MX2012002932A

MX2012002932A - Vacunas de matriz proteinica de inmunogenicidad mejorada.

Info

Publication number: MX2012002932A
Application number: MX2012002932A
Authority: MX
Inventors: Kevin P Killeen; Thomas J Griffin Iv; Ann Thanawastien
Original assignee: Matrivax Res & Dev Corp
Priority date: 2009-09-09
Filing date: 2010-09-09
Publication date: 2012-09-07
Also published as: EP2473188A4; CA2773690A1; EP2473188A1; BR112012005349A2; ZA201201714B; KR20120104178A; WO2011031893A1; CN102686238A; US20120231086A1; JP2013504588A; AU2010292195A1

Abstract

La presente invención se relaciona con composiciones inmunogénicas que contienen un antígeno de interés aprisionado con una matriz de proteína transportadora reticulada, los métodos para hacer dichas vacunas, y los métodos de administración de vacuna, en donde la inmnunogenicidad de la matriz proteínica, y por lo tanto su efectividad como vacuna, se mejoran controlando o seleccionando el tamaño de partículas de las partículas de la matriz proteínica para eliminar las partículas de bajo peso molecular, ej., menores a 100 nm de diámetro.

Description

VACUNAS DE MATRIZ PROTEINICA DE I MUNOGENICIDAD MEJORADA Referencia Cruzada con Solicitud Relacionada Esta solicitud reclama prioridad de la Solicitud Provisional Estadounidense No. 61 / 276 , 183 presentada el 9 de Septiembre de 2009 , cuyo contenido se incorpora aquí mediante referencia.

Campo de la Invención La invención se relaciona con composiciones inmunogénicas , métodos para hacer vacunas, y métodos de administración de vacunas. Específicamente, la invención se relaciona con vacunas de matriz capsular proteínica que presentan un antígeno de interés aprisionado en una matriz proteínica transportadora reticulada, en donde el tamaño de la partícula de la matriz capsular proteínica está controlado para incrementar la inmunogenicidad de la composición. Más específicamente, la invención se relaciona con las preparaciones de vacunas de matriz en las que las partículas de matriz de bajo peso molecular (ej . , <100 nm de diámetro) son eliminadas. Las ventajas de la inmunogenicidad incrementadas se obtienen en las formulaciones de vacuna de matriz preparadas para tener un diámetro de tamaño de partículas medio de más de 100 nm de diámetro, esto es, tamaños de partículas de 150 nm, 200 nm, 500 nm, 1 micrón, 2 micrones o aún más grandes se contemplan.

Muchos antígenos, particularmente aquellos asociados con una capa de cápsula de patógenos estimulan muy poca o ninguna respuesta inmune y complican esfuerzos para crear vacunas efectivas contra dichos antígenos . Las cápsulas son componentes de superficie de microbios que están típicamente compuestas de polímeros de compuestos orgánicos tales como carbohidratos, amino ácidos, o alcoholes. Las cápsulas son algo diversas químicamente. Las unidades monoméricas que hacen las cápsulas (ej., carbohidratos) pueden ser ligadas en varias configuraciones moleculares y pueden ser más sustituidas con fosfato, nitrógeno, sulfato y otras modificaciones químicas. La baja inmunogenicidad de cápsulas microbianas intactas permite que los microbios se escapen de las células efectoras de sistemas inmunes anfitriones. Las cápsulas también pueden ser factores de virulencia que evitan que los microbios sean fagocitados y matados por los macrofagos anfitriones y los leucocitos polimorfonucleares .

Los anticuerpos contra las cápsulas proporcionan una defensa potente contra organismos encapsulados al fijar el complemento a la superficie microbiana, lo que puede resultar en su lisis o su opsonización, ingesta, y muerte por parte de las células anfitrionas inmunes fagocíticas . Los anticuerpos más potentes contra las cápsulas microbianas son los anticuerpos de IgG. Los antígenos capsulares son generalmente clasificados como antígenos independientes -T ya que provocan respuestas inmunes que no requieren ayuda de células -T y generalmente no provocan respuestas inmunológicas de memoria de largo plazo. El acoplamiento covalente de una proteína con un antígeno capsular rinde el antígeno capsular "dependiente de T" , y dichos antígenos dependientes de T provocan una respuesta IgG ayudante mediada por célula T (dependiente de Th) .

Varios métodos para rendir antígenos más inmunogénicos e idealmente dependientes de T se han estudiado. El aislamiento de fragmentos de polisacáridos de superficie microbiana, frecuentemente proporciona un antígeno inmunogénico capaz de provocar una respuesta inmune que reconocerá el antígeno de ocurrencia natural en la cápsula microbiana. También se ha demostrado que el ligar covalentemente un antígeno a una proteína transportadora para proporcionar un inmunogen multivalente puede incrementar grandemente la inmunogenicidad del antígeno y también promover la respuesta inmune dependiente de T deseada (o memoria inmune) que lleva a la protección del anfitrión contra infecciones subsecuentes por el microorganismo que contiene el antígeno. Por ejemplo, una vacuna de neumococo no conjugada, tal como Pneumovax® de Merck, es eficaz en contra de enfermedades por neumococos en individuos, sin embargo, frecuentemente es inefectiva (ej . , en infantes) en proporcionar memoria inmunológica y la inmunidad protectora deseada que permitiría inmunidad de por vida y evitaría la re-inmunización constante. Las vacunas conjugadas, tales como Prevnar® de Pfizer, que tienen múltiples antígenos de polisacáridos de neumococos unidos a un "transportador" proteínico, han demostrado ser altamente inmunogénicos aún en los infantes de 2 meses de edad y que inducen la inmunidad dependiente de T.

Sin embargo, mientras que las vacunas conjugadas son inmunológicamente promisorias, pueden ser extremadamente difíciles y complicadas (y caras) para fabricar, disuadiendo en gran manera su distribución a todos los pacientes y poblaciones de pacientes alrededor del mundo que tienen necesidad de la misma. Por ejemplo, en el caso de Prevnar®, cada cepa de S. pneumoniae usada para proporcionar los 7 antígenos polisacáridos usados para la conjugación, se cultiva en un bioreactor; las células son cosechadas; se extrae el polisacárido, se purifica, se hidroliza al tamaño apropiado; los antígenos individuales son después conjugados al transportador proteínico; el conjugado es re-purificado, mezclado con los otros 6 complejos proteínicos-polisacáridos adicionales (conjugados) que se separaron de una manera similar; y a la mezcla muíti -conjugada finalmente se le agrega un adyuvante con alumbre. Se calcula que hay más de 200 GMP de pasos en la fabricación de la vacuna heptavalente Prevnar®.

Recientemente, las vacunas de matriz proteínica han sido propuestas como una alternativa para vacunas conjugadas. Ver, Publicación de Patente Estadounidense, 2008-0095803, que se incorpora aquí mediante referencia. En lugar de conjugar covalentemente un antígeno de interés con un transportador, una vacuna de matriz proteínica aprisiona el antígeno, preparado al reticular la proteína transportadora en la presencia del antígeno deseado. La ligadura covalente significativa del antígeno a la proteína transportadora es evitada; en su lugar, el antígeno permanece asociado con la matriz al llegar a ser aprisionado por el transportador proteínico durante la formación de la matriz (reacción reticulante) . Dichas vacunas de matriz proteínica han demostrado tener mucha más inmunogenicidad que las vacunas preparadas usando sólo el antígeno; y las vacunas de matriz proteínica también pueden lograr una inmunogenicidad (e inducción de inmunidad dependiente de T) del surtido visto con las vacunas conjugadas. Y dichas ventajas se logran con mucho menos pasos de procesamiento (ej., la mitad de los pasos) y las reacciones complicada de con ugaciones necesarias para producir vacunas conjugadas.

Aunque las vacunas de matriz proteínica proporcionan diversas ventajas, la concentración de anticuerpos específicos de antígenos específicos provocados por las vacunas de matriz proteínica es frecuentemente significativamente más bajo que la concentración provocada por una vacuna conjugada correspondiente, si alguno está disponible. Por lo tanto, es un problema técnico persistente en el campo el de proporcionar un medio para el incremento de la inmunogenicidad de vacunas de matriz proteínica, para poder explotar la promesa científica y las ventajas de fabricación y costos de esta tecnología emergente. Existe una necesidad continua para vacunas de matriz proteínica mejoradas que tienen inmunogenicidad o potencia mejoradas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una composición inmunogénica que comprende (1) un antígeno de interés y (2) una proteína transportadora, en donde dicha proteína transportadora está reticulada para formar una matriz proteínica, dijo antígeno de interés está aprisionado por dicha matriz proteínica, y dicha composición está comprimida de partículas de matriz proteínica de alto peso molecular, e . , que tienen un tamaño de partícula medio mayor a 100 nm de diámetro. Dichas composiciones pueden ser fácilmente preparadas al mezclar los componentes del antígeno y de la proteína transportadora, iniciando una reacción de reticulación para provocar una reticulación de la proteína transportadora, seguida por el procesamiento del producto de reacción para eliminar las especies de bajo peso molecular (ej . , especies de diámetro <100 nm) . Las composiciones de vacuna de matriz proteínica de partículas de matriz proteínica de alto peso molecular de acuerdo con la presente invención, han incrementado la inmunogenicidad en comparación con las composiciones de partículas de matriz proteínica de bajo peso molecular o composiciones que tienen un amplio rango de tamaños de partículas, incluyendo partículas de matriz proteínica de peso molecular más bajo.

La presente invención también proporciona un medio para mejorar la inmunogenicidad de una composición de vacuna de matriz proteínica que comprende el paso de selección de los tamaños de partículas de matriz proteínica de la composición para eliminar las partículas de bajo peso molecular (diámetro menor a 100 nm) o selección de de los tamaños de partículas de matriz proteínica de la composición para incluir tamaños de partículas mayores a 100 nm de diámetro. Las composiciones preferidas de acuerdo con la invención, tendrán un rango de tamaño de partícula que varía de 120-2000 nm de diámetro, o incluirán partículas predominantes seleccionadas de entre dicho rango. Las composiciones apropiadas pueden ser preparadas directamente después de la formación de la matriz proteínica que contiene antígeno por fraccionamiento de la mezcla de reacción reticulante y la selección de fracciones deseadas comprendidas de especies de alto peso molecular.

Una modalidad de la invención es una composición de vacuna que contiene un antígeno de interés y una matriz proteínica transportadora, en donde el antígeno está aprisionado con la matriz proteínica transportadora para formar un complejo. En modalidades deseables de la invención, el complejo de antígeno/proteínico tiene un diámetro de tamaño de partícula medio por arriba de los 100 nm. En modalidades más deseables de la invención, el complejo tiene un diámetro de tamaño de partícula media de más de 120 nm, de más de 170 nm, de más de 200 nm, de más de 500 nm, de más de 1000 nm, de más de 2000 nm o aún mayor, ej . , hasta los límites de la metodología para la recolección de las partículas de matriz proteínica. En modalidades aún más deseables de la invención, los complejos de antígeno/matriz proteínica de la composición de vacuna, abarcarán un rango de tamaños de partículas por arriba de los 100 nm de diámetro, tales como diámetro de 100-2000 nm, o selecciones dentro de dicho rango, ej . , 120-200 nm, 200-400 nm, 250-500 nm, 120-1000 nm, 200-2000 nm, y otros rangos de tamaños de partículas similares. Aún en otras modalidades deseables de la invención, la composición incluye complejos que tienen tamaños de partículas de 170-185 nm de diámetro. Aquí se demuestra que elevar el tamaño de partículas promedio del complejo, o eliminando los componentes de tamaño menor de partículas de la composición de vacuna, lleva a un incremento sorprendente en la inmunogenicidad con respecto al antígeno aprisionado. Más aún, las partículas de matriz proteínica más grandes que contienen cantidades muy pequeñas de antígeno, son capaces de provocar respuestas inmunes que sobrepasan o comparables a las composiciones del antígeno por si solo (no en complejo) que contiene muchas veces (ej . , 67 veces) más antígeno capsular que la composición de matriz capsular proteínica de partícula de tamaño seleccionado.

