KR20150021933A - 수막염구균 혈청군 x 포합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 포합체를 제공한다. 그 포합체는 전형적으로 (a) 협막 다당의 일차 하이드록실기를 산화시켜서 알데하이드기를 가지는 산화된 다당을 제공하는 단계; 및 (b) 산화된 다당을 담체 분자에 알데하이드기를 통해 결합시켜서 포합체를 제공하는 단계에 의해 제조된다. 포합체는 면역원성 조성물의 일부일 수 있다. 이 조성물은 하나 또는 그 이상의 추가 항원, 특히 혈청군 A, W135, C 및 Y로부터의 협막 다당 및 그것의 포합된 형태를 포함할 수 있다. 조성물은 수성 제형으로서 존재할 수 있다. 조성물은 백신으로서, 예를 들면 포유류에서 면역 반응을 발생시키기 위해 유용하다. 본 발명은 또한 포합체를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

수막염구균 혈청군 X 포합체{MENINGOCOCCUS SEROGROUP X CONJUGATE}
관련 출원
본 출원은 2012년 5월 22일에 출원된 미국 임시 출원 번호 61/650,025; 2012년 9월 9일에 출원된 미국 임시 출원 번호 61/698,677; 및 2013년 3월 15일에 출원된 미국 임시 출원 번호 61/799,528의 유익을 주장한다. 전술한 출원들의 전체 내용은 본원에 모든 목적에 대한 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 박테리아 협막 당(capsular saccharides), 특히 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 혈청군 X 협막 다당(capsular polysaccharide)에 관한 것이다. 다당은 포합체를 형성하기 위하여 담체에 포합될 수 있다. 다당 및 포합체는 특히 수성 제형으로의 면역화에 유용하다.
박테리아의 협막 당은 수년 동안 캡슐화된 박테리아에 대한 백신으로 사용되어 왔다. 그러나 당은 T-세포 독립 항원이기 때문에, 그것들은 면역원으로서는 빈약하다. 담체에의 포합은 T-세포 독립 항원을 T-세포 의존성 항원으로 전환시킬 수 있고, 그로써 기억 반응을 증강시킬 수 있고, 보호 면역이 발생하는 것을 가능하게 한다. 그러므로 가장 효과적인 당 백신은 당포합체를 토대로 하고, 원형(prototype) 포합체 백신은 헤모필루스 인플루엔자 타입 b('Hib')에 대한 것이었다[참고문헌 86의 14장 참조].
유기체의 협막 다당(capsular polysaccharides)을 토대로, N. 메닝기티디스의 12개의 혈청군이 확인되었다(A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y 및 Z). 군 A는 사하라 사막 이남의 아프리카에서 유행성 질병에 가장 자주 연루되는 병원균이다. 혈청군 B와 C는 USA와 대부분의 개발 국가에서 거의 대부분의 사례의 원인이 된다. 혈청군 W135 및 Y는 USA와 개발국의 나머지 사례들의 원인이다. 혈청군 A, C, Y 및 W135로부터의 협막 다당의 4가 백신은 수년 동안 알려져 왔다[1, 2]. 비록 청소년과 성인에서 효과적이긴 하지만, 그것은 빈약한 면역 반응 및 짧은 보호 기간을 유도하며, 다당이 추가면역될 수 없는 약한 면역 반응을 유도하는 T 세포-무관한 항원이기 때문에 유아에게는 사용될 수 없다[참고문헌 3 참조]. 이 백신의 다당류는 포합되지 않았다[4]. 혈청군 C에 대한 포합체 백신은 인간에게 사용하도록 승인되었고, 그런 백신은 MenjugateTM[5], MeningitecTM 및 NeisVac-CTM을 포함한다. 혈청군 A+C로부터의 포합체 혼합물은 알려져 있고[6 내지 8] 혈청군 A+C+W135+Y로부터의 포합체의 혼합물도 보고되었다[9 내지 13].
군 X의 협막 다당의 구조는 1970년대 이후로 알려져 있고[14] 이 혈청군은 예컨대 사하라 사막 이남의 아프리카 및 중국에서 수많은 수막염구균성 질병과 관련되어 있다[15, 16]. 혈청군 X는 5세 이하의 아동 중에서 혈청군 A보다 상당히 더 높은 공격률을 나타내는 것으로 알려져 있다. 비록 이 혈청군에 대한 백신에 대한 요구가 수년 동안 인지되어 왔지만[17], 효과적인 백신은 개발되지 않았다. 혈청군 X에 대한 포합체 백신이 제안되었으나[17, 18], 그런 포합체가 이 혈청군에 대해 면역원성이 될지 보호가 될지에 대해서는 여전히 알지 못하는 채로 남아있다.
따라서, 혈청군 X 협막 다당의 포합체에 대한 요구가 남아있다. 더욱이, 이 혈청군에 의해 유발된 질병에 대하여 백신접종하기 위해 사용될 수 있는 포합체에 대한 요구가 존재한다.
혈청군 X 협막 다당의 구조는 O-아세틸기 없이 α1-4 포스포다이에스터 결합에 의해 함께 유지되는 N-아세틸글루코사민-4-포스페이트 잔기들로 구성된다[19]: {→4)-D-GlcpNAc-α-(1→OPO3→}(도 1). 구조들 사이의 유사성을 토대로, MenA와 MenX 협막 다당 사이의 생합성 관계가 추정되었다[14]. MenA 협막 다당은 수성 용액에서 상당히 가수분해되려는 경향이 있다[20]. 이런 불안정성은 아노머 위치를 포함하는 포스포다이에스터 연쇄의 존재 및 만노사민의 위치 2에 있는 N-아세틸기의 존재에 의해 유발되는 것으로 여겨지고, 포스포모노에스터 기의 이탈을 보조할 수 있다[21]. 다른 가능성은 타입 6A 뉴모코쿠스[22] 및 헤모필루스 인플루엔자 타입 b[23]의 협막 다당에서 볼 수 있는 것과 같이, N-아세틸만노사민 하위유닛의 위치 4에 있는 하이드록실기가 포스포다이에스터기와 상호작용하여 내부 참여 메커니즘을 통해 가수분해를 촉진하는 것이다. MenX와 MenA 협막 다당의 구조의 유사성, 특히 그것들의 공통된 아노머 포스포다이에스터 연쇄는 MenX 다당이 수성 용액 중에서 유사한 안정성 문제를 나타낼 수 있음을 의미한다. 수성 용액 중에서의 MenA 협막 다당의 고유한 불안정성은 그것이 백신(예컨대 다당 백신 MencevaxTM 및 포합체 백신 MenAfriVacTM, MenveoTM 및 NimenrixTM)에 함유될 때 자주 동결건조된 형태로 존재한다는 것을 의미한다. 비록 MenX 협막 다당이 유사하게 그것의 안정성을 향상시키기 위하여 동결건조된 형태로 제공될 수 있었지만, 수성 제형이 보다 더 편리할 것이다. 수성 제형으로 MenA 협막 다당 포합체를 함유하는 유일한 백신은 MenactraTM지만, 이 백신은 저온에서의 보관을 필요로 한다. 그런 저온 보관은 값비싸고 MenA 및 MenX 발생이 통상적인 많은 나라들(예컨대 사하라 사막 이남의 아프리카)에서는 실제적인 어려움을 나타낸다.
따라서, 혈청군 X 협막 다당 및 그것의 포합체의 수성 제형, 특히 냉장을 필요로 하지 않는 수성 제형에 대한 요구가 존재한다.
MenX에 대한 백신의 개발은 과정-내 분석으로서 및/또는 최종 백신의 특성확인을 위해 사용될 수 있는 다당 정량 방법을 필요로 한다. MenX 협막 다당에서 포스페이트 기의 존재는 다당이 총 인 함량을 측정하는 비색법에 의해 정량될 수 있다는 것을 의미한다[24]. 그러나, 이 방법은 선택성이 결여되므로, 특정한 과정-내 적용에 대해서, 예를 들면 인산염 완충액 중의 다당의 분석에 대해서 또는 인산염-함유 불순물의 존재 하에서는 적당하지 않을 것이다. 보다 선택적인 방법은 NMR일 것인데, 그것은 이미 MenX 다당 정량에 대해 제안되었다[25]. 그러나, 이 접근법은 순수한 샘플과 다량의 재료를 필요로 한다. 참고문헌 26은 대체 접근법을 증명하는데, 그 방법에서는 MenX 다당이 NMR보다 더 민감하고 인산염 함량을 측정하는 것보다 더 선택적인 HPAEC-PAD에 의해 정량된다. 참고문헌 26의 저자들은 MenX 다당을 샘플을 가수분해하여 글루코사민으로 만들고, 방출된 글루코사민의 양을 N-아세틸-글루코사민-6-포스페이트 정량 표준으로부터 유도된 보정 곡선에 대해 비교함으로써 정량하였다. 그러나, 글루코사민은 오염때문에 존재할 수 있어서 부정확한 결과를 유도할 수 있다. 따라서 여전히 MenX 다당을 분석하기 위한 대체 또는 향상된 방법, 특히 MenX에 대해 보다 더 선택적인 방법에 대한 요구가 남아 있다.
본 발명은 부분적으로는 혈청군 X 협막 다당을 담체 분자에 포합시키기 위한 방법을 토대로 한다. 본 발명자들은 그 결과의 포합체가 면역원성이고, 살균성 항체 반응을 유도할 수 있음을 발견하였다. 그러므로 혈청군 X 포합체는 면역원성 조성물, 특히 백신에 유용하다. 본 발명자들은 또한 혈청군 X 협막 다당 항원, 예컨대 혈청군 X 포합체를, 혈청군 X에 대한 면역 반응을 잃지 않으면서 다른 항원과 조합시키는 것이 가능한 것을 발견하였다. 특히, 혈청군 X 포합체는 다른 포합체, 예를 들면 다른 박테리아 협막 당 항원을 포함하고 있는 포합체와 조합될 수 있다. 혈청군 X 포합체는 특히 다른 N. 메닝기티디스 혈청군, 예컨대 혈청군 A, C, W135 및 Y로부터의 협막 당 항원을 포함하고 있는 포합체와의 조합에 적당하다. 이들 조합에서, 혈청군 X 포합체만 그것의 면역원성을 보유하고 있는 것이 아니라, 혈청군 A, C, W135 및/또는 Y 포합체도 또한 그것들의 면역원성을 보유한다. 나아가, 본 발명자들은 또한 혈청군 X로부터의 협막 다당이 혈청군 A 협막 다당에 대한 구조적인 유사성에도 불구하고, 놀랍게도 용액 중에서 안정한 것을 발견하였다. 그러므로 혈청군 X 협막 다당 및 그것의 포합체는 수성 제형으로 사용하기에 특히 적당하다.
첫 번째 측면으로, 본 발명은 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 포합체를 제공한다. 본 발명자들은 특히 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 안정한 포합체가 아래에서 기술되는 본 발명의 두 번째 측면의 첫 번째 구체예의 방법을 사용하여 제조될 수 있음을 발견하였다. 예를 들어 포합체는 37℃에서 28일 후에 50% 미만의 유리 당을 함유할 수 있다. % 유리 당은 아래의 안정성 연구(2)에서 설명되는 것과 같이 측정될 수 있다. 따라서, 발명의 첫 번째 측면 내에서, 본 발명은 37℃에서 28일 후에 50% 미만의 유리 당을 포함하는 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 포합체를 제공한다. 포합체는 구체적으로 25% 미만의 유리 당, 특히 20% 미만의 유리 당 및 보다 특별하게 15% 미만의 유리 당, 예컨대 약 10%의 유리 당을 포함할 수 있다.
두 번째 측면으로, 본 발명은 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 포합체를 제조하는 방법을 제공하는데, 특히 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 구체예의 방법들을 아래에서 설명하기로 한다. 두 번째 측면은 또한 아래에서 기술되는 네 번째 구체예의 방법을 제공한다. 본 발명의 첫 번째 측면의 포합체는 전형적으로 이들 방법 중 하나에 의해 얻어지거나 얻을 수 있다. 그러나, 첫 번째 측면의 포합체는 다르게는 어떠한 적당한 방법에 의해서든지 제조될 수 있다. 발명의 포합체가 이들 다른 방법중 하나에 의해 제조되는 경우, 방법은 전형적으로 다음 단계들 중 하나 또는 둘 다를 포함하지 않는다: a) 다당을 링커에 결합시켜서 링커의 유리 단부가 에스터기인 다당-링커 중간체를 형성하는 단계, 이때 특히 결합은 간접적으로, 즉 다당이 링커에 결합되기 전에 다당을 유도체화하기 위해 사용되는 추가의 링커를 사용하여 일어나고; b) 다당의 환원 말단에 있는 카보닐기를 링커의 한 말단에 있는 일차 아민기와 반응시킴으로써 환원성 아민화하는 단계.
세 번째 측면으로, 본 발명은 (a) 특히 본 발명의 첫 번째 측면의 포합체 형태의 혈청군 X 협막 다당 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 조성물은 전형적으로 수성 제형으로 존재한다.
다른 측면으로, 본 발명은 발명의 방법에 유용한 중간체 및 이들 중간체를 제조하기 위한 방법들을 제공한다. 본 발명은 또한 발명의 포합체의 용도를 제공한다. 예컨대 면역원성 조성물, 특히 백신 내에서의 용도 및 포유류에서 면역 반응을 발생시키기 위한 용도를 제공한다.
발명의 두 번째 측면의 첫 번째 구체예로, 본 발명은 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 포합체의 제조 방법을 제공하는데, 그 방법은 다음의 단계들로 이루어진다: (a) 협막 다당의 일차 하이드록실 기를 산화시켜서 알데하이드기를 가지는 산화된 다당을 제공하는 단계; 그리고 (b) 산화된 다당을 알데하이드기를 통하여 담체 분자에 결합시킴으로써 포합체를 제공하는 단계. 이 방법은 특히 상대적으로 긴 다당, 예컨대 20 내지 200, 특히 60 내지 100(예컨대 70 내지 90, 특히 80 정도)의 중합도(DP)를 가지는 다당에 적당한(예컨대 수율의 관점에서) 것으로 여겨진다. 이 방법은 또한 상대적으로 적은 단계를 포함하여 산업적 시설로 규모-확대하는 것이 더 용이해진다. 그 결과의 포합체는 또한 보다 더 안정할 수 있는데, 특히 다당이 그것의 환원 말단을 통해 담체에 연결되어 있는 포합체와 비교할 때 더 안정할 수 있다. 단계 (b)에서의 결합은 전형적으로 직접적인데, 예를 들면 알데하이드기와 담체 분자 상의 일차 아민 기 사이의 환원성 아민화에 의해 이루어진다. 발명의 첫 번째 측면의 일부로서, 본 발명은 또한 이 방법에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 포합체를 제공한다. 본 발명은 또한 이 방법의 개별적인 단계들 (a)와 (b); 및 이 방법의 단계 (a)에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 산화된 다당 중간체를 제공한다.
발명의 두 번째 측면의 두 번째 구체예로, 본 발명은 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 포합체를 제조하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 (a) 협막 다당의 환원 말단을 환원성 아민화시켜서 공유 결합에 의해 말단 하위유닛의 C-1 원자에 결합된 일차 아민기를 가지는 변형된 다당을 제공하는 단계; 그리고 (b) 그 변형된 다당을 담체 분자에 일차 아민기를 통해 결합시켜서 포합체를 제공하는 단계로 이루어진다. 이 방법은 특히 상대적으로 짧은 다당, 예컨대 DP가 5 내지 50, 특히 10 내지 20, 예컨대 약 15인 다당에 적당하다. 단계 (b)에서의 결합은 전형적으로 간접적인데, 예를 들면 링커를 통해 이루어진다. 발명의 첫 번째 측면의 일부로서, 본 발명은 또한 이 방법에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 포합체를 제공한다. 본 발명은 또한 이 방법의 개별적인 단계 (a) 및 (b); 및 이 방법의 (a)에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 변형된 다당 중간체를 제공한다.
본 발명의 두 번째 측면의 세 번째 구체예로, 본 발명은 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 포합체를 제조하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 (a) 협막 다당의 환원 말단을 환원시켜서 그 말단에서 두 개의 인접한 하이드록실기를 가지는 변형된 다당을 제공하는 단계; (b) 그 인접한 하이드록실기를 산화성 절단하여 그 말단에서 알데하이드기를 가지는 추가로 변형된 다당을 제공하는 단계; (c) 알데하이드기를 환원성 아민화하여 그 말단에 일차 아민기를 가지는 변형된 다당을 추가로 제공하는 단계; 그리고 (d) 일차 아민기를 통하여 담체 분자의 추가의 변형된 다당을 결합시킴으로써 포합체를 제공하는 단계로 이루어진다. 이 방법은 첫 번째 및 두 번째 구체예의 방법들보다 더 좋은 수율을 제공하며, 특히 DP가 5 내지 50, 특히 10 내지 20, 예컨대 약 15인 상대적으로 짧은 다당에 대해 그러하다. 단계 (d)에서의 결합은 전형적으로 간접적으로, 예를 들면 링커를 통해 이루어진다. 발명의 첫 번째 측면의 일부로서, 본 발명은 또한 이 방법에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 포합체를 제공한다. 본 발명은 또한 이 방법의 개별적인 단계 (a), (b), (c) 및 (d)와, 단계들의 조합 (a)와 (b), (b)와 (c), (c)와 (d), (a), (b)와 (c) 및 (b), (c)와 (d); 및 이 방법의 단계 (a), (b) 또는 (c)에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 변형된 다당 중간체를 제공한다.
발명의 두 번째 측면의 네 번째 구체예로, 본 발명은 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 포합체를 제조하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 (a) 협막 다당의 환원 말단을 환원시켜서 그 말단에 두 개의 인접한 하이드록실기가 있는 변형된 다당을 제공하는 단계; (b) 인접한 하이드록실기를 산화성 절단하여 그 말단에 알데하이드기가 있는 추가로 변형된 다당을 제공하는 단계; (c) 추가의 변형된 다당을 담체 분자에, 담체 분자상의 일차 아민기를 사용한 알데하이드기의 환원성 아민화에 의해 직접 결합시켜서 포합체를 제공하는 단계로 이루어진다. 발명의 첫 번째 측면의 일부로서, 본 발명은 또한 이 방법에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 포합체를 제공한다. 본 발명은 또한 이 방법의 개별적인 단계 (a), (b) 및 (c)와 단계들의 조합 (a)와 (b) 및 (b)와 (c); 및 이 방법의 단계 (a) 또는 (b)에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 변형된 다당 중간체를 제공한다.
본 발명자들은 또한 혈청군 X 협막 다당의 분석 방법을 개발하였다. 그 방법은 글루코사민-4-포스페이트듸 검출을 포함하는데, 그것은 MenX 다당의 특징이지만 통상적으로 불순물에는 존재하지 않는다. 따라서 추가의 측면으로, 본 발명은 혈청군 X 협막 다당을 함유하는 것으로 의심되는 샘플의 분석 방법을 제공하며, 그 방법은 (i) 샘플 중의 어떠한 혈청군 X 협막 다당을 가수분해하여 가수분해물을 제공하는 단계; (ii) 그 가수분해물에 액체 크로마토그래피를 수행하는 단계; 그리고 (iii) 단계 (ii)에서 분리된 어떠한 글루코사민-4-포스페이트를 검출하는 단계로 이루어진다.
추가의 측면으로, 본 발명은 N-아세틸글루코사민-4-포스페이트를 제조하는 데 유용한 방법 및 시약을 제공한다. 이 화합물은 상기에서 기술된 혈청군 X 협막 다당의 분석 방법에서 분석 표준으로서 사용될 수 있다.
도 1은 혈청군 X 협막 다당의 반복 유닛을 도시한다.
도 2는 천연 및 가수분해된 혈청군 X 협막 다당에 대한 초성능 액체 크로마토그램을 도시한다.
도 3은 TEMPO 산화 및 이어서 환원성 아민화에 의한 혈청군 X 협막 다당의 CRM197에의 포합에 대한 계획도, 및 그 결과의 포합체의 SDS PAGE 분석을 도시한다.
도 4는 포스페이트 완충 식염수가 채워진 세파크릴 S300 칼럼 상에서 포합 혼합물을 흐르게 한 크로마토그램을 도시한다.
도 5는 SIDEA 링커를 통한 혈청군 X 협막 다당의 CRM197에의 포합에 대한 계획도 및 그 결과의 포합체의 SDS PAGE 분석을 도시한다.
도 6은 상이한 방법을 사용하여 SIDEA 링커를 통한 혈청군 X 협막 다당의 CRM197에의 포합에 대한 계획도 및 그 결과의 포합체의 SDS PAGE 분석을 도시한다.
도 7은 상이한 링커를 사용하여 만들어진 혈청군 X 협막 다당-CRM197 포합체의 SDS PAGE 분석을 도시한다.
도 8은 다양한 N. 메닝기티디스 포합체로 면역화한 후에 혈청군 X 협막 다당에 대한 IgG 역가 및 혈청군 X에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도시한다.
도 9는 동일한 실험으로부터 혈청군 A 협막 다당에 대한 IgG 항체 역가 및 혈청군 A에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도시한다.
도 10은 동일한 실험으로부터 혈청군 C 협막 다당에 대한 IgG 항체 역가 및 혈청군 A에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도시한다.
도 11은 동일한 실험으로부터 혈청군 W135 협막 다당에 대한 IgG 항체 역가 및 혈청군 W135에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도시한다.
도 12는 동일한 실험으로부터 혈청군 Y 협막 다당에 대한 IgG 항체 역가 및 혈청군 Y에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도시한다.
도 13은 산성 가수분해에 의해 생성된 MenA(a) 및 MenX(b) 올리고당에 대하여 400MHz 및 25±0.1℃에서 기록된 2D 1H-31P HMBC NMR 스펙트럼을 도시한다. 피크 배정이 표지된다.
도 14는 37℃ 및 45℃에서 MenA 및 MenX 협막 다당에 대해 수집된 시간의 함수로서의 a) avDP 및 b) pH 및 c) MenA 협막 다당만에 대한 O-아세틸 위치를 도시한다.
도 15는 45℃에서 상이한 시점 (a) 0, (b) 7, (c) 10, (d) 14, (e) 21일 및 37℃에서 (f) 7, (g) 14, (h) 21, (i) 28일에 a) MenA 및 b) MenX에 대해 37℃ 및 45℃에서 안정성 연구를 위해 수집된, 시간의 함수로서의 avDP의 프로필을 도시한다. 실험적으로 분해된 MenX 협막 다당의 프로필 외에, 산 처리(나트륨 아세테이트 pH 4.0, 80℃에서 약 4시간 동안)에 의해 얻어진 것이 b)(1)에 도시된다.
도 16은 다양한 N. 메닝기티디스로 면역화한 후에 혈청군 X 협막 다당에 대한 IgG 항체 역가 및 혈청군 X에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도시한다.
도 17은 추가의 방법을 사용하여 혈청군 X 협막 다당을 CRM197에 포합시키기 위한 계획도, 및 그 결과의 포합체의 SDS PAGE 분석을 도시한다.
도 18은 다양한 N. 메닝기티디스로 면역화한 후에 혈청군 A 협막 다당에 대한 IgG 항체 역가 및 혈청군 A에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도시한다.
도 19는 다양한 N. 메닝기티디스로 면역화한 후에 혈청군 C 협막 다당에 대한 IgG 항체 역가 및 혈청군 C에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도시한다.
도 20은 다양한 N. 메닝기티디스로 면역화한 후에 혈청군 W135 협막 다당에 대한 IgG 항체 역가 및 혈청군 W135에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도시한다.
도 21은 다양한 N. 메닝기티디스로 면역화한 후에 혈청군 Y 협막 다당에 대한 IgG 항체 역가 및 혈청군 Y에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도시한다.
도 22는 다양한 N. 메닝기티디스로 면역화한 후에 혈청군 X 협막 다당에 대한 고친화성 IgG 항체 역가를 도시한다.
협막 다당
본 발명은 N. 메닝기티디스 혈청군 X의 협막 다당을 포함한다. 군 X 협막 다당의 구조는 O-아세틸기 없이 α1-4 포스포다이에스터 결합에 의해 함께 유지되는 N-아세틸글루코사민-4-포스페이트 잔기들로 구성된다[19]: {→4)-D-GlcpNAc-α-(1→OPO3→}(도 1).
