包括有机碱(例如伯、仲和叔胺以及碱性氨基酸的盐)和无机碱(例如钠、钾、锂、铵、钙和镁盐)。
尽管本领域普通技术人员已知的任何合适载体可以用于配制的药物组合物中，但载体的类型将取决于施用模式而改变。本发明的组合物可以配制用于任何适当的施用方式，包括例如局部、口服、鼻、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌内施用。对于肠胃外施用，诸如皮下注射，载体优选包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于口服施用，可以采用任何的上述载体或固体载体，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解的微球(例如聚乳酸酯聚羟乙酸酯)也可以用作用于本发明的药物组合物的载体。
如果通过肠胃外施用递送，则所述药物组合物的pH应适合于肠胃外施用。通常，pH将在4.0至9.0的范围内。合适地，pH将在5.0至8.0、尤其是5.25至6.75、诸如6.5至7.5、特别是pH 6.75至7.25的范围内。约6.0的pH是特别令人感兴趣的。可以通过使用缓冲剂(包括例如Tris或磷酸盐缓冲剂)来控制pH。
可以将本发明的分离的多糖和缀合物配制于组合物中以形成免疫原性组合物，其合适地包含免疫刺激剂。免疫刺激剂是增强或加强对外源抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。免疫刺激剂的实例包括佐剂、可生物降解的微球(例如，聚乳酸半乳糖苷(polylactic galactide))和脂质体(向其中并入化合物；参见例如Fullerton，美国专利号4,235,877)。免疫原性组合物的制备一般描述于例如Powell & Newman, 编, VaccineDesign (亚基和佐剂方法(the subunit and adjuvant approach)) (1995)。在一些实施方案中，本文所述的免疫原性组合物可以用作疫苗。
免疫刺激剂的一个实例是佐剂。大多数佐剂含有经设计以保护抗原免于快速分解代谢的物质，诸如氢氧化铝或矿物油，以及免疫应答的刺激剂，诸如脂质A、百日咳博德特氏菌或分枝杆菌属物种或分枝杆菌属来源的蛋白。例如，可以使用去脂的、去糖脂的母牛分枝杆菌(“pVac”)。合适的佐剂是市售的，例如作为弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories, Detroit, MI)；Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc.,Rahway, NJ)；AS01B、AS02A、AS15、AS-2及其衍生物(GlaxoSmithKline, Philadelphia,PA)；CWS(来自结核杆菌(tubercule bacillus)的细胞壁骨架)，TDM(海藻糖双嘧菌酸酯(trehalose_dicorynomycolate))，Leif(利什曼原虫延伸起始因子)，铝盐，诸如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球；单磷酰脂质A (MPL®)(例如3D-MPL)；和quil A(例如QS17或QS21，合适地QS21)。细胞因子，诸如GM CSF或白介素2、-7或-12，也可以用作佐剂。
在一个具体实施方案中，所述免疫原性组合物包含皂苷和TLR4激动剂两者。在一个具体实例中，所述免疫原性组合物包含QS21和3D-MPL。
TLR-4激动剂、诸如脂多糖、诸如3D-MPL可以以1至100 ug/人剂量的免疫原性组合物的量使用。3D-MPL可以以约50 ug，例如40至60 ug，合适地45至55 ug或49至51 ug或50ug的水平使用。在一个进一步实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含水平为约25 ug，例如20至30 ug，合适地21至29 ug或22至28 ug或23至27 ug或24至26 ug或25 ug的3D-MPL。
皂苷、诸如QS21可以以1至100 ug/人剂量的免疫原性组合物的量使用。QS21可以以约50ug，例如40至60 ug，合适地45至55 ug或49至51 ug或50 ug的水平使用。在进一步实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含水平为约25 ug，例如20至30 ug，合适地21至29ug或22至28 ug或23至27 ug或24至26 ug或25 ug的QS21。
在TLR4激动剂和皂苷两者存在于免疫原性组合物中的情况下，则TLR4激动剂与皂苷的重量比合适地为1:5至5:1，合适地为1:2 至 2:1，诸如约1:1。例如，对于每人剂量的免疫原性组合物，在3D-MPL以50ug或25ug的量存在的情况下，则合适地QS21也可以分别以50ug或25ug的量存在。本发明的某些免疫原性组合物包含QS21和3D-MPL，其量为各1至100ug/人剂量，诸如其量为各10至75 ug/人剂量。本发明的免疫原性组合物可以合适地包含QS21和3D-MPL，其量为各15至35 ug/人剂量，诸如其量为各20至30 ug/人剂量。
在一个实施方案中，所述免疫刺激剂是TLR9激动剂，例如如WO 2008/142133中所述。在一个具体实例中，所述TLR9激动剂是免疫刺激性寡核苷酸，尤其是含有未甲基化CpG基序的寡核苷酸。此类寡核苷酸是众所周知的并且描述于例如WO96/02555、WO99/33488和US5,865,462。用于本文所述的免疫原性组合物中的合适的TLR9激动剂是含有CpG的寡核苷酸，任选含有被至少3个、合适地为至少6个或更多个核苷酸分隔的两个或更多二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸和随后的鸟嘌呤核苷酸。
在一个实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯键，或可能是硫代磷酸酯键，尽管也可以使用磷酸二酯键和其他核苷酸间键，包括具有混合核苷酸间键的寡核苷酸。用于产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204。考虑包含不同核苷酸间键的寡核苷酸，例如混合硫代磷酸磷酸二酯。可以使用稳定寡核苷酸的其他核苷酸间键。