En modalidades deseables de la invención, las composiciones de vacuna de matriz proteínica de la invención, al ser administrados a un mamífero, provocan una respuesta inmune dependiente de la célula T en el mamífero (ej . , producen memoria inmunológica en el anfitrión vacunado) .

En modalidades deseables adicionales, la composición de vacuna incluye, además, dos o más antígenos de interés, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y/o 10 o más antígenos de interés .

Otro aspecto de la invención presenta un método para hacer una composición de vacuna. Este método involucra (i) la mezcla de un antígeno de interés con una proteína transportadora para formar una mezcla del antígeno y la proteína transportadora, (ii) aprisionar el antígeno de interés con la proteína transportadora para formar un complejo antígeno/proteínico, y (iii) la selección de complejos que tienen un diámetro de tamaño de partícula medio de más de 100 nm.

En modalidades preferidas de la invención, el complejo antígeno/proteínico tiene un diámetro de tamaño de partícula media de más de 100 nm. Más preferentemente, el complejo de matriz antígeno/proteínico tiene un diámetro de tamaño de partícula media de más de 500 nm. Aún en otras modalidades preferidas, el complejo antígeno/proteínico tiene un diámetro de tamaño de partícula media de más de 1000 nm. En modalidades aún más preferidas, el complejo antígeno/proteínico tiene un diámetro de tamaño de partícula media de más de 1500 nm. En modalidades aún más preferidas, el complejo antígeno/proteínico tiene un diámetro de tamaño de partícula media de más de 2000 nm.

En modalidades deseables de la invención, la composición inmunogénica comprende un antígeno de interés aprisionado en una matriz proteínica transportadora y además incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En modalidades preferidas, la invención presenta otro método para hacer una composición de vacuna. Este método involucra (i) la mezcla de un antígeno de interés con una proteína transportadora y (ii) la adición de un agente reticulante capaz de formar reticulaciones entre moléculas proteínicas transportadoras o entre diferentes sitios de la misma molécula proteínica transportadora, (iii) iniciar una reacción de reticulación entre la proteína transportadora y el agente reticulante, y (iv) seleccionar de los complejos de productos de reacción que tienen un diámetro de tamaño de partícula de más de 100 nm. En ciertos casos, en donde los grupos reactivos del reagente reticulante y los sitios reactivos de la proteína transportadora reaccionarán al contacto, la mezcla y los pasos de iniciación (ii) y (iii) ocurrirán simultáneamente o se pueden considerar como un paso. Adicionalmente, puede ser ventajoso mitigar la reacción la reacción reticulante al incluir un paso previo al paso (iv) de la atenuación de la reacción de reticulación, ej . , mediante la adición de un agente mitigante o bloqueador apropiado.

Otras características y ventajas de la invención serán aparentes de la siguiente descripción detallada, los dibujos, y las reivindicaciones.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una gráfica que muestra un cromatograma del tamaño de un fraccionamiento de una vacuna de matriz capsular proteinica (PCMV por sus siglas en inglés) incluyendo el antigeno polisacárido de tipo 14 Streptococcus pneumoniae antígeno aprisionado en un mutante dominante negativo reticulado (DNI) del antígeno protector B. Anthracis (PCMV de PPS 14: DNI) en una columna CL-2B Sepharose®. Se traza la absorbencia de UV280 mostrando la cantidad de DNI que hace elución. La parte sombreada indica las fracciones recolectadas y agrupadas para posteriores experimentos de inmunización. El rango de tamaño medio de partículas de DNI para el Grupo 1 y el tamaño medio de partículas para el Grupo 2 se determinaron mediante SEC-MALS-RI (Cromatografía de Exclusión de Tamaño con un detector de Luz Láser Multiángulo y un detector de índice Refractor) .

La Figura 2 es una imagen que muestra las composiciones preparadas en el Ejemplo sujetas a electrofóresis de gel de poliacriamida SDS y tinción de azul Coomasie, lo que ilustra el grado de reticulación de la proteína DNI transportadora de las fracciones de PCMV.

La proteína DNI no reticulada migra a 83 kDa en la ausencia de reticulación (Composición 5). La Composición 1 (Grupo 1, tamaño de partículas 200-120 nm) , la Composición 2 (Grupo 2, tamaño de partículas 63 nm) , y la Composición 3 (PCMV no fraccionado, con DNI reticulado usando 0.25% de glutaraldehído) todos mostraron reticulación extensiva de la proteína DNI transportadora como se evidencia con el cambio de bandas a especies de peso molecular más alto. La Composición 4 (PCMV no fraccionado preparado con 0.05% de agente reticulante de glutaraldehído) también mostró la reticulación de la proteína DNI transportadora pero demostró una más amplia variedad de bandas que varían desde especies de menor peso molecular a bandas de especies de mayor peso molecular.

La Figura 3 muestra los resultados de una prueba de ELISA de captura de DNI en la que las composiciones de matriz capturadas son sondeadas con anticuerpos anti-DNI para confirmar la integridad reticulada del DNI y con anticuerpos anti-PPS 14 para confirmar el aprisionamiento y presentación del antígeno polisacárido (PPS 14) en la matriz de DNI capturada. A las formulaciones de prueba se les permitió enlazarse cualquier anticuerpo de captura anti-DNI inmovilizado en una placa de ELISA. El material no enlazado fue lavado, y los anticuerpos de anti-DNI (panel A) o los anticuerpos anti-polisacáridos (panel B) se usaron para detectar la matriz de DNI o polisacarido dentro de la matriz de DNI, respectivamente. El Panel A muestra la detección del DNI capturado por el anticuerpo de captura de DNI para demostrar que las formulaciones de vacunas que contienen DNI están enlazadas por el anticuerpo de captura. El panel B muestra que el antígeno de polisacárido se asoció con matriz proteínica, según se detectó por el anticuerpo de detección especifica de anti-polisacárido .

La Figura 4 es una gráfica de barra que muestra la respuesta inmune del anti-PPS 14 IgG en los ratones inmunizados con las cuatro preparaciones de PCMV, como se establece en el Ejemplo 1. Los ratones fueron inmunizados tres veces en intervalos de dos veces por semana, y el suero de cada ratón fue recolectado de 10-12 días después de la inmunización. Los ratones inmunizados con 5 g por proteína de Composición 1 (Grupo 1, PCMV de PPS 14: DNI que tiene tamaños de partículas de 120-200 nm de diámetro) generaron concentraciones anti-PPS 14 IgG equivalentes o mejores que los ratones inmunizados con la Composición 2 (Grupo 2, PCMV de PPS 14:DNI que tiene un diámetro medio de tamaño de partículas de 63 nm) , aunque la Composición 1 contenía la mitad de la dosis de antígeno de polisacárido como se administró en la Composición 2.

La Figura 5 es una gráfica de barra que muestra la concentración de anticuerpo de anti-PPS 14 IgG de los ratones inmunizados con 2 µg de la Composición 1 (Grupo 1 + alumbre, conteniendo 0.95 ug de PPS 14) en comparación de la concentración de anticuerpo de anti-PPS 14 IgG de ratones inmunizados usando 2 ug de antigeno de PPS 14 únicamente. Los ratones fueron inmunizados tres veces en intervalos de dos veces por semana y el suero de cada ratón fue recolectado de 10 a 12 días después de la inmunización. Los datos demuestran que los sueros de los ratones inmunizados con el Grupo 1 PCMV que contiene 0.95 \ig de PS muestra respuestas mejoradas de IgG específicos de PPS-14 a través del tiempo, en comparación con los sueros de los ratones inmunizados con 2 µg de antígeno de PPS 14 por sí solo .

Las Figuras 6A y 6B muestran gráficas de barra de concentraciones de punto final recíprocos de anti-PPS 14 de IgG desde el día 38 (Sangrado 3) en el estudio del Ejemplo 1. La Figura 6A ilustra las concentraciones de ratones inmunizados con 5 g por proteína de la Composición q (Grupo 1 + alumbre; que contiene 2.4 ug de PPS 14; el rango de tamaño de partículas de 120-200 nm) , la Composición 2 (Grupo 2 + alumbre; 5.0 \ig PPS 14; tamaño medio de partícula de 63 nm) , la Composición 3 (PCMV total, reticulado usando 0.25% de glutaraldehído) , la Composición 4 (PCMV total reticulado usando 0.05% de glutaraldehído), y el control de antígeno (PPS 14 únicamente; 5 ug) . La Figura 6B muestra los datos del día 38 (sangrado 3) de sueros de ratones inmunizados con 2 ]ig por proteína de la Composición 1 (Grupo 1 + alumbre, que contiene 0.95 g de PPS) o con 2 \ig de PPS 14 por sí solo. Los datos demuestran que la respuesta del antígeno PPS 14 de IgG es significativamente más alta en los ratones inmunizados con formulaciones de PCMV con proteínas transportadoras altamente reticuladas (ej . , composiciones o fracciones de PCMV usando 0.25% de glutaraldehído en la reacción de la formación) , en comparación con el PCMV preparado con 0.05% de glutaraldehído, lo que lleva a transportador de DNI menos altamente reticulado y tamaños de partículas más pequeñas, y en comparación con los ratones inmunizados con antígeno de polisacárido por sí solo.

La Figura 7 es un cromatograma que muestra fraccionamiento de un PCMV preparado usando el antígeno Vi de polisacárido Salmonella typhi y la proteína DNI transportadora. La absorbencia de UV2so del producto de la reacción de Vi: DNI que hace elución de la columna de gel de agarosa reticulada CL-2B Sepharose® es trazada. Las fracciones recolectadas se muestran por las cortas líneas verticales que se originan del eje x. las áreas sombreadas indican las fracciones que fueron recolectadas y combinadas para formar los grupos 1-4. El tamaño de partículas para cada grupo fue determinado por la dispersión de luz dinámica (DLS) , que indica el tamaño más grande de partículas contenido en la mezcla, y dicho tamaño de partícula (nm) está listado arriba de cada grupo. Para el Grupo 1, el tamaño de partículas fue calculado a 179 nm de diámetro. Las partículas en el Grupo 2 fueron de 171 nm de diámetro. Las partículas en el Grupo 3 fueron de 198 nm de diámetro, y las partículas en el Grupo 4 se calcularon como de 185 nm de diámetro.

La Figura 8 es una gráfica de barra que muestra los resultados de un ensayo que mide las respuestas inmunes de anti-Vi IgG en los ratones inmunizados con las cuatro preparaciones de PCMV preparadas como se describió en el Ejemplo 2: Grupo 1 + alumbre (tamaño de partícula de 179 nm) , Grupo 2 + alumbre (tamaño de partículas de 171 nm) , Grupo 3 + alumbre (tamaño de partículas de 198 nm) , Grupo 4 + alumbre (tamaño de partículas de 185 nm) , PCMV total (sin fraccionar) (0.25% de glutaraldehído) , y la preparación de control de antígeno (10 µg de antígeno de Vi solo) .

La Figura- 9 es una gráfica de barra que muestra las concentraciones de punto final del anti-Vi de IgG en el Día 38 para los ratones inmunizados, respectivamente, con una de las preparaciones de PCMV descritas en el Ejemplo 2, en comparación con la inmunización con antígeno capsular por sí solo.