협막 다당은 공지된 기법, 예를 들면 참고문헌 19에 기술된 방법에 의해 정제될 수 있다. 일반적으로, 수막염구균의 협막 다당은 다당 침전(예컨대 양이온 계면활성제를 사용하여), 에탄올 분류, 저온 페놀 추출(단백질을 제거하기 위함) 및 한외여과(LPS를 제거하기 위함)의 단계들로 이루어지는 방법에 의해 제조된다[예컨대 참고문헌 27]. 그러나, 혈청군 X 협막 다당에 대한 바람직한 방법은 참고문헌 10에 기술되어 있다. 이 방법은 다당 침전과 이어서 저급 알코올을 사용하여 침전된 다당을 가용화하는 것을 포함한다. 침전은 양이온 계면활성제, 예컨대 테트라뷰틸암모늄 및 세틸트라이메틸암모늄 염(예컨대 브로마이드 염) 또는 헥사다이메트린 브로마이드 및 미리스틸트라이메틸암모늄 염을 사용하여 이루어질 수 있다. 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드('CTAB')가 전형적으로 사용된다[28]. 침전된 물질의 가용화는 저급 알코올, 예컨대 메탄올, 프로판-1-올, 프로판-2-올, 부탄-1-올, 부탄-2-올, 2-메틸-프로판-1-올, 2-메틸-프로판-2-올, 다이올 등을 사용하여 이루어질 수 있지만, CTAB-다당 복합체를 가용화하는 데에는 에탄올이 특히 적당하다. 에탄올은 바람직하게는 침전된 다당에 첨가되어 50%와 95% 사이의 최종 에탄올 농도(에탄올과 물의 총 함량을 토대로)를 만든다.
재-용해 후에, 다당은 추가로 오염물을 제거하기 위해 처리될 수 있다. 이것은 특히 미량의 오염물이라도 허용되지 않는 경우에(예컨대 인간 백신 제조를 위함) 중요하다. 이것은 전형적으로 하나 또는 그 이상의 여과 단계, 예컨대 심층 여과, 활성화된 탄소를 통한 여과가 사용될 수 있는 여과, 크기 여과 및/또는 한외여과를 포함할 것이다.
일단 오염물을 제거하기 위해 여과되면, 다당은 추가의 처리 및/또는 가공처리를 위해 침전될 수 있다. 이것은 편리하게도 양이온을 교환함으로써(예컨대 칼슘 또는 나트륨 염을 첨가함으로써) 이루어질 수 있다.
그러나 본 발명은 천연 공급원으로부터 정제된 다당에 한정되지 않으며, 다당은 다른 방법에 의해, 예컨대 총 또는 부분 합성에 의해, 예를 들면 참고문헌 29에 기술된 효소적 합성에 의해 얻어질 수 있다.
다당은 자연에서 발견되는 것과 같은 협막 다당에 비하여 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어 다당은 탈-N-아세틸화(부분적으로 또는 전체적으로)되거나 N-프로피온화(부분적으로 또는 전체적으로) 등이 될 수 있다. 탈-아세틸화는 포합 전에, 중에 또는 후에 일어날 수 있지만, 전형적으로는 포합 전에 일어난다. 본 발명에서 사용되는 혈청군 X 협막 다당의 N-아세틸화 정도는 0 내지 100%, 50 내지 100%, 75 내지 100%, 80 내지 100%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100%일 수 있다. 전형적으로, N-아세틸화 정도는 100%이다. 다당의 N-아세틸화 정도는 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 방법에 의해서든지, 예를 들면 양성자 NMR에 의해서(예컨대 참고문헌 30 및 31에 기술되어 있는 것과 같이) 측정될 수 있다.
협막 다당은 일반적으로 올리고당의 형태로 사용될 수 있다. 이것들은 편리하게도 정제된 협막 다당의 파편화(예컨대 가수분해에 의한), 및 통상적으로 그 후의 원하는 크기의 단편의 정제에 의해 형성된다.
다당의 파편화는 바람직하게는 20 내지 200, 특히 60 내지 100(예컨대 70 내지 90, 특히 80 정도)의 올리고당의 최종 평균 중합도(DP)를 가지도록 수행된다. 본 발명자들은 이 길이의 다당이 특히 상기에서 설명된 첫 번째 구체예의 방법에 사용하기에 적당한 것을 발견하였다. 그러나 본 발명자들은 더 짧은 다당, 예컨대 DP가 5 내지 50, 특히 10 내지 20, 예컨대 약 15인 다당도 사용될 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 이 길이의 다당이 특히 상기에서 기술된 두 번째 및 세 번째 구체예의 방법에 사용하기에 적당한 것을 발견하였다. DP는 편리하게는, 이온 교환 크로마토그래피, NMR 또는 비색 분석에 의해 측정될 수 있다[32].
다당은 원하는 등급의 다당 크기를 얻기 위해 크기가 분류될 수 있다[33]. 이것은 다양한 방법으로, 예컨대 한외여과와 이어서 이온-교환 크로마토그래피에 의해 이루어질 수 있다.
담체 분자
본 발명은 전형적으로 단백질인 담체 분자의 사용을 포함한다. 일반적으로 당의 담체에의 공유 포합은 그것이 포합체를 T-세포 독립 항원으로부터 T-세포 의존성 항원으로 전환시키기 때문에 당의 면역원성을 증강시키고, 그로써 면역학적 기억에 대해 중요한 것이 될 수 있게 한다. 포합은 특히 소아과 백신에 유용하고[예컨대 참고문헌 34] 잘 알려져 있는 기법이다[예컨대 참고문헌 35 내지 43에서 검토됨].
바람직한 담체 단백질은 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 또는 파상풍 독소, 또는 변성 독소 또는 그것의 돌연변이, 특히 디프테리아 변성 독소 또는 파상풍 변성 독소이다. 본 발명자들은 CRM197 디프테리아 독소 돌연변이[44]가 특히 적당한 것을 발견하였다. H. 인플루엔자로부터의 단백질 D[45 내지 47]가 또한 사용될 수 있다.
다른 적당한 담체 단백질은 N. 메닝기티디스 외막 단백질 복합체[48], 합성 펩티드[49, 50], 열충격 단백질[51, 52], 백일해 단백질[53, 54], 사이토킨[55], 림포카인[55], 호르몬[55], 성장 인자[55], 인간 혈청 알부민(전형적으로 재조합체), 다양한 병원균-유도된 항원으로부터의 다수의 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질[56], 예컨대 N19[57], 폐렴구균 표면 단백질 PspA[58], 폐렴구균용혈소[59] 또는 그것의 비-독성 유도체[60], 철-흡수 단백질[61], C. difficile로부터의 독소 A 또는 B[62], GBS 단백질[63], GAS 단백질[64] 등을 포함한다.
다른 적당한 담체 단백질은 참고문헌 65에 기재되어 있고, 특히 SEQ ID NO:9의 담체 단백질도 그 문헌에 있다. 이들 담체 단백질은 또한 참고문헌 66에 기술되어 있고, 추가의 상세한 설명은 아래의 "예시적인 담체 단백질" 단원에 제공된다.
산화
상기에서 설명된 첫 번째 구체예의 방법의 단계 (a)에서, 협막 다당의 일차 하이드록실기는 산화되어 알데하이드기가 얻어진다. 일차 하이드록실기는 MenX 협막 다당 하위유닛의 C-6 원자에 공유 결합에 의해 결합되어 다음과 같은 단계가 진행된다:
Figure pct00001
이 단계는 하나 이상의 그런 일차 하이드록실기의 산화를 포함하고, 그 결과 하나 이상의 알데하이드기가 다당 사슬을 따라 도입된다. 예를 들어 본 발명자들은 혈청군 X 다당 내의 잔기의 1 내지 50%, 특히 1 내지 20%, 보다 특별히 1 내지 10%, 예를 들면 약 4 내지 8%에 대해 일차 하이드록실기의 산화가 진행됨으로써 적당한 포합체가 제조될 수 있다는 것을 발견하였다. 하이드록실기는 다양한 산화 반응(예컨대 Swern 산화, Dess-Martin 산화, CrVI 산화 등)에 의해 알데하이드로 전환될 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 TEMPO(2,2,6,6-테트라메틸피페리디닐 라디칼)-중재된 산화가 특히 적당한 것을 발견하였다. TEMPO-중재된 산화는 참고문헌 67에 설명되어 있다. 알데하이드기의 카복실기로의 산화를 방지하기 위하여, TEMPO-중재된 산화는 바람직하게는 비-수성 조건에서, 예를 들면 참고문헌 68에 설명되어 있는 것과 같이 DMF 용매를 사용하여 수행된다. 숙련된 사람은 산화에 대한 적당한 조건을 확인할 수 있을 것이다. 예를 들어 본 발명자들은 0℃에서 밤새 TEMPO(MenX 반복 하위유닛에 대해 0.06eq), NaHCO3(MenX 반복 하위유닛에 대해 9eq) 및 TCC(트라이클로로아이소시아누르산, MenX 반복 하위유닛에 대해 2eq)로 다당을 처리하는 것이 적당한 것을 발견하였다.
산화성 절단
상기에서 설명된 세 번째 및 네 번째 구체예의 방법의 단계 (b)에서, 협막 다당의 두 개의 인접한 하이드록실기는 산화성 절단이 진행되어 알데하이드기가 얻어진다:
Figure pct00002
산화성 절단(예컨대 NaIO4, Pb(OAc)4 등을 사용함)은 기술분야에 잘 알려져 있다. 본 발명자들은 10mM NaPi 완충액, pH 7.2에서 6 내지 8mg/ml의 다당을 NaIO4(MenX의 분자량에 비하여 10eq, 고체)와 1.5시간 동안 실온에서 반응시키는 것이 적당한 것을 발견하였다.
환원
상기에서 설명된 세 번째 및 네 번째 구체예의 방법의 단계 (a)에서, 협막 다당의 환원 말단은 환원되어 말단에 두 개의 인접한 하이드록실기를 가지는 변형된 다당이 얻어진다:
Figure pct00003
다당의 환원(예컨대 NaBH4 등을 사용함)은 기술분야에 잘 알려져 있다. 본 발명자들은 10mM NaPi 완충액, pH 8에서 15mg/ml의 다당을 NaBH4(MenX의 분자량에 비하여 12eq, 고체)와 1.5시간 동안 실온에서 반응시키는 것이 적당한 것을 발견하였다.
환원성 아민화
상기에서 설명된 두 번째 구체예의 방법의 단계 (a)에서, 협막 다당의 환원 말단은 환원성 아민화가 진행되어 공유 결합에 의해 말단 하위유닛의 C-1 원자에 일차 아민기가 결합되어 있는 변형된 다당이 얻어진다:
Figure pct00004
환원성 아민화는 유기화학의 표준 기법이다. 예를 들어 환원 말단에 있는 알데하이드기는 암모니아를 사용하여 일차 아민기로 전환될 수 있다. 이것은 편리하게도 암모늄 염(예컨대 암모늄 클로라이드 또는 암모늄 아세테이트)을 적절한 환원제(예컨대 시아노보로하이드라이드, 예를 들면 나트륨 시아노보로하이드라이드 NaBH3CN; 보란-피리딘; 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드; 보로하이드라이드 교환 수지)와 함께 사용하여 이루어질 수 있다. 숙련된 사람은 환원성 아민화에 대한 적당한 조건을 확인할 수 있을 것이다.
환원성 아민화는 또한 상기에서 설명된 세 번째 구체예의 방법의 단계 (c)에서 수행되어 말단에 일차 아민기를 가지는 변형된 다당이 얻어진다. 예를 들어 알데하이드기는 상기에서 설명된 것과 같이 일차 아민기로 전환될 수 있다. 그러므로 환원성 아민화는 공유 결합에 의해 말단 하위유닛의 C-5에 결합된 일차 아민기를 가지는 변형된 다당을 초래할 것이다:
Figure pct00005
그러나, 세 번째 구체예의 다른 실례에서, 환원성 아민화는 알데하이드기와 링커의 말단 일차 아민기 사이에서 일어난다. 링커는 알데하이드기와 변형된 다당의 말단에서 일차 아민기로서 작용하기 위한 두 번째 말단 일차 아민기를 반응시키기 위해 첫 번째 일차 아민기를 제공하는 이중기능성 링커이다. 예를 들어 식 X1-L-X2의 이중기능성 링커가 링커로서 사용될 수 있으며, 이때 식에서 X1은 알데하이드기와 작용할 수 있는 일차 아민기를 포함하고; X2는 일차 아민기를 포함하며; L은 링커의 연결 부분이다. 전형적인 L 기는 1 내지 10개의 탄소 원자(예컨대 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10)를 가지는 직쇄 알킬, 특히 -(CH2)4-이다. 식 X-L-X의 동종이중기능성 링커가 특히 링커로서 적당하고, 이때 두 개의 X기는 상호간에 서로 동일하며; L은 링커의 연결 부분이다. 전형적인 X기는 -NHNH2 기이다. L은 전형적으로 식 -L'-L2-L'-이며, 이때 L'은 카보닐이다. 전형적인 L2 기는 1 내지 10개의 탄소 원자(예컨대 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10)를 가지는 직쇄 알킬, 특히 -(CH2)4-이다. 그러므로 전형적인 링커는 아디프산 다이하이드라지드(ADH)이다. 더 짧은 링커, 예를 들면 카보다이하이드라진(CDH, 즉 X-L-X, 식에서 X는 -NHNH2이고 L은 카보닐이다)이 또한 사용될 수 있다.
환원성 아민화는 또한 상기에서 설명된 네 번째 구체예의 방법의 단계 (c)에서 수행되어 포합체가 얻어진다. 환원성 아민화는 추가의 변형된 다당의 알데하이드기와 담체 분자 상의 일차 아민기 사이에서 일어난다.
담체 분자에의 결합
상기에서 설명된 첫 번째 구체예의 단계 (b)에서 알데하이드기를 통하여 담체 분자에 산화된 다당이 결합되는 것은 직접적이거나 링커를 경유할 수 있다. 그러나, 결합은 바람직하게는 이것이 더 적은 수의 합성 단계를 포함하기 때문에 직접적이다. 상기 기술된 두 번째 구체예의 단계 (b)에서 일차 아민기를 통하여 담체 분자에 변형된 다당이 결합되는 것은 또한 직접적이거나 링커를 경유할 수 있다. 이 구체예에서, 링커는 전형적으로 다당과 담체 분자 사이에 공간을 제공하기 위해 사용된다. 상기 기술된 두 번째 구체예의 단계 (d)에서 일차 아민기를 통하여 담체 분자에 변형된 다당이 결합되는 것은 또한 직접적이거나 링커를 경유할 수 있다. 이 구체예에서, 링커가 전형적으로 사용되고, 다시 한 번 다당과 담체 분자 사이에 공간이 제공된다. 세 개의 모든 구체예에 대해 어떠한 적당한 포합 반응이든지 사용될 수 있고, 이때 필요하다면 어떠한 적당한 링커도 사용될 수 있다.
담체에 대한 다당 또는 링커-유도된 다당의 부착은 전형적으로, 예컨대 라이신의 측쇄 또는 담체 단백질의 잔기에서, 또는 아르기닌 잔기의 측쇄에서 일차 아민기(-NH2)를 통해 일어난다. 담체에의 부착은 또한 예컨대 시스테인 잔기의 측쇄에서 설프하이드릴(-SH)기를 통해 일어날 수 있다.
상기 기술된 첫 번째 구체예의 방법에 대해, 본 발명자들은 직접적인 결합이 편리하게는 산화된 다당의 알데하이드기를 담체의 아민기와 환원성 아민화에 의해 반응시킴으로써 이루어질 수 있다는 것을 발견하였다. 그러므로 이런 성질의 직접적인 결합은 이 구체예에서 바람직하다. 상기에서 논의된 것과 같이, 환원성 아민화는 표준 기법이고, 백신에 사용하기 위한 협막 다당의 포합체의 제조에 광범위하게 사용되어 왔다. 한 접근법에서, 산화된 다당의 알데하이드기는 담체의 아민기와 반응한다. 이것은 편리하게는 다당을 적절한 환원제(예컨대 시아노보로하이드라이드, 예를 들면 나트륨 시아노보로하이드라이드 NaBH3CN; 보란-피리딘; 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드; 보로하이드라이드 교환 수지 등)의 존재 하에 담체와 조합시킴으로써 이루어질 수 있다. 숙련된 사람이라면 환원성 아민에 대한 적당한 조건을 확인할 수 있을 것이다. 예를 들어 본 발명자들은 산화된 다당을 NaPi 10mM pH 7.2 완충액 중에서 4:1 w/w비율의 10mg/ml의 CRM197과 1:1 w/w 비율의 NaBH3CN으로 처리하는 것이 적당한 것을 발견하였다. 이 혼합물은 72시간 동안 37℃에서 서서히 교반됨으로써 환원성 아민화가 이루어질 수 있다. 필요하다면, 링커를 통한 결합은 이 구체예에서, 예컨대 산화된 다당의 알데하이드기를 링커의 아민기와 환원성 아민화에 의해 반응시킴으로써, 또는 알데하이드기를 환원성 아민화에 의해 아민기로 전환시킴으로써 링커의 부착을 위한 아민기를 제공하는 것으로 사용될 수 있다.
모든 구체예의 방법에서, 링커를 통한 결합은 어떠한 공지된 과정을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어 다당이 알데하이드기(예컨대 상기 기술된 첫 번째 구체예의 방법의 단계 (a)에서 생성된 알데하이드기)를 포함하는 경우, 알데하이드기에의 결합을 위해 첫 번째 기와 담체에의 결합을 위해 두 번째 기를 제공하기 위해 이중기능성 링커가 사용될 수 있다. 예를 들어 식 X1-L-X2의 이중기능성 링커가 사용될 수 있는데, 식에서 X1은 알데하이드와 반응할 수 있고; X2는 담체와 반응할 수 있으며; L은 링커의 연결 부분이다. 전형적인 X1기는 아민기이다. 전형적인 L기는 1 내지 10개의 탄소 원자(예컨대 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10)를 가지는 직쇄 알킬, 특히 -(CH2)4- 또는 -(CH2)3-이다. 유사하게, 다당이 일차 아민기(예를 들어 두 번째 구체예의 방법의 단계 (a)에서 생성된 일차 아민 또는 세 번째 구체예의 방법의 단계 (c)에서 생성된 일차 아민)를 포함하는 경우, 아민기에의 결합을 위한 첫 번째 기 및 담체에의 결합(전형적으로 담체의 아민에의 결합을 위한)을 위한 두 번째 기를 제공하기 위해 이중기능성 링커가 사용될 수 있다. 예를 들어 식 X-L-X의 동종이중기능성 링커가 사용될 수 있고, 이때 식에서 두 개의 X는 서로 동일하고 아민과 반응할 수 있으며; L은 링커의 연결 부분이다. 전형적인 X 기는 N-옥시석신이미드이다. L은 전형적으로 식 -L'-L2-L'-이며, 이때 L'은 카보닐이다. 전형적인 L2 기는 1 내지 10개의 탄소 원자(예컨대 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10)를 가지는 직쇄 알킬, 예컨대 -(CH2)4-이다. 그러므로 전형적인 링커는 아디프산 N-하이드록시석신이미드 다이에스터(SIDEA)이다:
Figure pct00006
다른 X기는 HO-L-OH, 예컨대 노르보란, p-니트로벤조산 및 설포-N-하이드록시석신이미드와 조합될 때 에스터를 형성하는 것들이다. 본 발명에 사용하기 위한 아민과 반응하는 추가의 이중기능성 링커로는 아크릴로일 할라이드(예컨대 클로라이드)[70], 할로아실할라이드[71], 다이석신이미딜 글루타레이트, 다이석신이미딜 수베레이트, 에틸렌 글리콜 비스[석신이미딜석시네이트] 등이 있다.
링커는 일반적으로 몰 초과량으로 다당에 첨가될 것이다. 링커/다당 반응은 일반적으로, 링커가 전형적으로 물에 불용성이기 때문에 비양성자성 용매(예컨대 DMSO, 에탄올 아세테이트 등)에서 일어날 것이다. 그러나 수용성 링커가 사용되는 경우에는 보다 넓은 범위의 용매가 활용가능하고, 이를테면 물과 같은 양성자성 용매가 사용될 수 있다.적당한 링커로는 설폰화된 형태, 예컨대 설폰화된 SIDEA를 포함한다:
Figure pct00007
링커가 사용될 때, 포합체는 링커 부분을 포함할 것이다. 이 부분은 다당이나 담체로부터 유래하는 것은 아니지만, 포합체가 제조되는 동안 사용되는 세 번째 분자이고, 최종 포합체 생성물에서 다당과 담체 단백질 둘 다와 쉽게 구별될 수 있다. 링커 부분은 탄소, 수소, 산소 및/또는 질소와 같은 원자를 포함할 수 있다. 탄소 및 수소를 포함하는 링커가 전형적이며, 추가로 산소 및/또는 질소를 포함하는 링커가 또한 전형적으로 사용된다. 질소 원자를 포함하는 링커는 질소 원자에 결합된 탄소 원자를 포함할 수 있고, 계속해서 두 번째 탄소 원자에 결합된다(-C-N-C-). 산소 원자를 포함하는 링커는 전형적으로 카보닐기의 일부로서 산소 원자를 포함한다. 분자량이 30 내지 500 Da인 링커 부분이 전형적이다. 두 개의 카보닐기를 함유하는 링커가 또한 전형적이다.
특히 유용한 링커 부분은 -NH-C(O)-(CH2)n-C(O)-이고, 식에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. n의 값은 전형적으로 4이다. 이 링커에서 말단 -NH-는 통상 다당 부분으로부터의 탄소 원자에 부착된다. 말단의 -C(O)-은 통상 담체의 아미노산 측쇄의 질소 원자에 부착된다. 바람직한 링커 부분은 편리하게는 다음을 포함하는 과정에 의해 도입될 수 있다: 다당의 -NH2 기와 다이오산(예컨대 아디프산, HOOC-(CH2)4-COOH)의 다이에스터(예컨대 다이석신이미딜 에스터)인 이중기능성 링커와의 반응; 및 그 생성물의 환원성 아민화(도 6[69] 참조).
다당의 -NH2 기에 링커를 부착시키기 위해 사용될 수 있는 다른 화학으로는 다음을 포함한다:
- 아크릴로일화(예컨대 아크릴로일 클로라이드와의 반응에 의해), 이어서 아미노산 측쇄의 ε-NH2 또는 시스테인 측쇄의 -SH에 Michael-유형 첨가[70]. 그 결과의 링커는 -NH-C(O)-(CH2)2-(프로피온아미도)이다.
- 할로아실할라이드와의 반응, 이어서 아미노산 측쇄의 ε-NH2 또는 시스테인 측쇄의 -SH와의 반응[71]. 링커는 -NH-C(O)-CH2-이다.
1:20(즉 단백질 과량) 및 20:1(즉 다당 과량)의 다당:단백질 비율(w/w)을 가지는 포합체가 본 발명의 방법에 의해 전형적으로 제조된다. 1:10 내지 1:1의 비율이 바람직하며, 특히 1:2 내지 1:1의 비율이 바람직하고, 가장 바람직하게는 약 1:1.5이다. 본 발명의 두 번째 측면의 첫 번째 구체예의 방법에 의해 제조된 포합체의 경우, 전형적인 비율은 0.1과 1.0 사이, 보다 구체적으로는 0.2 내지 0.4, 예컨대 약 0.35이다. 본 발명의 두 번째 측면의 두 번째 구체예의 방법에 의해 제조된 포합체의 경우, 전형적인 비율은 0.1과 1.0 사이, 보다 구체적으로는 0.1 내지 0.3, 예컨대 약 0.22이다. 본 발명의 두 번째 측면의 세 번째 구체예의 방법에 의해 제조된 포합체의 경우, 전형적인 비율은 0.1과 1.0 사이, 보다 구체적으로는 0.1 내지 0.3, 예컨대 약 0.21이다.
조성물은 소량의 유리 담체를 포함할 수 있다[72]. 주어진 담체 단백질이 발명의 조성물 중에 유리 및 포합된 형태로 존재할 때, 포합되지 않은 형태는 바람직하게는 전체적으로 조성물 중의 담체 단백질의 총량의 5% 이하의 양이고, 보다 바람직하게는 2 중량% 미만으로 존재한다.
포합 후에, 유리 및 포합된 다당은 분리될 수 있다. 분리에 적당한 많은 방법이 있고, 이를테면 소수성 크로마토그래피, 접선형 한외여과, 희석여과 등이 있다[참고문헌 73 및 74 등 참조].
포합체와 다른 항원의 조합
본 발명은 상기에서 기술된 것과 같은 개별적인 포합체를 제공하는 것뿐 아니라 발명의 포합체와 하나 또는 그 이상의 추가의 항원을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 전형적으로 면역원성 조성물이다.
추가 항원(들)은 추가의 포합체를 포함할 수 있다. 이들 구체예에서, 조성물 중의 상이한 포합체에 대해, 예를 들면 담체 억제의 위험을 줄이기 위해 하나 이상의 담체를 사용하는 것이 가능하다. 전형적으로 동일한 담체가 본 발명의 포합체를 포함하여 모든 포합체에 대해 사용된다. 그러나, 본 발명자들은 본 발명의 포합체에 대해 사용한 담체를 사용하는 것이 포합체가 추가의 포합체(들)과 조합될 때 면역 간섭을 줄일 수 있음을 발견하였다. 따라서, 어떤 구체예에서, 발명의 포합체는 하나의 담체(특히 파상풍 변성 독소 또는 참고문헌 65 및 66의 SEQ ID NO:9)를 사용하는 한편, 추가의 포합체(들)은 상이한 담체(특히 CRM197)를 사용한다.
