CN111132691A - 提供改善的免疫原性和亲合力的具有二价或多价缀合物多糖的多价缀合物疫苗 - Google Patents

Abstract

本公开内容描述了含有利用新型接头的缀合物的组合物、二价多糖缀合物、二价多糖缀合在开发多价缀合物疫苗中的方法。荚膜多糖与载体蛋白的缀合是使用特定长度的同双官能和/或异双官能接头进行的。接头的结合及其在双官能接头中的使用诱导了具有高亲合力的较高滴度的功能性抗体，引发较高的免疫记忆和降低的载体蛋白效应。这提供了免疫化学上交叉反应的荚膜多糖，其中一种或多种交叉反应的荚膜多糖使用带有相同或不同官能团的双官能接头而顺序地或同时地缀合到载体蛋白上。这样的接头和荚膜多糖的大小提供了有效的多价缀合物疫苗，其具有高的抗体滴度和降低的载体效应，并导致每剂量疫苗的荚膜多糖和蛋白的含量降低，这降低了反应原性。

Description

提供改善的免疫原性和亲合力的具有二价或多价缀合物多糖 的多价缀合物疫苗

相关申请的引用

本申请要求2017年6月10日提交的美国临时申请号62/517,905的优先权，其全部内容通过引用明确地并入本文。

背景

1. 发明领域

本发明涉及包含载体蛋白缀合的细菌荚膜多糖的多价缀合物、免疫原性组合物和疫苗及其用途。特别地，本发明的组合物包含单价和多价细菌荚膜多糖-蛋白缀合物，其中细菌荚膜多糖和寡糖衍生自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的血清型。载体蛋白通过单官能和双官能接头（优选地具有限定的长度）缀合至细菌荚膜多糖，以及该单官能或双官能接头可以是同-单官能的、同-双官能的、异-单官能的或异-双官能的。

2. 背景描述

肺炎链球菌是造成侵袭性肺炎球菌病(IPD)（例如肺炎、菌血症、脑膜炎和急性中耳炎）的革兰氏阳性病原体。肺炎是侵袭性肺炎球菌病最常见的表现，而呼吸道内的细菌传播可导致中耳感染、鼻窦炎或复发性支气管炎。肺炎球菌被化学连接的多糖封装，其导致了血清型特异性。已知至少有90种肺炎球菌血清型，其中约23种占侵袭性疾病的90%，以及荚膜多糖是差的免疫原。

目前全球市场上有三种可获得的PCV疫苗：PREVNAR®、SYNFLORIX®和PREVNAR-13®。由于在PREVNAR-13®中未找到血清型，并且可能随着时间的推移进行血清型置换，因此需要解决覆盖肺炎球菌病的仍未满足的医疗需求。需要免疫原性组合物，所述免疫原性组合物可用于诱导针对人和小于2岁儿童的额外的肺炎链球菌血清型的免疫应答。

荚膜多糖(CPS)是关键的毒力决定因素，并且通常免疫原性不足以诱导婴儿和儿童的T细胞依赖性免疫应答。载体蛋白与CPS的缀合可诱导经历类别转换的免疫应答。因此，已经开发了7价(PCV-7, Pfizer Inc., USA)、10价(Synflorox-10, GSK Vaccines)和13价肺炎球菌缀合物疫苗(PCV-13, Pfizer Inc., USA)，以有效地预防IPD的发生。还原胺化化学和氰基化化学已被广泛用于制备缀合物疫苗。

在这些缀合物中，CPS与载体蛋白之间的短的C-N键(2.1Å)通过载体蛋白和低CPS/蛋白比导致CPS表位的空间屏蔽。需要重要的参数以使现有疫苗的缺点最小化。

美国专利号9,492,559公开了包含缀合的荚膜多糖抗原的免疫原性组合物及其用途。所公开的免疫原性组合物包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20价肺炎球菌缀合物组合物。还公开了7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25价肺炎球菌缀合物组合物。

除了Preevnar-13价缀合物之外，国际申请公开号WO 2014/097099A2还公开了涉及几种血清型的糖缀合方法。将新的多糖缀合物添加到制剂中，以提高疫苗的功效。

美国专利申请公开号2011/023526公开了15价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗组合物。该专利涉及通过将两种或更多种血清型与目前可获得的1-3种疫苗添加在一起制备的15价缀合物疫苗。

国际申请公开号WO 2016/207905公开了多价肺炎球菌缀合物疫苗。该申请涉及13价或更高价的缀合物疫苗并缺失血清型6A。

美国专利申请公开号2017/007713公开了具有增强的功能性的含有((2-氧代乙基)硫基)的接头。

国际申请公开号WO 2014/092377公开了13价组合物，其中12种血清型选自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F以及1种选自12或9N。

国际申请公开号WO 2014/092378公开了具有13种不同多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物，其中每种缀合物含有从12种血清型分离的荚膜多糖，所述血清型选自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，以及血清型22F或33F。

中国申请公开号101590224公开了14-价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗，其含有血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F。

中国申请公开号104069488公开了14价多糖蛋白缀合物，其中14种血清型为1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。

国际申请公开号WO 2016207905公开了多价肺炎球菌缀合物疫苗，其包含CRM 197和至少14种荚膜多糖的缀合物，所述荚膜多糖选自血清型1、3、4、5、6B、7F、9N、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F。美国专利8,192,746公开了15价免疫原性组合物，其包含缀合至CRM197的来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的荚膜多糖。

国际申请公开号WO 2013/191459公开了15价组合物，其包含来自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌荚膜多糖。

中国申请公开号103656632公开了多价肺炎球菌荚膜多糖组合物，其含有血清型6A和至少一种额外的选自1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的血清型，其提供了针对24种不同肺炎球菌血清型的保护。

中国申请公开号103656631公开了多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白缀合物组合物，其包含24种不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖，即1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。

美国专利申请公开号2016/0324950公开了免疫原性多糖-蛋白缀合物，其包含来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)（也称为B族链球菌(GBS)）的荚膜多糖(CP)和载体蛋白，其中CP选自血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX。这意欲用来治疗慢性糖尿病、癌症、心力衰竭、神经学和泌尿科学病症。载体蛋白荚膜多糖缀合物是变化的。

美国专利号5,360,897公开了免疫原性缀合物，其包含细菌病原体肺炎链球菌的完整荚膜聚合物的还原胺化产物(其具有至少两个羰基)和细菌毒素或类毒素，所述缀合物包含交联的缀合物，其中荚膜聚合物与毒素或类毒素之间存在直接的共价键。