La Figura 10 es un cromatograma del fraccionamiento de una preparación de PCMV usando antígeno de polisacárido de Streptococcus pneumoniae tipo 14 y proteína DNI transportadora reticulada usando 0.25% de glutaraldehído . Las fracciones se separaron en una columna de exclusión de tamaño de agarosa reticulada CL-2B Sepharose®. La absorbencia de UV28o de la proteína es trazada. Las fracciones recolectadas se muestran por las pequeñas líneas verticales que se originan desde el eje x. Las áreas sombreadas indican las fracciones que fueron recolectadas y combinadas para los Grupos 1, 2, 3 y 4.

La Figura 11 es una imagen de un gel de electrofóresis de poliacrilamida de SDS teñido de azul Coomassie (4-12% de gel Bis-Tris) que demuestra la integridad de reticulación de las composiciones de PCMV de PPS 14: DNI descritas en el Ejemplo 3. La mezcla de reacción de los cuatro grupos de PCMV y del PCMV total (sin fraccionar) mostró reticulación extensiva de la proteína DNI transportadora según se demostró por la falta de migración hacia el gel de apilamiento. La apariencia de un frotis por debajo del pocilio para el Grupo 4, similar al frotis por debajo del pocilio para la reacción del PCMV total indica la presencia de especies de menor peso molecular en estas muestras.

La Figura 12 muestra los resultados de una prueba de ELISA de captura de DNI y sondas con anticuerpos de detección de anti-PPS 14 o anti-DNI para confirmar el aprisionamiento del antígeno de polisacárido y la integridad de reticulación del DNI . Las concentraciones variantes de los grupos de PCMV de PPS 14: DNI (Grupos 1-4; ver E emplo 3 y Figura 10) , la mezcla de reacción del PCMV total, o el DNI reticulado con polisacáridos de PPS 14 exógenamente agregados, se incubaron con anticuerpo de captura de DNI inmovilizado. La Figura 12A muestra la detección del PPS 14 que permanece asociado con la matriz proteínica de DNI después de la captura y el lavado; La Figura 12B muestra la detección del DNI capturado por el anticuerpo de captura del DNI para confirmar que las partículas capturadas en la prueba de ELISA están compuestas de DNI.

La Figura 13 es una gráfica de barra que muestra la respuesta inmune del anti-PPS 14 igG en ratones inmunizados con las preparaciones de PCMV descritas en el Ejemplo 3, en comparación con las de ratones inmunizados con el control de antígeno de PPS 14 por sí solo, o la vacuna conjugada Prevnar®. La Figura 13A muestra el IgG específico de PSS-14 de ratones inmunizados con PCMV que contienen 0.5 ug de DNI y cantidades variables de antígeno aprisionado, ej . , 0.03 ug de PPS 14 (Grupo 1), 0.06 ug de PPS 14 (Grupo 2), 0.13 \ig de PPS 14 (Grupo 3), y 0.48 ig de PPS 14 (Grupo 4), comparado contra el PCMV total, 0.05 \ig de PPS 14 solo, o Prevnar® (que contiene 2 de PPS 14) . El recorte de la concentración de punto final se calcula como la concentración que es 2 desviaciones estándar por arriba de la media del control negativo (sueros pre-inmunes). Los Grupos 1 y 2, que contenían partículas transportadoras de DNI de mayor tamaño, provocaron respuestas anti-PPS 14 comparables con la vacuna conjugada Prevnar®, en dosis significativamente menores de antígeno PPS 14.

La Figura 14 muestra concentraciones de punto final de anti-PPS 14 IgG de sueros individuales recolectados del Sangrado 3 (Día 39) a la complementación del régimen de inmunización de 0.5 µg descrito en el Ejemplo 3. Los ratones inmunizados con el Grupo 1 de PCMV (0.5 ug de DNI, 0.03 ug de PPS 14) y el Grupo 2 (0.5 ug de DNI, 0.06 \ig de PPS 14) desarrollaron GMT de IgG específico a anti-PPS 14 comparable en comparación con los ratones inmunizados con Prevnar®. La inmunización con PCMV arrojó una cantidad significativamente reducida del antígeno PPS 14 en comparación con la vacuna conjugada (Prevnar®) , aún provocó respuestas de IgG específicos de anti-PPS 14 significativas, y respuestas específicas de anti-PPS 14 comparables en los casos de los Grupos 1 y 2, en comparación con la respuesta inducida por la dosis de 2µg del PPS 14 contenido en la formulación de Prevnar® usada.

La Figura 15 muestra concentraciones de punto final de IgG anti-PPS 14 de sueros individuales recolectados del Sangrado 3 (Día 39) a la complementación del régimen de inmunización de 2]ig descrito en el Ejemplo 3. Los ratones inmunizados con el PCMV del Grupo 1 (0.05 \ig de DNI, 0.12 ug de PPS 14) y el Grupo 2 ( 0.5 ug de DNI, 0.22 ]ig de PPS 14) desarrollaron GMT de IgG específico de anti-PPS 14 comparable en comparación con los ratones inmunizados con la vacuna conjugada Prevnar®. La inmunización con PCMV arrojó una cantidad significativamente reducida del antígeno PPS 14 en comparación con la vacuna conjugada (Prevnar®) , aún provocó respuestas de IgG específicos de anti-PPS 14 significativas, respuestas específicas anti-PPS 14 comparables en los casos de los Grupos 1 y 2, en comparación con la respuesta inducida por la dosis de 2ig del PPS 14 contenido en la formulación de Prevnar® usada. Similar a los resultados vistos en la Figura 14, la inmunización con fracciones de PCMV incluyendo matrices de DNI de gran tamaño de partículas provocó, a una dosis significativamente reducida de PPS 14, respuestas de IgG específico de anti-PPS 14 comparable con las concentraciones inducidas por la dosis de 2 µg de PPS14 en Prevnar® .

La Figura 16 es un cromatograma del fraccionamiento de la preparación de PCMV de Vi:DNl descrita en el Ejemplo 4 en una columna de gel de agarosa reticulada CL-2B Sepharose®. La absorbencia en UV2so se traza. Las fracciones recolectadas se muestran por las líneas verticales que se originan desde el eje x. Las áreas sombreadas indican las fracciones que fueron recolectadas para los Grupos 1, 2, 3 y 4 (ver, Ejemplo 4).

La Figura 17 muestra los resultados de una prueba de ELISA de captura de DNI para confirmar el aprisionamiento y asociación del antígeno de Vi en la matriz de DNI reticulado. La Figura 17A muestra la detección de Vi que permanece asociada con la proteína de matriz de DNI mediante anticuerpo de detección de anti-Vi. La Figura 17B muestra la detección de DNI capturado por el anticuerpo de captura de DNI.

La Figura 18 es una imagen de gel de SDS-PAGE teñido de azul Coomassie (4-12% de gel Bis-Tris) ilustrando la integridad de reticulación de los grupos de fracción de PCMV de Vi.-DNI y el PCMV completo descrito en el Ejemplo 4. Las fracciones agrupadas de PCMV y la mezcla de reacción del PCMV completo contenían especies de muy alto peso molecular que no migraron visiblemente al gel y permanecieron en los pocilios de carga. El DNI no reticulado (control) mostró una banda de bajo peso molecular después de la electrofóresis (Flecha no etiquetada) .

La Figura 19 es una gráfica de barra que muestra las respuestas inmunes anti-Vi IgG en los ratones inmunizados con el PCMV y las preparaciones de control descritas en el Ejemplo 4. Las concentraciones de punto final del IgG anti-Vi de los sueros individuales recolectados del Sangrado 1 (Día 8) , Sangrado 2 (día 22) y sangrado 3 (día 41) se muestran. Las respuestas del IgG específico de Vi se determinan para los ratones inmunizados con las formulaciones de PCMV que contienen 10 ]ig de DNI con una dosis indeterminada de Vi para los grupos 1-4 y el PCMV completo. Los grupos de control de los ratones fueron inmunizados con 5 ]ig de Vi contenidos en un conjugado de Vi-BSA o con 10 ug de antígeno polisacárido de Vi por sí solo, derivado ya sea de Salmonella typhi o de Citrobacter freundii. Los sueros de ratones inmunizados con las partículas más grandes de matriz transportadora (Grupos 1-3) desarrollaron respuestas de IgG específicas de Vi más altas que los sueros de los ratones inmunizados con 10 \ig de Vi únicamente. La inmunización con el Grupo 4 (partículas más pequeñas) o PCMV total, generaron respuestas de anticuerpos específicos de Vi similares a cuando los ratones fueron inmunizados con Vi únicamente.

La Figura 20 es una gráfica de barra que muestra las concentraciones de punto final de anti-Vi de los cuatro PCMV y las preparaciones de control descritas en el Ejemplo 4. Las concentraciones de punto final de IgG de Anti-Vi se determinaron de los sueros individuales recolectados del sangrado 3 (Día 41) a la finalización del régimen de inmunización.

La Figura 21 es una gráfica de barra que muestra la proporción de IgG/ IgM de anti PPS 14. Los datos de las muestras sanguíneas de los días 10, 54, 239, 243 y 260 se recolectaron y analizaron para IgG e IgM específico de PPS-14 y se calculó la proporción IgG/IgM. Las proporciones de IgG/ IgM altas y ascendentes durante el curso de la inmunización observadas para los grupos 1 y 2, es una indicación de una respuesta de "memoria" inmunológica . La respuesta debilitante a través del tiempo y las bajas proporciones de IgG/IgM indican que la memoria inmune no fue inducida por las preparaciones que contienen solamente antígeno polisacárido .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las vacunas de matriz proteínica, y particularmente las vacunas de matriz capsular proteínica (PCMVs) , se describen en la publicación internacional de patente O 2008/021076 (Mekalanos), publicada el 21 de Febrero de 2008, y la publicación de patente estadounidense No. 2008-0095803 (Mekalanos), publicada el 28 de Abril de 2008, ambas incorporadas en este documento en su totalidad. Estas publicaciones nos muestran que las vacunas de matriz proteínica tienen las propiedades inmunologicas potentes de las típicas vacunas conjugadas de proteína PS pero difieren deseablemente de las vacunas conjugadas en que no se requiere enlace covalente significativo alguno para acoplar el antígeno de interés con la proteína transportadora. En su lugar, el antígeno de interés, ej . , polisacáridos , polímeros orgánicos capsulares u otros antígenos, está aprisionado con una matriz proteínica transportadora.

Cuando un biopolímero capsular o polisacárido de un patógeno es aprisionado en una matriz proteínica reticulada, dichas vacunas se denominan vacunas de matriz capsular proteínica (PCMVs por sus siglas en inglés). Como se describe en WO 2008/021076 y US 2008-0095803, las PCMVs se produjeron incluyendo unas basadas en el modelo de antígeno capsular independiente de T, ácido poligama-D-glutámico (PGA) , así como ácido algínico (alginato) y dextrano, y la proteína transportadora ejemplar, mutante Dominante Negativo Inhibidor (DNI) . El DNI es una forma imitada de Antígeno Protector (PA) de B . anthracis y se produjo a partir de Escherichia coli mediante el método de Benson, et al., Biochemistry, 37:3941-3948 (1988).

La presente invención se relaciona con descubrimientos y observaciones hechas con respecto a la mejora de la inmunogenicidad de las composiciones de vacuna de matriz proteinica.

Para que la invención puedas ser más claramente entendida, las siguientes abreviaturas y términos se usan como se define más adelante.