단일한 담체 단백질은 하나 이상의 다당 항원을 운반할 수 있어야 한다[75, 76]. 이 목표를 이루기 위하여, 상이한 다당이 포합 과정 전에 혼합될 수 있다. 그러나 전형적으로 각 다당에 대해 별도의 포합체가 있으며, 이때 상이한 다당은 포합 후에 혼합된다. 별도의 포합체는 상기에서 논의된 것과 같이 전형적으로 동일한 담체를 토대로 한다.
추가의 항원(들)은 특히 혈청군 A 협막 다당, 혈청군 C 협막 다당, 혈청군 Y 협막 다당 및 혈청군 W135 협막 다당으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 전형적으로, 이 군으로부터 선택된 추가의 항원(들)은 각각 별도로 담체 단백질에 포합된다. 바람직한 담체 단백질은 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 또는 파상풍 독소, 또는 변성 독소 또는 그것의 돌연변이, 특히 디프테리아 변성 독소 또는 파상풍 변성 독소이다. 본 발명자들은 CRM197 디프테리아 독소 돌연변이가 특히 적당한 것을 발견하였다. H. 인플루엔자로부터의 단백질 D가 또한 사용될 수 있다. 전형적으로, 동일한 담체 단백질이 임의로 본 발명의 포합체를 포함하여 모든 포합체에 대해 사용된다. 본 발명자들은 CRM197 디프테리아 독소 돌연변이가 특히 적당한 것을 발견하였지만, 디프테리아 변성 독소 및 파상풍 변성 독소도 또한 사용될 수 있다. 상기에서 주지된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 포합체에 대한 상이한 담체의 사용이 포합체가 추가의 포합체(들)과 조합될 때 면역 간섭을 감소시킬 수 있음을 발견하였다. 따라서, 어떤 구체예에서, 본 발명의 포합체는 하나의 담체를 사용하는 한편(특히 파상풍 변성 독소 또는 참고문헌 65 및 66의 SEQ ID NO:9), 추가의 포합체(들)은 상이한 담체(특히 CRM197)를 사용한다.
본 발명에 사용하기 위해 다음의 조합이 구체적으로 예상된다:
1) 본 발명의 포합체와 혈청군 A 협막 다당과 담체 단백질의 포합체;
2) 본 발명의 포합체와 혈청군 W135 협막 다당과 담체 단백질의 포합체;
3) 본 발명의 포합체, 혈청군 A 협막 다당과 담체 단백질의 포합체 및 혈청군 W135 협막 다당과 담체 단백질의 포합체; 및
4) 본 발명의 포합체, 혈청군 A 협막 다당과 담체 단백질의 포합체, 혈청군 X 협막 다당과 담체 단백질의 포합체, 혈청군 W135 협막 다당과 담체 단백질의 포합체 및 혈청군 Y 협막 다당과 담체 단백질의 포합체.
혈청군 X 및 혈청군 A 및/또는 혈청군 W135로부터의 항원을 포함함으로써, 조합 1) 내지 3)을 포함하는 조성물은 아프리카에서 대부분의 N. 메닝기티디스 질병을 유발하는 혈청군에 대한 보호를 제공할 수 있다. 그러므로 그런 조합이 특히 바람직하다. 비록 추가의 항원, 예컨대 혈청군 C 및 Y로부터의 항원 조합 4)에 첨가되어 포함됨으로써 추가의 보호를 제공하긴 하지만, 이 추가 보호의 유익은 포함된 추가 비용을 벌충하지 못할 수 있다. 따라서 발명의 어떤 구체예에서, 조성물은 혈청군 C로부터의 항원, 특히 혈청군 C 협막 다당과 담체 단백질의 포합체를 함유하지 않는다. 유사하게, 발명의 동일하거나 다른 구체예에서, 조성물은 혈청군 Y로부터의 항원, 특히 혈청군 Y 협막 다당과 담체 단백질의 포합체를 함유하지 않는다.
추가의 항원(들)은 추가의 박테리아, 바이러스 또는 기생충 항원을 포함할 수 있다. 이것들은 다음으로부터 선택될 수 있다:
- 폐렴연쇄구균으로부터의 당 항원[예컨대 참고문헌 77 내지 79; 참고문헌 86의 22 및 23장].
- A형 간염 바이러스로부터의 항원, 예컨대 비활성화된 바이러스[예컨대 80, 81; 참고문헌 86의 15장].
- B형 간염 바이러스로부터의 항원, 예컨대 표면 및/또는 코어 항원[81, 82; 참고문헌 86의 16장].
- C형 간염 바이러스로부터의 항원[예컨대 83].
- Bordetella pertussis로부터의 항원, 예컨대 백일해 완전독소(PT) 및 B. pertussis로부터의 필라멘트형 헤마글루티닌(FHA), 임의로 또한 페르탁틴(pertactin) 및/또는 아글루티노겐 2 및 3과의 조합으로도 존재함[참고문헌 84 및 85; 참고문헌 86의 21장].
- 디프테리아 항원, 예컨대 디프테리아 변성 독소[예컨대 참고문헌 86의 13장].
- 파상풍 항원, 예컨대 파상풍 변성 독소[예컨대 참고문헌 86의 27장].
- 헤모필루스 인플루엔자 B로부터의 당 항원[예컨대 참고문헌 86의 14장].
- 클라미디아 뉴모니아에로부터의 항원[예컨대 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93].
- 클라미디아 트라코마티스로부터의 항원[예컨대 94].
- Porphyromonas gingivalis로부터의 항원[예컨대 95].
- 소아마비 항원(들)[예컨대 96, 97; 참고문헌 86의 24장], 예컨대 IPV.
- 광견병 항원(들)[예컨대 98], 예컨대 동결건조된 비활성화 바이러스[예컨대 99, RabAvertTM].
- 홍역, 볼거리 및/또는 풍진 항원[예컨대 참고문헌 86의 19, 20 및 26장].
- 인플루엔자 항원(들)[예컨대 참고문헌 86의 17 및 18장], 예컨대 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 표면 단백질.
- Moraxella catarrhalis로부터의 항원[예컨대 100].
- 스트렙토코쿠스 파이오게네스(그룹 A 스트렙토코쿠스)로부터의 항원[예컨대 101, 102, 103].
- 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(그룹 B 스트렙토코쿠스)로부터의 항원[예컨대 64, 104 내지 106].
- S. 에피더미디스로부터의 항원[예컨대 참고문헌 107, 108 및 109에 기술된 것과 같은 균주 ATCC-31432, SE-360 및 SE-10으로부터 얻을 수 있는 타입 I, II 및/또는 III 협막 다당].
당 또는 탄수화물 항원이 사용되는 경우, 그것은 전형적으로 면역원성을 증강시키기 위하여 담체에 포합된다. H. 인플루엔자 B, 수막염구균 및 폐렴구균 당 항원의 포합이 잘 알려져 있다.
독성 단백질 항원은 필요하다면 독성이 제거될 수 있다(예컨대 화학적 및/또는 유전적 수단에 의한 파상풍의 독성제거[85]).
디프테리아 항원이 조성물에 포함되는 경우에, 파상풍 항원과 백일해 항원이 또한 포함되는 것이 전형적이다. 유사하게, 파상풍 항원이 포함되는 경우에는 디프테리아 및 백일해 항원이 또한 포함되는 것이 전형적이다. 유사하게, 백일해 항원이 포함되는 경우, 디프테리아 및 파상풍 항원이 또한 포함되는 것이 전형적이다.
항원은 알루미늄 염에 흡착될 수 있다.
조성물 중의 항원은 전형적으로 각각 적어도 1㎍/ml의 농도로 존재할 것이다. 일반적으로, 어떠한 주어진 항원의 농도는 그 항원에 대하여 면역 반응을 유도하기에 충분할 것이다.
본 발명의 조성물에 단백질 항원을 사용하는 것에 대한 대안으로서, 그 항원을 코드화하는 핵산이 사용될 수 있다[참고문헌 110 내지 118]. 그러므로 본 발명의 조성물의 단백질 성분은 그 단백질을 코드화하는 핵산(보통 DNA, 예컨대 플라스미드의 형태로)에 의해 대체될 수 있다.
실제적인 관점에서, 본 발명의 조성물에 포함되는 항원의 수에 대해서는 상한선이 있을 것이다. 본 발명의 조성물 중의 항원의 수는 20 미만, 19 미만, 18 미만, 17 미만, 16 미만, 15 미만, 14 미만, 13 미만, 12 미만, 11 미만, 10 미만, 9 미만, 8 미만, 7 미만, 6 미만, 5 미만, 4 미만 또는 3 미만일 것이다.
약학적 조성물 및 방법
본 발명은 (a) 특히 본 발명의 포합체 형태로 혈청군 C 협막 다당 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 전형적인 '약학적으로 허용되는 담체'는 그 자체로는 조성물을 받는 개체에 유해한 항생물질의 생성을 유도하지 않는 모든 담체를 포함한다. 적당한 담체는 전형적으로 크고, 서서히 대사되는 거대분자, 예를 들면 단백질, 다당, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 슈크로스[119], 트레할로스[120], 락토스 및 지질 응집체(예컨대 오일 드롭 또는 리포솜)이다. 그런 담체들은 해당 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다. 백신은 또한 희석제, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 등을 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 습윤 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 존재할 수 있다. 멸균되고 발열원이 없는, 인산염-완충된 생리 식염수가 전형적인 담체이다. 약학적으로 허용되는 부형제에 대한 철저한 논의는 참고문헌 121에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 조성물은 수성 제형으로(즉 용액 또는 현탁액) 또는 건조 형태로(예컨대 동결건조) 존재할 수 있다. 수성 제형은 본 발명자들이 혈청군 C 협막 다당이 놀랍게도 수성 환경에서 안정한 것을 발견했기 때문에 바람직하다. 만약 건조된 백신이 사용된다면 주입 전에 수성 제형으로 재구성될 것이다. 포합체 백신의 동결건조는 기술분야에 알려져 있는데, 예를 들면 MenjugateTM 제품은 동결건조된 형태로 제공되는 한편, NeisVac-CTM 및 MeningitecTM은 수성 형태로 제공된다. 동결건조되는 동안에 포합체를 안정시키기 위하여 전형적으로 당 알코올(예컨대 만니톨) 또는 이당(예컨대 슈크로스 또는 트레할로스)을, 예컨대 1mg/ml 내지 30mg/ml(예를 들면 약 25mg/ml)로 조성물에 포함하는 것이 전형적일 수 있다. 재구성 후에 이들 안정화제는 수성 제형에 존재할 수 있다.
조성물은 바이알로 제공될 수 있고, 또는 미리 채워진 주사기로 제공될 수 있다. 주사기에는 바늘이 부착되거나 그렇지 않을 수 있다. 주사기는 단일 용량의 조성물을 포함하겠지만, 바이알은 단일 용량 또는 다중 용량을 포함할 수 있다.
본 발명의 수성 제형은 또한 동결건조된 형태로부터 다른 백신을 재구성하기에 적당하다. 본 발명의 조성물이 그런 즉석 재구성에 사용되는 경우, 본 발명은 두 개의 바이알을 포함하거나 또는 하나의 미리 채워진 주사기와 하나의 바이알을 포함할 수 있는 키트를 제공하는데, 이때 주사기의 내용물은 주사 전에 바이알의 내용물을 재활성화하기 위해 사용된다.
본 발명의 조성물은 단위 용량 형태로 또는 다중 용량 형태로 포장될 수 있다. 다중 용량 형태에 대해서는, 바이알이 미리 채워진 주사기에 바람직하다. 효과적인 단위용량 부피는 기본적으로 수립될 수 있지만, 조성물의 전형적인 인간 용량의 부피는 예컨대 근육내 주사인 경우 0.5ml이다.
조성물의 pH는 전형적으로 6 내지 8, 예컨대 약 7이다. 안정한 pH는 완충액을 사용함으로써 유지될 수 있다. 예컨대 본 발명의 수성 제형에 사용하기 위한 전형적인 완충제는 인산염이다. 예를 들어 무수 이염기성 인산 나트륨과 일염기성 인산 나트륨의 혼합물이 전형적이다. 적당한 농도는 10mM의 무수 이염기성 인산 나트륨 및 10mM의 일염기성 인산 나트륨이다. 만약 조성물이 수산화 알루미늄 염을 포함한다면, 히스티딘 완충액을 사용하는 것이 전형적이다[122]. 조성물은 멸균되고 및/또는 발열원이 없을 수 있다. 본 발명의 조성물은 인간과 관련하여 등장성일 수 있다.
본 발명의 조성물은 면역원성이고, 보다 바람직하게는 백신 조성물이다. 발명에 따르는 백신은 예방적이거나(즉 감염을 방지하기 위함) 또는 치료적(즉 감염을 치료하기 위함)이지만, 전형적으로는 예방적일 것이다. 백신으로서 사용된 면역원성 조성물은 면역학적으로 효과적인 양의 항원(들)뿐만 아니라, 필요하다면 어떠한 다른 성분들을 포함한다. '면역학적으로 효과적인 양'이란 단일 용량으로나 연속적인 것의 일부로서 개체에게 그 양의 투여가 치료 또는 방지에 효과적인 것을 의미한다. 이 양은 치료하고자 하는 개체의 건강 및 신체 상태, 연령, 치료하고자 하는 개체의 분류군(예컨대 비-인간 영장류, 영장류 등), 항체를 합성하는 개체의 면역 체계의 용량, 원하는 보호 정도, 백신의 제형, 치료 의사의 의료 상황의 평가 및 다른 관련 요인들에 따라 달라진다. 그 양은 기본적인 실험을 통해 결정될 수 있고 상대적으로 광범위한 범위에 속할 것으로 예상된다.
각각의 용량 내에서, 개별적인 당 항원의 양은 일반적으로 1 내지 50㎍(당의 질량으로서 측정됨), 예컨대 약 1㎍, 약 2.5㎍, 약 4㎍, 약 5㎍ 또는 약 10㎍일 것이다.
N. 메닝기티디스는 신체의 다양한 지역에 영향을 미치고, 그래서 발명의 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 주사용으로서, 수용액 또는 현탁액 중 어느 하나로 제조될 수 있다. 조성물은 예컨대 흡입제로서, 미세 분말 또는 분무기를 사용하여 폐 투여용으로 제조될 수 있다. 조성물은 좌제 또는 페사리로서 제조될 수 있다. 조성물은 비강, 귀 또는 눈에 투여하기 위해, 예컨대 스프레이, 드롭, 겔 또는 분말로서 제조될 수 있다[예컨대 참고문헌 123 및 124]. 폐렴구균 당[125, 126], Hib 당[127], MenC 당[128] 및 Hib와 MenC 당 포합체의 혼합물[129]을 코에 투여하여 성공한 사례들이 보고되었다.
본 발명의 조성물은, 특히 다중 용량 형식으로 포장될 때 항미생물을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 예컨대 Tween(폴리소베이트), 예를 들면 Tween 80과 같은 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 일반적으로 예컨대 0.01% 미만의 낮은 수준으로 존재한다.
본 발명의 조성물은 강장성(tonicity)을 제공하기 위해 나트륨 염(예컨대 염화나트륨)을 포함할 수 있다. 2 내지 20mg/ml, 예컨대 약 10±2mg/ml 또는 약 5±1mg/ml(특히 약 4.25mg) 농도의 NaCl이 전형적이다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 완충제를 포함할 것이다. 인산염 완충제가 전형적이다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 다른 면역조절제와 함께 투여될 것이다. 특히 조성물은 통상 하나 또는 그 이상의 보조제를 포함할 것이다. 그런 보조제로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함한다:
A. 미네랄-함유 조성물
본 발명에서 보조제로서 사용하기에 적당한 미네랄 함유 조성물은 미네랄 염, 예를 들면 알루미늄 염 및 칼슘 염을 포함한다. 본 발명은 하이드록사이드(예컨대 옥시하이드록사이드), 포스페이트(예컨대 하이드록시포스페이트, 오르쏘포스페이트), 설페이트 등[예컨대 참고문헌 130의 8 및 9장], 또는 상이한 미네랄 화합물들의 혼합물(예컨대 포스페이트와 하이드록사이드 보조제의 혼합물, 이때 임의로 포스페이트는 과량임)과 같은 미네랄을 포함하며, 이때 화합물들은 어떠한 적당한 형태든지 취할 수 있고(예컨대 겔, 결정, 비정질 등), 염(들)에 흡착되는 것이 전형적이다. 미네랄 함유 조성물은 또한 금속 염의 입자로서 제형될 수 있다[131].
알루미늄 염은 본 발명의 백신에 포함될 수 있어서 Al3 +의 용량은 용량 당 0.2 내지 1.0mg이다.
전형적인 알루미늄 포스페이트 보조제는 0.84 내지 0.92의 PO4/Al 몰비를 가지고, 0.6mg의 Al3 +/ml로 포함되는 비정질 알루미늄 하이드록시포스페이트이다. 저용량의 알루미늄 포스페이트로, 예컨대 용량당 포합체당 50 내지 100㎍의 Al3 +로의 흡착이 사용될 수 있다. 알루미늄 포스페이트가 사용되고 항원을 보조제에 흡착시키지 않는 것이 바람직한 경우에, 유리 포스페이트 이온을 용액 중에 포함시키는 것(예컨대 포스페이트 완충제를 사용함으로써)이 선호된다.
B. 오일 에멀젼
본 발명에서 보조제로서 사용하기에 적당한 오일 에멀젼 조성물은 스쿠알렌-물 에멀션, 예컨대 MF59(5% 스쿠알렌, 0.5% Tween 80 및 0.5% Span 85, 미세유동화기를 사용하여 마이크론 이하의 입자로 제형됨)을 포함한다[참고문헌 130의 10장; 또한 참고문헌 132 내지 134]. MF59는 FLUADTM 인플루엔자 바이러스 3가 하위유닛 백신에 보조제로서 사용된다.
조성물에 사용하기에 특히 유용한 보조제는 미크론 이하의 수-중-유 에멀젼이다. 본원에서 사용하기에 바람직한 미크론 이하의 수-중-유 에멀젼은 임의로 달라지는 양의 MTP-PE를 함유하는 스쿠알렌/물 에멀젼, 예컨대 4 내지 5% w/v 스쿠알렌, 0.25 내지 1.0% w/v Tween 80(폴리옥시에틸렌소비탄 모노올레에이트) 및/또는 0.25 내지 1.0% Span 85(소비탄 트라이올레에이트), 및 임의로 N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-아이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE)을 함유하는 미크론 이하의 수-중-유 에멀젼이다. 조성물에 사용하기 위한 미크론 이하의 수-중-유 에멀젼, 그것의 제조 방법 및 면역자극제, 예컨대 뮤라밀 펩티드는 참고문헌 132 및 135 내지 136에 상세하게 설명되어 있다.
완전 프로인트 보조제(CFA) 및 불완전 프로인트 보조제(IFA) 또한 본 발명의 보조제로서 사용될 수 있다.
C. 사포닌 제형[참고문헌 130의 22장]
사포닌 제형은 또한 본 발명의 보조제로서 사용될 수 있다. 사포닌은 광범위한 식물 종의 나무껍질, 잎, 줄기, 뿌리 및 심지어 꽃에서도 발견되는 스테롤 글리코시드 및 트라이테르페노이드 글리코시드의 이종성 기이다. Quillaia saponaria Molina 나무의 껍질로부터 분리된 사포닌이 보조제로서 광범위하게 연구되어 왔다. 사포닌은 또한 Smilax ornata(sarsaprilla), Gypsophilla paniculata(brides veil) 및 Saponaria officianalis(soap root)로부터 상업적으로 얻어질 수 있다. 사포닌 보조제 제형은 정제된 제형, 예컨대 QS21뿐 아니라 지질 제형, 예컨대 ISCOM을 포함한다.
사포닌 조성물은 HPLC 및 RP-HPLC를 사용하여 정제되었다. 이들 기법을 사용하여 정제된 특정 분획은 확인되었고, QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B 및 QH-C가 있다. 바람직하게는 사포닌은 QS21이다. QS21의 제조 방법은 참고문헌 137에서 개시된다. 사포닌 제형은 또한 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 포함할 수 있다[138].
사포닌과 콜레스테롤의 조합은 면역자극 복합체(ISCOM)로 불리는 독특한 입자를 형성하기 위해 사용될 수 있다[참고문헌 130의 23장]. ISCOM은 전형적으로 또한 인지질, 예컨대 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린을 포함한다. 어떠한 공지된 사포닌이든지 ISCOM에 사용될 수 있다. 바람직하게는, ISCOM은 하나 또는 그 이상의 QuilA, QHA 및 QHC를 포함한다. ISCOM은 참고문헌 138 내지 140에서 한층 더 설명된다. 임의로, ISCOM은 추가의 계면활성제(들)이 전혀 없을 수 있다[141].
사포닌 기초 보조제의 개발에 관한 검토는 참고문헌 142 및 143에서 볼 수 있다.
D. 바이로좀 및 바이러스-유사 입자
바이로좀 및 바이러스-유사 입자(VLP)는 또한 본 발명의 보조제로서 사용될 수 있다. 이들 구조는 일반적으로 임의로 인지질과 조합되거나 그것과 함께 제형된 바이러스로부터의 하나 또는 그 이상의 단백질을 함유한다. 그것들은 일반적으로 비-병원성이고, 비-복제성이며 대체로 어떠한 천연 바이러스 게놈도 함유하지 않는다. 바이러스 단백질은 재조합적으로 제조되거나 전체 바이러스로부터 분리될 수 있다. 바이로좀 또는 VLP에 사용하기에 적당한 이들 바이러스 단백질은 인플루엔자 바이러스(예컨대 HA 또는 NA), B형 간염 바이러스(예컨대 코어 또는 캡시드 단백질), E형 간염 바이러스, 홍역 바이러스, 신드비스 바이러스, 로타바이러스, 수족구병 바이러스, 레트로바이러스, 노르워크 바이러스, 인간 유두종 바이러스, HIV, RNA-파지, Qβ-파지(예컨대 코트 단백질), GA-파지, fr-파지, AP205 파지 및 Ty(예컨대 레트로트랜스포존 Ty 단백질 p1)로부터 유도된 단백질을 포함한다. VLP는 참고문헌 144 내지 149에서 추가로 논의된다. 바이로좀은 추가로, 예를 들면 참고문헌 150에서 논의된다.
E. 박테리아 또는 미생물 유도체
본 발명에 사용하기에 적당한 보조제는 박테리아 또는 미생물 유도체, 예컨대 장내 박테리아의 리포다당(LPS)의 비-독성 유도체, 지질 A 유도체, 면역자극성 올리고뉴클레오티드 및 ADP-리보실화 독소 및 그것들의 독성제거된 유도체를 포함한다.
LPS의 비-독성 유도체로는 모노포스포릴 지질 A(MPL) 및 3-O-탈아실화된 MPL(3dMPL)을 포함한다. 3dMPL은 3 탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아실화된 사슬의 혼합물이다. 3 탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 "작은 입자" 형태는 참고문헌 151에 개시된다. 그런 3dMPL의 "작은 입자"는 0.22㎛의 막을 통해 멸균 여과될 수 있을 정도로 충분히 작다[151]. 다른 비-독성 LPS 유도체로는 모노포스포릴 지질 A 모방물, 예컨대 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트 유도체, 예컨대 RC-529가 있다[152, 153].
지질 A 유도체는 대장균으로부터의 지질 A의 유도체, 예컨대 OM-174를 포함한다. OM-174는 예를 들면 참고문헌 154 및 155에서 설명된다.
본 발명의 보조제로서 사용하기에 적당한 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 CpG 모티프(구아노신에 대한 포스페이트 결합에 의해 연결된 메틸화되지 않은 시토신을 함유하는 다이뉴클레오티드 서열)를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이중-가닥의 RNA 및 팔린드롬 또는 폴리(dG) 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 또한 면역자극성인 것으로 밝혀졌다.
CpG는 뉴클레오티드 변형/유사체, 예컨대 포스포로싸이오에이트 변형을 포함할 수 있고, 이중-가닥이거나 단일-가닥일 수 있다. 참고문헌 156, 157 및 158에는 가능한 아날로그 치환, 예컨대 구아노신의 2'-데옥시-7-데아자구아노신으로의 대체가 개시되어 있다. CpG 올리고뉴클레오티드의 보조제 효과는 추가로 참고문헌 159 내지 164에서 논의된다.
CpG 서열은 TLR9, 예컨대 모티프 GTCGTT 또는 TTCGTT에 대해 지시될 수 있다[165]. CpG 서열은 Th1 면역 반응, 예컨대 CpG-A ODN을 유도하는 데 특이적이거나, 또는 B 세포 반응, 예컨대 CpG-B ODN을 유도하는 데 더 특이적일 수 있다. CpG-A 및 CpG-B ODN은 참고문헌 166 내지 168에서 논의된다. 바람직하게는 CpG는 CpG-A ODN이다.