美国专利号7,862,823描述了具有至少两种不同载体蛋白的多价缀合物疫苗组合物。

美国专利号8,808,708公开了由多糖-蛋白缀合物组成的13价免疫原性组合物，其中血清型由1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F组成，且其中载体蛋白是CRMI97。

美国专利申请公开号2009/0017059公开了免疫原性组合物，其中血清型19A和19F缀合于不同的细菌类毒素。

国际申请公开号WO 2011/110241描述了肺炎球菌缀合物免疫原性组合物或疫苗，其中不同的缀合化学被用于免疫原性组合物或疫苗的不同组分。还原胺化用于至少一种血清型的缀合，而除了还原胺化的缀合用于不同血清型的缀合。为不同血清型选择的缀合方法允许使用允许糖表位的最好呈现的缀合方法来呈现每种血清型。一些肺炎球菌糖使用还原胺化很好地缀合，然而其它肺炎球菌糖则以不同的方式缀合，以使环状结构保持不断开，并提供更好的结果。

美国专利号7,955,605公开了制备包含血清型19A的载体蛋白多糖缀合物的方法，其中激活的血清型19A多糖和载体蛋白再悬浮于二甲亚砜(DMSO)中以形成缀合物。

美国专利申请公开号2010/0074922公开了含有10种或更多种血清型的免疫原性组合物，其中19F荚膜糖与白喉类毒素(DT)缀合，血清型18C荚膜糖与破伤风类毒素缀合，以及血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F荚膜糖与来自流感嗜血杆菌的蛋白D缀合。

美国专利申请公开号2010/0239604公开了包含多价肺炎链球菌荚膜糖缀合物的组合物，其中血清型19A与第一细菌类毒素缀合，以及19F与第二细菌类毒素缀合，以及肺炎链球菌的2-9的荚膜糖与蛋白D缀合。除了通过开发对更多数量的血清型提供保护的疫苗来增加保护范围外，还将努力集中在开发更新的合成方法上。

美国专利号7,709,001描述了合成荚膜多糖的载体蛋白缀合物的方法，其由以下步骤组成：1) 使纯化的多糖与弱酸反应，导致大小减小；2) 使步骤1的多糖在二价阳离子的存在下与氧化剂反应，形成激活的多糖；3) 使激活的多糖与载体蛋白混合；4) 使步骤3的激活的多糖和载体蛋白与还原剂反应，以形成多糖-载体蛋白缀合物；和5) 在步骤4的产物中封闭未反应的醛，以产生免疫原性多糖-载体蛋白缀合物。

国际申请公开号WO 2014/097099公开了合成载体蛋白缀合物的方法，其包括：a)将糖与2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)在水性溶剂中反应，以产生激活的糖；和b) 将激活的糖与包含一或多个胺基的载体蛋白反应。

美国专利申请公开号2012/321658公开了免疫原性组合物，其中血清型1、3、19A和19F直接地或者间接地通过还原胺化以外的化学连接至蛋白载体，以及一种或多种不同的糖选自由血清型4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C和23F组成的第二组，其通过还原胺化连接至蛋白载体。

肺炎球菌疫苗基于1) 肺炎球菌多糖疫苗和2) 肺炎球菌缀合物疫苗。由Merck上市的PNEUMOVAX®包含属于血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18e、19F、19A、20、22F、23F和33F的未缀合的多糖。婴儿和幼儿对大多数肺炎球菌多糖的反应不佳。弱免疫原的免疫原性通过与载体蛋白缀合而增强。多糖蛋白缀合物疫苗使用连接至蛋白载体的荚膜多糖来制备。缀合物诱导针对特定血清型的T细胞依赖的增强的免疫应答。

使用各种试剂，例如各种长度的同双官能、异双官能接头合成缀合物。市面上可获得3种肺炎球菌缀合物疫苗：PREVNAR®、SYNFLORIX®和PREVNAR-13®。PREVNAR®是七价疫苗，其含有来自血清型4、6B、9Y、14、18C、19F和23F的荚膜多糖，每种荚膜多糖都缀合至称为CRM197的载体蛋白。SYNFLORIX®是来自GSK Biologicals的十价疫苗，其包含10种缀合至来自NTHi的蛋白D的荚膜多糖，提供了针对另外三种肺炎球菌菌株(血清型1、5和7F)的覆盖。PREVNAR-13®是含有缀合至称为CRM197的载体蛋白的13种荚膜多糖的13价疫苗，所述荚膜多糖由肺炎链球菌的13种血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9Y、14、18C、19A、19F和23F)制备。

日益增加的对抗生素的微生物抗性和日益增加的免疫低下的人的数目需要开发具有甚至更广泛的保护的肺炎球菌疫苗，这导致对于不断增加数量的血清型是有效的多价疫苗的开发，特别是用于覆盖由于在PREVNAR-13®中没有发现的血清型引起的肺炎球菌病。对特定的血清型的需要取决于开发的区域和抗生素抗性。因此，US专利8192746报告了具有15种不同的多糖-蛋白缀合物的多价免疫原性组合物。每种缀合物由缀合至载体蛋白CRM197的荚膜多糖组成，所述荚膜多糖由肺炎链球菌的血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9\1、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F)制备。需要诱导针对血清型15B、15C和15A的免疫应答的疫苗。

随着多价缀合物疫苗制剂中多糖抗原数量的不断增加，载体蛋白含量增加。这种增加导致对载体蛋白的免疫应答增加，其可导致系统性超负荷。

因此，需要开发肺炎球菌疫苗，其提供针对数量越来越多的血清型的保护。虽然较高价的疫苗对于缀合是非常理想的，但优选对载体蛋白的免疫应答也减少。在开发将保护范围扩大到其它血清型的多价疫苗时，需要提高缀合物疫苗的免疫原性和亲合力，以适应数量增加的血清型，同时不弱化对所有血清型的免疫应答，这用常规的缀合方法是不可能的。除了对数量越来越多的血清型的保护外，还需要开发新的用于缀合的接头以提高免疫应答，甚至在血清型的数目越来越多以及载体蛋白应答减少(且也要避免空间位阻)的情况下。

虽然许多参考文献叙述了目前可获得的疫苗的功效，但当添加多种新血清型时，随着数量的增加对原始血清型的免疫应答减少。需要另外的血清型来提高免疫应答的功效。此外，更大的功效优选应包括减少对载体蛋白的免疫应答。因此，对更高价肺炎球菌缀合物疫苗仍有很大的需要，以在整个世界提供对感染的屏障。