Una composición o método descrita aquí como "que comprende" o "comprendiendo" uno o más elementos nombrados o pasos, es de criterio abierto, significando que los elementos nombrados o pasos son esenciales, pero que se pueden agregar otros elementos o pasos dentro del alcance de la composición o método. Para evitar la prolijidad, también se entiende que cualquier composición o método descrito como "que comprende" o "comprendiendo" uno o más elementos nombrados o pasos también describe la composición o método correspondiente, más limitado, "consistiendo esencialmente de" (o "que consiste esencialmente de") los mismos elementos nombrados o pasos, significando que la composición o método incluye los elementos esenciales nombrados o pasos y puede también incluir elementos adicionales o pasos que no afectan materialmente la(s) característica (s) básica(s) y novedosa(s) de la composición o método. También se entiende que cualquier composición o método aquí descrito como "comprendiendo" o "consistiendo esencialmente de" uno o más elementos nombrados o pasos, también describe la composición o método correspondiente, más limitada, y cerrada "consistiendo de" (o "que consiste de") los elementos nombrados o pasos para la exclusión de cualquier otro elemento no nombrado o paso. En cualquier composición o método aquí divulgado, los equivalentes conocidos o divulgados de cualquier elemento esencial nombrado o paso, pueden ser sustituidos por dicho elemento o paso. También se entiende que un elemento o paso "seleccionado del grupo que consiste de" se refiere a uno o más de los elementos o pasos en la siguiente lista, incluyendo combinaciones de cualquiera dos o más de los elementos listados o pasos.

El término "administrando" como se usa aquí, junto con una composición de vacuna, significa proporcionar la composición de vacuna a un sujeto tal como un sujeto humano en una dosis suficiente para inducir una respuesta inmune en el sujeto, en donde los resultados de la respuesta inmune en la producción de anticuerpos que enlazan específicamente un antígeno contenido en la composición de vacuna (ej., cuyo antígeno, en vacunas terapéuticas, corresponde a un marcador antigénico en un patógeno) . La administración de manera deseable incluye la inyección intramuscular, inyección intradérmica, inyección intravenosa, inyección intraperitoneal , inyección subcutánea o transcutánea, inhalación o ingestión, según sea apropiado para la forma de dosis y la naturaleza y actividad de la composición de vacuna a ser administrada. La administración puede involucrar una sola administración de una vacuna o la administración de una vacuna en dosis múltiples. Deseablemente, una segunda administración ("acelerador") se diseña para acelerar la producción de anticuerpos en un sujeto para evitar la infección por un agente infeccioso. La frecuencia y cantidad de dosis de vacuna depende de la actividad específica de la vacuna, y puede ser fácilmente determinada por experimentación de rutina .

El término "reticulación" se refiere a la formación de un enlace covalente entre dos moléculas, macromoléculas o combinación de moléculas, ej . , moléculas de proteína transportadora, o entre dos sitios de la misma molécula, ej . , dos residuos de amino ácidos de la misma proteína, ya sea directamente, cuando se usa un vinculante de "longitud cero" (creando un enlace directo) , o mediante el uso de moléculas reticulantes bifuncionales que forman un puente o vínculo molecular entre dos sitios reactivos. Los reticuladores bifuncionales exhiben dos grupos funcionales, cada uno capaz de formar un enlace covalente con una de dos moléculas separadas o entre dos grupos separados en la misma molécula (e . , para formar "curvas" o "duplicar" dentro de una molécula tal como una proteína transportadora) . Los vinculantes ejemplares incluyen reticuladores bifuncionales que son capaces de reticular dos proteínas transportadoras .

El término "antígeno" como se usa aquí, se refiere a cualquier molécula o combinación de moléculas que está específicamente enlazada por un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

El término "reticulador bi funcional" o "vinculante bi funcional" como se usa aquí, significa un compuesto que tiene dos grupos funcionales, cada uno separadamente capaz de formar un enlace covalente con grupos reactivos en dos moléculas separadas, átomos, o recolecciones de moléculas que se desea sean vinculadas.

Los vinculantes bifuncionales ejemplares se describen, por ejemplo, por G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1996), y Dick y Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohidrate Antigens," en Conjúgate Vaccines (Cruse and Lewis, eds) , Contrib. Microbiol . Inmuno1. Basel, Karger, 1989, vol . 10, pp. 48-114) . Deseablemente, un vinculante bi funcional es glutaraldehído, bis [sulfosuccinimidilo] suberato, o adipimidato de dimetilo.

El término "vinculante" o "reticulante" como se usa aquí, se refiere a un compuesto capaz de formar una unión química covalente o puente que une dos o más moléculas o dos o más sitios en la misma molécula. Los vinculantes deseables incluyen, ej . , glutaraldehído u otros dialdehídos de la fórmula OHC-R-CHO, en donde R es un alquileno divalente lineal o ramificado de 1 a 12 átomos de carbono, un radical aromático divalente de 5 a 10 átomos de carbono, un sistema cíclico de 3 a 10 átomos, (CH2CH20) 1CH2CH2 en el que q es 1 a 4, o una unión química directa vinculando dos grupos aldehido. La vinculación puede ser directa sin el uso de una molécula vinculante (de puente) . Por ejemplo, un grupo carboxilo, por ejemplo, al lado de la cadena de un residuo de Asp o Glu en un grupo carboxílico de proteína transportadora, puede ser vinculado directamente a un grupo libre de amino, por ejemplo, en el lado de la cadena de un residuo de Lys, usando química de carbodiimida o enzimáticamente usando transglutamidasas que catalizan la reticulación entre grupos libres de amino y grupos de carboxamida, ej . , de Gln.

El término "acelerar" en el contexto de provocar la producción de anticuerpos, se refiere a la activación de las células B de memoria que sucede durante una segunda exposición a un antígeno. Esto también es referido como "respuesta al acelerador" y es indicativo de respuesta inmune de memoria "secundaria" de largo plazo, resultando en la producción de largo plazo de anticuerpos.

El término "proteína transportadora" en el contexto de una composición de vacuna se refiere a una proteína usada en una composición de vacuna que evoca una respuesta inmune para sí misma y/o para un antígeno asociado con o en complejo con dicha proteína transportadora. En una composición de vacuna de matriz proteínica, un antígeno está asociado con una proteína transportadora que está reticulada para formar úna matriz proteínica, aprisionando así el antígeno para formar un complejo con la proteína transportadora, preferentemente sin vínculo covalente relevante de antígeno a la matriz. En una composición de vacuna conjugada, un antígeno es reaccionado con una proteína transportadora, para que el antígeno y la proteína transportadora sean covalentemente unidos uno con otro, por diseño. Deseablemente, la proteína transportadora contiene un epítope reconocido por una célula T. también abarcada por la definición de una "proteína transportadora" están los péptidos multi-antigénicos (MAPs), que son péptidos ramificados. Deseablemente, un MAP incluye lisina (Lys). Las proteínas transportadoras ejemplares deseables incluyen toxinas y toxoides (químicos o genéticos), que pueden ser mutados, ej . , para reducir la reactogenicidad. Las proteínas transportadoras apropiadas incluyen, ej . , toxina de difteria o un mutante de la misma, toxoide de difteria, toxina del tétanos o un mutante de la misma, toxoide tetánico, Pseudomonas aeruginosa exotoxina A o un mutante de la misma, subunidad B de toxina del cólera, fragmento C de la toxina tetánica, flagelina bacteriana, neumolisina, listeriolisina O (LLO, y moléculas relacionadas), una proteína de membrana externa de Neisseria menningitidis, Pseudomonas aeruginosa proteína Hcpl, enterotoxina lábil de calor Escherichia coli, toxina de tipo shiga, proteína humana LTB, un extracto proteínico de células bacterianas totales, el mutante inhibidor negativo dominante (DNI) del Antígeno Protector de Bacillus anthracis, o beta-galactosidasa de Escherichia coli, o cualquier otra proteína que pueda ser reticulada por un vinculante.

El término "aprisionado" como se usa aquí con referencia a un antígeno, significa la asociación o complejo de un antígeno con una proteína transportadora, en particular una proteína transportadora reticulada para formar una matriz que forma la asociación o complejo con el antígeno, de tal forma que el antígeno permanece en el complejo con la proteína transportadora bajo condiciones fisiológicas. Deseablemente, el antígeno es aprisionado en un complejo con proteínas transportadoras en la ausencia de unión covalente relevante entre el antígeno y una proteína transportadora. La ausencia de unión covalente significativa, como se usa aquí, se refiere a no más de 50% del antígeno que está siendo covalentemente unido a una proteína transportadora. Deseablemente, no más del 40%, no más del 30%, no más del 20%, no más del 10%, o deseablemente no más del 5% del antígeno es covalentemente unido a una proteína transportadora en una composición de vacuna de matriz proteínica.

Por "infección" se entiende la invasión de un sujeto por un microbio, e . , una bacteria, hongo, parásito o virus. La infección puede incluir, por ejemplo, la multiplicación excesiva de microbios que están normalmente presentes en o dentro del cuerpo de un sujeto o la multiplicación de microbios que están normalmente presentes en o dentro de un sujeto. Un sujeto está padeciendo una infección microbiana cuando una población microbiana excesiva indeseable (ej., patogénica) está presente en o sobre el cuerpo del sujeto o cuando la presencia de una(s) población (es ) está(n) dañando las células o provocando síntomas patológicos en un tejido del sujeto.

Por "agente infeccioso" se entiende un microbio que provoca una infección.

El término "inmunogénico" se refiere a un compuesto que induce una respuesta inmune en un sujeto.

Deseablemente, una respuesta inmune es una respuesta inmune dependiente de la célula T que involucra la producción de anticuerpos de IgG.

El término "polímero capsular microbiano" se refiere a un polímero presente en o dentro del revestimiento de la cápsula de un microbio. Deseablemente, un polímero capsular microbiano es un polímero orgánico tal como un polisacárido, fosfopolisacárido , polisacárido con azúcar de amino con una sustitución de N-acetilo, polisacárido que contiene una azúcar sulfonilatada, otra azúcar modificada con sulfato, o azúcar modificada por fosfato, polialcohol, poliamino ácido, ácido teicoico, , o una cadena lateral 0 de un lipopolisacárido .

"Monómero" se refiere a una estructura molecular capaz de formar una o más uniones con monómeros similares, arrojando frecuentemente una cadena o una seria de cadenas ramificadas, conectadas de subestructuras repetitivas de monómero, cuando son parte de un "polímero".

"Polímero orgánico" se refiere a un polímero compuesto de monómeros covalentemente vinculado cada uno compuesto de átomos de carbono, oxigeno, hidrógeno o nitrógeno o fracciones de fosfato o sulfato. Deseablemente, un polímero orgánico es un polisacárido, fosfopolisacárido , polisacárido con una amino azúcar con una sustitución de N-acetilo, polisacárido que contiene una azúcar sulfonilatada, otra azúcar modificada de sulfato, o azúcar modificada de fosfato, azúcar, polialcohol, poliamino ácido, ácido teicoico, y una cadena lateral 0 de lipopolisacárido .