바람직하게는 CpG 올리뉴클레오티드는, 5' 단부가 수용체 인지에 대해 무리가 없도록 구성된다. 임의로, 두 개의 CpG 올리고뉴클레오티드 서열은 그것의 3' 단부에 부착되어 "이뮤노머(immunomer)"를 형성할 수 있다. 예컨대 참고문헌 165 및 169 내지 171 참조.
박테리아의 ADP-리보실화 독소 및 그것의 독성 제거된 유도체는 본 발명의 보조제로서 사용될 수 있다. 바람직하게도, 단백질은 대장균으로부터 유도되고(대장균 열 불안정성 내독소 "LT"), 콜레라("CT") 또는 백일해("PT")로부터 유도된다. 독성제거된 ADP-리보실화된 독소의 점막 보조제로서의 사용은 참고문헌 172에서 설명되고, 비경구 보조제로서의 사용은 참고문헌 173에서 설명된다. 독소 또는 변성 독소는 바람직하게는 A 및 B 하위유닛 둘 다를 포함하는 완전독소의 형태로 존재한다. 바람직하게는 A 하위유닛은 독성제거 돌연변이를 함유하고; 바람직하게는 B 하위유닛은 돌연변이되지 않는다. 바람직하게도, 보조제는 독성 제거된 LT 돌연변이, 예컨대 LT-K63, LT-R72 및 LT-G192이다. ADP-리보실화 독소 및 그것의 독성 제거된 유도체, 특히 LT-K63 및 LT-R72의 보조제로서의 사용은 참고문헌 174 내지 181에서 찾아볼 수 있다. 아미노산 치환에 대한 수치 언급은 바람직하게는, 그것의 전체 내용이 참조로 본원에 구체적으로 포함된 참고문헌 182에서 설명된 ADP-리보실화 독소의 A 및 B 하위유닛의 일렬배열을 토대로 한다.
F. 인간 면역조절제
본 발명의 보조제로서 사용하기에 적당한 사람 면역조절제는 사이토킨, 예컨대 인터류킨(예를 들면 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12[183] 등), 인터페론(예컨대 인터페론-γ), 대식세포 콜로니 자극 인자 및 종양 괴사 인자를 포함한다.
G. 생체접착제 및 점막접착제
생체접착제 및 점막접착제가 또한 본 발명의 보조제로서 사용될 수 있다. 적당한 생체접착제로는 에스터화된 히알루론산 마이크로스피어[185] 또는 점막접착제, 예컨대 폴리(아크릴산)의 교차-결합된 유도체, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 다당 및 카복시메틸셀룰로스가 있다. 키토산 및 그것의 유도체 또한 본 발명의 보조제로서 사용될 수 있다[186].
H. 미소입자
미소입자 또한 본 발명의 보조제로서 사용될 수 있다. 생체 내에서 분해가능하고 비-독성인 물질(예컨대 폴리(α-하이드록시산), 폴리하이드록시부티르산, 폴리오르쏘에스터, 다가무수물, 폴리카프로락톤 등)로부터 폴리(락타이드-코-글리코리드)로 형성된 미소입자(예컨대 직경이 약 100nm 내지 약 150㎛인 입자, 바람직하게는 직경이 약 200nm 내지 약 30㎛, 가장 바람직하게는 직경이 약 500nm 내지 약 10㎛인 입자)가 바람직하며, 이것은 임의로 네거티브-전하 표면(예컨대 SDS로) 또는 포지티브-전하 표면(예컨대 양이온 계면활성제, 예컨대 CTAB로)을 갖도록 처리된다.
I. 리포솜(참고문헌 130의 13 및 14장)
보조제로서 사용하기에 적당한 리포솜 제형의 실례는 참고문헌 187 내지 189에 기술되어 있다.
J. 폴리옥시에틸렌 에써 및 폴리옥시에틸렌 에스터 제형
본 발명에 사용하기에 적당한 보조제는 폴리옥시에틸렌 에써 및 폴리옥시에틸렌 에스터를 포함한다[190]. 그런 제형은 추가로 옥토자이놀[191]과 조합된 폴리옥시에틸렌 소비탄 에스터 계면활성제뿐 아니라 적어도 하나의 추가의 비-이온성 계면활성제, 예를 들면 옥토자이놀과 조합된 폴리옥시에틸렌 알킬 에써 또는 에스터 계면활성제를 포함한다[192]. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에써는 다음 기로부터 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에써(라우레쓰 9), 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에써, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에써, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에써, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에써 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에써.
K. 폴리포스파젠( PCPP )
PCPP 제형은 예를 들면 참고문헌 193 및 194에 설명되어 있다.
L. 뮤라밀 펩티드
본 발명의 보조제로서 사용하기에 적당한 뮤라밀 펩티드의 실례는 N-아세틸-뮤라밀-L-쓰레오닐-D-아이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민(nor-MDP) 및 N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-아이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 MTP-PE)을 포함한다.
M. 이미다조퀴놀론 화합물
본 발명의 보조제로서 사용하기에 적당한 이미다조퀴놀론 화합물의 실례는 참고문헌 195 및 196에 추가로 설명되어 있는 이미쿠아모드 및 그것의 동족체(예컨대 "Resiquimod 3M")를 포함한다.
N. 싸이오세미카바존 화합물
본 발명의 보조제로서 사용하기에 적당한 싸이오세미카바존 화합물, 및 그것의 제형 방법, 제조 방법 및 화합물에 대한 선별 방법들의 실례는 참고문헌 197에 기술되어 있는 것들을 포함한다. 싸이오세미카바존은 특히 TNF-α와 같은 사이토킨의 제조를 위해 사람 말초혈 단핵 세포를 자극하는 데 효과적이다.
O. 트립탄쓰린 화합물
본 발명의 보조제로서 사용하기에 적당한 트립탄쓰린 화합물, 및 그것의 제형 방법, 제조 방법 및 화합물에 대한 선별 방법들의 실례는 참고문헌 198에 기술되어 있는 것들을 포함한다. 트립탄쓰린 화합물은 특히 TNF-α와 같은 사이토킨의 제조를 위해 사람 말초혈 단핵 세포를 자극하는 데 효과적이다.
본 발명은 또한 상기에서 확인된 하나 또는 그 이상의 보조제의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어 다음의 조합이 본 발명의 보조제 조성물로서 사용될 수 있다: (1) 사포닌과 수-중-유 에멀젼[199]; (2) 사포닌(예컨대 QS21) + 비-독성 LPS유도체(예컨대 3dMPL); (3) 사포닌(예컨대 QS21) + 비-독성 LPS 유도체(예컨대 3dMPL) + 콜레스테롤; (4) 사포닌(예컨대 QS21) + 3dMPL + IL-12(임의로 + 스테롤)[201]; (5) 3dMPL과, 예컨대 QS21 및/또는 수-중-유 에멀젼과의 조합[202]; (6) 미크론 이하의 에멀젼으로 미세유동화되거나 더 큰 입자 크기의 에멀젼을 생성하기 위해 와동된 10% 스쿠알렌, 0.4% Tween 80TM, 5% 플루론산-블록 중합체 L121 및 thr-MDP를 함유하는 SAF; (7) 2% 스쿠알렌, 0.2% Tween 80 및 단일인지질 A(MPL), 트레할로스 다이미콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 박테리아 세포벽 성분, 바람직하게는 MPL + CWS(DetoxTM)를 함유하는 RibiTM 보조제 시스템(RAS)(Ribi Immunochem); 및 (8) 하나 또는 그 이상의 미네랄 염(예컨대 알루미늄 염) + LPS의 비-독성 유도체(예컨대 3dMPL).
면역자극제로서 작용하는 다른 물질들은 참고문헌 130의 7장에서 개시된다.
알루미늄 염 보조제의 사용이 특히 유용하고, 항원은 일반적으로 그런 염에 흡착된다. MenjugateTM 및 NeisVacTM 포합체는 하이드록사이드 보조제를 사용하는 한편, MeningitecTM은 포스페이트 보조제를 사용한다. 본 발명의 조성물에서 일부 항원을 알루미늄 하이드록사이드에 흡착시키는 것이 가능하지만, 알루미늄 포스페이트와 함께 다른 항원을 가지는 것도 가능하다. 그러나 전형적으로, 둘 다가 아니라 단지 단일 염, 예컨대 하이드록사이드 또는 포스페이트만이 사용된다. 모든 포합체가 흡착될 필요는 없다. 즉 일부 또는 전체가 용액 중에 없을 수 있다.
치료 방법
본 발명은 또한 포유류에게 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 면역 반응을 발생시키는 방법을 제공한다. 면역 반응은 바람직하게는 보호성이고, 바람직하게는 항체를 포함한다. 그 방법은 추가면역 반응을 일으킬 수 있다.
포유류는 바람직하게는 사람이다. 백신이 예방적 용도로 사용되는 경우, 사람은 바람직하게는 아동(예컨대 영유아 또는 유아) 또는 십대이고; 백신이 치료적 용도인 경우, 사람은 바람직하게는 성인이다. 아동을 위해 의도된 백신은 또한 성인에게, 예컨대 안전성, 단위용량, 면역원성 등을 평가하기 위해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 조성물을 제공한다. 의약은 바람직하게는 포유류에서 면역 반응을 일으킬 수 있고(즉 그것은 면역원성 조성물이다) 보다 바람직하게는 백신이다.
본 발명은 또한 포유류에서 면역 반응을 일으키기 위한 의약의 제조에 사용되는 본 발명의 포합체의 용도를 제공한다.
본 발명의 바람직한 조성물은 인간 대상의 허용되는 백분율에 대한 각각의 항원 성분에 대한 혈청보호에 대한 기준보다 월등한 환자에서의 항체 역가를 부여할 수 있다. 숙주가 항원에 대해 혈청전환된 것으로 간주하는 역가 이상의 결합된 항체 역가를 가지는 항원은 잘 알려져 있고, 그런 역가는 WHO와 같은 기구에 의해 공개된다. 바람직하게는 대상의 통계학적으로 의미있는 샘플의 80% 이상이 혈청전환되며, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 93% 이상, 가장 바람직하게는 96 내지 100%가 혈청전환된다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 환자에게 직접 투여될 것이다. 직접 전달은 비경구 주사에 의해(예컨대 피하로, 복막 내로, 정맥 내로, 근육 내로 또는 조직 사이의 공간으로), 또는 직장, 경구, 질, 국소, 경피, 비강 내, 눈, 귀, 폐 또는 다른 점막 투여에 의해 이루어질 수 있다. 대퇴부 또는 상완에의 근육 내 투여가 바람직하다. 주사는 바늘(예컨대 피하 주사기)을 통할 수 있지만, 바늘이 없는 주사도 대안적으로 사용될 수 있다. 전형적인 근육 내 용량은 0.5ml이다.
본 발명은 전신적 및/또는 점막 면역성을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
단위용량 치료는 단일 용량 스케줄이거나 다중 용량 스케줄일 수 있다. 다중 용량은 일차 면역화 스케줄 및/또는 추가면역 면역화 스케줄에 사용될 수 있다. 일차 용량 스케줄에는 추가면역 용량 스케줄이 이어질 수 있다. 기본적인 용량 사이(예컨대 4 내지 16주 사이), 및 기초와 추가면역 사이의 적당한 타이밍은 일상적으로 결정될 수 있다.
예시적인 담체 단백질
상기에서 논의된 것과 같이, 본 발명자들은 참고문헌 65 및 66에서 기술된 담체 단백질, 특히 그 문헌들에서 SEQ ID NO:9(본원에서도 SEQ ID NO:9이다)의 단백질이 특히 본 발명의 담체 분자로서의 사용에 적당한 것을 발견하였다.
이들 담체 분자는 spr0096 항원과 spr2021 항원을 포함한다. 전형적으로, 담체 분자는 단일 폴리펩티드 사슬("하이브리드" 폴리펩티드)로서 spr0096 항원과 spr2021 항원을 포함한다. spr0096 항원, spr2021 항원 및 하이브리드 폴리펩티드의 성질은 아래에서 보다 상세하게 설명된다.
spr0096 항원
원래의 'spr0096' 폴리펩티드 서열은 참고문헌 203에서 '가상 단백질'로서 설명되었다(GI:15902140 참조). 참조의 목적으로, R6 균주에서 발견되는 것과 같은 전체 길이 spr0096의 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NO:1로 제시된다.
본 발명의 spr0096 항원은 적어도 하나의 CD4+ T 세포 에피토프를 포함한다. CD4+ T 세포는 B 림프구가 항원에 대한 항체를 생성하는 것을 보조한다[204]. T-세포 에피토프는 실험적으로 확인될 수 있거나(예컨대 PEPSCAN[205, 206] 또는 유사한 방법을 사용하여), 또는 예측될 수 있다(예컨대 Jameson-Wolf 지표[207], 매트릭스-기초 접근법[208], TEPITOPE[209], 신경망[210], OptiMer & EpoMer[211, 212], ADEPT[213], Tsites[214], 친수성[215], 항원 지표[216] 또는 참고문헌 217에 개시된 방법들을 사용하여).
본 발명에 사용하기 위한 바람직한 spr0096 항원은 (a) SEQ ID NO:1에 대해 50% 또는 그 이상(예컨대 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상)의 동일성을 가지고; 및/또는 (b) SEQ ID NO:1의 적어도 'n'개의 연속적인 아미노산의 단편(이때 'n'은 7 또는 그 이상(예컨대 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 이상)이다)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:1로부터의 적어도 하나의 CD4+ T 세포 에피토프를 포함한다. 다른 바람직한 단편은 SEQ ID NO:1의 C-말단으로부터의 하나 또는 그 이상(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상)의 아미노산 및/또는 N-말단으로부터 하나 또는 그 이상(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상)의 아미노산이 결핍되어 있는 한편, SEQ ID NO:1의 적어도 하나의 CD4+ T 세포 에피토프를 보유한다. 다른 단편은 하나 또는 그 이상의 단백질 도메인이 생략된다. 하나의 적당한 단편은 SEQ ID NO:14이고, 그것은 천연 리더 펩티드 서열이 생략된다. spr0096 항원은 SEQ ID NO:1로부터의 단일 CD4+ T 세포 에피토프로 구성될 수 있다.
SEQ ID NO:1에 관련하여 그것의 C-말단 가까이에 삽입물을 포함하는 spr0096의 변이체 형태는 본원의 SEQ ID NO:2이다. 이 변이체를 면역화를 위해 사용하는 것은 참고문헌 218에 기록되어 있는데(그 문헌에서 SEQ ID NO:150), 거기에서 LysM 도메인 단백질로서 표시된다. 그러므로 본 발명에 사용하기 위한 spr0096 항원은 (a) SEQ ID NO:2에 대해 50% 또는 그 이상(예컨대 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상)의 동일성을 가지고; 및/또는 (b) SEQ ID NO:2의 적어도 'n'개의 연속적인 아미노산의 단편(이때 'n'은 7 또는 그 이상(예컨대 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 이상)이다)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 이들 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 변이체를 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:2로부터의 적어도 하나의 CD4+ T 세포 에피토프를 포함한다. 다른 바람직한 단편은 SEQ ID NO:2의 C-말단으로부터의 하나 또는 그 이상(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상)의 아미노산 및/또는 N-말단으로부터 하나 또는 그 이상(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상)의 아미노산이 결핍되어 있는 한편, SEQ ID NO:2의 적어도 하나의 CD4+ T 세포 에피토프를 보유한다. 다른 단편은 하나 또는 그 이상의 단백질 도메인이 생략된다. 하나의 적당한 단편은 SEQ ID NO:15이고, 그것은 천연 리더 펩티드 서열이 생략된다. SEQ ID NO:2의 면역원성 단편은 참고문헌 218의 표 1에서 확인된다. spr0096 항원은 SEQ ID NO:2로부터의 단일 CD4+ T 세포 에피토프로 구성될 수 있다.
spr0096 항원은 이량체, 예컨대 동종이량체 형태로 사용될 수 있다.
spr2021 항원
원래의 'spr2021' 폴리펩티드 서열은 참고문헌 203에서 '일반적인 스트레스 단백질 GSP-781'로서 설명되었다(GI:15904062 참조). 참조의 목적으로, R6 균주에서 발견되는 것과 같은 전체 길이 spr2021의 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NO:3으로 제시된다.
본 발명의 spr2021 항원은 적어도 하나의 CD4+ T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 바람직한 spr2021 항원은 (a) SEQ ID NO:3에 대해 50% 또는 그 이상(예컨대 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상)의 동일성을 가지고; 및/또는 (b) SEQ ID NO:3의 적어도 'n'개의 연속적인 아미노산의 단편(이때 'n'은 7 또는 그 이상(예컨대 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 이상)이다)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 이들 spr2021 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 변이체를 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:3으로부터의 적어도 하나의 CD4+ T 세포 에피토프를 포함한다. 다른 바람직한 단편은 SEQ ID NO:3의 C-말단으로부터의 하나 또는 그 이상(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상)의 아미노산 및/또는 N-말단으로부터 하나 또는 그 이상(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상)의 아미노산이 결핍되어 있는 한편, SEQ ID NO:3의 적어도 하나의 CD4+ T 세포 에피토프를 보유한다. 다른 단편은 하나 또는 그 이상의 단백질 도메인이 생략된다. 하나의 적당한 단편은 SEQ ID NO:4이고, 그것은 천연 리더 펩티드 서열이 생략된다. spr2021 항원은 SEQ ID NO:3으로부터의 단일 CD4+ T 세포 에피토프로 구성될 수 있다.
참고문헌 218은 spr2021을 GbpB에 대해 상동성을 가지는 분비된 45kDa 단백질로서 설명하고 그것의 면역원으로서의 용도를 개시한다(그 문헌에서 SEQ ID NO:243; SP2216). spr2021의 면역원성 단편은 참고문헌 218의 표 1에서 확인된다(페이지 73). spr2021의 다른 유용한 단편은 참고문헌 219의 SEQ ID NO:1로서 개시된다(본원에서 SEQ ID NO:3의 아미노산 28 내지 278).
하이브리드 폴리펩티드
전형적으로, spr0096 항원과 spr2021 항원은 단일 폴리펩티드 사슬로서 발현된다('하이브리드' 폴리펩티드). 하이브리드 폴리펩티드는 식 NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH로 표시되는데, 식에서, A는 임의의 N-말단 아미노산 서열이고; B는 임의의 C-말단 아미노산 서열이며; n은 2 또는 그 이상의 정수이고(예컨대 2, 3, 4, 5, 6 등); 각각의 X는 spr0096 항원 또는 spr2021 항원의 아미노산 서열이며(상기에서 기술된 것과 같음), 이때 적어도 하나의 X는 spr0096 항원이고, 적어도 하나의 X는 spr2021 항원이며; L은 임의의 링커 아미노산 서열이다. 통상적으로 n은 2이다. n이 2일 때, X1은 통상 spr0096 항원이고 X2는 통상 spr2021 항원이다. n이 2 이상일 때 각각의 spr0096 항원(하나 이상이 존재할 때)은 동일하거나 상이할 수 있고, 각각의 spr2021 항원(하나 이상이 존재할 때)은 동일하거나 상이할 수 있다.
spr0096 항원 또는 spr2021 항원은 각각의 X의 아미노산 서열이 상기에서 규정된다. 이들 항원은 (a) 주어진 서열에 대해 50% 또는 그 이상(예컨대 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상)의 동일성을 가지고; 및/또는 (b) 주어진 서열의 적어도 'n'개의 연속적인 아미노산의 단편(이때 'n'은 7 또는 그 이상(예컨대 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 이상)이다)을 포함하는 관점에서 규정되고, (a)에서 동일성의 수준 및 (b)에서 'n'의 값은 각각의 X에 대해 동일할 수 있다.
각 -X-부분의 야생형 형태의 리더 펩티드 서열은 하이브리드 단백질에서 포함되거나 생략될 수 있다. 어떤 구체예에서, 하이브리드 단백질의 N-말단에 위치한 -X- 부분을 제외하고 리더 펩티드는 결실되는데, 즉 X1의 리더 펩티드는 보유되지만, X2...Xn의 리더 펩티드는 생략될 것이다. 이것은 모든 리더 펩티드를 결실하고 부분 -A-로서 X1의 리더펩티드를 사용하는 것과 동등하다.
{-X-L-}의 각 n 경우에 대해, 링커 아미노산 서열 -L-은 존재하거나 없을 수 있다. 예를 들어 n이 2인 경우 하이브리드는 NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH 등일 수 있다. 링커 아미노산 서열(들) -L-은 전형적으로 짧을 것이다(예컨대 20 또는 그 미만의 아미노산, 즉 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). 실례는 폴리-글리신 링커(즉 Glyn, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)과 히스티딘 태그(즉 Hisn, n은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)의 클로닝을 촉진하는 짧은 펩티드 서열을 포함한다. 다른 적당한 링커 아미노산 서열은 기술분야에 숙련된 사람들에게 드러날 것이다. 유용한 링커는 GSGGGG(SEQ ID NO:5) 또는 GSGSGGGG(SEQ ID NO:6)이고, 이때 Gly-Ser 2펩티드는 BamHI 제한 부위로부터 형성되고, 그로써 클로닝 및 조작을 보조할 수 있고, (Gly)4 테트라펩티드는 전형적인 폴리-글리신 링커이다. 다른 적당한 링커, 특히 최종 Ln으로서 사용하기 위한 링커는 Leu-Glu 2펩티드 또는 SEQ ID NO:7이다.
-A-는 임의의 N-말단 아미노산 서열이다. 이것은 전형적으로 짧을 것이다(예컨대 40 또는 그 이하의 아미노산, 즉 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). 실례로는 단백질 트래피킹을 지시하기 위한 리더 서열, 또는 클로닝 또는 정제를 용이하게 하는 짧은 펩티드 서열(예컨대 히스티딘 태그, 즉 Hisn, n은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상임)을 포함한다. 다른 적당한 N-말단 아미노산 서열은 해당 기술분야의 숙련자들에게 드러날 것이다. 만약 X1이 그 자체의 N-말단 메티오닌이 없다면, -A-는 바람직하게는 N-말단 메티오닌을 제공하는 올리고펩티드(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산을 가짐), 예컨대 Met-Ala-Ser, 또는 단일 Met 잔기이다.
-B-는 임의의 C-말단 아미노산 서열이다. 이것은 전형적으로 짧을 것이다(예컨대 40 또는 그 이하의 아미노산, 즉 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). 실례로는 단백질 트래피킹을 지시하기 위한 서열, 클로닝 또는 정제를 용이하게 하는 짧은 펩티드 서열(예컨대 히스티딘 태그, 즉 Hisn(n은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상임)을 포함함) 또는 단백질 안정성을 증강시키는 서열을 포함한다. 다른 적당한 C-말단 아미노산 서열은 해당 기술분야의 숙련자들에게 드러날 것이다.
하이브리드의 실례는 spr00976-spr2021(예컨대 SEQ ID NO:9) 또는 spr2021-spr0096(예컨대 SEQ ID NO:10)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 하이브리드는 또한 SEQ ID NO:9 또는 10에 대해 50% 또는 그 이상(예컨대 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상)의 동일성을 가진다. 전형적으로 하이브리드는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함한다. 하이브리드는 또한 SEQ ID NO:9에 대해 50% 또는 그 이상(예컨대 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상)의 동일성을 가진다.
특정 구체예에서, 담체 분자는 (a) SEQ ID NO:2로부터의 하나 또는 그 이상(예컨대 1, 2, 3, 4, 5 등)의 CD4+ T 세포 에피토프 및 (b) SEQ ID NO:3으로부터의 하나 또는 그 이상(예컨대 1, 2, 3, 4, 5 등)의 CD4+ T 세포 에피토프를 포함한다.
샘플의 분석 방법
특정 측면으로, 본 발명은 혈청군 X 협막 다당을 함유하는 것으로 의심되는 샘플의 분석 방법을 제공하며, 그 방법은 (i) 샘플 중의 어떠한 혈청군 X 협막 다당을 가수분해시키는 단계; (ii) 그 가수분해물에 대해 액체 크로마토그래피를 수행하는 단계; 그리고 (iii) 단계 (ii)에서 분리된 어떠한 글루코사민-4-포스페이트를 검출하는 단계로 이루어진다.
방법은 샘플 중의 혈청군 X 협막 다당을 정량하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법으로 샘플 중의 다당의 농도를 측정하는 것이 가능하다. 전형적으로 정량은 N-아세틸글루코사민-4-포스페이트 표준과의 비교를 포함한다. 그러나 다른 표준, 이를테면 글루코사민-6-포스페이트도 사용될 수 있다.