发明简述

本发明克服了与目前的策略和设计相关的问题和缺点，并提供了新的包含缀合的荚膜糖的免疫原性组合物及其用途。

本发明的一个实施方案涉及多价肺炎链球菌缀合物疫苗，其包含两组缀合物，其中第一组包含单价细菌荚膜多糖缀合物，而第二组包含多价缀合物，所述多价缀合物含有具有交叉反应性的二价细菌荚膜多糖的缀合物。优选地，第一组缀合物由一种或多种肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、7F、8、10A、11A、12F、14、17F、18C、20、22F、23F、24F、33F和35B的单价荚膜多糖缀合物组成。优选地，第二组缀合物由以下组成：交叉反应血清型的二价或多价荚膜多糖缀合物，所述交叉反应血清型为一种、两种或更多种肺炎链球菌血清型6A/6B/6C/6D，一种、两种或更多种肺炎链球菌血清型9V/9N/9A/9B，一种、两种或更多种肺炎链球菌血清型15B/15A/15C，或肺炎链球菌血清型19A/19F的交叉反应血清型；和载体蛋白。优选地，构成多价肺炎链球菌缀合物疫苗的第二组包含肺炎链球菌交叉反应血清型的多价缀合物，其中缀合物为二价单分子并衍生自细菌荚膜多糖。优选地，疫苗包含顺序地或同时地缀合至相同载体蛋白的两种免疫交叉反应血清型的荚膜多糖。优选地，第一组或第二组的单价细菌荚膜多糖缀合物从具有10 kDa-50 Kda、30 KDa-100 KDa或100 KDa-300 KDa的分子量范围的天然细菌荚膜多糖合成。

优选地，两种免疫交叉反应血清型的二价荚膜多糖由式PS1-载体蛋白-PS2代表，并且还优选地，缀合物包含6APS-CRM197-6BPS。优选地，载体蛋白包含破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、破伤风类毒素片段(TTHc)、脑膜炎奈瑟菌蛋白PorB、RSV病毒蛋白、百日咳杆菌蛋白、百日咳类毒素(PT)、腺苷酸环化酶毒素(ACT)、69 KDa蛋白、人乳头瘤病毒蛋白抗原、人乳头瘤病毒VLP形式、乙型肝炎病毒核心抗原、乙型肝炎病毒VLP形式、HBsAg的衍生物，或其组合。优选地，与4微克或更多的相同两种多糖疫苗的单价缀合物比较，二价交叉反应多糖缀合物的单剂量包含少于4微克。

优选地，多价缀合物疫苗中的总载体蛋白量显著少于相同交叉反应血清型的各个多糖的单缀合物中的用量。优选地，本发明的疫苗，缀合至二价交叉反应多糖的载体蛋白量与相同的两种多糖的单价缀合物相比每种血清型具有更少的蛋白，从而由该疫苗产生的载体蛋白免疫应答低于对由包含各个多糖的单缀合物的其它所生产的疫苗的载体蛋白的应答。优选地，在多价缀合物疫苗中的总载体蛋白含量为相同交叉反应血清型的各个多糖的单缀合物(PS:载体蛋白之间的比是1:1)的从0.5至0.7重量%。优选地，缀合物疫苗还包含至少一种选自铝或铝盐、磷酸钙、单磷酰脂质A (MPLA)的脂质体、皂苷QS-21和/或有效的TLR7/8激动剂的佐剂。优选地，至少一种佐剂包含选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝的铝佐剂。优选地，细菌多糖选自来自不同细菌荚膜多糖的两种或更多种交叉反应血清型，和/或细菌多糖包含：肺炎链球菌和流感嗜血杆菌a、b型血清型；肺炎链球菌和B族链球菌血清型、流感嗜血杆菌a、b型血清型或脑膜炎奈瑟菌血清型。优选地，荚膜多糖包含衍生自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、B族链球菌或卡他莫拉菌脂寡糖(LOS)的多糖。还优选地，肺炎链球菌荚膜多糖与选自以下的血清型是免疫化学上交叉反应的：6A/6B/6C/6D；9V/9A/9B.9N；15A/15B；19A/19F和类似类型的交叉反应多糖。优选地，荚膜多糖衍生自流感嗜血杆菌血清型a/b/c/d/e/f、不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)多糖，或卡他莫拉菌脂寡糖(LOS)，或脑膜炎奈瑟菌血清型A、B、C、Y、W-135或X，或B族链球菌血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX和N，和脑膜炎奈瑟菌血清型A、C、Y、X和W-135。

本发明的另一个实施方案涉及用于治疗或预防革兰氏阳性和革兰阴性病原体感染的缀合物疫苗，其包含治疗有效量的本发明的缀合物疫苗，和任选的药理学上可接受的载体。优选地，荚膜多糖衍生自流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、B族链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌脂寡糖(LOS)及其组合。

本发明的另一个实施方案涉及将多糖与载体蛋白偶联的方法，其包括：激活多糖；将约2.0-40Å的限定长度的间隔臂附接至激活的多糖；和将激活的多糖附接的间隔臂附接至载体蛋白。

本发明的另一个实施方案涉及将载体蛋白与多糖偶联的方法，其包括：激活所述载体蛋白，还原载体蛋白二硫键以产生巯基，优选使用2-亚氨基硫杂环戊烷(2-IT)、SMPH样双官能接头生成巯基；将4.0-40Å的限定长度间隔臂附接至激活的载体蛋白；和将多糖与附接至激活的载体蛋白的间隔臂附接。优选地，激活的载体蛋白选自从白喉棒状杆菌(C. diphtheria)获得或衍生的交叉反应材料(CRM197)，或从荧光假单胞菌或大肠杆菌获得或衍生的重组CRM197。

本发明的另一个实施方案涉及为同-双官能或异-双官能的双官能接头。

本发明的另一个实施方案涉及多价肺炎链球菌缀合物疫苗，其中载体蛋白是从白喉棒状杆菌获得的交叉反应材料(CRM197)、从荧光假单胞菌获得的重组CRM197或从大肠杆菌获得的重组CRM197。