通过经由全身或粘膜途径施用所述组合物的方式，所述药物和免疫原性组合物可用于保护或治疗易于感染的哺乳动物。这些施用可以包括经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径的注射；或经由粘膜施用至口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。鼻内施用组合物用于治疗肺炎或中耳炎是优选的(因为可以更有效地防止鼻咽携带肺炎球菌，因此在其最早期减轻感染)。尽管所述组合物可以作为单剂量施用，但其组分也可以在相同时间或不同时间一起共同施用(例如肺炎球菌糖缀合物可以与施用所述组合物的任何细菌蛋白组分分开、同时或其后1-2周施用，用于最佳地协调关于彼此的免疫应答)。对于共同施用，任选的Th1佐剂可以存在于任何或所有不同的施用中。除了单一施用途径以外，可以使用2种不同的施用途径。例如，可以IM(或ID)施用糖或糖缀合物，并且可以IN(或ID)施用细菌蛋白。另外，可以IM施用所述组合物用于引发剂量并且可以IN施用所述组合物用于加强剂量。
在本发明的一个方面，提供了疫苗试剂盒，其包含含有本发明的分离的多糖抗原的小瓶，并且进一步包含含有如本文所述的药物载体的小瓶。预想的是，在本发明的该方面，所述药物载体将用于重构喷雾干燥的多糖抗原。
另外的组合物组分
根据本发明，所述分离的多糖包含在液体组合物中，最合适地包含在水性组合物中。
如以上关于多糖分子量所讨论，技术人员将理解，多种其他参数将影响多糖溶液的粘度。技术人员将理解，当使用太低或太高的粘度时，喷雾干燥效率将降低，并且将调整参数以相应地改变粘度。
所述液体溶液的粘度将影响喷雾干燥性能和最终干燥的多糖粉末的参数。合适地，包含分离的多糖的液体组合物具有1至150 cP、更合适地5至120 cP、更合适地10至100cP、更合适地15至95 cP、更合适地20至90 cP、更合适地25至85 cP的粘度。
合适地，所述液体组合物包含基本上纯的分离的多糖。合适地，所述分离的多糖基本上不含污染物。合适地，所述分离的多糖是基本上纯的，诸如至少90%，诸如至少95%，诸如至少98%，诸如至少99%，诸如至少99.5%，诸如至少99.8%，诸如至少99.9%，诸如至少99.95%，诸如至少99.99%纯的(w/w)。
合适地，所述液体组合物包含至少70%分离的多糖，更合适地至少80%分离的多糖，更合适地至少90%分离的多糖，更合适地至少95%分离的多糖，更合适地至少98%分离的多糖，更合适地至少99%分离的多糖，更合适地至少99.5%分离的多糖，更合适地100%分离的多糖w/w(干重)。
合适地，所述液体组合物包含有限量的污染物。污染物是除了所述分离的多糖以外的任何物质。合适地，所述液体组合物包含小于20%，更合适地小于10%，更合适地小于5%，更合适地小于2%，更合适地小于1%，更合适地小于0.5%，更合适地小于0.2%，更合适地小于0.1%，更合适地小于0.05%，更合适地小于0.01% w/w污染物(干重)。最合适地，所述液体组合物不包含污染物。
合适地，所述液体组合物的污染物:分离的多糖的比率低。合适地，污染物与分离的多糖的比率为0.5:1或更低，更合适地0.3:1或更低，更合适地0.1:1或更低，更合适地0.05:1或更低，更合适地0.01:1或更低(以干重计)。
所述液体组合物可以包含小量蛋白。合适地，所述液体组合物中的蛋白与分离的多糖的比率将通常为0-5% (w/w)，合适地0-4% (w/w)，合适地0-3% (w/w)，合适地0-2% (w/w)，优选地0-1% (w/w)(干重)。在另一个实施方案中，所述液体组合物包含小于1%蛋白，诸如小于0.5%蛋白，诸如小于0.1%蛋白，诸如小于0.05%蛋白，诸如不包含蛋白w/w(干重)。
合适地，所述液体组合物包含有限量的固体。合适地，所述液体组合物包含小于20%，更合适地小于10%，更合适地小于5%，更合适地小于2%，更合适地小于1%，更合适地小于0.5%，更合适地小于0.2%，更合适地小于0.1%，更合适地小于0.05%，更合适地小于0.01% w/w固体(干重)。最合适地，所述液体组合物不包含固体。
所述液体组合物可以包含保护剂。保护剂是保护多糖的结构、基本上防止官能团的分解或丧失的物质，例如玻璃样糖，诸如海藻糖、蔗糖和乳糖。合适地，所述液体组合物中的所有保护剂与所有多糖的比率将通常为0-5% (w/w)，合适地0-4% (w/w)，合适地0-3%(w/w)，合适地0-2% (w/w)，优选地0-1% (w/w)。在另一个实施方案中，所述液体组合物包含小于1% (w/w)，诸如小于0.5% (w/w)，诸如小于0.2% (w/w)，诸如小于0.1% (w/w)，诸如小于0.05% (w/w)，诸如小于0.01% (w/w)保护剂。最合适地，所述液体组合物不包含保护剂。
在一个实施方案中，所述液体组合物包含分离的荚膜多糖和小于1% (w/w)，诸如小于0.5% (w/w)，诸如小于0.2% (w/w)，诸如小于0.1% (w/w)，诸如小于0.05% (w/w)，诸如小于0.01% (w/w)除了分离的多糖以外的碳水化合物。最合适地，所述液体组合物不包含除了分离的荚膜多糖以外的碳水化合物。
在一个实施方案中，所述液体组合物包含分离的荚膜多糖，并且不含除了分离的荚膜多糖以外的碳水化合物。在一个实施方案中，所述液体组合物包含分离的荚膜多糖，并且不包含除了分离的荚膜多糖以外的碳水化合物。
在一个实施方案中，所述液体组合物包含分离的荚膜多糖并且不包含赋形剂。
在一个实施方案中，所述液体组合物包含分离的荚膜多糖，并且除了分离的荚膜多糖以外，不包含碳水化合物、单糖、二糖、环糊精、多糖、淀粉、纤维素、盐、磷酸钠、磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、聚乙二醇(PEG's)、普朗尼克或表面活性剂。
在一个实施方案中，所述液体组合物包含分离的荚膜多糖并且不包含如US 2005/0266011中所定义的赋形剂。
在一个实施方案中，所述液体组合物包含一种多糖，其中所述多糖是分离的荚膜多糖。
在一个实施方案中，所述液体组合物包含一种多糖，其中所述多糖是分离的荚膜多糖，且其中该多糖是所述液体组合物中存在的唯一多糖。
在一个实施方案中，所述液体组合物基本上由溶剂和分离的荚膜多糖组成。在一个实施方案中，所述液体组合物基本上由水和分离的荚膜多糖组成。
在一个实施方案中，所述液体组合物由水和分离的荚膜多糖组成。
合适地，上面提及的分离的荚膜多糖是PS 1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F。
如本文所用的“干重”是指这样的组合物，其中基本上所有溶剂已经被除去，诸如小于0.01%溶剂，诸如小于0.005%溶剂，诸如小于0.001%溶剂，诸如不包含溶剂。
疾病的治疗或预防
在一个实施方案中，提供了本发明的分离的多糖、缀合物或组合物，其用作药物。
在一个进一步实施方案中，提供了本发明的分离的多糖、缀合物或组合物，其用于治疗或预防细菌感染。
在一个进一步实施方案中，提供了本发明的分离的多糖、缀合物或组合物用于制备用于治疗或预防细菌感染的药物的用途。
在一个进一步实施方案中，提供了治疗或预防细菌感染的方法，其包括将安全和有效剂量的本发明的分离的多糖、缀合物或组合物施用于受试者。