"Polialcohol" significa una forma hidrogenada de un carbohidrato en donde un grupo carbonilo ha sido reducido a un grupo hidroxilo primario o secundario. Los polialcoholes ejemplares son un óxido polialquileno (PAO) , tal como glicoles polialquilenos (PAG) , incluyendo polimetilenglicol , polietilenglicol (PEG) , metoxipolietilenglicol (MPEG) , y polipropilenglicol ; alcohol polivinílico (PVA) ; anhídrido de ácido polietilen-co-maleico; anhídrido de ácido poliestireno-co-málico; dextranos incluyendo dextranos de carboximetilo ; celulosas, incluyendo metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa carboxietilcelulosa, e hidroxipropilcelulosa; hidrolisatos de quitosano; almidones tales como almidones de hidroxietilo y almidones de hidroxipropilo; glicogen; agarosas y sus derivados; goma guar; pululana; insulina; goma xantana; carragenana; pectina; hidrolisatos de ácido algínico; sorbitol; un alcohol de glucosa, mañosa, galactosa, arabinosa, gulosa, xilosa, treosa, sorbosa, fructosa, glicerol, celobiosa de maltosa, sucrosa, amilasa, amilopectina; o mono propilenglicol (MPG) .

"Poli amino ácido" o "poliamino ácido" significa al menos dos amino ácidos vinculados por una unión péptida. Deseablemente, un poli amino ácido es un péptido que contiene una secuencia repetitiva de amino ácidos o una cadena del mismo amino ácido (ej . , un homopolímero) .

El término "reduciendo una base de Schiff" se refiere a la exposición de azometina o un compuesto de la fórmula RiR2C=N-R3 (en donde Ri, R2 y R3 son subes tructuras químicas, que contienen típicamente átomos de carbono) a un agente reductor que satura la doble unión de la base de Schiff con los átomos de hidrógeno. Los métodos de reducción son conocidos para los expertos en la materia.

El término "une específicamente" como se usa aquí, con referencia a un anticuerpo o a un fragmento del mismo, significa una afinidad incrementada de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo para un antígeno en particular, ej . , una proteína o segmento de la misma, relativa a una cantidad igual de cualquier otro antígeno. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo deseablemente tiene una afinidad para su antígeno que es de al menos de 2 veces, 5 veces, 10 veces, 30 veces o 100 veces más grande que para una cantidad igual de cualquier otro antígeno, incluyendo los antígenos relacionados, como se determinó usando métodos estándares tales como un ensayo inmunosorbente vinculado de enzimas (ELISA) .

Por "sujeto" se entiende un animal que puede ser infectado por un microbio. Deseablemente, un sujeto es un mamífero tal como un humano, mono, perro, gato, ratón, rata, vaca, oveja, cabra o caballo. Un sujeto humano puede ser un humano adulto, niño, infante, menor o pre-puberto.

Un "antígeno independiente de célula T" se refiere a un antígeno que resulta en la generación de anticuerpos sin la cooperación de linfocitos T. el antígeno independiente de célula T puede estimular directamente los linfocitos B sin la cooperación de linfocitos T. Los antígenos independientes de célula T ejemplares deseables incluyen ácido antígeno de ácido glutámico poli-gama-D capsular (PGA) , ácido algínico (algenato) , dextrano, polisacáridos (PS) , poli amino ácidos, polialcoholes y ácidos nucleicos.

Las composiciones de vacuna de matriz proteínica de la presente invención no requieren vinculación covalente entre el antígeno que pretende evocar una respuesta inmune y la proteína transportadora usada para formar la matriz. Esto simplifica ventajosamente la preparación de composiciones de vacuna de matriz proteínica, reduciendo el costo de su preparación en comparación con la tecnología de vacunas conjugadas. Las vacunas conjugadas de proteína de polisacárido (PS) han probado ser prohibitivamente caras para producirse y venderse en el mundo en desarrollo. Las vacunas conjugadas convencionales son difíciles de producir de manera barata debido a la alta química especializada requerida para cada vacuna y los costos de producción y purificación tanto del antígeno PS y la proteína transportadora.

Las composiciones de vacuna de acuerdo con la presente invención se enfocan a una necesidad de vacunas que pueden inducir de manera segura la inmunidad en contra de antígenos previamente intratables. Las composiciones de vacunas como se describen aguí, pueden ser monovalentes (que tienen un solo antígeno para inducir una respuesta inmune) o multivalente (que tienen antígenos múltiples para inducir respuestas inmunes múltiples) . Las composiciones de vacunas que contienen ligandos de receptor tipo Toll (TLR) han demostrado evocar respuestas inmunes para antígenos de otra manera intratables, pero tienden a ser inseguros debido a que los ligandos TLR son frecuentemente proinflamatorios , tóxicos hasta en dosis pequeñas, reactogénicos , y tienden a causar síntomas adversos en comparación con las composiciones de esta invención.

El significado de otros términos será entendido por el contexto en el que aparecen o como se entienden por los expertos en la materia, incluyendo practicantes en los campos de química orgánica, farmacología, microbiología, bioquímica proteínica, e inmunología.

La presente invención se relaciona con una composición inmunogénica que comprende (1) un antígeno de interés y (2) la al menos una proteína transportadora, en donde dicha proteína transportadora está reticulada para formar una matriz proteínica, dicho antígeno de interés está aprisionado por dicha matriz proteínica, y dicha composición está comprendida de partículas de matriz proteínica de alto peso molecular, ej . , que tienen un tamaño de partículas medio superior a 100 nm de diámetro, deseablemente un tamaño de partículas medio en el rango de 100 - 2000 nm de diámetro o más. Dichas composiciones pueden ser fácilmente preparadas al mezclar los componentes de antígeno y proteína transportadora, iniciando una reacción reticulante para provocar la reticulación de la proteína transportadora, seguida por el procesamiento del producto de reacción para eliminar especies de menor peso molecular (ej . , especies < 100 nm de diámetro) . Se ha descubierto que la producción de composiciones de vacuna de matriz proteínica que tienen tamaño de partícula de matriz proteínica más grande, ej . , > 100 nm de diámetro, llevan a inmunogenicidad incrementada del antígeno transportado (aprisionado) . Más aún, la mejora en inmunogenicidad mediante el incremento del tamaño de partículas de matriz proteínica se vuelve más pronunciado con el tamaño de partículas en incremento, de forma tal que las partículas mayores a 200 nm de diámetro, 300 nm de diámetro, 500 nm de diámetro, 750 nm de diámetro, o 1000 nm (1 um) de diámetro o aún más, se contemplan aquí. Las composiciones de matriz proteínica de partículas de matriz proteínica de alto peso molecular de acuerdo con la presente invención, han incrementado la inmunogenicidad en comparación con las composiciones de partículas de matriz proteínica de bajo peso molecular o las composiciones que tienen un amplio rango de tamaños de partículas incluyendo las partículas de matriz proteínica de menor peso molecular.

La presente invención presenta, en particular, composiciones de vacunas de matriz capsular proteínica de partículas de matriz capsular proteínica de alto peso molecular y los métodos para hacer y administrar dichas composiciones para proporcionar inmunidad en contra de antígenos, particularmente antígenos independientes de célula T o antígenos que normalmente evocan respuestas inmunes débiles, tales como, ej . , polisacáridos (PS) , polialcoholes , poliaminoácidos , y otros polímeros orgánicos. Las composiciones de vacuna de la invención tienen las propiedades inmunológicas potentes de las vacunas típicas conjugadas de PS-proteína pero difieren deseablemente de las vacunas conjugadas en que no se requiere ninguna unión atómica covalente relevante para acoplar el antígeno de interés, ej . , polímero de PS u orgánico capsular, a la proteína transportadora. En su lugar, el antígeno de interés, ej . , polímeros de PS u orgánicos, está aprisionado con la matriz proteínica transportadora. Por ejemplo, una matriz proteínica puede estar formada mediante moléculas de proteína transportadora reticulante covalente con ellas mismas, en la presencia de un antígeno soluble, ej . , polímeros PS u orgánicos capsulares . Las proteínas transportadoras que están altamente reticuladas unas con otras pueden formar una matriz que puede capturar un antígeno y facilitar la ingesta de dicho antígeno y la estimulación de la producción de anticuerpos en células inmunes. Como se demuestra aquí, la inmunogenicidad de una composición de vacuna de matriz capsular proteínica es mejorada por la selección de los tamaños de partículas de matriz proteínica de la composición para eliminar partículas de peso molecular más bajo (menos de 100 nm de diámetro) o la selección de los tamaños de partícula de matriz proteínica de la composición, para incluir tamaños de partículas mayores a 100 nm de diámetro.

La matriz proteínica transportadora puede tener la forma de una "malla" que encierra el antígeno o una serie de "perlas en cadena" en donde el antígeno es la "cadena", la proteína o complejos de proteínas reticuladas es la "perla" en esta analogía. El antígeno es aprisionado con la proteína transportadora si la proteína transportadora rodea el antígeno para formar un anillo alrededor del antígeno o una malla tridimensional en la que el antígeno es enredado.

En modalidades deseables, las moléculas de la proteína transportadora son reticuladas covalentemente, por ejemplo, el vínculo covalente contiene una unión péptida entre un grupo amino primario de una cadena lateral de lisina y un grupo carboxi de una cadena lateral de aspartate o glutamato. En otras modalidades deseables, las reticulaciones covalentes pueden iniciarse usando reticulantes tales como compuestos de la fórmula OHC-R-CHO, en donde R es un alquileno divalente lineal o ramificado de 1 a 12 átomos de carbono, un heteroalquilo divalente lineal o ramificado de 2 a 12 átomos de carbono, un alquinileno divalente lineal o ramificado de 2 a 12 átomos de carbono, un radical aromático divalente de 5 a 10 átomos de carbono, un sistema cíclico de 3 a 10 átomos, - (CH2CH20) qCH2CH2- en el que q es de 1 a 4, o una unión química directa que vincula dos grupos aldehidos. En modalidades preferidas, el vínculo covalente se forma usando glutaraldehído como un agente reticulante, o alternativamente tales agentes como ester m-maleimidobenzoilo-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida, o benzidina bis-biatozitada , suberato de bis [sulfosuccinimidilo] , o adipimidato de dimetilo pueden usarse. Aunque no se requiere en la formación de una composición de vacuna de matriz proteínica, el antígeno de interés puede ser covalentemente unido para la proteína transportadora, por ejemplo, a un alcance que es incidental para la formación de la matriz proteínica transportadora reticulada, ej . , debido a los grupos reactivos no bloqueados o grupos terminales amino o carboxilo o grupos hidroxilo que pueden existir en el antígeno^.. En general, el vinculo covalente de antigeno a un transportador no es un objeto en la formación de vacunas de matriz proteínica. Para los fines de la invención, las vacunas de matriz proteínica son composiciones de vacuna en donde no más del 50% del antígeno está covalentemente vinculado a la proteína transportadora.

En modalidades deseables, el antígeno y la proteína transportadora no están covalentemente vinculados. Dicha unión no covalente puede involucrar una interacción hidrofóbica, interacción iónica, interacción de van der Waals, o unión hidrogena. El vínculo no covalente puede incluir configuraciones geométricas físicas que no asocian covalentemente antígeno con complejos pro eínicos (ej . , como en la anterior analogía de "perlas en cadena" ) .

Las composiciones de vacuna dé la invención pueden prepararse usando cualquiera de muchos posibles vinculantes para reticular cualquiera de muchas posibles proteínas transportadoras en la presencia de cualquier antígeno de interés. Los vinculantes ejemplares y preferidos, proteínas transportadoras y antígenos de interés, se comentan ahora.

Los polisacáridos (PS) son polímeros de. sacáridbs (azúcares) . Los PS derivados de cápsulas microbianas son los componentes antigénicos principales involucrados en la inmunidad protectora contra patógenos bacterianos encapsulados tales como Neisseria meningitidis , Streptococcus pneumoniae, Salmonella typhi , y Haemophilus influenzae Tipo B. La inmunización de adolescentes y adultos con vacunas basadas en los polisacáridos microbianos ha sido exitosa en la reducción de cargas de enfermedad, pero ha sido menos efectiva en la provisión de inmunidad protectora a infantes y niños pequeños (ej . , niños menores a 24 meses de edad) . Los niños pequeños no han desarrollado un repertorio inmune adaptativo inmune maduro y los antigenos independientes de células T tales como PS capsular y son pobremente inmunogenicos y no llevan a respuestas inmunes protectoras de largo plazo (e . , una respuesta de memoria inmunológica) en tales recipientes de vacunas j óvenes .