本发明的其它实施方案和优点部分地在下面的描述中阐述，以及部分地可以从该描述中显而易见，或者可以从本发明的实践中获知。

附图描述

图1A 大小减少的血清型6A的荚膜多糖1H-NMR光谱(500MHz)-NMR数据显示与天然PS相比无结构完整性的损失。

图1B 大小减少的血清型6B的荚膜多糖1H-NMR光谱(500MHz)-NMR数据显示与天然PS相比无结构完整性的损失。

图2A 使用基于多重珠的试验程序的荚膜多糖特异性抗体(总IgG) (用于这些缀合物的多糖是在10-50KDa的范围内)。

图2B 使用基于多重珠的试验程序的荚膜多糖特异性抗体(总IgG)，其中多糖是在200-300 KDa或更大的范围内。

图2C 使用基于多重珠的试验程序的6A和6B荚膜多糖二价缀合物特异性抗体(总IgG)，其中多糖是在10-50 KDa和200-400KDa的范围内。

图3A 单价缀合物合成工作流程图。

图3B 用接头激活PS1和PS2的流程图。

图4A 二价单分子缀合物和二价缀合物合成工作流程图。

图4B CRM化学偶联。

图5 CDAP (1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓四氟硼酸盐)、三聚氯氰(2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪)、溴化氰(CNBr)。

图6 用亚氨基硫杂环戊烷的CRM 197的硫醇化。

发明描述

肺炎链球菌是可引起疾病（例如肺炎、菌血症、脑膜炎和急性中耳炎）的革兰氏阳性细菌。肺炎球菌被化学连接的多糖封装，其导致血清型特异性。已知至少有90种肺炎球菌血清型，其中约23种占侵袭性疾病的90%。针对侵袭性肺炎球菌病的保护与对荚膜多糖特异性的抗体有关，因此保护是血清型特异性的。

令人惊讶地发现，在载体蛋白和多糖之间包含接头以形成两组缀合物的多价肺炎链球菌缀合物疫苗(其中第一组包含单价细菌荚膜多糖缀合物，而另一组包含多价载体蛋白缀合物)提供了大幅改进的结果。特别地，二价缀合物和二价单分子缀合物优选通过载体蛋白和附接至交叉反应肺炎链球菌血清型的双官能接头之间的反应合成。与含有单价细菌荚膜多糖缀合物的含有多价肺炎链球菌缀合物疫苗的疫苗(具有相同数量的血清型，二者之间直接缀合，而不是通过接头)比较，所取得的结果有了大幅改进。

本发明的一个实施方案涉及具有增强的免疫原性的包含二价-多糖蛋白缀合物的多价缀合物疫苗。具有通用结构PS1-载体蛋白-PS2的二价缀合物具有比类似的单价缀合物更高的免疫原性，其中PS1和PS2是来自革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌病原体的两种不同的血清型多糖。通过开发二价缀合物疫苗，提高了疫苗的功效，并降低了载体免疫原性。本文公开的化学大幅提高了缀合物免疫原性，同时降低了载体蛋白的载量。

本发明的另一个实施方案涉及具有较低分子量多糖和较长臂双官能接头的疫苗，优选其具有增强的免疫原性。本发明的另一个实施方案涉及提供二价缀合物的较高的免疫原性和亲合力以及较低的载体蛋白免疫原性。本发明的另一个实施方案涉及降低具有较高免疫原性的缀合物疫苗剂量。

如本文所公开的，为了使常规疫苗的缺点最小化，已引入了四个参数：

多糖大小优选为10-50KDa。

交叉反应多糖同时缀合至载体蛋白。

两种或更多种交叉反应血清型同时与载体蛋白缀合。

长的异-双官能或同-双官能间隔臂优选为2-40Å (并且2-40Å、4-40Å、10-40Å、20-40Å、9-20Å、5-20Å、5-30Å)。

这四个参数结合在一起显著有效地提高缀合物多糖/蛋白的比值，降低载体蛋白载量，和提供免疫原性和亲合力的数倍增加。

本发明涉及具有增强的免疫原性(表现出显著高的抗体滴度)的多糖–蛋白缀合物。载体蛋白从例如破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、破伤风类毒素片段(TTHc)、脑膜炎奈瑟菌蛋白PorB、RSV病毒蛋白、百日咳杆菌蛋白样百日咳类毒素(PT)、腺苷酸环化酶毒素(ACT)、69KDa蛋白和人乳头瘤病毒蛋白抗原或其VLP形式、乙型肝炎核心抗原或其VLP形式或HBsAg的衍生物和其它常规载体获得。多糖片段从革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的群获得，优选从肺炎链球菌的免疫化学上交叉反应多糖获得。本发明还涉及制备多糖-蛋白缀合物的方法，其中载体蛋白与最佳链长的裂解和解聚的多糖片段反应。

本发明的免疫原性组合物提供了针对在PREVNAR-13®和SYNFLORIX-10®中没有发现的肺炎链球菌血清型的适当水平和改进的保护。

具有短链分子大小(10-50KDa)的肺炎链球菌血清型(6A/6B、9V/9N、15A/15B和19A/19F和类似的交叉反应血清型)的交叉反应多糖的二价缀合物被用来制备本研究中的16-26价肺炎球菌CPS缀合物疫苗。肺炎球菌6A和6B型多糖被用作模型交叉反应CPS。CRM197因为其临床接受而被用作载体蛋白。

多价单缀合物也已使用较短的PS链长(0-50KDa)、具有同-双官能或异-双官能PEG或非-PEG接头的长间隔臂(9-40Å)与载体蛋白CRM197制备。

通过氧化或者通过氰基化化学激活CPS并用高碘酸钠将其氧化，并在CPS中引入反应性醛或者异硫氰酸酯(-OCN)基团。

两种策略(短接头和长接头、短CPS和长CPS)被分别用来引入。然后独立或与多价缀合物制剂结合研究二价缀合物疫苗的物理化学和免疫学特性。

以下实施例说明了本发明的实施方案，但不应被视为限制本发明的范围。

实施例

实施例1 多种肺炎链球菌血清型-1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、10A、11A、12F、14、15A、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F和35B的多糖大小减小、激活和缀合过程

6A和6B多糖

在pH 2.5-3.0下将肺炎链球菌6A和6B的荚膜多糖各100 mg溶于含10mM乙酸或0.1 MHCl的10 ml水性溶液中，并通过维持溶液在60-85℃的温度下进行水解60-120分钟的时间。中和后将如此得到的寡糖，使用3-10 KDa TFF Centricon过滤器进行渗滤。通过¹H NMR分析(图1A和1B)，形成的寡糖没有显示出结构完整性的损失，或表位或重复单元结构的损失。使用蒽酮试验测定多糖，并且得到的分子大小分布(KDa)在10-50KDa、30-100KDa和100-300KDa的范围内。