合适地，以上段落中提及的细菌属于选自以下的属：嗜血杆菌属(诸如流感嗜血杆菌，诸如b型流感嗜血杆菌(Hib))，链球菌属(诸如肺炎链球菌(肺炎球菌)，A群链球菌)(GBS，诸如化脓性链球菌)和B群链球菌(GBS))，奈瑟氏菌属(诸如脑膜炎奈瑟氏菌(脑膜炎球菌，血清群A、B、C、W135和/或Y)，克雷伯氏菌属(诸如肺炎克雷伯氏菌)，艰难梭菌，白色假丝酵母，铜绿假单胞菌，沙门氏菌属(诸如伤寒沙门氏菌)，无乳链球菌(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和/或VIII型，金黄色葡萄球菌(来自例如血清型5和8)，粪肠球菌或屎肠球菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌，霍乱弧菌。更合适地，属于链球菌属的细菌，诸如B群链球菌或肺炎链球菌。最合适地，肺炎链球菌。
合适地，待治疗的受试者是哺乳动物，最合适地人。
喷雾干燥
喷雾干燥是用于从液体进料产生脱水粉末的方法。喷雾干燥广泛用于食品和制药行业中。干燥通常描述了热除去挥发性物质(水分)以获得固体产品的方法。出于以下原因，需要对各种原料进行干燥：保存和储存，降低运输成本和实现期望的产品质量。
所述方法的喷雾干燥步骤可以使用一定范围的设备设计和操作条件来进行。最佳操作条件可能取决于所选设备的精确设计。
喷雾干燥的步骤可以包括：液体进料雾化，小滴干燥，粉末收集和后续处理。进料的雾化可以使用许多方法来实现。尽管已使用旋转、振动孔口和静电喷雾方法，但用于喷雾干燥药物产品的主要雾化方法利用双流体喷嘴。在此方法中，将液体进料流和加压的雾化流体混合并迫使其离开喷嘴，此时，流体的快速减压和液体流的工程化分散导致液体雾化，将其转化成小滴的喷雾。可以通过改变液体进料的特性(例如，进料浓度、溶剂或表面张力)、雾化流体的性质和喷雾喷嘴的工程化，将液体小滴的特性调整至特定的产品规格。雾化旨在获得最佳的小滴大小。
可以通过旋转轮、旋风分离器(cyclone)和/或旋转喷嘴来实现雾化。考虑到它们将影响该方法期间液体组合物将被暴露的潜在破坏性剪切力，因此还需要控制雾化参数。小滴被分散至通常由加热、干燥、惰性气体组成的干燥环境中。材料对干燥环境的暴露由干燥室控制，所述干燥室可以被设计成将进料喷雾引入干燥气体的并流或逆流中。然后将干燥气体过滤，除湿并在密闭系统中返回至干燥室。气体也可以过滤并在开放系统中释放至外部环境。相对于溶剂蒸发的焓而言，干燥环境的温度对于产生干燥产品是至关重要的。随着小滴干燥，溶解/悬浮的材料浓缩，直至饱和，在此时，在剩余的进料液周围可以形成固体层。
随后的干燥随着溶剂蒸气通过干燥的外层的交换而发生。由于蒸发冷却，干燥小滴的温度将低于或等于周围干燥气体的温度。必须控制干燥气体的温度，使得疫苗不暴露于有害的高温。
一旦干燥，必须从干燥环境收集颗粒。可以使用旋风收集器中的颗粒惯性，通过撞击至过滤器或通过静电沉淀，来实现将干燥颗粒与干燥气体的分离。散装粉末可以在流化床上进一步干燥，用额外的赋形剂包衣或包封或与其他粉末共混。最终的疫苗粉末可以散装储存，或者重新包装到单剂量或多剂量容器中。
喷雾干燥相对于冻干的优势在于，在连续过程中生产可控、均一的产品，无需冷冻，所述过程更容易按比例放大，并且可得到多种产品填充选项。另一方面，冻干更耗时，具有高功率要求，并且需要大的操作空间(McAdams等人 2012)。
合适地，在喷雾干燥过程期间分离的多糖经历的最高温度不大于200℃，更合适地不大于190℃，更合适地不大于185℃，更合适地不大于180℃。
合适地，所述喷雾干燥器具有不大于200℃、更合适地不大于150℃、更合适地不大于130℃、更合适地不大于120℃的入口温度。合适地，所述喷雾干燥器具有100至200℃、更合适地110至190℃、更合适地120至170℃的入口温度。
合适地，所述喷雾干燥器具有不大于100℃、更合适地不大于80℃、更合适地不大于70℃、更合适地不大于65℃的出口温度。合适地，所述喷雾干燥器具有40至80℃、更合适地45至70℃、更合适地50至65℃的出口温度。
合适地，所述喷雾干燥器中的液体组合物的进料流速为0.1至50L/H，更合适地0.3至25L/H，更合适地0.5至20L/H，更合适地0.8至10L/H。
技术人员将理解，流速和/或涡轮转速的增加可以补偿较高的入口和出口温度。可以调节这些(和其他)喷雾干燥参数以优化工艺，只要大部分多糖在处理期间保持不受损即可。
合适地，所述方法不需要沉淀步骤。现有技术的许多方法需要沉淀步骤以在干燥之前纯化多糖，这需要大量的溶剂。在本发明中使用喷雾干燥步骤消除了沉淀步骤的需要，导致与先前的方法相比，在新方法期间溶剂的消耗低得多。
合适地，所述方法不需要沉淀步骤。现有技术的许多方法需要沉淀步骤以在干燥之前纯化多糖，这需要大量的溶剂，诸如醇。这种醇的量可能作为污染物保留在干燥的多糖中。
根据本发明，已经令人惊讶地发现，低浓度的多糖溶液可用于有效的喷雾干燥方法中。合适地，所述液体组合物中多糖的浓度为0.01至20g/L，更合适地0.1至15g/L，更合适地0.5至13g/L，更合适地0.7至11g/L，更合适地0.9至10g/L。
在一个实施方案中，本发明的方法包括在喷雾干燥包含分离的多糖的液体组合物的步骤之前，过滤包含分离的多糖的组合物(合适地通过超滤)的步骤。更合适地，所述方法包括在进行上述步骤之前，澄清包含分离的多糖的组合物的步骤。更合适地，以上过滤步骤包括以下步骤或更合适地由以下步骤组成：浓缩，第1渗滤，第2渗滤和冲洗步骤。
在一个进一步实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：过滤包含分离的多糖的组合物(合适地通过超滤)，随后澄清，随后过滤(合适地超滤)，随后进一步过滤(合适地超滤)，随后进一步澄清，随后进一步过滤(合适地超滤)，随后将包含分离的多糖的液体组合物喷雾干燥。
合适地，在上述步骤之前，本发明的方法包括发酵以产生多糖、随后失活的步骤。
条款
描述本发明的一些具体实施方案的条款如下：
1. 用于干燥分离的多糖的方法，其包括喷雾干燥包含所述分离的多糖的液体组合物的步骤。
2. 根据条款1所述的方法，其中所述分离的多糖是分离的荚膜多糖。
3. 根据条款2所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖是抗原。
4. 根据条款2或3所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖源自革兰氏阳性细菌。
5. 根据条款4所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖源自链球菌细菌。
6. 根据条款5所述的方法，其中所述细菌是B群链球菌或肺炎链球菌物种的细菌。
7. 根据条款6所述的方法，其中所述细菌是肺炎链球菌物种的细菌。