비록 방법이 혈청군 X 협막 다당에 대해 개발되었지만, 그것의 구조에 글루코사민-4-포스페이트를 가지는 어떠한 물질, 예컨대 박테리아 지질 A에 대해서도 적당하다. 따라서, 본 발명은 또한 그것의 구조에 글루코사민-4-포스페이트를 가지는 물질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플의 분석 방법을 제공하는데, 그 방법은 (i) 샘플 중의 구조에 글루코사민-4-포스페이트를 포함하는 어떠한 물질을 가수분해하여 가수분해물을 제공하는 단계; (ii) 그 가수분해물에 대해 액체 크로마토그래피를 수행하는 단계; 그리고 (iii) 단계 (ii)에서 분리된 어떠한 글루코사민-4-포스페이트를 검출하는 단계로 이루어진다.
샘플
샘플은 전형적으로, 예컨대 방법이 백신 생성물의 특성확인에서 다당 정량에 대해 사용되는 경우 백신이다. 그러나, 방법은 또한 백신 제조 동안 과정-중 분석으로서 사용될 수 있다. 이들 구체예에서, 샘플은 제조 과정으로부터의 과정 중간체일 것이다. 본 발명의 방법은 혈청군 X 협막 다당의 매우 낮은 농도(≥0.5㎍/ml)를 정량할 수 있고, 그러므로 예를 들면 제조 과정 동안 과정-중에 취한 작은 샘플 중의 혈청군 X 협막 다당의 분석에 적당하다. 방법은 또한 불순물이 존재할 때에도 혈청군 C 협막 다당에 특이적이다. 그러므로 샘플은 발효 육즙, 또는 발효 육즙으로부터 취한 상층액일 수 있다.
샘플은 유리(포합되지 않은) 혈청군 X 협막 다당 및/또는 포합된 혈청군 X 협막 다당을 함유할 수 있다. 그로써 방법은 박테리아로부터 제조된 다당, 정제 후의 다당, 포합 전의 다당 및/또는 포합 후의 다당을 분석하기 위해 사용될 수 있다.
포합된 혈청군 X 협막 다당을 함유하는 샘플에서, 샘플 중의 유리 다당의 총 다당에 대한 수준의 비교(즉 포합되지 않은 다당:(포합되지 않은 + 포합된) 다당의 비율)는 안정성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 고수준의 포합되지 않은 다당은 바람직하지 않다. 그런 분석의 시간-연속물은 포합체가 예컨대 보관 중에도 안정한지를 드러낼 수 있다. 유리 다당의 수준은 또한 포합체 반응이 완료되었는지를 조사하기 위해서도 사용될 수 있다.
샘플은 전형적으로 수성이겠지만, 건조된 형태로부터, 예를 들어 동결건조물로부터 수성 형태로 재구성될 수 있다. 그러므로 샘플은 동결건조 안정화제를 함유할 수 있다. 이들 안정화제는 당 알코올(예컨대 만니톨 등), 이당(예컨대 슈크로스, 트레할로스 등) 및 다른 단순 당과 같은 물질을 포함한다. 본 발명의 방법의 장점은 그것이 불순물 바탕에 대하여, 어떠한 다당 및 불순물의 사전-분리를 필요로 하지 않으면서 혈청군 X 협막 다당을 분석할 수 있다는 것이다.
샘플은 분석 전에 희석될 수 있다. 분석 후에 샘플 중의 다당의 수준은 원래의 비희석 물질의 수준과 비교될 수 있다. 예를 들어 희석은 샘플의 분석이 보정 곡선의 원하는 부분 내에서 결과를 제공하는 것을 보장하는 데 유용하다.
혈청군 X 협막 다당 외에, 샘플은 예컨대 헤모필루스 인플루엔자 타입 B로부터, 다른 수막염구균 혈청군(예컨대 A, C, W135 및/또는 Y)으로부터, 폐렴구균 등으로부터 다른 박테리아 협막 다당을 함유할 수 있다.
샘플은 또한 다른 성분, 예컨대 백신에서 자주 발견되는 비-항원 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면 그것은 상기에서 기술된 것과 같이 담체, 보조제, 부형제, 완충제 등을 포함할 수 있다.
어떤 상황에서, 예를 들면 포합 또는 비포합 형태의 공지량의 혈청군 X 협막 다당을 첨가하기 위하여 샘플을 의문의 공지량의 분석물로 스파이크하는 것이 유용하다. 스파이킹 연구는 보정을 위해, 및 민감성, 가변성, 회수 등을 연구하기 위해 유용할 수 있다.
가수분해
방법은 혈청군 X 협막 다당의 가수분해를 포함한다. 전형적인 가수분해 방법은 예컨대 트라이플루오로아세트산(TFA)를 사용한 산 가수분해를 포함한다. 본 발명자들은 특히 효과적인 조건이 2 내지 3시간 동안 100℃에서 2M의 TFA로 처리하는 것임을 발견하였다. 이들 조건은 다당의 단량체 하위유닛이 분해되지 않으면서 양호하게 방출되는 것을 가능하게 한다. 그러나, 예컨대 1 내지 6시간 동안의 더 짧거나 더 긴 처리도 또한 가능하다.
총 혈청군 X 협막 다당은 포합된 다당을 포함하고 있는 샘플로부터, 상기에서 기술된 것과 같이, 전체 샘플에 대해 가수분해를 수행함으로써 제조될 수 있다. 그러나 만약 포합되거나 포합되지 않은 혈청군 X 협막 다당만의 측정이 바람직하다면, 포함되거나 포합되지 않은 다당은 가수분해 전에 서로로부터 분리되어야 한다. 적당한 분리 기법으로는 선택적 침전, 크기-기초 방법, 고체-상 추출[220] 등이 있다.
액체 크로마토그래피
혈청군 X 협막 다당 가수분해의 결과는 액체 크로마토그래피에 의해 분석된다. 그로써 본 발명의 방법은 전형적으로 액체 크로마토그래피 칼럼을 활용할 것이고, 그런 칼럼의 산출물을 분석하는 것을 포함한다.
다양한 액체 크로마토그래피 칼럼이 사용될 수 있지만, 본 발명은 전형적으로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용할 것이다. 본 발명은 특히 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)에 의해 또는 고성능 양이온 교환 크로마토그래피(HPCEC)에 의해 분리 결과를 분석하는 데 유용하다. HPAEC는 당의 특성확인을 위해 사용된 통상적인 기법으로, 다당을 검출하고 정량하기 위해 자주 펄스 전류측정(amperometric) 검출(PAD)과 조합하여 사용된다[221, 222]. 적당한 HPAEC-PAD 시스템은 DionexTM Corporation(Sunnyvale, CA)에 의해, 예컨대 BioLCTM 시스템으로 제공된다. 이들 시스템에서, HPAEC 칼럼으로부터의 용출물은 PAD를 사용하여, 즉 전기 전류를 기초로 분석된다. 적당한(높은) pH에서, 탄수화물은 양전위를 적용함으로써 전극 표면에서 전기촉매적으로 산화될 수 있다. 이 방법에서 생성된 전류는 탄수화물 농도에 비례하여, 전류 측정에 의해 탄수화물의 검출 및 정량이 가능해진다. 간단한 전류 측정 검출과 비교하여, PAD는 표준 검출 전위를 가지는 세정 및 재생 전위의 짧은 펄스를 중간에 배치시키고, 그로써 분석물의 산화 생성물이 전극을 더럽힐 때 발생하는 어려움을 피할 수 있게 된다.
비-전류 측정 방법은 용출물을 분석하기 위해 PAD와 조합될 수 있다[예컨대 참고문헌 223 참조].
그로써 가수분해된 혈청군 X 협막 다당은 분리를 위해 HPAEC가 수행될 수 있고, 분리된 물질은 검출되고, 임의로 PAD에 의해 정량될 수 있다. 아래의 실시예에서 알 수 있는 것과 같이, HPAEC-PAD는 샘플 중의 다른 바탕 물질로부터 가수분해된 글루코사민-4-포스페이트 잔기를 분리할 수 있다.
바람직한 칼럼은 자발적으로 당을 보유함으로써 당이 칼럼으로부터 용출되는 것이다. 크로마토그래피 칼럼으로부터의 용출은 등용매 용출 또는 구배 용출일 수 있다. 하이드록사이드 및/또는 아세테이트 염을 포함하는 용출액은 당의 HPAEC-PAD 분석 중에 사용된 전형적인 용출액이다. 그러나, 질산염, 염화물 등과 같은 음이온을 사용하는 것도 가능하다. 나트륨 염이 전형적으로 사용된다. AEC 칼럼으로부터의 분석물을 용출하기 위해서 용출액은 일반적으로 염기성, 예컨대 pH는 >8, >9, >10, >11, >12, >13 등이다. 하이드록사이드 염(예컨대 NaOH)은 원하는 pH를 이루기 위해 사용될 수 있다.
용출물은, 특히 이온이 사용되는 분석 검출 기법을 간섭하는 경우에 하이드록사이드 이온의 화학적 억제가 수행된다. 미세막 억제제, 예컨대 DionexTM으로부터의 MMS 생성물이 편리하게도 사용될 수 있다. 'MMS III' 생성물은 분석물 전도성을 증강시키는 한편, 용출액 전도성을 감소시키기 위하여 연속적인 화학적 억제를 사용하고, 광범위한 농도 범위에 걸쳐서 등용매 또는 구배 용출을 사용하여 이온-교환을 적용하여 직접적인 전도성 검출을 가능하게 한다.
본 발명에 사용하기에 적당한 HPAEC 칼럼은 Dionex에 의해 시판되는 "CarboPac" 칼럼, 예컨대 PA1[다이비닐벤젠으로 2% 교차결합되고, 500nm의 MicroBead 4차 암모늄 기능화된 라텍스(5% 교차결합됨)로 응집된 10㎛ 직경의 폴리스티렌 기질], PA100, PA20, PA10[다이비닐벤젠으로 55% 교차결합되고, 460nm의 MicroBead 이중기능성 4차 암모늄 이온(5% 교차결합됨)으로 응집된 10㎛ 직경의 에틸비닐벤젠 기질], PA200 또는 MA1 칼럼이다.
분석용 HPAEC 칼럼은 예비-칼럼 및/또는 트랩 칼럼과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, PA10 분석 칼럼은 인라인 PA10 보호 칼럼, 및/또는 인라인 트랩(예비-처리) 칼럼과 조합하여 사용될 수 있다. 그런 칼럼은 그렇지 않으면 분석물을 간섭할 물질들을 제거할 수 있는데, 예를 들면 "아미노트랩" 칼럼은 당 분석 전에 아미노산을 제거할 수 있다. 보레이트 트랩이 또한 사용될 수 있다. 전형적인 "아미노트랩" 수지는 이중기능성 4차 암모늄 음이온 교환 부위로 그래프트된 10㎛ 직경의 기질(다이비닐벤젠으로 55% 교차결합된 에틸비닐벤젠)을 가지는 한편, 전형적인 "보레이트트랩"은 보레이트에 대해 매우 높은 선택성을 가지는 20㎛ 직경의 고용량 수지를 가진다.
PA1 및 PA10 칼럼은 둘 다 단일- 및 2당의 고용해 분리를 전달하기 위해 PAD와 함께 사용되도록 디자인되는 음이온-교환 칼럼이고, 두 칼럼의 수지는 모두 기능화된 미세비드의 미세한 라텍스로 덮인 10㎛ 직경의 비다공성 비드이다. 그것들의 박막 수지 구조는 우수한 물질 수송을 가능하게 하고, 그 결과 고용해 크로마토그래피와 신속한 재-평형이 이루어진다. PA1이 다양한 매트릭스에서 일당 및 이등의 측정에 적당한 다-목적 칼럼이고 선형 다당의 고용해 분리를 위해 선택된 것인 한편, PA10은 포유류 당단백질의 탄수화물 부분에서 발견되는 아미노, 중성 및 산성 모노당을 측정하기 위해 최적화된다. PA1과 PA10 칼럼 사이의 주요 차이는 PA1의 수지가 다이비닐벤젠으로 2% 교차결합된 폴리스티렌이지만, PA10에서는 다이비닐벤젠으로 55% 교차결합된 에틸비닐벤젠이라는 것이다.
지금까지, 혈청군 X 협막 다당에 대한 가장 바람직한 HPAEC 분리 방법은 Guard PA1 예비-칼럼(4×50mm)과 조합된 CarboPac PA1 칼럼(4×250mm)을 포함한다.
용출 및 검출 후에, 본 발명은 샘플 중에서 확인된 어떠한 혈청군 X 협막 다당의 특성, 예컨대 그것의 DP(전형적으로 평균 DP), 그것의 분자량, 그것의 순도 등을 측정하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
N-아세틸글루코사민-4- 포스페이트의 제조
추가의 측면으로, 본 발명은 N-아세틸글루코사민-4-포스페이트를 제조하는 데 유용한 방법 및 시약을 제공한다. 상기에서 논의된 것과 같이, 이 화합물은 혈청군 X 협막 다당을 분석하기 위한 방법에서 분석 표준으로서 사용될 수 있다.
이 측면의 첫 번째 구체예에서, 본 발명은 식 A의 화합물을 N-탈보호하는 것과 탈보호된 화합물을 N-아실화하여 식 B의 화합물을 제공하는 것을 포함하는 과정을 제공한다:
Figure pct00008
상기 식에서, PG는 산소 보호기이고; PGN은 질소 보호기이며 모든 PG기는 동일하다. PG와 PGN은 예를 들어 참고문헌 224에서 기술된 것과 같은 어떠한 적당한 보호기일 수 있다.
이 측면의 두 번째 구체예에서, 본 발명은 식 B의 화합물에 유기포스페이트 기를 도입하여 식 C의 화합물을 제공하는 과정을 포함한다:
Figure pct00009
상기 식에서, 두 개의 RP는 동일하고, RP는 예를 들면 참고문헌 224에서 기술된 것과 같은 H 또는 아릴메틸 포스페이트 보호기이거나; 또는 RP기는 함께 결합되어 단일한 아릴메틸 보호기, 예를 들면 o-자일레닐을 형성한다. PG는 상기에서 규정된 것과 같고, 모든 PG기는 동일하다. RP가 H인 경우, 식 B의 화합물은 전형적으로 인산화 시약 및 산화제와 반응된다. 인산화제는 전형적으로 피리딘 및 피발로일 클로라이드의 존재하에 살리실 클로로포스파이트일 수 있다. 인산화제는 또한 PCl3와, 이어서 물 또는 수성 NaHCO3일 수 있다. 산화제는 I2 또는 mCPBA일 수 있고, 전형적으로 I2이다. RP가 함께 결합하여 단일 보호기를 형성하는 경우에, 식 B의 화합물은 전형적으로 o-자일렌 함유 유기 인 시약과 반응된 후 산화제와 반응한다. o-자일렌 함유 유기 인 시약은 전형적으로 N-다이에틸-1,5-다이하이드로-3H-2,3,4-벤조다이오악사포스파인-3-아민과 같은 포스포로아미다이트이다. 산화제는 I2 또는 mCPBA, 전형적으로 mCPBA이다. RP기가 함께 결합되어 단일 보호기를 형성하지 못하는 경우, 식 B의 화합물은 전형적으로 RP기를 함유하는 파이로포스페이트 시약과 반응한다. 적당한 파이로포스페이트 시약은 RP가 벤질기인 경우에 테트라벤질파이로포스페이트이다.
이 측면의 세 번째 구체예에서, 본 발명은 식 C의 화합물을 탈보호하여 N-아세틸글루코사민-4-포스페이트를 제공하는 것을 포함하는 과정을 제공한다:
Figure pct00010
PG와 RP는 상기에서 규정된 것과 같고, 모든 PG기는 동일하다. 전형적으로, RP는 포스페이트 보호기이고, 모든 PG기 및 RP기는 동일한 단계에서, 예를 들면 수소 첨가 분해에 의해 제거된다.
이 측면의 추가의 구체예에서, 본 발명은 첫 번째 구체예와 두 번째 구체예를 포함하는 과정; 두 번째 구체예와 세 번째 구체예 및 첫 번째 구체예와 두 번째 구체예와 세 번째 구체예를 포함하는 과정을 제공한다. 이들 구체예가 첫 번째 구체예를 포함하는 경우에, 첫 번째 구체예는 아래에서 기술되는 추가의 구체예가 이어질 수 있다.
이 측면의 추가의 구체예에서, 본 발명은 상기 식 A의 화합물을 제조하는 방법을 제공하고, 그 방법은 식 Z의 화합물을 환원시켜서 다음 식 A'의 화합물을 제공하는 것을 포함한다:
Figure pct00011
상기 식에서, R1은 페닐 또는 알킬, 예컨대 메틸 또는 에틸; O-알킬, 예컨대 O-메틸; 및 니트로로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 기로 치환된 페닐이어서, 식A'에서 R1CH2-부분은 치환된 또는 비치환된 벤질 에써 산소 보호기이다. 보호기는 예를 들면 참고문헌 224에서 기술된 어떠한 적당한 보호기일 수 있다. 특히, 보호기는 벤질, p-메톡시벤질, 3,4-다이메톡시벤질, 2,6-다이메톡시벤질, o-니트로벤질, p-니트로벤질일 수 있고, 전형적으로는 벤질이다. PGN은 상기에서 규정된 것과 같은 질소 보호기이다. 전형적인 PGN기는 프탈이미드; Boc 및 Fmoc와 같은 카바메이트; 노실, 토실 및 메실이다. 특히, PGN은 프탈이미드이다. 전형적으로, 반응은 식 Z의 화합물(식에서 R1은 페닐이고 PGN은 프탈이미드 기이다)을 붕소 함유 화합물 및 루이스 산과 유기 용매 중에서 반응시켜서 식 A'의 화합물을 얻는 것을 포함한다. 붕소 함유 화합물은 트라이알킬아미노보란과 같은 보로하이드라이드, 특히 트라이에틸아미노보란 또는 트라이메틸아미노보란일 수 있고, 전형적으로 트라이메틸아미노보란이다. 루이스 산은 AlCl3 또는 붕소 함유 루이스 산, 예컨대 붕소 트라이플루오라이드 복합체일 수 있고, 전형적으로는 BF3·Et2O이다. 유기 용매는 염소처리된 유기 용매, 예를 들면 CHCl3 또는 CH2Cl2 또는 비-염소처리된 용매일 수 있고, 전형적으로는 아세토니트릴이다. 반응은 약 -10 내지 약 10℃, 약 -5 내지 5℃의 온도 범위에서, 전형적으로는 약 0℃에서 수행될 수 있다.
이 측면의 첫 번째 구체예의 실례는 단계 i) 식 A'의 화합물을 N-탈보호하는 단계와 단계 ii) 탈보호된 화합물을 N-아실화하여 식 B'의 화합물을 얻는 단계를 포함한다:
Figure pct00012
상기 식에서, R1과 PGN은 상기에서 규정된 것과 같다. 전형적으로, 반응은 단계 i)에서 식 A'의 화합물(식에서 PGN은 프탈이미드이다)을 알코올 용매, 예컨대 MeOH 또는 EtOH, 전형적으로는 EtOH 중의 1,2-다이아미노에탄과 반응시키는 것을 포함한다. 단계 i)은 통상 실온과 용매의 환류점 사이에서, 예를 들면 약 25℃ 또는 그 이상의 온도에서, 약 25 내지 약 80℃, 약 35 내지 약 80℃, 약 45 내지 약 80℃, 약 55 내지 약 80℃, 약 65 내지 약 80℃, 약 75 내지 약 80℃에서, 전형적으로는 약 80℃ 또는 용매의 대략 환류 지점에서 수행된다. 단계 ii)는 아실화제를 첨가하는 것을 포함한다. 아실화제는 어떠한 적당한 아실화제, 전형적으로 아민 염기, 예컨대 피리딘 또는 트라이에틸아민 또는 이미다졸과의 Ac2O일 수 있다. 또는 다르게는, 아실화제는 EtOH:Ac2O의 4:1 혼합물일 수 있다. 단계 ii)는 약 실온에서, 예를 들면 약 25℃에서 수행될 수 있다. 전형적으로 단계 i)과 ii) 사이에는 정제 단계가 없다, 예를 들어 단계 i)로부터의 용매만이 단계 ii)가 수행되기 전에 제거된다.
이 측면의 두 번째 구체예의 실례는 식 B'의 화합물에 유기포스페이트 기를 도입하여 식 C'의 화합물을 얻는 것을 포함한다:
Figure pct00013
상기 식에서, R1은 상기에서 규정된 것과 같다. 전형적으로, 식 B'의 화합물은 먼저 o-자일렌 함유 유기 인 시약, 예컨대 포스포라미다이트, 예를 들면 N-다이에틸-1,5-다이하이드로-3H-2,3,4-벤조다이오악사포스핀-3-아민과 아민 염기, 전형적으로 1H-테트라졸의 존재하에, 유기 용매, 예컨대 THF 또는 CH2Cl2, 전형적으로 CH2Cl2 중에서 반응된다. 그런 다음 산화제, 예컨대 피리딘 및 물 또는 mCPBA중의 I2가 첨가된다. mCPBA는 통상적으로 약 -20℃ 내지 약 20℃, 약 -15℃ 내지 약 15℃, 약 -10℃ 내지 약 10℃, 약 -5℃ 내지 약 5℃ 및 전형적으로는 약 0℃의 온도에서 사용된다. mCPBA는 통상 첫 번째 단계에서 사용된 것과 동일한 반응 용매에 첨가된다. 첫 번째 단계의 완료는 예를 들면 TLC 분석에 의해, mCPBA가 첨가되기 전에 검출될 수 있다.
이 측면의 두 번째 구체예의 추가의 실례는 식 B'의 화합물에 유기포스페이트 기를 도입하여 식 C''의 화합물을 얻는 것을 포함한다:
Figure pct00014
상기 식에서, R1은 상기에서 규정된 것과 같다. 전형적으로 식 B'의 화합물은 피로포스페이트 시약, 예컨대 테트라벤질피로포스페이트와 반응된다. 반응은 염기의 존재하에 수행되고, 적당한 염기는 리튬 아마이드, 예컨대 LDA 또는 LiHMDS이다. 반응은 유기 용매, 예를 들면 염소처리된 용매, 예컨대 CH2Cl2 또는 에써 용매, 전형적으로 다이에틸 에써 또는 THF 중에서 수행된다. 전형적으로 반응은 약 0℃ 아래에서, 예를 들면 약 -10℃, 약 -20℃, 약 -30℃, 약 -40℃, 약 -50℃, 약 -60℃, 약 -70℃, 적절하게는 약 -80℃에서, 그런 다음에는 약 -30℃에서 수행된다.
이 측면의 두 번째 구체예의 추가의 실례는 식 B'의 화합물에 유기포스페이트 기를 도입하여 식 C'''의 화합물을 얻는 것을 포함한다:
Figure pct00015
상기 식에서, R1은 상기에서 규정된 것과 같다. 전형적으로 식 B'의 화합물은 적당한 인산화 시약 및 산화제로 인산화된다. 전형적인 인산화 시약은 살리실 클로로포스파이트 또는 PCl3 및 물 또는 수성 NaHCO3이다. 인산화 시약이 살리실 클로로포스파이트인 경우, 반응은 전형적으로 피리딘 용매 중에서 수행되고 피발로일 클로라이드가 전형적으로 존재한다. 반응은 통상 실온에서, 예를 들면 약 25℃에서 수행된다. 그런 다음 산화제, 예컨대 피리딘 및 물 중의 I2 또는 mCPBA가 첨가되는데, 전형적으로는 I2이다. 반응은 전형적으로 산화제의 첨가 전에 약 0℃ 아래로, 예를 들면 약 -10℃, 약 -20℃, 약 -30℃, 약 -40℃, 약 -50℃, 전형적으로는 약 -40℃로 냉각된다. 산화는 전형적으로 약 0℃의 온도에서 완료된다. I2는 전형적으로 피리딘/물 중의 용액으로서 첨가된다. 용액의 농도는 전형적으로 약 0.1 내지 1M, 약 0.2 내지 0.9M, 약 0.3 내지 0.8M, 약 0.4 내지 0.7, 적적하게는 약 0.5M이다. 피리딘 대 물의 비율은 전형적으로 약 10:1 내지 30:1, 약 12:1 내지 약 28:1, 약 14:1 내지 약 26:1, 약 16:1 내지 약 24:1, 약 18:1 내지 약 22:1, 적절하게는 약 19:1이다. 산화제는 통상 첫 번째 단계에서 사용된 것과 같은 반응 용매에 첨가된다. 첫 번째 단계의 완성은 예를 들면 TLC 분석에 의해, 산화제가 첨가되기 전에 검출될 수 있다. 식 C'''의 화합물은 통상 염, 전형적으로는 다이-트라이에틸암모늄 염으로서 분리된다.