CPS (50 mg)部分(大小在≥200-500KDa之间的天然多糖或大小在10-50KDa之间的大小减少的多糖)是激活过程中常用的激活的氰基化试剂(表1)。使用SEC-HPLC (ShodexSB-405和SB-406 SEC柱)，测定多糖分子大小分布，其中使用(10-1000KDa)普鲁兰多糖(Pollulan)混合物作为参考标准(来自美国Shodex的普鲁兰多糖标准)进行分析。

在pH 5.6-6.0下，通过与5-8倍摩尔过量的ADH (Sigma)反应3-5小时，将短间隔臂引入至PS。在pH 5.6-6.0下，通过与5-10倍摩尔过量反应3-5小时，将长间隔臂(双官能接头或长4-臂接头)引入至PS。

表1

用于缀合的多糖大小分布(KDa)

PS	多糖KDa
		6A	10-30KDa
6B	20-50KDa
		15B	20-40KDa
18C	20-50KDa
		22F	10-30KDa

激活的PS进一步用短臂接头(己二酸二酰肼，ADH，174.2g/摩尔)，又一个从2-4Å到8-20Å (600g/摩尔-3.5g/摩尔)的不同大小的间隔臂接头来衍生。

具有附接了二胺官能团的同-双官能或异-双官能PEG接头，如NH₂-PEG0.6K-NH₂、NH₂-PEG3.5K-COOH (表2)。

表2

使用的用于多糖或载体蛋白衍生的短的和长的链接头(也已使用聚乙二醇化形式或者非-聚乙二醇化形式的几种其它接头)

Mal-马来酰亚胺，NHS-琥珀酰亚胺，PEG-聚乙二醇衍生物，ADH-己二酸二酰肼。

将2mL各个衍生的CPS (10 mg/ml)的两份等分试样与2个CRM197蛋白样品(10 mg/ml)的1mL等分试样在4℃混合8-12小时。具有长和短间隔臂的缀合物通过100-300 KDaCentricon过滤器(EMD Millipore)纯化(表3)。

表3

单价缀合物的物理化学表征

PS	通过SEC-HPLC的激活的PS KDa	通过SEC-HPLC的缀合物KDa	PS:蛋白比	游离PS%
					6A	10-30KDa、200-300KDa	>200-300、>2500	0.5-2、1-2	<2
6B	20-50Kda、200-400KDa	>300-500、>2500	0.5-2、1-2	<1
					15B	20-40KDa	>300-500	0.5-2、1:1	<1
18C	20-50KDa	>300-500	0.5-2、1:1	<2
					22F	10-30KDa	>200-300	0.5-2、1:1	<1

注：SEC-HPLC的用于PS的KDa测定的内部标准：普鲁兰多糖标准混合物(2 KDa-2500KDa)。

实施例2 不同分子量的大小减小的多糖的激活

激活如在实施例1中所述合成的不同分子量的寡糖。氰基化试剂通常用于激活过程。

CDAP (1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(Sigma Aldrich, USA))、三聚氯氰(2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪)或溴化氰(CNBr)和偶联载体蛋白(见图5和6)。

多糖溶液(10 mg/ml)与10mg/ml CDAP (在乙腈中100mg/ml)在2M NaCl或200-300mM碳酸氢盐缓冲液中，在RT下孵育4-6分钟。使用1N NaOH或者1N HCl维持pH在10-10.5。然后，将pH调节至8.1-8.2，允许聚乙二醇化的接头(Hz-PEG-HZ)与CDAP处理的PS反应。在RT下8-12小时。对反应混合物进行深度过滤，然后用150 mM NaCl，通过100-300 KDa截断centricon过滤器5-8次。

激活的大小减小的多糖的衍生

用短链同-双官能酰肼接头进一步衍生激活的寡糖。典型的试剂是己二酸二酰肼，ADH，分子量174.2 g/摩尔。使用带有二胺、二酰肼或胺或酰肼-羧酸/醛官能团的同-双官能或异-双官能PEG接头，例如NH2-PEG(1K-3.5K)-NH2、HZ-PEG(1-3.5K)-HZ、NH2-PEG3.5K-COOH(表2)。几种其它同-双官能或异-双官能间隔臂也可被用于衍生(表2)。在pH 5.8-6.0下通过与5-8倍摩尔过量的己二酸二酰肼(Sigma)反应3-5小时将短间隔臂引入至寡糖。在RT、pH5.8-6.0下通过与对寡糖5-10倍摩尔过量的接头反应3-5小时，将长链接头(双官能接头或长四官能接头(表2)，12号四臂接头)引入多糖。

用短或长接头进行载体蛋白的衍生

用短链同-双官能酰肼接头进一步衍生载体蛋白CRM197。典型的试剂是己二酸二酰肼，ADH，分子量174.2 g/摩尔。使用带有二胺、二酰肼或胺或酰肼-羧酸/醛官能团的同-双官能或异-双官能PEG接头，例如NH2-PEG(1K-3.5K)-NH2、HZ-PEG(1-3.5K)-HZ、NH2-PEG3.5K-COOH (表2)。几种其它同-双官能或异-双官能间隔臂也可被用于衍生，如表2中所列出的。在RT，在pH 5.8-6.2下，在300-600 mM MES缓冲液中，通过将短间隔臂与5-8倍摩尔过量的己二酸二酰肼(Sigma)反应3-5小时引入至载体蛋白CRM197。在RT（室温），在pH 5.8-6.2下，在300-600mM MES缓冲液中，通过与对寡糖5-10倍摩尔过量的接头反应3-5小时，将长链接头(双官能接头或长四官能接头(表2)，12号四臂接头)引入载体蛋白。

实施例3 交叉反应多糖血清型激活和短的或长的间隔臂接头的附接(目的血清型为6A/6B、9V/9N、15A/15B和19A/19F或任何其它交叉反应血清型)。

激活衍生自肺炎链球菌6A和6B型的荚膜多糖的寡糖，与CRM197缀合，和同时将伯氨基引入至寡糖。

使用如在实施例1和2中描述的相同程序缀合血清型6A和6B的天然或大小减小的多糖(≥200-400KDa)。

将因此如在实施例1中所报告而获得的寡糖混合物溶于WFI，至最终浓度为10 mg/ml。在反应结束时，通过使用3-10 KDa Centricon过滤器渗滤来纯化寡糖。