8. 根据条款7所述的方法，其中所述细菌是肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的细菌。
9. 根据条款7所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖是PS 1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F。
10. 根据条款1至9中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含小于1% (w/w)蛋白。
11. 根据条款10所述的方法，其中所述液体组合物不包含任何蛋白。
12. 根据条款1至11中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含小于1% (w/w)保护剂。
13. 根据条款12所述的方法，其中所述液体组合物不包含任何保护剂。
14. 根据条款1至13中任一项所述的方法，其中所述分离的多糖为至少99% (w/w)纯的。
15. 根据条款1至14中任一项所述的方法，其中所述喷雾干燥步骤具有0.3至25L/H的进料流速。
16. 根据条款1至15中任一项所述的方法，其中在所述喷雾干燥步骤中使用的喷雾干燥器具有110至190℃的入口温度。
17. 根据条款1至16中任一项所述的方法，其中在所述喷雾干燥步骤中使用的喷雾干燥器具有45至70℃的出口温度。
18. 根据条款1至17中任一项所述的方法，其中所述液体组合物中的多糖的浓度为0.5至13g/L。
19. 根据条款1至18中任一项所述的方法，其中所述液体组合物的粘度为15至95cP。
20. 根据条款1至19中任一项所述的方法，其中所述方法在所述喷雾干燥步骤之前进一步包括至少一个过滤步骤。
21. 根据条款1至20中任一项所述的方法，其中所述液体组合物在喷雾干燥之前进行过滤。
22. 根据条款21所述的方法，其中所述液体组合物通过切向流过滤进行过滤。
23. 根据条款21或22所述的方法，其中所述液体组合物在喷雾干燥之前过滤至少两次。
24. 根据条款1至23中任一项所述的方法，其中所述方法不包括絮凝步骤。
25. 根据条款1至23中任一项所述的方法，其中所述方法不包括沉淀步骤。
26. 根据条款1至23中任一项所述的方法，其中所述液体组合物未用醇处理。
27. 分离的多糖，其通过根据条款1至26中任一项所述的方法可获得或获得。
28. 缀合物，其包含条款27的分离的多糖。
29. 条款28的缀合物，其中所述多糖缀合至蛋白。
30. 条款29的缀合物，其中所述分离的多糖通过ADH (己二酸二酰肼)接头缀合至蛋白。
31. 药物组合物，其包含条款1至30中任一项的分离的多糖或缀合物和药学上可接受的赋形剂。
32. 免疫原性组合物，其包含条款1至30中任一项的分离的多糖或缀合物和免疫刺激剂。
33. 根据条款1至32中任一项所述的分离的多糖、缀合物或组合物，其用作药物。
34. 根据条款33所述的分离的多糖、缀合物或组合物，其用于治疗或预防细菌感染。
35. 根据条款1至32中任一项所述的分离的多糖、缀合物或组合物在制备用于治疗或预防细菌感染的药物中的用途。
36. 用于治疗或预防细菌感染的方法，其包括将根据条款1至30中任一项所述的分离的多糖、缀合物或组合物施用于受试者。
37. 根据条款33至36中任一项所述使用的分离的多糖、缀合物或组合物，所述用途或所述方法，其中所述细菌感染由属于链球菌属的细菌引起。
38. 根据条款37所述使用的分离的多糖、缀合物或组合物，所述用途或所述方法，其中所述细菌感染由属于B群链球菌或肺炎链球菌物种的细菌引起。
39. 根据条款38所述使用的分离的多糖、缀合物或组合物，所述用途或所述方法，其中所述细菌感染由属于肺炎链球菌物种的细菌引起。
40. 喷雾干燥器用于干燥包含分离的荚膜多糖的液体组合物中的分离的多糖的用途。
进一步条款
描述本发明的一些具体实施方案的进一步条款如下：
1. 用于干燥分离的多糖的方法，其包括喷雾干燥包含所述分离的多糖的液体组合物的步骤。
2. 根据条款1所述的方法，其中所述分离的多糖是分离的荚膜多糖。
3. 根据条款2所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖是抗原。
4. 根据条款2或3所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖源自革兰氏阳性细菌。
5. 根据条款4所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖源自链球菌细菌。
6. 根据条款5所述的方法，其中所述细菌是B群链球菌或肺炎链球菌物种的细菌。
7. 根据条款6所述的方法，其中所述细菌是肺炎链球菌物种的细菌。
8. 根据条款7所述的方法，其中所述细菌是肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的细菌。
9. 根据条款7所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖是PS 1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F。
10. 根据条款6所述的方法，其中所述细菌是无乳链球菌物种的细菌。
11. 根据条款10所述的方法，其中所述细菌是无乳链球菌(GBS)血清型Ia、Ib、II、III、IV或V的细菌。
12. 根据条款11所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖是PS Ia、Ib、II、III、IV或V。
13. 根据条款1至12中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含小于1% (w/w)蛋白。
14. 根据条款13所述的方法，其中所述液体组合物不包含任何蛋白。
15. 根据条款1至14中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含小于1% (w/w)保护剂。
16. 根据条款15所述的方法，其中所述液体组合物不包含任何保护剂。
17. 根据条款1至16中任一项所述的方法，其中所述分离的多糖为至少99% (w/w)纯的。
18. 根据条款1至17中任一项所述的方法，其中所述喷雾干燥步骤具有0.3至25L/H的进料流速。
19. 根据条款1至18中任一项所述的方法，其中在所述喷雾干燥步骤中使用的喷雾干燥器具有110至190℃的入口温度。
20. 根据条款1至19中任一项所述的方法，其中在所述喷雾干燥步骤中使用的喷雾干燥器具有45至70℃的出口温度。
21. 根据条款1至20中任一项所述的方法，其中所述液体组合物中的多糖的浓度为0.5至13g/L。
22. 根据条款1至21中任一项所述的方法，其中所述液体组合物的粘度为15至95cP。