인산화제가 PCl3 및 물 또는 수성 NaHCO3인 경우, 반응은 전형적으로 MeCN과 같은 유기 용매 중에서 수행된다. 물 또는 수성 NaHCO3는 PCl3 후에, 적절하게는 실온에서 첨가된다. 그런 다음 산화제, 예컨대 I2 또는 mCPBA, 전형적으로는 I2가 첨가된다. 통상적으로 용매는 산화제 첨가 및 새로운 용매가 첨가되기 전에 제거된다. 새로운 용매는 전형적으로 피리딘과 트라에틸아민의 혼합물이다. 피리딘 대 트아리에틸아민 비율은 전형적으로 약 2:1 내지 약 8:2이고, 적절하게는 약 4:1이다. I2는 전형적으로 피리딘/물 중의 용액으로서 첨가된다. 용액의 농도는 약 0.1 내지 1M, 약 0.2 내지 0.9M, 약 0.3 내지 0.8M, 적절하게는 약 0.4M이다. 식 C'''의 화합물은 통상 염, 전형적으로는 다이-트라이에틸암모늄 염으로서 분리된다.
이 측면의 세 번째 구체예의 실례는 식 C'의 화합물을 탈보호, 전형적으로는 수소첨가 분해에 의해 N-아세틸글루코사민-4-포스페이트를 얻는 것을 포함한다:
Figure pct00016
상기 식에서, R1은 상기 규정된 것과 같다. 전형적으로, 식 C'의 화합물은 팔라듐 촉매, 예컨대 10% Pd/C 또는 펄만 촉매 Pd(OH)2/C의 존재 하에, 알코올성 용매, 예를 들면 MeOH 또는 EtOH, 전형적으로는 MeOH 중에서 H2와 반응된다. 반응은 통상 약 1 내지 약 5atm, 약 1 내지 약 4atm, 약 1 내지 약 3atm, 약 1 내지 약 2atm, 전형적으로는 약 1atm의 대기압에서 수행된다.
이 측면의 세 번째 구체예의 추가의 실례는 식 C''의 화합물의, 전형적으로는 수소첨가 분해에 의한 탈보호에 의해 N-아세틸글루코사민-4-포스페이트를 얻는 것을 포함한다:
Figure pct00017
상기 식에서, R1은 상기 규정된 것과 같다. 전형적으로 식 C''의 화합물은 팔라듐 촉매, 예컨대 10% Pd/C 또는 펄만 촉매 Pd(OH)2/C의 존재 하에, 알코올성 용매, 예를 들면 MeOH 또는 EtOH, 전형적으로는 MeOH 중에서 H2와 반응된다. 반응은 통상 약 1 내지 약 5atm, 약 1 내지 약 4atm, 약 1 내지 약 3atm, 약 1 내지 약 2atm, 전형적으로는 약 1atm의 대기압에서 수행된다.
이 측면의 세 번째 구체예의 추가의 실례는 식 C'''의 화합물, 또는 그것의 다이-트라이에틸암모늄 염을 전형적으로는 수소첨가분해에 의해 탈보호하여 N-아세틸글루코사민-4-포스페이트를 얻는 것을 포함한다:
Figure pct00018
상기 식에서, R1은 상기 규정된 것과 같다. 전형적으로 식 C'''의 화합물은 팔라듐 촉매, 예컨대 10% Pd/C 또는 펄만 촉매 Pd(OH)2/C의 존재 하에, 알코올성 용매, 예를 들면 MeOH 또는 EtOH, 전형적으로는 MeOH 중에서 H2와 반응된다. 반응은 통상 약 1 내지 약 5atm, 약 1 내지 약 4atm, 약 1 내지 약 3atm, 약 1 내지 약 2atm, 전형적으로는 약 1atm의 대기압에서 수행된다.
N-아세틸글루코사민-4-포스페이트는 예를 들면 결정화, 또는 보다 전형적으로는 크로마토그래피, 특히 소수성 변형된 실리카 고정상을 사용하는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 이 측면의 과정의 화합물 및 중간체, 특히 식 C의 화합물, 보다 특별하게는 식 C', C'' 및 C'''의 화합물을 제공한다.
추가의 구체예에서, 이 측면의 과정은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00019
이 구체예에 대한 적당한 반응 조건은 아래의 "실시예" 단원에서 제시된다(예컨대 계획도 1).
일반적 사항
본 발명의 실시는 다르게 표시되지 않는 한, 해당 기술분야의 숙련도 내에서 종래의 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약물학 방법들을 사용할 것이다. 그런 기법들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예컨대 참고문헌 225 내지 232 등 참조.
"GI" 넘버링이 상기에서 사용된다. GI 번호, 또는 "GenInfo 식별자"는 서열이 그것의 데이터베이스에 첨가될 때 NCBI에 의해 진행된 각 서열 기록에 대해 연속적으로 배당된 일련의 숫자이다. 서열이 업데이트될 때(예컨대 수정을 위해, 또는 더 많은 주석이나 정보를 첨가하기 위해) 새로운 GI 번호가 부여된다. 그로써 주어진 GI 번호와 관련된 서열은 결코 변하지 않는다.
항원 "도메인"이 생략되는 경우, 이것은 신호 펩티드, 세포질 도메인, 경막 도메인, 세포외재성 도메인 등의 생략을 포함할 수 있다.
용어 "포함하는"은 "포함하는"뿐 아니라 "구성되는"을 포함하며, 예를 들면 X를 "포함하는" 조성물은 독점적으로 X로 구성되거나 추가로 어떤 것, 예컨대 X+Y를 포함할 수 있다.
수치 x와 관련하여 용어 "약"은 예를 들면 x±10%를 의미한다.
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않는다. 예컨대 "실질적으로" Y가 없는 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요하다면, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
본 발명이 다수의 순차적인 단계를 포함하는 과정을 제공하는 경우, 본 발명은 또한 총 단계 수보다 적은 단계를 포함하는 과정을 제공할 수 있다. 유사하게, 출발 다당 물질이 이미 부분적으로 처리되었다면 본 발명은 방법의 단지 나중의 단계들만을 포함하는 과정을 포함한다. 이렇게 다른 단계들은 상이한 장소에서(예컨대 다른 나라에서) 다른 사람들에 의해 매우 다른 시점에서 수행될 수 있다.
당 고리는 개방되거나 폐쇄된 형태로 존재할 수 있고, 폐쇄된 형태가 본원에서 구조식으로 표시된 한편, 개방된 형태 또한 본 발명에 포함된다는 것이 인정될 것이다. 유사하게, 당은 피라노스 및 퓨라노스 형태로 존재할 수 있고, 피라노스 형태가 본원에서 구조식으로 표시된 한편, 퓨라노스 형태 또한 포함된다. 당의 상이한 아노머 형태들도 또한 포함된다.
두 개의 아미노산 서열 사이의 백분율 서열 동일성은 서열이 일렬배열될 때, 아미노산의 백분율이 두 개의 서열을 비교할 때 동일한 것을 의미한다. 이런 일렬배열과 % 상동성 또는 서열 동일성은 해당 기술분야에 알려져 있는 소프트 프로그램, 예를 들면 참고문헌 233의 단원 7.7.18에서 기술된 것들을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직한 일렬배열은 12의 오픈 페널티 및 2의 갭 연장 페널티, 62의 BLOSUM 매트릭스를 가지는 아핀(affine) 갭 연구를 사용하는 Smith-Waterman 상동성 연구 알고리즘에 의해 측정된다. Smith-Waterman 상동성 연구 알고리즘은 참고문헌 234에서 개시된다.
발명의 특별한 구체예
본 발명의 특별한 구체예는 다음을 포함한다:
1. 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 포합체.
2. 구체예 1의 포합체로서, 그 포합체는 다음의 단계들로 이루어지는 방법에 의해 얻을 수 있다: (a) 협막 다당의 일차 하이드록실기를 산화하여 알데하이드기 를 가지는 산화된 다당을 제공하는 단계; 및 (b) 알데하이드 기를 통하여 담체 분자에 산화된 다당을 결합시킴으로써 포합체를 제공하는 단계.
3. 구체예 2의 포합체로서, 단계 (a)에서 산화는 협막 다당의 잔기의 1 내지 10%의 잔기 상의 일차 하이드록실기의 산화이다.
4. 구체예 3의 포합체로서, 산화는 협막 다당의 잔기의 4 내지 8%의 잔기 상의 일차 하이드록실기의 산화이다.
5 구체예 2 내지 4 중 어느 것의 포합체로서, 단계 (a)의 산화는 TEMPO-중재된 산화이다.
6. 구체예 2 내지 5 중 어느 것의 포합체로서, 단계 (b)의 결합은 직접적이다.
7. 구체예 6의 포합체로서, 단계 (b)에서 결합은 알데하이드 기와 담체 분자 상의 일차 아민 기 사이의 환원성 아민에 의한 것이다.
8. 구체예 1의 포합체로서, 포합체는 다음의 단계들로 이루어지는 방법에 의해 얻을 수 있다: (a) 협막 다당의 환원 말단의 환원성 아민화로 공유 결합에 의해 말단 하위유닛의 C-1 원자에 결합된 일차 아민기를 가지는 변형된 다당을 제공하는 단계; 및 (b) 일차 아민기를 통해 담체 분자에 변형된 다당을 결합시킴으로써 포합체를 제공하는 단계.
9. 구체예 8의 포합체로서, 단계 (b)의 결합은 링커를 통해서이다.
10. 구체예 1의 포합체로서, 포합체는 다음의 단계들로 이루어지는 방법에 의해 얻을 수 있다: (a) 협막 다당의 환원 말단의 환원으로 그 말단에서 두 개의 인접한 하이드록실 기를 가지는 변형된 다당을 제공하는 단계; (b) 인접한 하이드록실기의 산화성 절단으로 그 말단에서 알데하이드기를 가지는 추가로 변형된 다당을 제공하는 단계; (c) 알데하이드기의 환원성 아민화로 그 말단에서 일차 아민기를 가지는 추가로 변형된 다당을 제공하는 단계; 및 (d) 추가로 변형된 다당을 담체 분자에 일차 아민기를 통해 결합시킴으로써 포합체를 제공하는 단계.
11. 구체예 10의 포합체로서, 일차 아민기는 공유 결합에 의해 말단 하위유닛의 C-5 원자에 결합된다.
12. 구체예 10의 포합체로서, 단계 (c)의 환원성 아민화는 알데하이드 기와 식 X1-L-X2의 이중기능성 링커의 말단 일차 아민기 사이에서 일어나고, 식에서 X1은 말단 일차 아민기를 포함하며; X2는 추가의 말단 일차 아민기를 포함하고; L은 연결 부분이다.
13. 구체예 12의 포합체로서, X1과 X2 기는 둘 다 -NHNH2이다.
14. 구체예 10 내지 13 중 어느 것의 포합체로서, 단계(d)의 결합은 링커를 통해서 일어난다.
15. 구체예 9 또는 14의 포합체로서, 결합은 이중기능성 링커를 통해서 일어나고, 이때 결합은 담체 분자의 일차 아민기에 결합하기 위한 첫 번째 기와 아민에 결합하기 위한 두 번째 기를 가지는 이중기능성 링커를 통해서 일어난다.
16. 구체예 15의 포합체로서, 이중기능성 링커는 식 X-L-X의 단일이중기능성 링커이고, 이때 식에서 두 개의 X 기는 상호 동일하며 일차 아민과 반응할 수 있고, L은 링커의 연결 부분이다.
17. 구체예 16의 포합체로서, X 기는 N-옥시석신이미드이다.
18. 구체예 12, 13, 16 또는 17의 포합체로서, L은 식 -L'-L2-L'-로 표시되고, 식에서 L'은 카보닐이다.
19. 구체예 18의 포합체로서, L2는 -(CH2)4-이다.
20. 어떠한 전술한 구체예의 포합체로서, 그 중 협막 다당은 올리고당이다.
21. 구체예 20의 포합체로서, 올리고당은 60 내지 100 또는 10 내지 20의 중합도를 가진다.
22. 어떠한 전술한 구체예의 포합체로서, 담체 분자는 디프테리아 또는 파상풍 변성 독소, CRM197 또는 단백질 D이다.
23. 구체예 1 내지 21 중 어느 것의 포합체로서, 담체 분자는 spr0096 항원과 spr2021 항원을 포함한다.
24. 구체예 23의 포합체로서, spr0096 항원은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 대해 50% 또는 그 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
25. 구체예 23 또는 구체예 24의 포합체로서, spr2021 항원은 SEQ ID NO:3에 대해 50% 또는 그 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
26. 구체예 23 내지 25 중 어느 것의 포합체로서, 담체 분자는 spr0096 항원과 spr2021 항원을 단일 폴리펩티드 사슬로서 포함한다.
27. 구체예 26의 포합체로서, 폴리펩티드 사슬은 식 NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH의 것이고, 식에서 A는 임의의 N 말단 아미노산 서열이며; B는 임의의 C 말단 아미노산 서열이고; n은 2 또는 그 이상의 정수이며; 각각의 X는 spr0096 항원 또는 spr2021 항원의 아미노산 서열이고, 이때 적어도 하나의 X는 spr0096 항원이며 적어도 하나의 X는 spr2021 항원이고; L은 임의의 링커 아미노산 서열이다.
28. 구체예 27의 포합체로서, n은 2이다.
29. 구체예 28의 포합체로서, X1은 spr0096 항원이고 X2는 spr2021 항원이다.
30. 구체예 29의 포합체로서, 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:9, 특히 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열에 대해 50% 또는 그 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
31. 특히 어떠한 전술한 구체예에서 규정된 것과 같은 포합체 형태의 혈청군 X 협막 다당을 포함하는 면역원 조성물.
32. 구체예 31의 면역원 조성물로서, 추가로 하나 또는 그 이상의 추가 항원을 포함한다.
33. 구체예 31 또는 구체예 32의 면역원 조성물로서, 추가로 혈청군 A 협막 다당을 포함한다.
34. 구체예 33의 면역원 조성물로서, 혈청군 A 협막 다당은 담체 분자에 포합된다.
35. 구체예 31 내지 34 중 어느 것의 면역원 조성물로서, 추가로 혈청군 W135 협막 다당을 포함한다.
36. 구체예 35의 면역원 조성물로서, 조성물은 담체 분자에 포합된 혈청군 A 협막 다당을 포함한다.
37. 구체예 35 또는 구체예 36의 면역원 조성물로서, 혈청군 W135 협막 다당은 담체 분자에 포합된다.
38. 구체예 34, 36 또는 37의 면역원 조성물로서, 담체 분자는 구체예 22에서 규정된 것과 같다.
39. 구체예 31 내지 38 중 어느 것의 면역원 조성물로서, 추가로 혈청군 C 협막 다당을 포함한다.
40. 구체예 31 내지 39 중 어느 것의 면역원 조성물로서, 추가로 혈청군 Y 협막 다당을 포함한다.
41. 구체예 39 또는 구체예 40의 면역원 조성물로서, 협막 다당은 담체 분자에 포합된다.
42. 구체예 41의 조성물로서, 담체 분자는 구체예 22에서 규정된 것과 같다.
43. 구체예 31 내지 42 중 어느 것의 면역원 조성물로서, 조성물은 수성 제형으로 제공된다.
44. 구체예 31 내지 43 중 어느 것의 면역원 조성물을 포함하는 백신.
45. 구체예 31 내지 44 중 어느 것의 면역원 조성물을 포유류에게 투여하는 것으로 이루어지는, 포유류에서 면역 반응을 발생시키는 방법.
46. 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 포합체를 제조하는 방법으로서, 그 방법은 구체예 2 내지 19 중 어느 것에서 규정된 것과 같다.
47. 구체예 46의 방법으로서, 그 중 포합체는 구체예 20 내지 30 중 어느 것에서 규정된 것과 같다.
48. (a) 혈청군 X 협막 다당과 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물로서, 그 조성물은 수성 제형으로 존재한다.
49. 구체예 48의 약학적 조성물로서, 그 중 혈청군 X 협막 다당은 구체예 1 내지 30 중 어느 것에서 규정된 것과 같은 포합체 형태로 존재한다.
50. 구체예 48 또는 구체예 49의 약학적 조성물로서, 추가로 구체예 32 내지 42 중 어느 것에서 규정된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 추가 항원을 포함한다.
51. 혈청군 X 협막 다당을 함유하는 것으로 의심되는 샘플의 분석 방법으로서, 그 방법은 (i) 샘플 중의 어떠한 혈청군 X 협막 다당을 가수분해하여 가수분해물을 제공하는 단계; (ii) 그 가수분해물에 액체 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)에서 분리된 어떠한 글루코사민-4-포스페이트를 검출하는 단계로 이루어진다.
52. 구체예 51의 방법으로서, 샘플은 포합되지 않은 혈청군 X 협막 다당 및/또는 포합된 혈청군 X 협막 다당을 함유한다.
53. 구체예 51 또는 구체예 52의 방법으로서, 샘플 중의 포합되거나 포합되지 않은 혈청군 X 협막 다당은 단계 (i) 전에 상호 분리된다.
54. 구체예 53의 방법으로서, 분리는 고체상 추출을 사용한다.
55. 구체예 51 내지 54 중 어느 것의 방법으로서, 단계 (ii)는 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)를 포함한다.
56. 구체예 51 내지 55 중 어느 것의 방법으로서, 단계 (iii)는 펄스 전류측정 검출(PAD)을 포함한다.
57. 구체예 51 내지 56 중 어느 것의 방법으로서, 단계 (i)은 산 가수분해를 포함한다.
58. 구체예 51 내지 57 중 어느 것의 방법으로서, 단계 (iii)는 정량적이다.
59. 어떠한 전술한 구체예의 방법으로서, 그 중 샘플은 표본 중의 포합되거나 포합되지 않은 혈청군 X 협막 다당을 분리한 후 포합되지 않은 물질을 샘플로서 사용함으로써 제조된다.
60. 혈청군 X 협막 다당을 함유하는 것으로 의심되는 표본의 분석 방법으로서, 총 혈청군 X 협막 다당 함량은 구체예 53을 제외한 구체예 51 내지 59 중 어느 것의 방법에 의해 측정되고, 포합되지 않은 혈청군 X 협막 다당 함량은 구체예 53 내지 59 중 어느 하나에서 기술된 것과 같이 측정되며, 그로써 총 혈청군 X 협막 다당에 포합되지 않은 혈청군 X 협막 다당의 비율이 계산될 수 있다.
실시예
혈청군 X 협막 다당 생성을 위한 박테리아 성장
상층액에서 혈청군 X 협막 다당의 생성 및 방출을 위한 최적의 박테리아 성장 조건을 확인하기 위하여, 세 가지 상이한 배지를 MenX 5967(ST 750) 균주를 사용하여 시험하였다. 상이한 성장을 플라스크에서 수행하였고, 양성자 핵 자기 공명 분광학(1H NMR)에 의하여 모니터하였다. 배양 상층액을 저분자량(MW) 종으로부터 파생된 신호를 중단하고 더 높은 MW의 혈청군 X 협막 다당의 신호를 강조하기 위해 확산 필터를 포함하는 NMR 순서에 의해 분석하였다. 고체 상태에서 1H 고-용해 매직 각 회전 NMR(HR-MAS NMR)에 의한 해당하는 펠릿의 추가의 분석은 혈청군 X 협막 다당 신호를 나타내지 않았고, 그것은 대부분의 다당이 상층액에 방출되었음을 시사한다(이 분석의 검출 한계를 고려함, 박테리아에 남아있는 다당의 최대량은 출발 량의 1/8이어야 한다). 유사한 결과가 세 개의 배지로 얻어졌다.
NMR 방법 외에, 정화된 배양 육즙에서 혈청군 X 협막 다당 정량을 위한 보다 정확한 방법을 펄스 전류측정 검출이 포함된 고성능 음이온-교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD)를 사용하여 개발하였다(아래 참조). 아래의 표에서 알 수 있는 것과 같이, 배지 #3은 가장 높은 양의 다당을 유발하였다. 그러므로 그것을 보다 큰 규모(18L)의 발효를 위해 선택하였고, 그것은 상층액 중에 356㎍/mL의 혈청군 X 협막 다당을 생성하였다.
상이한 배지에서의 MenX 5967( ST 750) 균주 성장 및 상대적인 다당 생성
Figure pct00020
* 1. 변형 Caltin v.6: 카사미노산 10g/L, NaCl 5.8g/L, 글루코스 10g/L, K2HPO4 4g/L, NH4Cl 1g/L, K2SO4 1g/L, MgCl2·6 H2O 0.4g/L, CaCl2·2 H2O 0.03g/L, Fe(III) 시트레이트 0.5mg/L, pH 7.2; 2. MCDM1: 글루코스 10g/L, 콩 펩톤 15g/L, NaCl 5.80g/L, K2SO4 1g/L, K2HPO4 4g/L, L-글루탐산 5g/L, L-아르기닌 0.3g/L, L-세린 0.5g/L, L-시스테인 0.23g/L, MgCl2 0.19g/L, CaCl2 0.021g/L, FeSO4 0.002g/L; 3. 변형 Frantz: L-글루탐산 1.6g/L, Na2HPO4·2H2O 15.5g/L, KCl 0.09g/L, NH4Cl 1.25g/L, pH 7.6, 다음으로 보충됨: 글루코스 50g/L, MgSO4·7H2O 30g/L, 25g/L의 한외여과된 효모 추출물, L-시스테인 1.5g/L.
혈청군 X 협막 다당의 정제
혈청군 X 협막 다당을 정제하기 위한 과정을 참고문헌 235로부터 적용한 방법에 의해 정제하였다.
포합체 생성 및 특성 확인
포합체를 상이한 사슬 길이와 상이한 포합 화학을 사용하여 만들었다.
산화 및 환원성 아민화에 의해 포합 (방법 A):
정제된 혈청군 X 협막 다당을 50mM아세트산 나트륨 pH 7.4중에서 100℃에서 1시간 동안 가수분해하였다(도 2). 그 결과의 올리고당의 평균 중합도는 80이고, NMR에 의해 25 내지 30kDa의 분자량에 해당하는 것으로 측정되었다. 다당 중합을 초고성능 액체 크로마토그래피-크기 축출 크로마토그래피(UPLC-SEC) 및 인(31P) NMR 분광학에 의해 과정 중에 모니터하였고, 원하는 avDP에 도달했을 때 그것을 중화에 의해 퀀칭하였다. 완충제를 테트라뷰틸 암모늄 브로마이드로 교환하여 다이메틸폼아마이드 용매 중에서 당의 용해를 가능하게 한다. 그런 다음 당을 TEMPO(MenX 반복 하위유닛에 대하여 0.06eq), NaHCO3(MenX 반복 하위유닛에 대해 9eq), TCC(MenX 반복 하위유닛에 대해 2eq)로 0℃에서 밤새 산화하였다. 이 산화로 개별적인 하위유닛의 C-6 위치에서 알데하이드기가 생성된다(도 3). 산화된 당을 아세톤/NaCl을 사용한 침전 및 세파덱스 G15 칼럼을 사용한 겔 여과에 의해 정제하였다. 당을 HPAEC-PAD를 사용하여 정량하였고, 그것의 구조적 동일성을 NMR을 사용하여 확인하였다. 그 결과 사슬당 대략 4.5개의 산화된 기가 있고, 그것은 circa 80 잔기 사슬을 따라 대략 6%의 산화 정도에 해당한다. 산화된 당의 분자량 분포를 UPLC-SEC에 의해 측정하였다.
알데하이드기를 환원성 아민화에 의해 담체 단백질 CRM197에 포합시키기 위해 사용하였다(도 3). 간단히 설명하면, 당을 10mg/ml의 CRM197과 4:1의 w/w 비율로, NaBH3CN과 1:1의 w/w 비율로 NaPi 10mM pH 7.2 완충액 중에서 혼합하였다. 그 혼합물을 72시간 동안 37℃에서 서서히 교반하였다. 포합체를 포스페이트 완충된 식염수로 세파크릴 S300 칼럼 상에서 정제하고, 분획을 풀(pool)로 수집하였다(도 4). 포합을 SDS PAGE로 확인하였다(도 3). 정제된 포합체(풀 1)의 특성을 아래에 나타낸다:
Figure pct00021
포합체를 또한 이 방법에 의해 만들었는데, 그때 다당은 아세트산 나트륨으로 가수분해하지 않았고, 따라서 천연 중합도를 가졌다. 추가의 포합체를 130의 평균 중합도를 가지는 다당을 함유하도록 만들었다.