在DMSO的水性溶液(20-30% v/v)中，将已引入氨基的寡糖稀释为10 mg/ml的浓度，DMSO含有相对于寡糖中引入的氨基摩尔过量(通常为5-10:1)的ADH短接头或长间隔臂接头。该反应是通过将溶液保持在RT下4-12小时的时间来进行的。在这段时间结束时，使用3-10 KDa Centricon过滤器再次纯化寡糖。

实施例4 肺炎球菌多糖单价缀合物的合成

在4℃下，将如在实施例3中合成的相同或不同大小减小和衍生的大小减小的多糖(具有短间隔臂ADH和长间隔臂HZ-PEG-HZ)的两个独立等分试样(10 mg/ml)与1 ml CRM197蛋白样品的等分试样(10 mg/ml)混合8-12小时。含有长链和短链两种接头的缀合物使用100-300KDa centricon过滤器(EMD Millipore)纯化。每种单价缀合物的总多糖含量通过蒽酮或者糖醛酸试验而测定，总蛋白含量通过BCA或Lowry试验而测定(表4)。

所有其它交叉反应多糖缀合物使用如上所述的相同程序制备。

表4

通用结构6A-CRM197-6B的二价缀合物的物理化学表征

注：SEC-HPLC内部标准(KDa)：普鲁兰多糖标准混合物(2KDa-1200KDa)

实施例4 16V或更高价肺炎球菌缀合物疫苗的研究制剂

将含1、3、5、7F、14、15B、18C、22F、23F、33F、35B的血清型的Pneumo多糖-CRM197缀合物和交叉反应多糖缀合物6A、6B、9V、9N、15A、15B、19A和19F合并，以得到4.0 µg PS/mL的最终抗原浓度。氯化钠(150 mM)溶液、10-20 mM组氨酸、琥珀酸和0.001% Tween-20在配制过程期间也用作稀释剂，以及磷酸铝(Adju-Phos, Brenntag, USA)被用作研究佐剂。16-V缀合物被无菌地装于2mL无菌小瓶中。将PNEUMOVAX® (Merck，USA)或PREVNAR-13® (Pfizer，USA)用作两种对照市售疫苗制剂。

实施例5 缀合物的免疫原性研究

在本工作中选择新西兰白兔模型(NZW)，以比较Pneumo PS-CRM197缀合物的免疫原性。在免疫期前后检查来自所有组(16-V{价}、PREVNAR-13®和PNEUMOVAX®)的兔的临床迹象。对于所有组，收集免疫前、加强剂量(7天和14天)和末期抽血(28天)，并将其等分并在-80℃储存直至使用。使用参考标准血清007 (CBER, FDA, USA)，根据标准方案进行多重免疫原性试验来确定总IgG。稀释参考血清和兔血清，并通过用肺炎球菌CWPS和22F PS或25PS处理来预吸附用于使抗体交叉反应。人单克隆抗多糖抗体(Pamlico Biopharma, USA)被用于总IgG估计。Bio-Plex 200 (Bio-Rad)。按照制造商的指示使用多重阅读器(见图2A、2B和2C)。

实施例5 肺炎链球菌交叉反应荚膜多糖血清型激活和短的和长的间隔接头的附接

6A/6B、9V/9N、15A/15B和19A/19F血清型（其为交叉反应血清型）被用于合成含有荚膜多糖和载体蛋白的二价缀合物。根据定义，二价缀合物包含两个同时或共同附接至CRM 197的荚膜多糖。

激活衍生自肺炎链球菌6A和6B型的荚膜多糖的大小减小的多糖，与CRM197缀合，和将伯氨基或酰肼基团引入寡糖同时进行。

血清型6A和6B的天然多糖或大小减小的寡糖(≥200-500KDa)使用如在实施例1-4中所述的相同程序进行缀合。

将因此获得的大小减小的多糖混合物溶于注射用水中，以使最终浓度为10 mg/ml。引入氨基或酰肼基团的大小减小的多糖在二甲亚砜(DMSO)的水性溶液中被稀释至10mg/ml的浓度，所以DMSO的百分比在20-30% (v/v)范围内。将其以相对于大小减小的多糖中引入的氨基/酰肼基团摩尔过量(通常5:1或10:1，更特别是8:1)，添加到含有短链接头（例如ADH）或长链接头(如在表2中所述)的DMSO中。

反应在室温下进行，持续时间为4-12小时。在反应期结束时，使用3-10KDaCentricon过滤器再次纯化反应产物。

实施例6 作为二价缀合物制备，6A型和6B型的肺炎链球菌寡糖与CRM197载体蛋白的同时或共同缀合

将含15 mg/ml CRM197的水性溶液添加到含有附接接头的衍生自肺炎链球菌6A型荚膜多糖的寡糖(在水中20-30%)的DMSO中。附接接头的寡糖与CRM197的比率选自1:1、2:1、1:2。将如此获得的混合物在温和搅拌下、在室温下保持8-12小时。在所述时间结束时，添加含有衍生自肺炎链球菌6B的荚膜多糖的衍生的寡糖的溶液。肺炎链球菌6B的荚膜多糖与CRM197的摩尔比选自1:1、2:1、1:2。将得到的混合物在室温下保持8-12小时(表5)。通过在相同时间(同时地)，将分别从肺炎链球菌6A型的荚膜多糖和肺炎链球菌6B型的荚膜多糖衍生的两种激活的寡糖添加到含CRM197的溶液中，也可进行缀合反应。如此获得的寡糖-蛋白缀合物使用100-300KDa透析膜(Spectrum lab, USA)透析，在含有0.2M NaCl的0.01 M磷酸盐缓冲液(pH=6.6-7.0)中调节，并最终通过0.22 µm过滤器过滤。

使用如上文采用的相同程序制备所有其它交叉反应多糖缀合物。反应顺序描述于图3A、3B、4A和4B中。

表5

PS含量的比较

实施例7 18价或更高价肺炎球菌缀合物疫苗的研究制剂

将含有1、3、5、7F、14、18C、22F、23F、33F、35B的血清型(10种血清型多糖)的肺炎球菌多糖-CRM197缀合物和(6A、6B)、(9V、9N)、(15A、15B)和(19A、19F)的交叉反应多糖缀合物(8种血清型)合并，以得到2.2-4.4 µg PS/mL (1.1-2.2 µg/人剂量, 0.5 mL)的最终多糖浓度。氯化钠(150mM)溶液、10-20 mM组氨酸、20 mM HEPES或MOPS缓冲液和0.001% Tween-20在配制过程期间也用作稀释剂，并使用磷酸铝(Adju-Phos, Brenntag, USA)作为研究佐剂。