Un antígeno independiente de célula T tal como un polisacárido se puede convertir en un antígeno dependiente de la célula T mediante acoplamiento químico de polisacárido con proteína. Este proceso, conocido como "conjugación", involucra la formación de uniones covalentes entre los átomos en la estructura de polisacárido y átomos de cadena lateral de amino ácidos presentes en la proteína "transportadora". Tales "vacunas conjugadas" más eficientemente promueven la inducción de maduración de células B y el cambio de isotipo, llevando a niveles mucho más altos de anticuerpos con el perfil protector de anti-PS correcto. Los anticuerpos protectores tienen alta afinidad de sus antígenos de polisacáridos , y son típicamente de la subclase de Inmunoglobulina G(IgG), un anticuerpo de larga vida con actividad complementaria de fijación y realizador de opsonización.

Un antígeno independiente de célula T generalmente no estimula la inmunidad duradera, ej . , la producción de anticuerpos IgG, pero puede estimular la producción de anticuerpos menos potentes y más temporales de igM. Como tal, los antígenos de polisacáridos por sí solos no producen típicamente respuestas aceleradoras de IgG. Sin embargo, los polisacáridos producen respuestas aceleradoras si se lleva a cabo la inmunización primaria con un conjugado de proteína PS debido a que las células de memoria inducidas por el conjugado ya han sido programadas para producir IgG. De hecho, la respuesta aceleradora en animales o humanos vacunados, se cree que imita la respuesta protectora debido a la exposición a un microbio que despliega el PS; esta memoria de largo plazo es crítica para que una vacuna trabaje en proporcionar inmunidad protectora a sujetos inmunizados años después de su inmunización. Por lo tanto, los conjugados de proteína PS se valoran por (1) su capacidad para inducir altos niveles de IgG en contra de antígenos PS, y (2) su capacidad para inducir respuestas inmunes de memoria en contra de los antígenos de PS . Los antígenos polisacáridos típicamente no despliegan estas propiedades, y por lo tanto son antígenos inferiores. La dificultad en la síntesis de vacunas conjugadas y su costo de producción, han hecho más lento el desarrollo de vacunas conjugadas para muchas enfermedades bacterianas en donde una respuesta inmune a un antígeno de polisacárido puede ser protectora.

Otros antígenos independientes de células T, incluyen homopolímeros de amino ácidos, tales como ácido poli-gama-D-glutámico (PGA) y polialcoholes . La mayoría de los biopolímeros son antígenos independientes de células T. Los polímeros pueden reticular receptores de Inmunoglobulina (Ig) en células B que los reconocen debido a la naturaleza repetitiva de sus estructuras químicas (y por lo tanto epítopes). Por lo tanto los polímeros pueden activar las células B para la producción de IgM antipolímero en la misma manera en que lo hacen los polisacáridos. Por ejemplo, un homopolímero de amino ácido, ácido poli-gama-D-glutámico (PGA) de Bacillus anthracis, es un polímero capsular que es muy poco inmunogénico y también un antígeno independiente de célula T. las vacunas compuestos de PGA conjugadas con transportadores de proteínas son altamente inmunogénicos , capaces de inducir un IgG anti-PGA, y memoria inmunológica al PGA. Por lo tanto, la mayoría de los polímeros responden como PS en términos de su inmunogenicidad debido a que no pueden ser procesados y desplegados en el contexto de MHC-II y por lo tanto no pueden usar la ayuda de la célula T. Una excepción se encuentra en algunos polímeros de ocurrencia natural que interactúan con otra clase de receptores denominados receptores de tipo Toll (TLRs) . Una vez activado, el TLRs puede inducir la producción de citocinas por células anfitrionas y producen cambios en la respuesta inmune adaptativa. Algunos PS están covalentemente fijados a los ligandos de TLR o contaminados con dichos ligandos. Por ejemplo, los lipopolisacáridos (LPS) son PS que son altamente inmunogénicos e inducen el IgG y respuestas de memoria; la fracción de lípido A de LPS es un ligando de TLR y puede ser responsable de las propiedades inmunológicas .

Las vacunas conjugadas convencionales son difíciles de producir de manera económica debido a los costos de producción y purificación de ambos antígenos de PS y proteína transportadora y la química específica involucrada en cada conjugación de polisacárido-proteína . Generalmente ambas necesitan ser casi puras antes de que la química de conjugación pueda ser llevada a cabo con una eficiencia de acoplamiento razonable. Típicamente, la química de acoplamiento debe ser específicamente desarrollada para varios PS que son únicos para la química del PS y las proteínas transportadoras que han sido seleccionadas. Esta química de acoplamiento introduce grupos funcionales en el PS que pueden después estar vinculados a la proteína transportadora típicamente mediante las cadenas laterales de amino épsilon de residuos de lisina. La modificación química del PS para introducir dichos grupos de acoplamiento puede destruir epítopes en el PS e introducir nuevos epítopes (ej., asociados con los grupos vinculantes o de sacárido modificados) cuya relevancia solo puede ser evaluada por el desempeño de análisis inmunológico cuidadoso. Más aún, para las vacunas conjugadas de PS-proteína convencionales, el tamaño del PS, el número de moléculas de PS unidas por molécula transportadora de proteína, la naturaleza del transportador seleccionado, y el tipo de química de vinculación pueden afectar la inmunogenicidad de la vacuna conjugada. Como tal, por ejemplo, en el caso de la enfermedad de neumococos en donde cada uno de los más de 90 serotipos tiene una estructura de PS diferente (Bentley et al., PLOS Genetics 2(3):e31 262-269, 2006), un sólo método de conjugación puede no ser apropiado para todos los serotipos .

Las vacunas conjugadas reproduciblemente sintetizantes con propiedades inmunológicas reproducibles involucra el control cuidadoso del tamaño del PS, el número de unión de moléculas de PS por molécula transportadora de proteína, la naturaleza del transportador seleccionado, y el tipo de química vinculante y esto, en cambio, incrementa dramáticamente el costo de fabricación de vacunas conjugadas .

La emergencia de resistencia al antibiótico resalta la urgencia para el desarrollo de vacunas seguras y efectivas. Hacer de las vacunas alto ampliamente disponible, especialmente para aquellos en países en desarrollo, requiere que la manufactura de vacunas también sea de costo efectivo. La incorporación de vacunas conjugadas combinadas contra muchos antígenos polisacaridos de diferentes serotipos de una o más especies bacterianas en el régimen de inmunización de la infancia simplificaría la administración de vacunas de esa población de alto riesgo. Sin embargo, la tecnología actual de vacuna conjugada no tiene un costo efectivo, y por lo tanto, las vacunas de combinación conjugada son virtualmente imposibles de administrar en el mundo en desarrollo debido a su alto costo.

En modalidades deseadas, las composiciones de vacuna inmunogénica de la invención son vacunas de matriz capsular proteínica (PCMV) en donde uno o más componentes capsulares bacterianos están aprisionados en una matriz proteínica transportadora reticulada que tiene un rango de tamaño de partículas por arriba de los 100 nm de diámetro, deseablemente en el rango de 100 nm a 2000 n de diámetro, o incluirán predominantemente partículas seleccionadas de entre dicho rango. Las PCMs pueden ser producidas fácilmente porque uno necesita como material de inicio el antígeno de interés, ej . , cápsulas, que no necesiten ser hidrolizadas a fragmentos más pequeños y pueden activar polisacáridos múltiples para ser aprisionados simultáneamente .

Debido a que el método para hacer vacunas de la invención no requiere ningún conocimiento de la química del antígeno de interés, ej . , un polisacárido capsular, el método no depende de la necesidad de desarrollar química reticulante que sea compatible con la química del antígeno de interés y la proteína transportadora. Mientras que es posible que algunos antígenos, no obstante, interactúen con el reticulante, esto no debería restar de la eficacia de la vacuna, debido a que el reticulante no pretendido del antígeno de interés y la proteína transportadora se esperaría que tuvieran propiedades inmunogénicas de cualquier manera. En las vacunas de la invención, la reticulación del antígeno de interés con la proteína transportadora no es un requisito para que la vacuna sea efectiva. Esto está en agudo contraste con las vacunas conjugadas convencionales, las que son obstaculizadas en su fabricación y desarrollo. Las vacunas de la invención deseablemente tienen al menos, ej . , 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o hasta un 100$ de las proteínas transportadoras reticuladas, y no más de, e . , 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ó 1% del antígeno de interés reticulado a la proteína transportadora. Deseablemente, no más de un 10% de los antígenos están reticulados con las proteínas transportadoras y al menos un 50% de las proteínas transportadoras están reticuladas.

Como se comenta aquí, las composiciones de vacuna de matriz proteínica de partículas de matriz proteínica de alto peso molecular de acuerdo con la presente invención, han incrementado la inmunogenicidad en comparación con las composiciones de partículas o composiciones de matriz proteínica de bajo peso molecular que tienen un amplio rango de tamaños de partículas, incluyendo partículas de matriz proteínica de menor peso molecular. Por lo tanto, después de la mezcla del antígeno y los componentes de proteína transportadora y la iniciación de una reacción de reticulación para provocar la reticulación de la proteína transportadora, el producto de reacción es deseablemente aún más procesado para eliminar especies de menor peso molecular (ej . , especies <100 nm de diámetro) o al seleccionar los tamaños de partícula de matriz proteínica de la composición para que incluyan tamaños de partículas mayores a al menos 100 nm de diámetro. Las composiciones preferidas de acuerdo con la invención tendrán un rango de tamaño de partículas de 120-2000 nm de diámetro o incluirán partículas predominantemente seleccionadas de dentro de dicho rango. En modalidades deseables de la invención, las composiciones de vacuna de matriz proteínica tendrán partículas de matriz proteínica de un diámetro de tamaño de partícula medio mayor a 120 nm, mayor a 170 nm, mayor a 200 nm, mayor a 500 nm, mayor a 1000 nm, mayor a 2000 nm o aún mayores, ej . , a los límites de la metodología para la recolección de partículas de matriz proteínica. En modalidades aún más deseables de la invención, las composiciones inmunogénicas de la invención están comprendidas de complejos de matriz proteínica/antígeno que tienen un rango de tamaños de partículas por arriba de los 100 nm de diámetro, tales como 100-2000 nm de diámetro, o selecciones dentro de dicho rango, ej . , 120-200 nm, 200-400 nm, 250-500 nm, 120-1000 nm, 200-2000 nm, y otros rangos de tamaños de partículas. En modalidades aún más deseables de la invención, la composición incluye complejos que tienen tamaños de partículas de 170-185 nm de diámetro. Como se comenta aquí, la elevación del tamaño de partículas del complejo promedio, o la eliminación de los componentes de menor tamaño de partículas de la composición de la vacuna, lleva a un incremento sorprendente en inmunogenicidad con respecto al antígeno aprisionado. Más aún, las partículas de matriz proteínica más grandes que contienen muy pequeñas cantidades de antígeno, son capaces de provocar respuestas inmunes que sobrepasen o comparables con composiciones del antígeno por sí solo (no en complejo) que contiene muchas veces (ej . , 67 veces) más antígeno que la composición de matriz capsular proteínica con tamaño de partícula seleccionado de esta invención.