23. 根据条款1至22中任一项所述的方法，其中所述方法在所述喷雾干燥步骤之前进一步包括至少一个过滤步骤。
24. 根据条款1至23中任一项所述的方法，其中所述液体组合物在喷雾干燥之前进行过滤。
25. 根据条款24所述的方法，其中所述液体组合物通过切向流过滤进行过滤。
26. 根据条款24或25所述的方法，其中所述液体组合物在喷雾干燥之前过滤至少两次。
27. 根据条款1至26中任一项所述的方法，其中所述方法不包括絮凝步骤。
28. 根据条款1至26中任一项所述的方法，其中所述方法不包括沉淀步骤。
29. 根据条款1至26中任一项所述的方法，其中所述液体组合物未用醇处理。
30. 根据条款1至29中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含分离的荚膜多糖和小于1% (w/w)，诸如小于0.5% (w/w)，诸如小于0.2% (w/w)，诸如小于0.1% (w/w)，诸如小于0.05% (w/w)，诸如小于0.01% (w/w)除了分离的多糖以外的碳水化合物。
31. 根据条款30所述的方法，其中所述液体组合物不包含除了分离的荚膜多糖以外的碳水化合物。
32. 根据条款1至29中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含分离的荚膜多糖，并且不含除了分离的荚膜多糖以外的碳水化合物。
33. 根据条款1至29中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含分离的荚膜多糖，并且不包含除了分离的荚膜多糖以外的碳水化合物。
34. 根据条款1至29中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含分离的荚膜多糖并且不包含赋形剂。
35. 根据条款1至29中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含分离的荚膜多糖，并且除了分离的荚膜多糖以外，不包含碳水化合物、单糖、二糖、环糊精、多糖、淀粉、纤维素、盐、磷酸钠、磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、聚乙二醇(PEG's)、普朗尼克或表面活性剂。
36. 根据条款1至29中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含分离的荚膜多糖并且不包含如US 2005/0266011中所定义的赋形剂。
37. 根据条款1至29中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含一种多糖，其中所述多糖是分离的荚膜多糖。
38. 根据条款1至29中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含一种多糖，其中所述多糖是分离的荚膜多糖，且其中该多糖是所述液体组合物中存在的唯一多糖。
39. 根据条款1至29中任一项所述的方法，其中所述液体组合物基本上由溶剂和分离的荚膜多糖组成。在一个实施方案中，所述液体组合物基本上由水和分离的荚膜多糖组成。
40. 根据条款1至29中任一项所述的方法，其中所述液体组合物由水和分离的荚膜多糖组成。
41. 分离的多糖，其通过根据条款1至40中任一项所述的方法可获得或获得。
42. 缀合物，其包含条款41的分离的多糖。
43. 条款42的缀合物，其中所述多糖缀合至蛋白。
44. 条款43的缀合物，其中所述分离的多糖通过ADH (己二酸二酰肼)接头缀合至蛋白。
45. 药物组合物，其包含条款1至44中任一项的分离的多糖或缀合物和药学上可接受的赋形剂。
46. 免疫原性组合物，其包含条款1至44中任一项的分离的多糖或缀合物和免疫刺激剂。
47. 根据条款1至46中任一项所述的分离的多糖、缀合物或组合物，其用作药物。
48. 根据条款47所述的分离的多糖、缀合物或组合物，其用于治疗或预防细菌感染。
49. 根据条款1至46中任一项所述的分离的多糖、缀合物或组合物在制备用于治疗或预防细菌感染的药物中的用途。
50. 用于治疗或预防细菌感染的方法，其包括将根据条款1至46中任一项所述的分离的多糖、缀合物或组合物施用于受试者。
51. 根据条款48至50中任一项所述使用的分离的多糖、缀合物或组合物，所述用途或所述方法，其中所述细菌感染由属于链球菌属的细菌引起。
52. 根据条款40所述使用的分离的多糖、缀合物或组合物，所述用途或所述方法，其中所述细菌感染由属于B群链球菌或肺炎链球菌物种的细菌引起。
53. 根据条款52所述使用的分离的多糖、缀合物或组合物，所述用途或所述方法，其中所述细菌感染由属于肺炎链球菌物种的细菌引起。
为了可以更好地理解本发明，阐述以下实施例。这些实施例仅用于举例说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
制备十种水溶液，其各自包含一种不同的肺炎链球菌多糖。将这些溶液过滤并通过切向流过滤进行浓缩，且然后喷雾干燥。
建立的这些多糖的干燥方法涉及乙醇沉淀，随后过滤，以回收作为沉淀的多糖，将其真空干燥。这些实验的目的是使用喷雾干燥产生满足要求规格的粉末形式的干燥多糖，并获得与该建立的干燥方法的产率相当的产率。
以下实施例提供了产率-优化研究以及与建立的干燥多糖规格参数的比较两者。对于产率-优化工作，将源自建立的方法的多糖粉末溶解于水以达到期望浓度，然后经历喷雾干燥。为了与建立的干燥多糖规格参数进行比较，从建立的方法的第2硅藻土洗脱步骤取3升样品的等分试样，并将该等分试样喷雾干燥以获得用于分析的粉末。
“第2硅藻土洗脱(E2Cl)”是指从硅藻土过滤步骤取出用于进一步测试的总溶液的百分比。喷雾干燥程序的规模小于建立的沉淀方法。因此，当喷雾干燥时取出的总溶液的百分比总是低于当使用建立的沉淀方法时取出的总溶液的百分比，且因此可以预期收集的产物更低。
这些研究中最重要的参数是干燥后多糖的产率、水含量和完整性。
以下实施例中使用的技术：
HPSEC
HPSEC (%)是指对样品进行的高压大小排阻色谱程序，以确定在所述方法中回收的完整多糖的百分比。使用两个不同的柱(TSKgel G5000 PWXL和Tosoh GMPWXL)，其各自都具有折射率检测器。折射率变化与溶液浓度直接相关。因此，洗脱时间和电阻桥输出发出特定大小的分子的相对丰度的信号。
MSD通过测量以下比率来评估：
Figure 757885DEST_PATH_IMAGE001
。
NMR
在以下实施例中使用NMR来测定多糖中存在的特定官能团(包括o-乙酰基、糖醛酸、己糖胺和甲基戊糖)的含量。这种分析与用于疫苗用途的多糖的QC释放测试一致。下表列出经由NMR研究的每种纯化的本体多糖的官能团。
Figure 81550DEST_PATH_IMAGE002
Karl Fisher