포합체를 또한 이 방법에 의해 만들었는데, 그때 담체 단백질은 파상풍 변성 독소(TT) 또는 SEQ ID NO:0(SEQ9)였다. 이들 포합체의 다당의 평균 중합도는 130이었다. 이들 포합체의 다른 특성을 아래의 표에 나타낸다:
Figure pct00022
환원성 아민화와 이어서 SIDEA 링커와의 반응에 의한 포합 (방법 B):
정제된 혈청군 X 협막 다당을 50mM 아세트산 나트륨, pH 7.4에서 100℃에서 2시간 동안 가수분해하였다(도 2). 그 결과의 올리고당의 평균 중합도는 15였고, NMR에 의해 5kDa의 분자량에 해당하는 것으로 측정되었다. 그런 다음 5mg/ml의 당을 5mM의 아세트산 나트륨, pH 6.5 중에 300mg/ml의 NH4OAc와 49mg/ml의 NaBH3CN을 5일 동안 37℃에서 사용하여 용해시켰다. 이 단계로 말단 알데하이드기의 환원성 아민화가 일어나 일차 아민기가 생성되었다(도 5). 그런 다음 그 반응 혼합물을 접선 흐름 여과에 의해 1M NaCl 및 물에 대해 200cm2의 Hydrosart(셀룰로스) 2kDa-컷오프 막을 사용하여 정제하였다. 그런 다음 일차 아민기를 SIDEA를 사용한 활성화에 사용하여 계속해서 담체 단백질 CRM197에 포합시켰다(도 5). 간단하게 설명하면, 변형된 당을 DMSO/물에 NEt3을 사용하여 9:1(v/v)로(5:1의 NEt3:총 NH2기의 몰 비율로) 12:1의 몰 SIDEA:총 몰 NH2 기의 비율로 3시간 동안 실온에서 용해시켰다. 그런 다음 그 반응 혼합물을 90% 다이옥산(v/v)을 사용하여 침전에 의해 정제하였다. 그럼 다음 SIDEA-변형된 당을 13:1의 비율(몰 비 활성 에스터기:CRM197)로 25mg/ml의 CRM197과 25mM NaPi 완충액 pH 7.2중에서 반응시켰다. 그 혼합물을 5시간 동안 실온에서 느리게 교반하면서 놓아두었다. 포합체를 (NH4)2SO4를 사용한 침전에 의해 정제하였다. 포합을 SDS PAGE에 의해 확인하였다(도 5). 대다수의 이들 포합체의 특성을 아래에 나타낸다:
Figure pct00023
환원, 산화 및 환원성 아민화에 이어 SIDEA 링커와의 반응에 의한 포합 (방법 C):
15mg/ml의 정제된 혈청군 X 협막 다당을 10mM NaPi 완충액 pH 8중에서 NaBH4(MenX의 분자량에 대해 12eq, 고체)와 1.5시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이 단계로 당의 환원이 유발되었다. 그런 다음 6 내지 8mg/ml의 환원된 당을 10mM NaPi 완충액 pH 7.2 중에서 NaIO4(MenX의 분자량에 대해 10eq, 고체)와 1.5시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이들 두 단계의 조합된 효과는 당의 환원 말단에서의 알데하이드기의 생성이다(도 6). 그런 다음 변형된 당에 환원성 아민화를 수행하여 SIDEA로 활성화하고 계속해서 담체 단백질 CRM197에 포합하기 위해 사용될 수 있는 일차 아민 기를 얻는다(도 6). 간단히 설명하면, 4 내지 5mg/ml의 변형된 당을 10mM NaPi 완충액 pH 7 중에서 300mg/ml의 NH4OAc 및 49mg/ml의 NaBH3CN으로 5일 동안 37℃에서 용해시켰다. 변형된 당을 그런 다음 DMSO/물에 NEt3을 사용하여 9:1(v/v)로(5:1의 NEt3:총 NH2기의 몰 비율로) 12:1의 몰 SIDEA:총 몰 NH2 기의 비율로 3시간 동안 실온에서 용해시켰다. 그런 다음 그 반응 혼합물을 80% 아세톤(v/v)을 사용하여 침전에 의해 정제하였다. 그런 다음 SIDEA-변형된 당을 13:1의 비율(몰 비 활성 에스터기:CRM197)로 25mg/ml의 CRM197과 100mM NaPi 완충액 pH 7.2중에서 반응시켰다. 그 혼합물을 밤새 실온에서 느리게 교반하면서 놓아두었다. 포합체를 (NH4)2SO4를 사용한 침전에 의해 정제하였다. 포합을 SDS PAGE에 의해 확인하였다(도 6). 대다수의 이들 포합체의 특성을 아래에 나타낸다:
Figure pct00024
대체 링커를 통한 포합 (방법 D):
상기에서 기술된 것과 같이, 평균 중합도가 15인 정제된 혈청군 X 협막 다당을 또한 CRM197에 US 61/534,751의 도 7의 방법에 따라 상이한 링커를 사용하여 포합시켰다. 포합을 SDS PAGE에 의해 확인하였다(본원의 도 7).
환원, 산화 및 환원성 아민화에 의한 담체와의 포합 (방법 E):
15mg/ml의 정제된 혈청군 X 협막당을 10mM NaPi 완충액 pH 8 중에서 NaBH4(MenX의 분자량에 대하여 12eq, 고체)와 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이 단계로 당이 환원되었다. 그런 다음 환원된 당을 6 내지 8mg/ml로 10mM의 NaPi 완충액 pH 7.2에서 NaIO4(MenX의 분자량에 관련하여 10eq, 고체)와 1.5시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이들 두 단계의 조합된 효과는 당의 환원 말단에서의 알데하이드 기의 생성이다(도 17). 변형된 당은 그런 다음 담체 단백질 CRM197로 환원성 아민화된다. 간단히 설명하면, 2mg/ml의 변형된 당을 300mM의 NaPi 완충액 pH 8(8:1의 당:CRM197의 중량 비로)과 NaBH3CN(4:1의 당:NaBH3CN의 중량 비로)에 4일 동안 37℃에서 용해시켰다. 포합을 SDS PAGE에 의해 확인하였다(도 17).
면역화 연구(1)
일반적인 분석 프로토콜: Balb/c 마우스를 아래에 설명되는 스케줄에 따라 피하 주사에 의해 면역화하였다. 주사 부피는 200㎕였고, 주사는 알룸 포스페이트 보조제를 함유하였다(120㎍/용량). 주사를 1, 14 및 28일에 수행하였고, 채혈은 0일(면역전 혈청에 대해), 28일(두 번째 면역화 후 혈청) 및 42일(세 번째 면역 후 혈청)에 실시하였다.
Figure pct00025
MenACWY = 참고문헌 10에 따라 제조된 MenA-CRM197, MenC-CRM197, MenW135-CRM197 및 MenY-CRM197의 혼합물.
혈청군 X 협막 다당에 대한 세 번째 면역화 후 IgG 항체 역가 및 혈청군 X 균주 Z9615에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도 8에 도시한다. 혈청군 X 포합체는 면역원이었고 살균 항체를 유도하였다. 그 반응은 용량이 10배로(0.1㎍으로) 감소되었을 때에도 감쇠되지 않았다. 반응은 포합체가 혈청군 A, C, W135 및 Y로부터 유도된 포합체와 조합되었을 때 약간 감소하였지만, 여전히 대조표준 이상이었다. 따라서 이들 포합체와 혈청군 X 포합체 사이의 면역 간섭은 상대적으로 작은 것으로 나타난다.
혈청군 A, C, W135 및 Y 협막 다당에 대한 세 번째 면역화 후 IgG 항체 역가 및 이들 혈청군에 대한 혈청 살균 항체 역가를 또한 그룹 5, 6, 7 및 8에 대해 측정하였다(각각 균주 F8238, 11, 240070 및 860800을 사용함). 그 결과를 도 9 내지 12에 나타낸다. 혈청군 A, C, W135 및 Y 포합체에 대한 반응은 일반적으로 혈청군 X 포합체와 조합될 때 감쇠되지 않았다. 다시 한 번, 이들 결과는 이들 포합체와 혈청군 X 포합체 사이에 면역 간섭이 거의 없다는 것을 시사한다.
항-혈청군 X 협막 다당 IgM ELISA 유닛은 IgM으로부터 IgG로의 효과적인 아이소타입 스위칭으로 인해 포합체 백신에 대해 예상했던 것처럼 모든 포합체에 대해 낮은 것으로 밝혀졌다.
변형된 ELISA를 사용하여 더 높은 결합력의 IgG 항체만을 측정하였다(도 22). 변형된 ELISA는 더 높은 결합력의 IgG 항체만을 선택하고 검출하기 위하여 무질서 염을 사용한다. 항-혈청군 X 협막 다당 IgG ELISA 유닛은 표준 ELISA에 의한 유닛과 비교하여 두 번째 및 세 번째 투약 후에 모두 모든 포합체에 대해 낮았지만, 통계학적으로 유의미한 추가면역 효과가 모든 포합체에 대해 세 번째 투약 후에 관찰되었다(P는 0.0006으로부터 <0.0001으로).
다음의 표는 세 번째 면역화 후 모아진 혈청으로부터의 다양한 균주에 대한 토끼 보완 혈청 살균 항체 역가를 요약한 것이다.
Figure pct00026
면역화 연구(2)
일반적인 분석 프로토콜: Balb/c 마우스를 아래에서 설명되는 스케줄에 따라 피하 주사에 의해 면역시켰다. 주사 부피는 200㎕였고 주사는 알룸 포스페이트 보조제를 함유하였다.
Figure pct00027
MenACWY = 참고문헌 10에 따라 제조된 MenA-CRM197, MenC-CRM197, MenW135-CRM197 및 MenY-CRM197의 혼합물.
혈청군 X 협막 다당에 대한 세 번째 면역화 후 IgG 항체 역가 및 혈청군 X 균주 Z9615에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도 16에 도시한다. 혈청군 X 포합체는 면역원이었고 살균 항체를 유도하였다. 반응은 MenX-CRM197 포합체가 혈청군 A, C, W135 및 Y로부터 유도된 포합체와 조합되었을 때 약간 감소하였지만, 여전히 대조표준 이상이었다. 대조적으로, MenX-TT 또는 MenX-SEQ9 포합체가 이들 포합체와 조합되었을 때에는 거의 감소되지 않았거나 감소를 볼 수 없었다. 따라서 MenX 다당에 대한 상이한 담체 단백질의 사용은 이들 포합체와 혈청군 X 포합체 사이의 어떠한 면역 간섭이든지 감소되는 것을 보조할 수 있다.
MenX 포합체가 혈청군 A, C, W135 및 Y로부터 유도된 포합체들과 조합되었을 때 혈청군 A 협막 다당에 대한 세 번째 면역화 후 IgG 항체 역가 및 혈청군 A 균주 F8238에 대한 혈청 살균 항체 역가를 도 18에 나타낸다. 혈청군 C, W135 및 Y에 대한 해당 데이터를 도 19 내지 21에 나타낸다.
안정성 연구(1)
재료: 정제된 MenA 및 MenX 다당을 참고문헌 10의 방법에 따라 얻었다. 다당 제제의 순도를 잔류 단백질과 핵산 함량의 추정에 의해 평가하였고, 그것은 당의 1% w/w보다 낮았다.
NMR 분석: 1H, 13C 및 31P NMR 실험을, 고정밀 온도 조절기가 장착되고 5-mm 광대역 탐침(Bruker)을 사용하는 Bruker Avance III 400 MHz 분광계 상에서 기록하였다. 데이터 획득과 프로세싱을 위해 TopSpin 버전 2.6 소프트웨어(Bruker)를 사용하였다. 1H NMR 스펙트럼을 10ppm 스펙트럼 폭에 걸쳐, 128 스캔을 축적하면서 32k 데이터 지점으로 25±0.1℃에서 수집하였다. 스펙트럼을 0.2Hz 라인 증폭으로 무게를 측정하고 Fourier-변환시켰다. 송신기를 참조 신호(4.79ppm)로서 사용한 물 주파수로 설정하였다. 13C NMR 스펙트럼을 200ppm 스펙트럼 폭에 걸쳐, 4k 스캔을 축적하면서 32k 데이터 지점으로 100.6MHz 및 37±0.1℃에서 기록하였다. 스펙트럼을 0.2Hz 라인 증폭으로 무게를 측정하고 Fourier-변환시켰다. 송신기를 참조 신호(30.89ppm)로서 사용한 아세톤 주파수로 설정하였다. 31P NMR 스펙트럼을 20ppm 스펙트럼 폭에 걸쳐, 대략 1k 스캔을 축적하면서 32k 데이터 지점으로 161.9MHz 및25±0.1℃에서 기록하였다. 스펙트럼을 3.0Hz 라인 증폭으로 무게를 측정하고 Fourier-변환시켰다. 산화 중수소 중의 85% 인산을 외부 표준으로서(0ppm) 사용하였다. 모든 1H 및 31P NMR 스펙트럼을 각 신호의 전체 회수를 보장하기 위하여 총 재생 시간을 사용하여 정량적 방식으로 얻었다(5×세로 완화 시간 T1). MenA 및 MenX 협막 다당의 분해 메커니즘을 확인하고, 따라서 31P NMR 피크를 배정하기 위하여, 2차원 1H-31P 이종핵 다중-결합 수정(HMBC) 실험을 MenA 및 MenX 올리고당 샘플에 대해 수행하였는데, 그것들은 이전에 각각 50mM 아세트산 나트륨 pH 4.8 중에서(당 함량은 ~10mg/mL임) 73℃에서 약 2.5시간 동안 및 pH 4.0에서 80℃에서 약 5.5시간 동안(당 함량은 약 2.5mg/mL임) 산 가수분해에 의해 생성되었다. MenA와 MenX의 평균 중합도(avDP)는 31P NMR 분석에 의해 추정되는 바(아래의 안정성 실험 참조) 각각 대략 12 및 10이었다. 이들 NMR 분석 샘플을 대략 10mg의 건조 당을 0.75mL의 산화 중수소(99.9% 원자 D - Aldrich)에 용해시키고, 표준 펄스-프로그램을 사용하여 제조하였다. 4096 및 512 데이터 지점을 각각 F2 및 F1 차원에서 수집하였다. 64 스캔을 Fourier 변환 전에 축적시켜서 각각 F2 및 F1에서 지점 당 0.2Hz 및 5.0Hz의 디지털 해상도를 얻었다.
HPLC 분석: HPLC 분석을 펄스 전류측정 검출기가 장착된 ICS 3000 Dionex 시스템에 연결된 보호 칼럼(4mm×50mm; Dionex)이 부착된 CarboPacPA200 칼럼(4mm×250mm; Dionex)을 사용하여 수행하였다. 칼럼 평형을 위해 100mM의 NaOH+10mM 질산 나트륨 완충액을 사용하였고, 용출을 위해 증가하는 양의 질산 나트륨의 3-단계 구배(100mM NaOH+10mM, 250mM, 500mM 질산 나트륨, 각각 80, 15 및 3분)를 사용하였다. 전체 120분의 작동을 위해 0.4mL/분의 유속을 사용하였다. 20μL 샘플을 대략 1mg/mL의 농도로 주입하였다. 용출액을 전기화학적 검출기를 사용하여 금 작업 전극과 Ag/AgCl 참조 전극을 포함하는 펄스 전류측정 방식으로 모니터하였다. 탄수화물에 대해 4배-전위 파형을 적용하였다. 그 결과의 크로마토그래피 데이터를 Chromeleon 소프트웨어 6.8(Dionex)을 사용하여 처리하였다.
안정성 실험: MenA 및 MenX 다당 용액을 대략 1mg/mL의 농도로 중수소처리된 물로 제조된 100mM의 인산 칼륨 pH 7.0중에서 37℃ 및 45℃에서 각각 인큐베이션하였다. 상이한 시점에서, 샘플을 철회하고 NMR 및 HPLC에 의해 분석하였다. pH를 또한 각 시점에서 모니터하였다. MenA와 MenX의 avDP를 다당 안정성에 대해 모니터하였다. avDP 값을 31P NMR 스펙트럼의 통합에 의해 계산하고 [(Pde/Pme)+1]로 표시하는데, 이때 Pde는 사슬 기의 포스포다이에스터의 몰 농도이고 Pme는 포스포모노에스터 단부 기의 몰 농도이다. HPLC 프로필을 또한 31P NMR 분석에 의해 수집된 보다 정확한 안정성 평가를 확인하기 위하여 반(semi)-정량적으로 평가하였다.
MenA 및 MenX 다당의 분해 메커니즘: 경미한 산성 가수분해에 의해 생성된, MenA 올리고당에 대한 NMR 1H-31P HMBC 데이터를 도 13(a)에 기록한다. 만노스아민 잔기의 C3 및 C4에 있는 O-아세틸기의 존재로 인해, 여러 회전 시스템을 검출하였고 다음과 같이 배정하였다: (i) 3- 또는 4-O-아세틸화된 잔기의 Cl에 있는 양성자(H1-Pde)3/4OAc; (ii) 탈-O-아세틸화된 잔기의 C1에 있는 양성자(H1-Pde)deOAc; (iii) O-아세틸 기의 C3 및 C4 같은 자리의(geminal) 양성자(H3/H4-Pde)3 /4 OAc; (iv) 3-O-아세틸화된 잔기의 C2에 있는 양성자(H2-Pde)3OAc; (v) 4-O-아세틸화된 잔기의 C2에 있는 양성자(H2-Pde)4OAc; (vi) 탈-O-아세틸화된 잔기의 C2에 있는 양성자(H2-Pde)deOAc; (vii) 3- 또는 4-O-아세틸화된 잔기의 C5 및 C6에 있는 양성자(H5/6-Pde)3 /4 OAc; (viii) 탈-O-아세틸화된 잔기의 C3, C4, C5 및 C6에 있는 양성자(H3 /4/5/6-Pde)deOAc. 포스포모노에스터의 3- 또는 4-O-아세틸화된 잔기의 C6에 있는 양성자(H6-Pme)3 /4 OAc에 대한 및 탈-O-아세틸화된 잔기에 있는 양성자(H6-Pme)deoOAc에 대한 교차 피크에 의해 확인된 C6에서의 포스페이트의 부착은 가수분해되는 중에 포스포다이에스터 결합이 절단되어 비-환원 말단에 포스페이트기가 부착된 채로 남아있음을 가리키고, 그것은 포스페이트-C1 연쇄의 더 낮은 안정성과 일치한다. 다른 1H-31P 스칼라(scalar) 상관관계가 검출되지 않았기 때문에, 가수분해 중에 C4 또는 C3에서 유리 하이드록실기를 포함한 포스페이트 기의 이동은 발생하지 않았다. MenX 올리고당에 대한 1H-31P HMBC(도 13(b))는 또한 포스페이트-C1 연쇄가 덜 안정적이고 이 경우 비-환원 말단이 C4에 부착된 포스페이트 기를 가지며; 모노에스터 포스페이트는 C4에 있는 양성자와만 교차-상관되는 것으로 나타나는 것을 가리켰다. 또한 MenX 에 대해서, 가수분해 중에 C3 또는 C6에서 유리 하이드록실기를 포함한 포스페이트 이동은 발생하지 않았다. 모든 31P 회전 시스템을 배정하였고, 포스포다이에스터 및 포스포모노에스터 신호는 각각 -1.40ppm 및 4.65ppm이었다. 양성자 NMR 프로필을 또한 31P-이중결합된 스펙트럼을 수집함으로써 배정하였는데, 그것은 이 스칼라 결합으로 인해 피크 구조를 환원시킨다. 모든 스펙트럼 배정은 주로 13C NMR 분석을 토대로 한 공개된 결과(참고문헌 30)와 일치하였다. MenX 협막 다당의 13C NMR 화학적 쉬프트는 아래의 표 1에 나타낸 것과 같이 공개된 데이터(참고문헌 14)와 일치하였다.
MenX 협막 다당의 13C NMR 화학적 쉬프트
C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 CH 3 NAc CO NAc
화학적
쉬프트( ppm ) 		95.2 54.8 71.1 75.1 73.2 61.3 23.2 175.6
MenA 및 MenX 다당의 열 안정성. 포스포다이에스터 결합에서의 가수분해의 결과로서 MenA 및 MenX 협막 다당의 분해는 새롭게 형성된 포스포모노에스터 말단기를 노출시키는 더 낮은 avDP의 단편을 초래한다. NMR 실험에서, 이들 포스포모노에스터기는 내부 포스포다이에스터 기에 의해 발생하는 것보다 더 높은 장(field)에서 31P 공명 신호를 발생하고, 그로써 상기 안정성 실험 단원에서 설명된 것과 같은 avDP 계산이 가능해진다. 보관 중에 avDP의 변동은 당 안정성의 지표이고, 그러므로 MenA 및 MenX 협막 다당의 샘플의 avDP를 37℃ 및 45℃에서 노출되는 동안 상이한 시점에서 취하여 31P NMR에 의해 측정하였다(표 2 및 도 14(a)).
온도 (℃) 시간(일) MenA PS MenX PS
pH avDP OAc( mol / mol ) pH avDP
37 0 6.97 >100 0.932 6.96 >100
7 6.91 88.1 0.916 6.91 >100
14 6.91 68.2 0.916 6.89 >100
21 7.00 46.1 0.897 6.93 >100
28 6.96 22.9 0.883 6.91 >100
45 0 6.97 >100 0.932 6.96 >100
7 6.95 22.4 0.891 6.94 >100
10 6.93 15.1 0.886 6.86 >100
14 6.91 10.5 0.851 6.85 >100
21 6.90 5.1 0.826 6.87 >100
상기 표는 상이한 시점 및 37℃ 및 45℃의 온도에서 MenA 및 MenX 샘플에 대한 31P NMR 분석에 의해 추정된 avDP 및 검출된 pH 값을 나타낸다. 반복 유닛의 몰당 몰 O-아세틸기로 표시된 MenA 협막 다당의 O-아세틸화 상태도 또한 기록되었다. 사용된 샘플 농도에서, avDP가 100보다 높을 때, 기술적 민감성으로 인해 두 가지의 다당에 대해 모두 0 시간에서 avDP의 측정이 가능하지 않았다. 각 시점에 대해 샘플의 pH는 7.0±0.1의 범위 내에서 유지되었다(도 14(b)).
37℃에서 MenA 협막 다당은 28일 동안 인큐베이션한 후에 22.9의 avDP로 분해된 한편, 45℃에서 분해는 21일 후에 5.1의 avDP로 가속화되었다. 동일한 조건 하에서, MenX 협막 다당은 분해를 나타내지 않아다(두 가지의 인큐베이션 온도에서 모든 시점에 대해 avDP>100; 분석 민감성을 토대로, 100은 검출할 수 있는 최대 avDP 값이다). 37℃ 및 45℃에서 인큐베이션된 MenA 협막 다당의 HPLC 프로필(도 15)은 더 짧은 올리고당의 증가된 세기 피크를 점진적으로 나타냈고, 그것은 사슬의 중합해체를 가리킨다. 그것과 비교하여, 모든 MenX 샘플에 대해 수집된 HPLC 프로필은 대략 87분에 긴 사슬 다당으로 인해 넓은 피크를 보이면서 실제로 변동되지 않은 채로 유지되었는데, 그것은 부가적으로 이 탄수화물의 더 높은 안정성을 증명한다. 1H NMR 분석은 37℃ 및 45℃에서의 MenA 및 MenX 협막 다당의 인큐베이션이 다당 반복 유닛의 구조를 변경시키지 않았음을 확인해주었다. 단지 37℃ 및 45℃에서 0.932로부터 각각 0.883 및 0.826 몰/몰 반복 유닛으로의 O-아세틸화 수준의 제한된 감소만이 관찰되었다(O-아세틸기는 MenA 협막 다당에만 존재한다)(표 2 및 도 14(c)). 이들 NMR 및 HPLC 데이터를 함께 취하면, 그것들은 수성 용액에서 MenA 협막 다당에 비교하여 MenX의 더 높은 안정성을 확인한다.
안정성 연구(2)
재료: MenX-CRM197 포합체를 상기 방법 A, B 및 C에 따라 제조하였다.
방법 A에 따라 제조한 포합체는 100의 평균 중합도를 가지는 다당을 함유하였다. 이 포합체의 다른 특성을 다음에 제시한다:
Figure pct00028
방법 B에 따라 제조한 포합체는 다음의 특성을 가졌다:
Figure pct00029
방법 C에 따라 제조한 포합체는 19의 평균 중합도를 가지는 다당을 함유하였다. 이 포합체의 다른 특성을 아래에 제시한다:
Figure pct00030
가속화된 안정성 연구를 이들 포합체의 안정성에 대해 예비 정보를 제공하기 위하여 수행하였다. 안정성 연구를 37℃에서 28일 동안 수행하였고, 측정을 위한 시점은 매 7일마다였다(0, 7, 14, 21, 28일). 포합체로부터 방출된 당을 측정함으로써 샘플을 모니터하였다. 유리 당의 분리를 용출 완충액으로서 ACN 10 내지 20%+TFA 0.05%를 사용하여 SPE-C4 카트리지에 의해 수행하였다. 총 및 유리 당을 HPAEC-PAD 분석에 의해 정량하였고, % 유리 당을 계산하였다. 세 종류의 포합체에 대한 값을 아래에 제시한다:
Figure pct00031
방법 A를 사용하여 만들어진 포합체는 방법 B 및 C에 의해 만들어진 포합체보다 더 안정하였다.
분석 연구
재료: MenX 다당을 나이세리아 메닝기티디스 X5967 균주(ST 750)의 박테리아 성장에 의해 생성시키고, 참고문헌 235로부터 적용한 방법에 의해 정제하였다. 다당 제제의 순도를, 잔류 단백질 및 핵산 함량을 비색 분석을 사용하여 추정함으로써 평가하였고(둘 다 1% w/w 미만의 당으로 존재함), LAL 분석을 사용하여 내독소 함량을 측정하였다(<10EU/㎍ 당). 아세트산 나트륨 염(Thermo Scientific Dionex), 나트륨 하이드록사이드 50% 용액(J.T. Baker), 트라이플루오로아세트산(Sigma), Water MilliQ 등급(Millipore)은 프로(pro)분석 품질의 것이었다.