Los tamaños de partículas deseados pueden ser fraccionados mediante cualquier medio apropiado, incluyendo la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) , seguido por el agrupamiento de las partículas de mayor tamaño y descartando las partículas de menor tamaño. Alternativamente, el uso de membranas de filtro con cortes de peso molecular bien elegido, podrían ser usados para remover las partículas de menor tamaño mientras que retiene las partículas del tamaño deseado. La eliminación de especies de menor peso molecular (ej . , especies < 100 nm de diámetro) o la selección de los tamaños de partícula de matriz proteínica de la composición para incluir tamaños de partículas mayores a al menos 100 nm de diámetro, puede lograrse por cualquier medio conocido en la materia, por ejemplo, cromatografía, incluyendo la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) , cromatografía de filtración de gel, o cromatografía de permeabilidad de gel. Las técnicas de electrofóresis de gel también podrían usarse.

Los métodos para hacer vacunas aquí descritos, no resultan en la modificación extensiva del antígeno de interés, ej . , un polímero capsular. El antígeno generalmente permanece en el mismo estado con una posible modificación siendo, ej . , la reducción de azúcares reductoras para las cápsulas de PS que transportan dichos grupos al final de las cadenas de polímeros. Dichas modificaciones menores es poco probable que afecten la inmunogenicidad de la mayoría de los PS capsulares debido a que las azúcares terminales son de 100-10000 veces menor abundantes que los residuos internos en el polímero. En contraste, para las vacunas conjugadas convencionales, usualmente es necesario introducir grupos vinculantes al antígeno, ej . , un polímero capsular, que sirve como el punto de fijación covalente de la proteína transportadora. Los vinculantes necesitan ser usados debido a que muchos antígenos, ej . , polímeros capsulares, no tienen un grupo reactivo tal como un grupo carboxilo o amino como parte de su estructura. Por ejemplo, los grupos reactivos de introducción en un PS puede resultar en la destrucción de epítopes capsulares y la generación de epítópes novedosos que pueden ser indeseables en un producto de vacuna debido a su reactividad reticulada inmunológica desconocida con los auto-epítopes anfitriones.

Los métodos para hacer las vacunas aquí descritas son menos complejos que la tecnología de vacunas conjugada debido a que su química depende sólo en la química de reticulación de la proteína transportadora (ej., DNI , subunidad de toxina de cólera B, toxoide de difteria, toxoide tetánico o Fragmento C, o beta-galactosidasa de Escherichia coli) . Por ejemplo, mientras que el polímero capsular afecta la tasa de reticulación cuando está mezclado con DNI, no afecta el patrón o alcance de la reticulación que está regida más por la proteína usada, su concentración, y la concentración del agente reticulante (ej . , glutaraldehído) agregado. Estos parámetros pueden ser fácilmente ajustados, reduciendo así el tiempo y esfuerzo requeridos para hacer la vacuna, y ahorrar gastos.

Los métodos para hacer composiciones de PCMV aquí descritos, pueden usarse con cualquier antígeno, ej . , un polímero capsular o cualquier biopolímero con pocos, en caso de que haya, grupos amino, y cualquier proteína transportadora que pueda ser reticulada, ej . , proteínas transportadoras que no tienen epítopes críticos que puedan ser destruidos mediante reducción de borohidruro. Las proteínas transportadoras que pueden usarse en los métodos descritos aquí de manera deseable tienen al menos dos residuos de lisina u otros residuos que están desbloqueados y que pueden ser reticulados mediante modificación química. El toxoide tetánico es una proteína transportadora posible. Esta toxina se proporciona de manera no tóxica mediante tratamiento con formaldehido, un reagente que reacciona con grupos amino de proteínas . Otras proteínas transportadoras deseables incluyen la subunidad de la toxina del cólera B (disponible de SBL Vaccin AB) , toxoide de difteria o CRM197, toxoide tetánico o Fragmento C (Disponible de Sigma Aldrich) , DNI o betagalactosidasa de Escherichia Coli (disponible de Sigma Aldrich) .

Las vacunas conjugadas multivalentes actuales se hacen mediante síntesis de vacunas conjugadas individuales primero, seguidas por su mezcla para producir una vacuna conjugada de "coctel" (ej . , la vacuna contra el neumococo heptavalente de Wyeth, Prevnar®) . Los presentes métodos de la invención para hacer vacunas, pueden usarse para hacer vacunas multivalentes mediante la mezcla de antígenos químicamente diferentes, ej . , polímeros orgánicos capsulares, antes de reticular la proteína transportadora, ej . , con glutaraldehído u otro agente reticulante, o mediante la mezcla de vacunas específicas de la invención que fueron sintetizadas separadamente. Esta flexibilidad proporciona ventajas significativas sobre los métodos convencionales de manufactura de vacunas multivalentes .

Las vacunas ejemplares de la invención comentadas en los ejemplos llevados a cabo comparabíemente con las vacunas conjugadas a pesar del hecho de que estas vacunas fueron sintetizadas por un método que no se predice que genere ninguna unión covalente entre los átomos al hacer la molécula del antígeno y la proteína transportadora. El glutaraldehído reacciona exclusivamente con las cadenas laterales de amino de las proteínas tipificadas por el grupo de amino épsilon de residuos de lisina. Los antígenos de polisacárido contienen pocos grupos libres de amino (las cadenas laterales de amino son típicamente acetilatadas) para reaccionar con reticulantes de glutaraldehído o funcionales al aldehido (ej . , OCH-R-CHO, comentado como supra) , por lo tanto, dichos antígenos son apropiados para la formación de PCMV, en donde menos del 50% del antígeno está reticulado directamente a una proteína transportadora. Como se ve en los ejemplos más adelante, las respuestas inmunes generadas por PCMVs, que se comparan favorablemente para controles conjugados, indican que las moléculas de PS fueron molecularmente aprisionadas dentro de una matriz reticulada de moléculas proteínicas de DNI.

De acuerdo con un modelo no limitativo, el aprisionamiento actúa para transportar la composición de vacuna de matriz proteínica en las células B que unen dichas matrices y esto resulta en los péptidos derivados de proteínas transportadoras que son desplegados en moléculas MHC clase II de las células B correspondientes. Esto, en cambio, utiliza la ayuda de la célula T y por lo tanto lleva a la expansión y maduración de dichas células B para que se vuelvan plasma productor de IgG y células de memoria específicas para el antígeno. Por lo tanto, de acuerdo con el modelo no limitativo, los PCMVs trabajan como vacunas capsulares conjugadas de proteínas inmunológicamente, pero son diferentes ya que las PCMVs no tienen unión covalente relevante entre la proteína transportadora y los polímeros capsulares.

Las vacunas de la invención, incluyendo las PCMVs, pueden ser usadas en combinación, por ejemplo, en vacunas pediátricas. En adición, las vacunas de la invención pueden ser usadas para vacunar contra, por ejemplo, la infección por neumococo, infección por estreptococos (grupos A y B) , infección por Haemophilus influenzae tipo B ("HiB"), infección por meningococo (ej . , Neisseria meningitides) , y puede ser usada como vacunas de antígeno O de bacteria Gram negativa (ej . , Pseudomonas aeruginosa, Francisella tularensis (Thirumalapura et al., J. Med. Microbiol. 54:693-695, 2005; Vinogradov and Perry, Carbohidr. Res. 339:1643-1648, 2004; Vinogradov et al., Carbohidr. Res. 214:289-297, 1991), especies Shigella, especies Salmonella, especies Acinetobacter, especies Burkholderia, y Escherichia coli.

Las vacunas de la invención pueden hacerse usando cualquier vinculante, tales como, ej . , aquellas aquí descritas, para reticular cualquier proteína transportadora, tal como, e , aquellas aquí descritas, en la presencia de uno o más antígenos de interés, tales como, ej . , aquellos aquí descritos. Si se usa un antígeno de interés, la vacuna de matriz proteínica de la invención, se dice que es monovalente. Si más de un antígeno de interés se usa, la vacuna de matriz proteínica de la invención se dice que es multivalente . Si un polímero capsular microbiano o polisacárido es el antígeno de interés, la vacuna de matriz proteínica de la invención, se dice que es una vacuna de matriz capsular proteínica (PCMV) .

Vinculantes Los agentes reticulantes útiles para reticular las proteínas transportadoras son bien conocidos en la materia e incluyen glutaraldehído, ester de m-maleimidobenzoilo-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida y benzidina bis-biazotizada .

Los métodos generales y las fracciones para reticular directamente las proteínas transportadoras, usando un vinculante homobifuncional o heterobifuncional se describen, por ejemplo, por G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1996), y Dick y Beurret, "Glicoconjugates of Bacterial Carbohidrate Antigens", en Conjúgate Vaccines (Cruse and Lewis, eds), Contrib. Microbial . Imunol. Basel, Karger, 1989, vol. 10, pp 48-114). Por ejemplo, con una proteína transportadora que posee n números de fracciones de lisina, existen, teoréticamente, n+1 aminas primarias (incluyendo la amina terminal) disponible para su reacción con un grupo carboxílico de reticulante ejemplar. Por lo tanto, el uso de este procedimiento de conjugación directa, el producto está limitado a tener formadas uniones de n+1 amida.

El vinculante empleado en modalidades deseadas de la presente invención es, en su forma más simple, una unión que conecta dos proteínas transportadoras . El vinculante puede ser, un esqueleto molecular lineal, cíclico o ramificado, con grupos colgantes que se unen covalentemente a dos proteínas transportadoras, (A) y (B) . Cualquier proteína transportadora dada puede estar vinculada a más de una proteína transportadora, de tal forma que una matriz de proteínas transportadoras interconectadas se crea, en la que un antígeno de interés puede ser aprisionado.

El término "grupo de vinculación" se refiere a la unión covalente que resulta de la combinación de fracciones reactivas del vinculante (L) con grupos funcionales de (A) o (B) . Ejemplos de grupos de vinculación incluyen, sin limitación, ester, carbamato, tioéster, imina, disulfuro, amida, éter, tioéter, sulfonamida, isourea, isotiourea, imidoester, amidina, fosforamidato, fosfodiéster, tioéter e hidrazona .

La vinculación de (A) con (B) se logra mediante medios covalentes, involucrando la formación por unión (grupo de vinculación) con uno o más grupos funcionales localizados en (A) y (B) . Ejemplos de grupos funcionales reactivos que pueden ser usados para este fin incluyen, sin limitación, grupos amino, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilo, carbonilo, tioéteres, guanidinilo, imidazolilo, y fenólicos, los cuales están presentes en los amino ácidos de ocurrencia natural en muchas proteínas transportadoras .

La vinculación covalente de (A) con (B) puede, por lo tanto, ser efectuada usando un vinculante (L) que contiene fracciones reactivas capaces de reaccionar con dichos grupos funcionales presentes en (A) y (B) . El producto de esta reacción es un grupo de vinculación que contiene las uniones nuevas formadas que vinculan (L) con (A) y (L) con (B) . Por ejemplo, un grupo hidroxilo de (A) puede reaccionar con un grupo ácido carboxílico de (L) , o su derivado activado, vide infra, resultando en la formación de un grupo de vinculación de ester.