Karl Fisher是一种用于测量样品中的水含量的分析技术。Karl-Fisher滴定涉及两个反应。在第一反应中，醇(甲醇)、二氧化硫和碱反应以形成烷基亚硫酸盐中间体。其次，该烷基亚硫酸盐与碘和样品中的水分(water content)反应(氧化反应)。水和碘以等摩尔消耗，如果已知碘的消耗量的话；这允许定量样品中存在的水量：
Figure 861287DEST_PATH_IMAGE003
。
MALLS
静态光散射是一种使用由分子散射的光的强度与其分子量和大小之间的关系来测量分子量的技术。当光子(入射光束)撞击分子时，来自光子的一些能量用于引发分子内的振荡偶极子。该能量随后被分子在所有方向上作为光重新发射。该关系由瑞利理论描述，所述瑞利理论称分子的分子量与散射光的瑞利比成正比。另一个因素，角度依赖性(分子的大小)也影响散射光的强度。分子大小(在静态光散射中)的一种常用值是回转半径(Rg)。
瑞利方程为：
Figure 53234DEST_PATH_IMAGE004
　　　　　(方程1)
其中：
C = 样品浓度
Figure 867607DEST_PATH_IMAGE005
= 测量角度
Figure 96594DEST_PATH_IMAGE006
= 在测量角度
Figure 363627DEST_PATH_IMAGE005
下的瑞利比(散射光强度与入射光强度之比)。
Mw = 分子量
A2 = 第二维里系数
K和
Figure 234631DEST_PATH_IMAGE007
是更复杂的项；
Figure 903510DEST_PATH_IMAGE008
　　　　　(方程2)
其中：
Figure 896874DEST_PATH_IMAGE009
= 在真空中的激光波长
Figure 182361DEST_PATH_IMAGE010
= 阿伏加德罗氏数
Figure 919373DEST_PATH_IMAGE011
= 溶剂的折射率
Figure 633905DEST_PATH_IMAGE012
= 样品的折射率增量
并且，最后：
Figure 63750DEST_PATH_IMAGE013
　　　　　(方程3)
其中Rg = 分子的回转半径。
多角度激光光谱仪(MALLS或MALS)是一种收集许多角度的散射光的检测器。该技术可以用作SEC色谱(检测器)的一部分，并且允许确定分析的分析物的分子量。用多角度散射数据，可以计算回转半径以给出分子的大小。通过在纪尼厄图(Guinier plot)上以不同角度绘制所有该光强度数据，可以将最佳拟合线外推回0°，由此可以计算分子量。该线的初始斜率使得能够准确计算分子大小Rg。完成图并外推回0°。从截距计算分子量，并且从该线的初始斜率计算Rg。
通过重量测定方法的水含量
水分含量是喷雾干燥后粉末的最常测量的特性之一。在该研究中，使用HalogenMoisture Analyzer METTLER TOLEDO HG53。该仪器按照热重原理工作：在测量开始时，水分分析仪(Moisture Analyzer)测定样品的重量，然后通过整体的卤素加热模块快速加热样品，并且水分蒸发。在干燥过程期间，该仪器不断测量样品的重量并展示水分的减少。一旦已经完成干燥，样品的水分或固体含量被展示为最终结果。
实施例1 - PS 1
用溶解的PS 1进行实验，其显示可以通过调节喷雾干燥参数增加产率。在后续实验中使用且在下表中概述的条件在产率、水含量和粉末流动性的方面改进了最终粉末。发现通过改变某些参数，喷雾干燥产率增加17%。
初始实验 后续实验
喷雾的体积(L) 1.5 2.0
粘度(cP) 110 50
T℃ 入/出 190/85 160/80
固体含量(%) 1.10 0.45
进料流速(L/H) 1.0 0.5
喷雾干燥产率(%) 44 61
通过重量测定方法的水含量(%) 11.0 10.5
使用PS 1进行进一步实验。根据以下参数将包含PS 1的溶液喷雾干燥。
喷雾的体积(L) 1.4
粘度(cP) 55
T℃ 入/出 160/80
进料流速(L/H) 0.5
产生流体粉末。在测试结束后，检查干燥室，并且仅观察到很少沉淀。对粉末进行表征，并将其与建立的沉淀/干燥的过程后获得的粉末进行比较。结果在下面提供。
Figure 977479DEST_PATH_IMAGE014
总之，通过每种方法产生的粉末表明相似的特性。喷雾干燥的多糖符合规格参数。
用溶解的PS 1进行的后续实验已经显示，在喷雾干燥试验后，多糖的完整性得以保留。结果在下面提供。
沉淀 喷雾干燥
T℃ 入/出 NA 190/85
HPSEC MALLS (kDa) 703 714
Rw (多糖的均方根半径，nm) 61.8 59.5
Mw/Mn (多分散性) 1.199 1.219
实施例2 - PS 4
用溶解的PS 4进行实验，其显示可以通过调节喷雾干燥参数增加产率。在后续实验中使用且在下表中概述的条件在产率、水含量和粉末流动性的方面改进了最终粉末。发现通过降低进料溶液中的多糖浓度，喷雾干燥产率增加23%。
初始实验 后续实验
喷雾的体积(L) 2.8 1.4
粘度(cP) / 50
T℃ 入/出 160/80 160/80
固体含量(%) 0.6 0.36
进料流速(L/H) 0.5 0.5
喷雾干燥产率(%) 71 92
通过重量测定方法的水含量(%) 10.0 9.5
使用PS 4进行进一步实验。根据以下参数将包含PS 4的溶液喷雾干燥。
喷雾的体积(L) 1.39
粘度(cP) 60
T℃ 入/出 160/80
进料流速(L/H) 0.5
产生流体粉末。在测试结束后，检查干燥室，并且仅观察到很少沉淀。对粉末进行表征，并将其与建立的沉淀/干燥的过程后获得的粉末进行比较。结果在下面提供。
Figure 252603DEST_PATH_IMAGE015
总之，通过每种方法产生的粉末表明相似的特性。实现高产率，并且喷雾干燥的多糖符合规格参数。
用溶解的PS 4进行的后续实验已经显示，在喷雾干燥试验后，多糖的完整性得以保留。结果在下面提供。
沉淀 喷雾干燥
T℃ 入/出 NA 190/85
HPSEC MALLS (kDa) 364 344
Rw (nm) 56.9 55.0
Mw/Mn 1.230 1.244
实施例3 - PS 5
用溶解的PS 5进行实验，其显示可以通过调节喷雾干燥参数增加产率。在后续实验中使用且在下表中概述的条件在产率、水含量和粉末流动性的方面改进了最终粉末。发现通过降低进料溶液中的多糖浓度，喷雾干燥产率增加24 %。
初始实验 后续实验
喷雾的体积(L) 0.4 2.5
粘度(cP) 75 -
T℃ 入/出 160/80 160/80
固体含量(%) 1.0 0.4
进料流速(L/H) 0.5 0.7
喷雾干燥产率(%) 60 84
通过重量测定方法的水含量(%) 10.0 7.3
使用PS 5进行进一步实验。根据以下参数将包含PS 5的溶液喷雾干燥。
喷雾的体积(L) 1.63
粘度(cP) 40
T℃ 入/出 160/80
进料流速(L/H) 0.5