일반적 방법: 총 인 함량을 참고문헌 24의 방법을 따라 측정하였다.
반응을 실리카겔 60 F254(Sigma Aldrich) 상에서 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 모니터하였고: UV 광 아래에서 조사한 후에 화합물을 10%(v/v) 에탄올성 H2SO4를 사용한 가열에 의해 가시화하였다. 칼럼 크로마토그래피를 사전-충전된 실리카 카트리지 RediSep(Teledyne-Isco, 0.040 내지 0.063nm)를 사용하여 수행하였다. 다르게 명시되지 않는 한, 0에서 100%까지의 용출 혼합물의 구배를 Combiflash Rf(Teledyne-Isco) 기기에 적용하였다.
1H, 13C 및 31P NMR 실험을 고정밀 온도 조절기가 장착된 Bruker Avance III 400 MHz 분광계상에서 5-mm 광역 탐침(Bruker)을 사용하여 기록하였다. 데이터 획득 및 처리를 위하여, TopSpin 버전 2.6 소프트웨어(Bruker)를 사용하였다.
1H NMR 스펙트럼을 10ppm 스펙트럼 폭에 걸쳐 32k 데이터 지점으로 25±0.1℃에서 수집하였다. 스펙트럼을 0.2Hz 라인 증폭으로 무게를 측정하고 Fourier-변환시켰다. 화학적 쉬프트 값을, 내부 Me4Si(0.00ppm, CDCl3) 또는 용매 신호(4.79ppm, D2O)와 관련하여 ppm으로 기록하였다. 13C NMR 스펙트럼을 200ppm 스펙트럼 폭에 걸쳐, 32k 데이터 지점으로 100.6MHz 및 37±0.1℃에서 기록하였다. 스펙트럼을 0.2Hz 라인 증폭으로 무게를 측정하고 Fourier-변환시켰다. 화학적 쉬프트 값을 CDCl3의 신호(77.0ppm, CDCl3)와 관련하여 ppm으로 기록하였다.
31P NMR 스펙트럼을 20ppm 스펙트럼 폭에 걸쳐, 32k 데이터 지점으로 161.9MHz 및 25±0.1℃에서 기록하였다. 스펙트럼을 3.0Hz 라인 증폭으로 무게를 측정하고 Fourier-변환시켰다. 산화 중수소 중의 85% 인산을 외부 표준으로서(0ppm) 사용하였다.
정확한 질량을 Q-Tof 마이크로 매크로매스(Waters) 기기를 사용하여 전자 분무 이온화 컷-오프 분광학에 의해 측정하였다. 광학 회전을 P-2000 Jasco 편광계를 사용하여 측정하였다. 벤질 3,6- 다이 -O-벤질-2- 데옥시 -2- 프탈이미도 -β-D- 글루코피라노시드 3. 출발 물질 2(참고문헌 236)(1.8g, 3.1mmol)를 질소 하에 아세토니트릴(200ml)에 녹이고, 0℃에서 트라이메틸아민보란(1.4g, 18.4mmol) 및 BF3Et2O(2.6ml, 18.4mmol)으로 처리하였다. 그것을 1시간 동안 0℃에서 교반한 후에, 그 혼합물을 주변 온도가 되도록 놓아둔 후, 그 시점에서 반응을 완료시켰다(TLC, 7:3 사이클로헥산-EtOAc). 거기에 MeOH(3ml) 및 트라이에틸아민(3ml)을 첨가하고, 그 혼합물을 농축하였다. 그 잔류물을 aq NaHCO3로 분할하고, 유기 층을 조합하여 농축하고 실리카겔(사이클로헥산-EtOAc) 상에서 정제하여 1.5g의 생성물 3을 얻었다(83%). [α]D 24=+1.9(c 0.5, CHCl3). 1H NMR (CDCl3, 400MHz):δ=7.80-6.95 (m, 19H, Ph), 5.15(d, 1H, J 1 ,2 8.0Hz, H-1), 4.78, 4.47(2d, 2H, 2 J 12.2Hz, CH 2Ph), 4.72, 4.51(2d, 2H, 2 J 12.0Hz, CH 2Ph), 4.67, 4.59(2d, 2H, 2 J 12.0Hz, CH 2Ph), 4.26-4.18(m, 2H, H-2,3), 3.87-3.88(m, 3H, H-4,6), 3.66-3.62 (m, 1H, H-5), 2.89(d, 1H, J 2 , OH 2.3Hz, OH-4). 13C NMR(CDCl3, 100MHz):δ=167.81(CO), 138.15, 137.59, 137.10, 133.67, 131.61, 128.12, 127.91, 127.86, 127.81, 127.58, 127.40(Ar), 97.35(C-1), 78.49(C-3), 74.37, 74.24(CH2Ph), 73.78(C-5), 73.45(C-4), 70.80(CH2Ph), 70.69(C-6), 55.37(C-2). ESI HR-MS (C35H33NO7): m/z = ([M+Na]+ 실측치 597.2547; 계산치 597.2601); ([M+Na]+ 실측치 618.1895; 계산치 618.1894).
벤질 2- 아세트아미도 -3,6- 다이 -O-벤질-2- 데옥시 -β-D- 글루코피라노시드 4. 1.2ml의 에틸렌다이아민을 함유하고 있는, EtOH(20ml)중의 N-프탈이미도 화합물 3(1g, 1.7mmol)의 혼합물을 밤새 환류시켰다. TLC(톨루엔-EtOAc 4:1) 후에 반응이 완료된 것으로 나타났고, 그 혼합물을 농축하여 4:1의 EtOH-Ac2O(25ml)에 다시 녹였다. 그 혼합물을 3시간 동안 교반한 후 농축하였다. 그 잔류물의 크로마토그래피(사이클로헥산-EtOAc)로 740mg의 모노당 4를 얻었고, 그것의 NMR 데이터는 문헌[237]에서 최근에 보고된 것과 동일하였다.
벤질 2- 아세트아미도 -3,6- 다이 -O-벤질-4-(1,5- 다이하이드로 -3-옥소-3γ 5 -3H-2,4,3-벤 조다이옥사포 스페핀-3-일)-β-D- 글루코피라노시드 5. N,N-다이에틸-1,5-다이하이드로-3H-2,3,4-벤조다이옥사포스페핀-3-아민(717mg, 3mmol)을 CH2Cl2(9ml) 중의 모노당(500mg, 1mmol) 및 아세토니트릴(9ml) 중의 0.45M의 1H-테트라졸 용액에 0℃에서 첨가하였다. 10분 후에 얼음 배스를 제거하고, 교반을 계속하였다. 추가로 3시간 교반한 후에 반응을 완료시켰다(TLC, 1:1 톨루엔-EtOAc). 그 혼합물을 -20℃로 냉각하고 m-CPBA를 첨가하였다. 20분 후에 약간의 aq NaHCO3를 첨가하여 혼합물을 퀀칭하였다. 그 혼합물을 CH2Cl2로 희석하고, NaHCO3를 사용하여 분리 깔때기로 추출하였다. 유기층을 조합하여 농축한 후 잔류물을 실리카겔(사이클로헥산-EtOAc) 상에서 정제하여 630mg의 생성물을 얻었다(92%). EtOAc로부터의 백색 결정, m.p. 159 내지 160℃. = [α]D 24= +34.7 (c 0.1, CHCl3). 1H NMR(CDCl3, 400MHz): δ=7.41-7.12(m, 18H, Ph), 5.90(d, 1H, J 1 ,2 7.6Hz, H-1), 5.17-5.12(m, 2H, 2 CHPh), 5.00-4.78(m, 4H, 4 CHPh), 4.65-4.58(m, 5H, 4 CHPh, H-4), 4.32(t, 1H, J 9.0 Hz, H-3), 3.89(d, 1H, J 6a ,5 9.0Hz, H-6a), 3.76-3.69(m, 2H, H-5,6b), 3.46-3.42(m, 1H, H-2), 1.80(s, 3H, CH 3CO). 13C NMR(CDCl3, 100MHz): δ=170.61(CO), 138.26, 137.36, 134.98, 128.94, 128.35, 127.95, 127.98, 127.80, 127.71, 127.57, 127.50(Ar), 98.85(C-1), 78.71(C-3), 76.72(C-4), 73.97(C-5), 73.76, 73.42, 70.09(CH2Ph), 69.04(C-6), 68.30, 60.25(CH2Ph), 56.95(C-2), 23.40(CH3CO). 31P NMR(CDCl3, 162MHz): δ=0.32. ESI HR-MS(C37H40NO9P): m/z = ([M+H]+ 실측치 674.2476; 계산치 674.2519).
2- 아세트아미도 -2- 데옥시 -β-D- 글루코피라노실 포스페이트 6. 보호된 모노당 5(100mg, 0.15mmol)를 MeOH(10ml)에 녹이고 10% Pd/C(30mg) 상에서 수소처리하였다. 그 혼합물을 1d동안 교반한 후, 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 용매를 증발시키고, 회수한 미정제 물질을 C-18 Isolute SPE 카트리지 상에서 정제하였다. 당을 함유하고 있는 분획을 냉동-건조하여 42mg의 포말성 생성물 6(95%)을 얻었고, 그것의 NMR 데이터는 문헌[238]에 보고된 것과 일치하였다.
MenX 정량을 위한 펄스 전류측정 검출을 포함한 고성능 음이온-교환 크로마토그래피( HPAEC - PAD ): MenX 샘플을 0.5 내지 8㎍/mL 범위에서 600μL의 총 부피로 희석된 2M의 최종 농도의 TFA로 처리하였다. 샘플을 100℃에서 2.5시간 동안 폐쇄된 나사-캡 시험관에서 가열한 후 2 내지 8℃에서 30분 동안 냉각시키고, 700μL의 NaOH 2M을 첨가한 후, 0.45㎛의 Acrodisc(PALL) 필터로 여과한 다음 분석하였다. 총 인 함량에 대한 비색 방법을 통해 적정된 MenX PS의 순수한 제제 또는 합성 단량체 4-GlcNAc-4P를 보정 곡선을 만들기 위해 사용하였고, 0.5 내지 8㎍/mL의 범위에서 표준으로 설정하였다. HPAEC-PAD를 PA1 보호 칼럼이 결합되어 있는 CarboPac PA1 칼럼(4×250mm; Dionex)이 장착된 Dionex ICS3000을 사용하여 수행하였다. 샘플을 10분 동안 100nM의 NaOH 중의 100mM로부터 500mM AcONa까지의 구배를 사용하여 1mL/분의 유속으로 흐르게 하였다. 용출액을 금 작업 전극과 Ag/AgCl 참조 전극을 포함한 펄스 전류측정 방식으로 전기화학적 검출기를 사용하여 모니터하였다. 탄수화물에 대하여 4배-전위 파형을 적용하였다. 그 결과의 크로마토그래피 데이터를 Chromeleon 소프트웨어 6.8을 사용하여 처리하였다.
MenX 다당 및 GlcNAc -4P의 산 가수분해 및 NMR 특성확인: 대규모 산 가수분해를 MenX 다당 및 합성 단량체(10mg)에 대해 수행하였다. 두 샘플 모두 2mL의 2M TFA에 녹이고 100℃에서 2.5시간 동안 가수분해하였다. 그 샘플을 건조시키고, 분석 전에 D2O로 2회 교환하였다.
가수분해 조건의 선택: 단량체 하위유닛을 완전하게 방출시키고 그것의 분해를 최소화할 수 있는 MenX 가수분해에 대한 최적 조건을 확인하기 위하여, 100℃에서 2M TFA에서의 가수분해를 수행하는 MenX 다당의 가수분해에 대한 상이한 반응 시간(1부터 6시간까지)을 탐구하였다. 총 인 함량에 대한 비색 방법을 통해 적정된 MenX 다당의 순수한 제제를 2가지 상이한 농도(0.5 및 2㎍/mL)에서 사용하였다. 하나의 일반적인 피크를 HPAEC-PAD 분석에 의해 검출하였다. 피크의 면적은 시간이 경과함에 따라 증가하였고, 최대는 2시간 내지 3시간 사이에 있었으며 더 긴 시간인 경우 감소하였다. 궁극적으로 2.5시간을 최적 가수분해 시간으로 선택하였다.
방법의 선형성을 0.5 내지 8㎍/mL 범위에서 확인하였다(R2=99.807). 방법을 계속해서 발효 육즙을 포함하여 정제 과정 중간체에 적용하였고, 방법의 정확성을 측정하기 위하여 회수연구를 수행하였다. 공지량의 다당을 분석을 수행한 표준 샘플에 첨가하였다. 스파이크를 보인 샘플에 대해 측정된 총 농도와 스파이크를 보이지 않은 샘플에서 발견된 농도 사이의 차이를 토대로 회수율을 계산하였다. 평균 회수율 범위는 98 내지 102%였고, 그것은 고도의 정확성을 나타낸다. 반복성 내부-분석을, 동일한 샘플을 1%의 CV 및 0.5%의 해당 평균 CV를 사용하여 4회 분석함으로써 수행하였다.
4P- GlcNAc 의 합성: 계획도 1에서 알 수 있는 것과 같이, 표적 화합물 6의 합성은 보호된 GlcN 2(92% 수율)의 위치선택적 고리 개방으로부터 시작하였는데, 그것은 참고문헌 236에서 기술된 것과 같이 갈락토사민 염산염으로부터 제조되었다. 에틸렌다이아민에 의한 N-프탈아미도 보호의 제거와, 이어서 선택적 N-아세틸화는 공지된 화합물 4[237]를 87% 수율로 제공하였다. 4와 N,N-다이에틸-1,5-다이하이드로-3-H-2,3,4-벤조다이옥사포스페핀-3-아민 및 1H-테트라졸과의 반응 및 계속해서 m-클로로퍼벤조산(m-CPBA)으로의 산화는 다른 방법들[238]로 전에 보고된 것보다 상당히 더 높은 수율로 포스페이트기가 도입되는 것을 가능하게 하였고, 결정성의 상온 저장가능한 화합물 5를 제공하였다(m.p. 159 내지 160℃). 31P NMR 스펙트럼에서 0.32ppm에서의 포스포모노에스터 피크는 4.58ppm에서의 H-4 신호와 상호관련이 있고, 1H-31P HMBC NMR 스펙트럼에서 CH 시스템의 2개의 커플(각각 5.13, 4.98 및 5.14, 4.99ppm)은 5의 구조의 평가를 가능하게 하였다. 마지막으로 10% Pd-C 상에서의 수소첨가분해는 보호되지 않은 포스페이트가 존재했을 때 얻어진 50% 수율과 비교하여 우수한 수율로(95%) 표적 4P-GlcNAc 6을 제공하였다. 최종 생성물의 NMR 데이터는 문헌[239]에 보고된 것과 매우 잘 일치하였다.
Figure pct00032
계획도 1. a. 참고문헌 236; b. 트라이메틸아민보란, BF3·Et2O, CH3CN, 0℃, 83%; c. H2NCH2CH2NH2, EtOH, 환류; Ac2O, 피리딘, 87%(2 단계에 걸쳐); d. N,N-다이에틸-1,5-다이하이드로-3H-2,3,4-벤조다이옥사포스페핀-3-아민, 1H-테트라졸, CH2Cl2; m-CPBA, CH2Cl2, H2O, 92%; e. H2, 10% Pd-C, 95%.
MenX 다당 또는 4P- GlcNAc 의 산 가수분해에 의해 형성된 생성물의 NMR 특성확인: MenX 다당과 합성 단량체 6을, NMR 분석에 의하여 결과적으로 생성된 종의 구조를 확인하기 위해 HPAEC-PAD 분석에 대해 최적화된 과정에 따라 대규모로 가수분해하였다. 두 가지 경우 모두 4P-GlcNAc를 일반적 종으로서 평가하였다.
4P-GlcNAc 6의 1H MR 스펙트럼은 각각 5.19 및 4.72ppm에서 α/β 아노머 피크를 나타냈고, 4.00 내지 3.69ppm 범위에서 양성자 신호를 나타냈다. H-2α 및 H-2β를 동종-핵 COSY NMR 상관관계에 의해 3.91ppm과 3.72ppm 신호로 배정하였다. 0.58ppm에서의 포스페이트 모노에스터에 대한 하나의 단일 피크를 31P NMR에서 검출하였다.
표준 6 및 천연 MenX PS 둘 다의 가수분해 후에, 획득된 4P-GlcN의 1H NMR 분석은 각각 5.40 및 4.92ppm에서 5.5:5.5 및 6.7:3.3의 비율로 α/β 혼합물에 해당하는 두 개의 주요 아노머 신호를 나타냈다. 남아있는 고리 양성자 신호는 4.08과 3.44ppm에 속하는 한편, H-2α(dd, J 3.7 및 10.3Hz, 3.91ppm에서) 및 H-2β(dd, J 8.5 및 10.5Hz, 3.06ppm에서)는 아세틸기의 상실로 인해 장(field)에서 쉬프트업되었다. 나아가 N-아세틸 CH3 신호는 검출되지 않았는데, 그것은 가수분해 결과 전체적으로 N-아세틸화가 제거되었음을 가리킨다.
이차원적인 1H-31P HMBC NMR은 31P NMR 스펙트럼의 0.68 및 0.14ppm에서 포스페이트 모노에스터 신호에 배정되고, 1H NMR에서 각각 3.94 및 3.96ppm에서의 H-4α 및 H-4β와 상관관계가 있는 두 개의 중복하는 교차 피크를 증명하였다.
HPAEC - PAD 에 의한 MenX 정량을 위한 표준으로서 4P- GlcNAc 의 사용: 합성 단량체 6을 총 인 함량에 대해 비색 방법에 의해 정량한 후, 천연 MenX 다당에 비교하여 보정 곡선(0.5 내지 8㎍/mL의 범위에서)을 만들기 위해 사용하였다. 합성 단량체 및 천연 다당에 대해 MenX 다당 샘플에 대해 최적화된 동일한 가수분해 조건을 수행한 후, 동일한 피크를 HPAEC-PAD에 의해 검출하였고, 완벽하게 중복된 곡선을 얻었다. 미지 샘플과 다당 정제 과정의 중간체의 농도는 정량을 위해 사용한 곡선과는 무관하게 일치하였다(다당 농도 값의 차이는 모든 시험된 샘플에 대해 <2%였다). 가수분해된 MenX 다당과 합성 단량체의 혼합물을 또한 CarboPac PA1 칼럼 상에서 HPAEC-PAD에 의해, 10mM 나트륨 하이드록사이드로 용출하면서 분석하여, 사용된 가수분해 조건에서 GlcN의 궁긍적인 형성을 증명하였다[26]. GlcN의 형성은 천연 MenX 및 합성 단량체 샘플 둘 다에 대해 몰(mol)에서 5%보다 적었다.
본 발명자들은 또한 MenX에 대해 최적화된 동일한 가수분해 조건을 사용하여, 분석에 대한 표준으로서 상업적으로 활용가능한 글루코사민-6-포스페이트(6P-GlcN)를 사용하는 것의 가능성을 증명하였다. 그 결과의 보정 곡선은 천연 MenX 및 그것의 합성 단량체를 사용하여 얻어진 것과 중복되었지만, 그 결과의 HPAEC-PAD에 의해 검출된 피크의 용출 시간은 달랐고(MenX에 대한 9.88분에 대해 8.97분), 그것은 4P-GlcN의 활용이 보다 더 직설적임을 증명한다.
MenX 다당 정량에 대한 이 방법은 정제 과정 중간체와 최종 포합체 백신의 당 함량을 모니터하기 위한 중대한 분석적 도구이다. 과정의 수율이 계산될 수 있는 것 외에도 정량은 포합체의 당/단백질 비율 및 유리 당의 %의 계산을 가능하게 하는데, 두 가지 모두 최종 백신 제형의 품질 및 일관성을 증명하기 위한 중요한 변수들이다.
합성 단량체의 사용은 분석을 위해 다당의 배치를 규격화할 필요가 없음을 의미한다. 전체 방법은 신속하고, 최소 샘플 정화로 당의 매우 낮은 농도(≥0.5㎍/mL의 다당)의 검출을 가능하게 하며, 발효 육즙을 포함하여 정제 과정 중간체의 특성확인을 위해서도 매우 잘 활용될 수 있는 것으로 증명되었다. 방법은 포합체 과정의 중간체의 정량을 위해, 그리고 최종 백신 제형의 특성확인을 위해 적당할 수 있다.
본 발명은 실시예에 의해서만 설명되고 변형이 이루어질 수 있는 한편으로 본 발명의 범주 및 사상 내에서 유지된다는 것이 인정될 것이다.
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Claims (25)

  1. 나이세리아 메닝기티디스 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 포합체.
  2. 제 1항에 있어서, 포합체는 (a) 협막 다당의 일차 하이드록실기를 산화시켜서 알데하이드기를 가지는 산화된 다당을 제공하는 단계; 및 (b) 산화된 다당을 담체 분자에 알데하이드기를 통해 결합시켜서 포합체를 제공하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 포합체.
  3. 제 2항에 있어서, 단계 (a)에서의 산화는 협막 다당의 잔기 중 1 내지 10%의 잔기 상의 일차 하이드록실기의 산화인 것을 특징으로 하는 포합체.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 단계 (b)에서의 결합은 직접적인 것을 특징으로 하는 포합체.
  5. 제 1항에 있어서, 포합체는 (a) 협막 다당의 환원 말단의 환원성 아민화로 말단 하위유닛의 C-1 원자에 공유 결합에 의해 결합된 일차 아민기를 가지는 변형된 다당을 제공하는 단계; 및 (b) 변형된 다당을 담체 분자에 일차 아민기를 통해 결합시킴으로써 포합체를 제공하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 포합체.
  6. 제 1항에 있어서, 포합체는 (a) 협막 다당의 환원 말단의 환원으로 그 말단에서 두 개의 인접한 하이드록실기를 가지는 변형된 다당을 제공하는 단계; (b) 인접한 하이드록실기의 산화성 절단으로 말단에 알데하이드기를 가지는 더 변형된 다당을 제공하는 단계; (c) 알데하이드기의 환원성 아민화로 말단에 일차 아민기를 가지는 더 변형된 다당을 제공하는 단계; 및 (d) 상기 더 변형된 다당을 담체 분자에 일차 아민기를 통해 결합시킴으로써 포합체를 제공하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 포합체.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 단계 (d)에서의 결합은 링커를 통한 것을 특징으로 하는 포합체.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 협막 다당은 올리고당인 것을 특징으로 하는 포합체.
  9. 제 1항 내지 제 8 중 어느 한 항에 있어서, 담체 분자는 디프테리아 또는 파상풍 변성 독소, CRM197 또는 단백질 D인 것을 특징으로 하는 포합체.
  10. 제 1항 내지 제 8 중 어느 한 항에 있어서, 담체 분자는 spr0096 항원과 spr2021 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 포합체.
  11. 특히 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 포합체 형태로 혈청군 X 협막 다당을 포함하는 면역원성 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 하나 이상의 추가 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 추가로 혈청군 A 협막 다당을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 혈청군 A 협막 다당은 담체 분자에 포합되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  15. 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 수성 제형으로 존재하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  16. 제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 포함하는 백신.
  17. 제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 면역 반응을 발생시키는 방법.
  18. 혈청군 X 협막 다당과 담체 분자의 포합체를 제조하는 방법으로서, 제 2항 내지 제 7항 중 어느 한 항에서 규정되어 있는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 포합체는 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에서 규정되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. (a) 혈청군 X 협막 다당과 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물로서, 수성 제형으로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  21. 제 20항에 있어서, 혈청군 X 협막 다당은 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에서 규정되어 있는 포합체의 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 제 13항 또는 제 14항에서 규정되어 있는 하나 또는 그 이상의 추가 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  23. 혈청군 X 협막 다당을 함유하는 것으로 의심되는 샘플의 분석 방법으로서, (i) 샘플 중의 어떠한 혈청군 X 협막 다당을 가수분해하여 가수분해물을 제공하는 단계; (ii) 가수분해물에 대해 액체 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)에서 분리된 어떠한 글루코사민-4-포스페이트를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 샘플 중의 포합되거나 포합되지 않은 혈청군 X 협막 다당은 단계 (i) 전에 서로 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 혈청군 X 협막 다당을 함유하는 것으로 의심되는 표본의 분석 방법으로서, 총 혈청군 X 협막 다당 함량은 제 22항 또는 제 23항의 방법에 의해 측정되고, 포합되지 않은 혈청군 X 협막 다당 함량은 제 24항에 기술된 것과 같이 측정되며, 그로써 총 혈청군 X 협막 다당에 대한 포합되지 않은 혈청군 X 협막 다당의 비율이 계산될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
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