18价或更高价(>20V-24V)缀合物被无菌地装于2mL无菌小瓶中。将PNEUMOVAX®(Merck, USA)和/或PREVNAR-13® (Pfizer, USA)用作对照。

实施例9 缀合物的免疫原性研究

在本工作中选择新西兰白兔模型(NZW)，以比较肺炎球菌PS-CRM197缀合物的免疫原性。在免疫期前后检查来自所有组(18价或更高价缀合物、PREVNAR-13® (Pfizer)和PNEUMOVAX®-23 (Merck USA))的兔的血清学滴度。对于所有组，收集免疫前、加强剂量(7天和14天)和末期抽血(28天)，并将其等分并在-80℃储存直至使用。使用参考标准血清007(CBER, FDA, USA)，根据标准方案进行免疫原性试验来确定总IgG。稀释参考血清和兔血清，并通过用肺炎球菌CWPS和非疫苗血清型25PS处理来预吸附以使抗体交叉反应。人/兔/小鼠单克隆抗多糖抗体被用于总IgG估计。按照制造商的指示使用Bio-Plex 200 (Bio-Rad)阅读器。

使用基于珠的ELISA试验方法测定缀合物的免疫原性，即荚膜多糖特异性抗体(总IgG)，在表6中提供。在兔免疫原性数据中，将总IgG值与PREVNAR-13®进行头对头比较。14天的数据显示，IVT-18V-1疫苗的滴度与PREVNAR-13®疫苗相比显著增加。类似地，与PREVNAR-13®比较，IVT-18V-1数据在IgG值上有显著加强(表6)。

表6

使用基于多重珠的ELISA试验，18V-单价缀合物疫苗的荚膜多糖特异性抗体(总IgG，以µg/ml为单位)

注：IVT-18V == 18-V缀合物疫苗(单价缀合物混合在一起)；9N、15A、15B、22F和23F血清型不存在于PREVNAR-13®中，所以未测定IgG值；除4.4 µg的6B缀合物外，对于每种血清型均使用2.2 µg制备作为单价缀合物的18-V制剂。氯化钠(150mM)溶液、10-20 mM组氨酸、20 mM HEPES或MOPS缓冲液和0.001% Tween-20在配制过程期间也用作稀释剂，以及磷酸铝(Adju-Phos, Brenntag, USA)被用作研究佐剂；使用基于珠的ELISA的荚膜多糖抗体(总IgG)：18-V缀合物疫苗制剂-2 (IVT-18V-2)：作为单价缀合物的10-V制剂和作为二价缀合物添加的剩余的8-V（其包括6A/6B、9V/9N、15A/15B和19A/19F）。(除了4.4 µg的6B外，对于每种血清型以2.2 µg的疫苗剂量使用)作为单价缀合物的10-V制剂和作为二价缀合物添加的剩余的8-V（其包括6A/6B、9V/9N、15A/15B和19A/19F）。6A-6B二价单分子缀合物以2.2 µg/剂量使用，剩余的二价缀合物以2.2 µg/剂量使用。氯化钠(150mM)溶液、10-20 mM组氨酸、20 mM HEPES或MOPS缓冲液和0.001% Tween-20也在配制过程期间用作稀释剂，以及磷酸铝(Adju-Phos, Brenntag, USA)被用作研究佐剂。

使用基于珠的ELISA试验方法测定缀合物的免疫原性，即荚膜多糖特异性抗体(总IgG)，在表7中提供。在兔免疫原性数据中，将总IgG值与PREVNAR-13®进行头对头比较。14天的数据显示，IVT-18V-2疫苗的滴度与PREVNAR-13®疫苗相比显著增加。重要的是，与具有单价缀合物的IVT-18V-1制剂比较，对于二价缀合物血清型(例如6A/6B、9V/9N、15A/15B和19A/19F)的IVT-18V-2总IgG数据在IgG值上有显著加强。因此，可以得出结论，与单价缀合物相比，二价缀合物具有更好的免疫原性(表7)。因此，IVT-18V-2缀合物疫苗制剂不仅相对于PREVNAR-13®，而且还相对于IVT-18V-1制剂具有优秀的免疫原性。用1-3.5K接头(HZ-PEG-HZ)缀合的多糖引起比短接头(ADH)或无接头缀合物(如在PREVNAR-13®中)高得多的免疫原性。

表7

使用基于多重珠的ELISA的荚膜多糖抗体(总IgG)

注：1VI-18V-2 = 10种单价缀合物和4种二价缀合物混合在一起；18-V缀合物疫苗制剂(IVT-18V-3)：以2.2 µg/剂量使用的作为单价缀合物的10-V制剂和作为二价-缀合物添加的剩余8-V（除了6B 2.2 µg/剂量外，其包括以1.1 µg/剂量使用的6A/6B、9V/9N、15A/15B和19A/19F）。

使用基于多重珠的ELISA试验方法测定缀合物的免疫原性，即荚膜多糖特异性抗体(总IgG)，在表8中提供。在兔免疫原性数据中，将总IgG值与PREVNAR-13®进行头对头比较。14天的数据显示，IVT-18V-3疫苗的滴度与PREVNAR-13®疫苗相比显著增加。重要的是，具有较低剂量(2.2对比1.1ug剂量)的IVT-18V-3制剂，二价缀合物血清型(例如6A/6B、9V/9N、15A/15B和19A/19F)的总IgG数据与二价缀合物血清型的IVT-18V-2制剂比较具有相当的IgG值。因此，可以得出结论，与具有较低剂量的单价缀合物相比，二价缀合物具有更好的免疫原性。因此，IVT-18V-2缀合物疫苗制剂不仅相对于PREVNAR-13®，而且还相对于IVT-18V-1制剂具有优秀的免疫原性。用1-3.5K接头(HZ-PEG-HZ)缀合的多糖引起比短接头(ADH)或无接头缀合物(如在PREVNAR-13®中)高得多的免疫原性(表8)。