产生流体粉末。在测试结束后，检查干燥室，并且仅观察到很少沉淀。对粉末进行表征，并将其与建立的沉淀/干燥的过程后获得的粉末进行比较。结果在下面提供。
Figure 427232DEST_PATH_IMAGE016
总之，通过每种方法产生的粉末表明相似的特性。喷雾干燥的多糖符合规格参数。
用溶解的PS 5进行的后续实验已经显示，在喷雾干燥试验后，多糖的完整性得以保留。结果在下面提供。
沉淀 喷雾干燥
T℃ 入/出 / 140/160
HPSEC MALLS (kDa) 364 368
Rw (nm) 48.6 46.3
Mw/Mn 1.241 1.267
实施例4 – PS 6B
用溶解的PS 6B进行实验，其显示可以通过调节喷雾干燥参数增加产率。在后续实验中使用且在下表中概述的条件在产率、水含量和粉末流动性的方面改进了最终粉末。发现通过降低进料溶液中的多糖浓度，喷雾干燥产率增加10 %。
初始实验 后续实验
喷雾的体积(L) 1.3 1.9
粘度(cP) NA 65
T℃ 入/出 190/85 190/85
固体含量(%) 1.1 0.5
进料流速(L/H) 1.0 0.9
喷雾干燥产率(%) 50 60
通过重量测定方法的水含量(%) 10.2 8.1
使用PS 6B进行进一步实验。根据以下参数将包含PS 6B的溶液喷雾干燥。
喷雾的体积(L) 1.7
粘度(cP) 80
T℃ 入/出 160/80
进料流速(L/H) 0.4
产生流体粉末。在测试结束后，检查干燥室，并且仅观察到很少沉淀。对粉末进行表征，并将其与建立的沉淀/干燥的过程后获得的粉末进行比较。结果在下面提供。
Figure 762398DEST_PATH_IMAGE017
总之，通过每种方法产生的粉末表明相似的特性。喷雾干燥的多糖符合规格参数。
用溶解的PS 6B进行的后续实验已经显示，在喷雾干燥试验后，多糖的完整性得以保留。结果在下面提供。
沉淀 喷雾干燥
T℃ 入/出 NA 190/85
HPSEC MALLS (kDa) 1330 1226
Rw (nm) 59.0 58.3
Mw/Mn 1.179 1.198
实施例5 – PS 9V
用溶解的PS 9V进行实验，其显示可以通过调节喷雾干燥参数增加产率。在后续实验中使用且在下表中概述的条件在产率、水含量和粉末流动性的方面改进了最终粉末。发现通过降低进料溶液中的多糖浓度，喷雾干燥产率增加25 %。
初始实验 后续实验 后续实验
喷雾的体积(L) 1.5 1.5 2.6
粘度(cP) 110 70 -
T℃ 入/出 190/85 160/80 160/80
固体含量(%) 1.1 0.5 0.6
进料流速(L/H) 0.9 0.5 0.5
喷雾干燥产率(%) 41 66 62
通过重量测定方法的水含量(%) 9.4 10.1 7.6
使用PS 9V进行进一步实验。根据以下参数将包含PS 9V的溶液喷雾干燥。
喷雾的体积(L) 1.3
粘度(cP) 60
T℃ 入/出 160/80
进料流速(L/H) 0.5
产生流体粉末。在测试结束后，检查干燥室，并且仅观察到很少沉淀。对粉末进行表征，并将其与建立的沉淀/干燥的过程后获得的粉末进行比较。结果在下面提供。
Figure 163424DEST_PATH_IMAGE018
总之，通过每种方法产生的粉末表明相似的特性。
用溶解的PS 9V进行的后续实验已经显示，在喷雾干燥试验后，多糖的完整性得以保留。结果在下面提供。
沉淀 喷雾干燥
T℃ 入/出 NA 190/85
HPSEC MALLS (kDa) 1409 1410
Rw (nm) 73.6 72.4
Mw/Mn 1.241 1.226
实施例6 – PS 18C
用溶解的PS 18C进行实验，其显示可以通过调节喷雾干燥参数增加产率。在后续实验中使用且在下表中概述的条件在产率、水含量和粉末流动性的方面改进了最终粉末。发现通过改变某些参数，喷雾干燥产率增加48 %。
初始实验 后续实验
喷雾的体积(L) 1.0 3.2
粘度(cP) - 50
T℃ 入/出 200/85 160/80
固体含量(%) 1.7 0.3
进料流速(L/H) 1.0 0.5
喷雾干燥产率(%) 20 71
通过重量测定法的水含量(%) 13.3 8.5
使用PS 18C进行进一步实验。根据以下参数将包含PS 18C的溶液喷雾干燥。
喷雾的体积(L) 0.8
粘度(cP) 60
T℃ 入/出 160/80
进料流速(L/H) 0.4
产生流体粉末。在测试结束后，检查干燥室，并且仅观察到很少沉淀。对粉末进行表征，并将其与建立的沉淀/干燥的过程后获得的粉末进行比较。结果在下面提供。
Figure 242238DEST_PATH_IMAGE019
总之，通过每种方法产生的粉末表明相似的特性。喷雾干燥的多糖符合规格参数。
用溶解的PS 9V进行的后续实验已经显示，在喷雾干燥试验后，多糖的完整性得以保留。结果在下面提供。
沉淀 喷雾干燥
T℃ 入/出 NA 220/95
HPSEC MALLS (kDa) 574 582
Rw (nm) 64.8 65.0
Mw/Mn 1.102 1.098
实施例7 – PS 19F
用溶解的PS 19F进行喷雾干燥实验。实验中使用的条件概述于下表中。
初始实验 后续实验
喷雾的体积(L) 3.3 0.9
粘度(cP) - -
T℃ 入/出 120/50 120/55
固体含量(%) 0.5 0.9
进料流速(L/H) 0.5 0.5
喷雾干燥产率(%) 49 48
通过重量测定法的水含量(%) 12.1 12.0
使用PS 19F进行进一步实验。根据以下参数将包含PS 19F的溶液喷雾干燥。
喷雾的体积(L) 3.3
粘度(cP) -
T℃ 入/出 120/50
进料流速(L/H) 0.75
产生流体粉末。对粉末进行表征，并将其与建立的沉淀/干燥的过程后获得的粉末进行比较。结果在下面提供。
Figure 271374DEST_PATH_IMAGE020
总之，通过每种方法产生的粉末表明相似的特性。喷雾干燥的多糖符合规格参数。
用溶解的PS 19F进行的后续实验已经显示，在喷雾干燥试验后，多糖的完整性得以保留。结果在下面提供。
沉淀 喷雾干燥
T℃ 入/出 NA 190/85 120/55
HPSEC MALLS (kDa) 1103 773 1040
Rw (nm) 81.4 64.0 78.1
Mw/Mn 1.366 1.478 1.413
实施例8 – PS 23F
用溶解的PS 23F进行实验，其显示可以通过调节喷雾干燥参数增加产率。在后续实验中使用且在下表中概述的条件在产率、水含量和粉末流动性的方面改进了最终粉末。发现通过改变参数，喷雾干燥产率增加14 %。
初始实验 后续实验
喷雾的体积(L) 1.5 1.9
粘度(cP) - -
T℃ 入/出 190/85 160/75
固体含量(%) 0.5 0.3
进料流速(L/H) 1.0 0.5
喷雾干燥产率(%) 53 67
通过重量测定法的水含量(%) 8.1 6.7
使用PS 23F进行进一步实验。根据以下参数将包含PS 23F的溶液喷雾干燥。
喷雾的体积(L) 1.0
粘度(cP) 85
T℃ 入/出 180/60
进料流速(L/H) 0.5
产生流体粉末。在测试结束后，检查干燥室，并且仅观察到很少沉淀。对粉末进行表征，并将其与建立的沉淀/干燥的过程后获得的粉末进行比较。结果在下面提供。
Figure 43021DEST_PATH_IMAGE021
总之，通过每种方法产生的粉末表明相似的特性。喷雾干燥的多糖符合规格参数。
用溶解的PS 23F进行的后续实验已经显示，在喷雾干燥试验后，多糖的完整性得以保留。结果在下面提供。
沉淀 喷雾干燥
T℃ 入/出 / 190/85
HPSEC MALLS (kDa) 1249 1207
Rw (nm) 76.4 74.5
Mw/Mn 1.239 1.221
实施例9 – PS 7F
用溶解的PS 7F进行实验，其显示可以通过调节喷雾干燥参数增加产率。在后续实验中使用且在下表中概述的条件在产率、水含量和粉末流动性的方面改进了最终粉末。发现通过改变某些参数，喷雾干燥产率增加17%。
初始实验 后续实验
喷雾的体积(L) 2.0 1.5
粘度(cP) / 25
T℃ 入/出 140/60 190/85
固体含量(%) 0.5 1.1
进料流速(L/H) 0.7 0.6
喷雾干燥产率(%) 55 72
使用PS 7F进行进一步实验。根据以下参数将包含PS 7F的溶液喷雾干燥。
喷雾的体积(L) 1.7
粘度(cP) 25
T℃ 入/出 140/65
进料流速(L/H) 0.5
产生流体粉末。对粉末进行表征，并将其与建立的沉淀/干燥的过程后获得的粉末进行比较。结果在下面提供。
Figure 665763DEST_PATH_IMAGE022
由于多糖具有中性电荷，在本实施例中使用Q琼脂糖(Q seph)离子交换柱用于纯化。总之，通过每种方法产生的粉末表明相似的特性。实现高产率，并且喷雾干燥的多糖符合规格参数。
用溶解的PS 7F进行的后续实验已经显示，在喷雾干燥试验后，多糖的完整性得以保留。结果在下面提供。
沉淀 喷雾干燥
T℃ 入/出 NA 190/85
HPSEC MALLS (kDa) 1004 969
Rw (nm) 49.9 49.7
Mw/Mn 1.219 1.254
实施例10 - PS 14
用溶解的PS 14进行实验，其显示可以通过调节喷雾干燥参数增加产率。在后续实验中使用且在下表中概述的条件在产率、水含量和粉末流动性的方面改进了最终粉末。发现通过改变某些参数，喷雾干燥产率增加7 %。
初始实验 后续实验
喷雾的体积(L) 1.2 2.0
粘度(cP) 50 25
T℃ 入/出 140/65 160/80
固体含量(%) 1.4 0.9
进料流速(L/H) 0.5 0.5
喷雾干燥产率(%) 57 64
使用PS 14进行进一步实验。根据以下参数将包含PS 14的溶液喷雾干燥。
喷雾的体积(L) 1.0
粘度(cP) 25
T℃ 入/出 140/60
固体含量(%) 0.75
进料流速(L/H) 0.76
产生流体粉末。对粉末进行表征，并将其与建立的沉淀/干燥的过程后获得的粉末进行比较。结果在下面提供。
Figure 548269DEST_PATH_IMAGE023
由于多糖具有中性电荷，在本实施例中使用Q琼脂糖(Q seph)离子交换柱用于纯化。总之，通过每种方法产生的粉末表明相似的特性。喷雾干燥的多糖符合规格参数。
用溶解的PS 14进行的后续实验已经显示，在喷雾干燥试验后，多糖的完整性得以保留。结果在下面提供。
沉淀 喷雾干燥
T℃ 入/出 NA 190/85
HPSEC MALLS (kDa) 1135 1104
Rw (nm) 54.5 54.1
Mw/Mn 1.239 1.237
概述
表明这些多糖可以成功地喷雾干燥。喷雾干燥的多糖具有与使用建立的沉淀方法产生的多糖相似的完整性，并且符合规格。喷雾干燥的样品中残余的醇量减少(由于在该生产方法中不使用醇)。经由喷雾干燥过程也实现高产率。
参考文献
Baraldoi等人 2004 Infect Immun 72; 4884-4887
Chen等人 2010 Vaccine 28:5093-5099
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Zhu等人 2014 Pharm Res 31:3006-3018

Claims (15)

1.用于干燥分离的多糖的方法，其包括喷雾干燥包含所述分离的多糖的液体组合物的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离的多糖是分离的荚膜多糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖是抗原。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖源自革兰氏阳性细菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖源自链球菌细菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细菌是B群链球菌或肺炎链球菌物种的细菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细菌是肺炎链球菌物种的细菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细菌是肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的细菌。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述分离的荚膜多糖是PS 1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包含小于1% (w/w)保护剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述分离的多糖为至少99% (w/w)纯的。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述液体组合物中的多糖的浓度为0.5至13 g/L。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述液体组合物的粘度为15至95cP。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法不包括沉淀步骤。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述液体组合物未用醇处理。
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