表8

二价缀合物血清型的总IgG数据

注：1VI-18V-3 = 10种单价缀合物和4种二价缀合物混合在一起。

对于本领域技术人员，从本文公开的本发明的说明书和实践考虑，本发明的其它实施方案和使用将是显而易见的。本文引用的所有参考文献，包括所有出版物、美国和外国专利和专利申请都通过引用被特别和完整地并入。本说明书和实施例的目的被认为仅仅是示例性的，而本发明的真正范围和精神用以下权利要求书指明。此外，术语“包含”包括术语“由……组成”和“基本上由……组成”。

Claims (27)

1.一种多价缀合物，其包含：

第一组缀合物和第二组缀合物，其中：

第一组缀合物包含肺炎链球菌(S. Penumoniae)血清型1、2、3、4、5、7F、8、10A、11A、12F、14、17F、18C、20、22F、23F、24F、33F和35B的单价荚膜多糖缀合物；以及

第二组缀合物包含具有双官能接头的肺炎链球菌血清型6A/6B/6C/6D、肺炎链球菌血清型9V/9N/9A/9B、肺炎链球菌血清型15B/15A/15C或肺炎链球菌血清型19A/19F的交叉反应血清型的二价或多价荚膜多糖缀合物；和

载体蛋白。

2.权利要求1所述的多价缀合物，其中所述第一组缀合物和/或第二组缀合物为二价的并衍生自细菌荚膜多糖。

3.权利要求2所述的多价缀合物，其中所述二价荚膜多糖包含两种免疫交叉反应血清型，由式PS1-载体蛋白-PS2代表。

4.权利要求1所述的多价缀合物，其中所述二价荚膜多糖包含顺序地或同时地缀合至相同载体蛋白的两种免疫交叉反应血清型。

5. 权利要求1所述的多价缀合物，其中所述第一组缀合物和/或第二组缀合物包含从10 kDa到50 kDa、从30 KDa到100KDa和/或从100KDa到300Kda的二价荚膜多糖。

6.权利要求1所述的多价缀合物，其中所述缀合物包含6APS-CRM197-6BPS。

7. 权利要求1所述的多价缀合物，其中载体蛋白包含破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、破伤风类毒素片段(TTHc)、脑膜炎奈瑟菌(N. Meningitidis)蛋白PorB、RSV病毒蛋白、百日咳杆菌(B. Pertussis)蛋白、百日咳类毒素(PT)、腺苷酸环化酶毒素(ACT)、69 KDa蛋白、人乳头瘤病毒蛋白抗原、人乳头瘤病毒VLP形式、乙型肝炎病毒核心抗原、乙型肝炎病毒VLP形式、HBsAg的衍生物，和/或其组合。

8.权利要求1所述的多价缀合物，其中与4微克或更多的相同两种多糖疫苗的单价缀合物比较，二价交叉反应多糖缀合物的单剂量包含少于4微克。

9.权利要求1所述的多价缀合物，其中载体蛋白的量为所述荚膜多糖的缀合物和与所述荚膜多糖相同的交叉反应血清型的缀合物的从0.5重量%到0.7重量%。

10.权利要求1所述的多价缀合物，其具有约1:1比率的荚膜多糖与载体蛋白。

11.权利要求1所述的多价缀合物，其中载体蛋白量显著少于用于制备相同交叉反应血清型的荚膜多糖的缀合物的量。

12. 权利要求1所述的多价缀合物，其还包含至少一种选自以下的佐剂：铝盐、磷酸钙、单磷酰脂质A (MPLA)的脂质体、皂苷QS-21和/或有效的TLR7/8激动剂。

13.权利要求12所述的多价缀合物，其中所述铝盐选自磷酸铝、硫酸铝和/或氢氧化铝。

14.权利要求1所述的多价缀合物，其中所述荚膜多糖选自细菌荚膜多糖的交叉反应血清型。

15. 权利要求14所述的多价缀合物，其中所述细菌荚膜多糖包含肺炎链球菌的一种或多种血清型、流感嗜血杆菌(H. Influenza) a和/或b型；肺炎链球菌、B族链球菌(Group B Streptococcus)和/或脑膜炎奈瑟菌(N. meningitis)。

16. 权利要求1所述的多价缀合物，其中所述荚膜多糖包含衍生自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟菌、B族链球菌或卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)脂寡糖(LOS)的多糖。

17.权利要求16所述的多价缀合物，其中所述肺炎链球菌荚膜多糖与选自6A/6B/6C/6D；9V/9A/9B.9N；15A/15B；19A/19F和类似类型的交叉反应多糖的血清型是免疫化学上交叉反应的。

18.权利要求1所述的多价缀合物，其中所述荚膜多糖衍生自流感嗜血杆菌血清型a/b/c/d/e/f、不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)多糖和/或卡他莫拉菌脂寡糖(LOS)。

19.权利要求1所述的多价缀合物，其中一种或多种所述荚膜多糖衍生自脑膜炎奈瑟菌血清型A、B、C、Y、W-135或X。

20.权利要求1所述的多价缀合物，其中一种或多种所述荚膜多糖衍生自B族链球菌血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX或N。

21.权利要求1所述的多价缀合物，其中二价交叉反应多糖缀合物的单剂量的量相当于相同的两种多糖的各个单价缀合物的量。

22.权利要求1所述的多价缀合物，其中与相同的两种多糖的单价缀合物比较，单剂量的二价交叉反应多糖缀合物对所述载体蛋白产生较低的免疫应答。

23.一种用于治疗或预防革兰氏阳性和革兰阴性病原体感染的免疫原性组合物，其包含治疗有效量的权利要求1所述的多价缀合物和药理学上可接受的载体。

24. 权利要求23所述的免疫原性组合物，其包含衍生自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、脑膜炎奈瑟菌、B族链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌(H. influenza)及其组合的荚膜多糖。

25.一种将多糖与载体蛋白偶联的方法，其包括：

激活所述多糖；

将约2.0-40Å的间隔臂附接至所述激活的多糖；和

将附接至间隔臂的所述激活的多糖附接至载体蛋白。

26.一种将含有二硫键的载体蛋白与多糖偶联的方法，其包括：

激活所述载体蛋白以形成激活的载体蛋白；

还原所述载体蛋白的所述二硫键以产生巯基；

将2.0-40Å的间隔臂附接至所述激活的载体蛋白；和

将所述多糖与附接至所述激活的载体蛋白的所述间隔臂附接。

27. 权利要求26所述的方法，其中所述激活的载体蛋白选自从白喉棒状杆菌(C. diptheriae)获得或衍生的交叉反应材料(CRM197)，或从荧光假单胞菌(P. fluorescens)或大肠杆菌(E. coli)获得或衍生的重组CRM197。

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