Ejemplos de fracciones capaces de reaccionar con grupos sulfhidrilos incluyen compuestos de cr-haloacetilo del tipo XCH2CO- (en donde X = Br, Cl o I) , que muestran reactividad particular para los grupos sulfhidrilos, pero que también pueden ser usados para modificar grupos de imidazolilo, tioéter, fenol y amino, como se describe por, por ejemplo, Gurd, Methods Enzymol . , 11:532, 1967. Los derivados de N-maleimida también se consideran selectivos hacia los grupos de sulfhidrilo, pero pueden ser adicionalmente útiles en el acoplamiento de grupos amino bajo ciertas condiciones. Los reagentes tales como 2-iminotiolano (Traut et al., Biochemistry, 12:3266, 1973), que introducen un grupo tiolo mediante la conversión de un grupo amino, pueden considerarse como reagentes de sulfhidrilo si la vinculación sucede a través de la formación de puentes de disulfuro.

Ejemplos de fracciones reactivas capaces de reaccionar con grupos amino incluyen, por ejemplo, agentes alquilantes y acilantes. Los agentes alquilantes representativos incluyen: (i) compuestos de a-haloacetilo, que muestran especificidad hacia los grupos amino en la ausencia de grupos de tiolo reactivos y son del tipo de XCH2CO (en donde X =¦ Cl, Br o D, como se describió por, por ejemplo, Wong {Biochemistry, 24:5337, 1979)); (ii) derivados de N-maleimida, que pueden reaccionar con grupos amino ya sea mediante una reacción de tipo Michael o mediante acilación por adición al grupo de anillo carbonilo como se describió por, por ejemplo, Smyth et al. (J. Am. Chem. Soc, 82:4600, 1960 y Biochem. J., 91:589, 1964); (iii) hálidos arilos tales como compuestos nitroariloaromáticos reactivos; (iv) hálidos alquilo, como se describió por, por ejemplo, McKenzy et al., (J". Protein Che ., 91:589, 1964); (v) aldehidos y cetonas capaces de la formación base de Schiff con grupos amino, los aductos formados generalmente siendo estabilizados mediante reducción para arrojar una amida estable.; (vi) derivados de epóxido tales como epiclorohidrina y bisoxiranos, que pueden reaccionar con grupos amino, sulfhidrilo o fenólicos hidroxilo ; (vii) derivados que contienen cloro de s-triazinas, que son muy reactivos hacia los nucleófilos tale como grupos amino, sulfhidrilo e hidroxilo; (viii) aziridinas con base en compuestos de s-triazina detallados anteriormente como se describió por, por ejemplo, Ross (<J. ,.???. Cáncer Res., 2:1, 1954), que reacciona con nucleófilos tales como grupos amino mediante apertura anular; (ix) esteres dietilo ácidos escuáricos como lo describió, por ejemplo, Tietza (Che . Ber. , 124:1215, 1991); y (x) éteres a-haloalquilo, que son agentes alquilantes más reactivos que los hálidos alquilos normales, debido a la activación provocada por el átomo de oxígeno éter, como lo describió, por ejemplo, Benneche et al. (Eur. J. Med. Chem. , 28:463, 1993) .

Los agentes acilantes amino-reactivos representativos incluyen: (i) isocianatos e isotiocianatos , particularmente derivados aromáticos, que forman derivados de urea y tiourea estables, respectivamente; (ii) cloruros de sulfonilo, que han sido descritos por, por ejemplo, Herzig et al. (Biopolímeros, 2:349, 1964). (iii) hálidos ácidos; (iv) esteres activos tales como nitrofeniloesteres o esteres N-hidroxisuccinimidilo; (v) anhídridos ácidos tales como nitrofeniloesteres o esteres N-hidroxisuccinimidilo; (vi) otros reagentes útiles para la formación de unión de amidas como lo describe, por ejemplo, M. Bodansky (Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, 1984) ; (vii) acilazidas, ej . , en donde el grupo de azida se genera de un derivado de hidrazida preformado usando nitrito sódico, como lo describió, por ejemplo, Wetz et al., (Anal. Biochem., 58:347, 1974); y (viii) imidoesteres , que forman amidinas estables con la reacción con los grupos de amino como lo describió, por ejemplo, Hunter y Ludwig (J. Am. Chem. Soc, 84: 3491, 1962) .

Los aldehidos tales como, ej . , glutaraldehído y cetonas , pueden ser reaccionados con aminos para formar bases de Schiff, que pueden ser ventajosamente estabilizadas mediante aminación reductiva. Las fracciones de alcoxilamino fácilmente reaccionan con cetonas y aldehidos para producir alcoxiaminas estables como lo describió, por ejemplo, Webb et al. {Bioconjugate Chem., 1:96, 1990) .

Ejemplos de fracciones reactivas capaces de reaccionar con grupos carboxilo incluyen compuestos de diazo tales como esteres de diazoacetato y diazoacetamidas , que reaccionan con alta especificidad para generar grupos esteres como lo describió, por ejemplo, Herriot (Adv. Protein Chem., 3:169, 1947). Los reagentes modificantes de ácido carboxílico tales como carbodiimidas , que reaccionan mediante la formación de O-acilurea seguida por formación de unión de amida, también pueden ser usadas.

Los grupos funcionales en (A) y/o (B) pueden, si se desea, ser convertidos a otros grupos funcionales antes de la reacción, por ejemplo, para conferir reactividad adicional o selectividad. Ejemplos de métodos útiles para este fin incluyen la conversión de aminas a ácidos carboxilicos usando reagentes tales como anhídridos dicarbocíclicos ; la conversión de aminas a tiolos usando reagentes tales como tiolactona de N-acetilhomocisteína, anhídrido S-acetilmercaptosuccínico, 2-iminotiolano o derivados de succinimidilo que contienen tiolo; conversión de tiolos a ácidos carboxilicos usando reagentes tales como alfa-haloacetatos ; conversión de tiolos a aminas usando reagentes tales como etilenimina o 2-bromoetilamina; conversión de ácidos carboxilicos a aminas usando reagentes tales como carbodiimidas seguida por diaminas; y conversión de alcoholes a tioles usando reagentes tales como cloruro de tosilo seguido por la transesterificación con tioacetato e hidrólisis al tiolo con acetato sódico.

Los tan llamados vinculantes de longitud cero, involucrando la unión covalente directa de un grupo químico reactivo de (A) con un grupo químico reactivo de (B) sin introducir material vinculante adicional pueden, si lo desean, ser usados de acuerdo con la invención. Los ejemplos incluyen compuestos en los que (L) representa una unión química que vincula un átomo de oxígeno de (A) a una fracción de carbonilo o tiocarbonilo presente en (B) , de forma tal que el grupo vinculante es un ester o tioéster. Por ejemplo, un grupo amino (A) puede ser vinculado a un grupo carboxilo (B) usando química de carbodiimida arrojando A-L-B, en donde L es una unión de amida o RC(:0) vinculada a N-RR en donde R es la cadena de carbono derivada de las cadenas laterales de amino ácido de la misma o dos moléculas proteínicas diferentes. Más' comúnmente, sin embargo, el vinculante incluye dos o más fracciones reactivas, como se describe arriba, conectadas por un elemento espaciador. La presencia de un espaciador permite que os vinculantes bi funcionales reacciones con grupos funcionales específicos dentro de (A) y (B) , resultando en un vínculo covalente entre estos dos compuestos. Las fracciones reactivas en un vinculante (L) pueden ser las mismas (vinculante homobifuncional ) o diferentes (vinculante heterobifuncional , o, en donde están presentes diversas fracciones reactivas disímiles, vinculante heteromultifuncional ) , proporcionando una diversidad de reagentes potenciales que pueden provocar fijación covalente entre (A) y (B) .

Los elementos espaciadores típicamente consisten de cadenas que separan efectivamente (A) y (B) mediante un alquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos de carbono, un heteroalquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos, un alqueno lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un alquino lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un residuo aromático de 5 a 10 átomos de carbono, un sistema cíclico de 3 a 10 átomos, o - (CH2CH20) nCH2CH2- , en donde n es 1 a 4.

La naturaleza de material extrínseco introducida por el agente vinculante puede tener una repercusión sobre la farmacocinética y/o actividad del producto de vacuna final. Por lo tanto, puede ser deseable introducir vinculantes clivables, que contienen brazos espaciadores que son biodegradables o químicamente sensibles o que incorporan sitios de clivaje enzimático.

Estos vinculantes clivables, como se describe, por ejemplo, en la Publicación de PCT WO 92/17436 (incorporada aquí mediante referencia) , son fácilmente biodegradados in vivo. En algunos casos, los grupos de vinculación son clivados en la presencia de esterasas, pero son estables en la ausencia de dichas enzimas. (A) y (B) pueden, por lo tanto, ser venta osamente vinculados para permitir su lenta liberación por las enzimas activas cerca del sitio de la enfermedad.

Los vinculantes pueden formar grupos de vinculación con grupos de diéster biodegradable, diamida, o dicarbamato de la fórmula: - (Z1) 0- (Y1) u- (Z2) s- (R11) - (Z3 ) t- (Y2)V-(Z )P- en donde cada uno de Z1, Z2, Z3 y Z4 es independientemente seleccionado de O, S y NRi2 (en donde Ri2 es hidrógeno o un grupo alquilo) ; cada uno de Y1 y Y2 es independientemente seleccionado de un grupo carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo, fosforilo o grupo de formación ácida similar; o, p, s, t u y v son cada uno independientemente 0 ó 1; y Rn es un alquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos de carbono, un heteroalquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos, un alqueno lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un alquino lineal o ramificado de 2 a 1-0 átomos de carbono, un residuo aromático de 5 a 10 átomos de carbono, un sistema cíclico de 3 a 10 átomos, - (CH2CH20) qCH2CH2- en donde 1 es 1 a 4, o una unión química que vincula - ( Z1 ) c- ( Y1 ) u- ( Z2) s- (Rn) - ( Z3 ) t-(Y2)v-(Z )P-.

Los vinculantes deseables ejemplares (L) usados en la presente invención, pueden ser descritos por cualquiera de las fórmulas I-II: -C:0-Ri3-C:0- I -C:0-NH-R13-NH-C:0 II en donde el vinculante está covalentemente fijado tanto a un átomo de oxígeno (A) como a un átomo de oxígeno de (B) . De conformidad, el vinculante (L) de las fórmulas I-II está fijado a proteínas transportadoras (A) y (B) mediante grupos de vinculación de dipirano, es er o carbamato. En estas modalidades, Ri3 representa un alquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos de carbono, un heteroalquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos, un alqueno lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un alquino lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un residuo aromático de 5 a 10 átomos de carbono, un sistema cíclico de 3 a 10 átomos, - (CH2CH20) nCH2CH2- en donde n es 1 a 4, o una unión química que vincula dos nitrógenos o dos carbonilos .

Los vinculantes diseñados para formar vínculos de hidrazona tienen la fórmula química III : -(Y3)-(Z5)W-R14-C(:x4)-Ri5 III en donde Z5 se selecciona de O, S o NRi6; Ri6 es hidrógeno o grupo alquilo; Ri5 se selecciona de hidrógeno, un alquilo, o un heteroalquilo; Y3 se selecciona de un grupo carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo, fosforilo o un grupo de formación de ácido similar covalentemente unido a un átomo de oxígeno de (A); w es 0 ó 1; Ri4 es un alquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos de carbono, un heteroalquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos, un alqueno lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un alquino lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un residuo aromático de 5 a 10 átomos de carbono, un sistema cíclico de 3 a 10 átomos, - (CH2CH20)nCH2CH2- , en el que n es 1 a 4, o un vinculante de unión química -(Y3)-(Z5)W- a, y X4 es una hidrazona resultante de la reacción de condensación de (B) conteniendo un grupo de hidrazida y el precursor al vinculante II, en el que X4 es el átomo de oxígeno de un grupo de cetona o aldehido.

Proteínas Transportadoras En general, cualquier proteína transportadora que puede aprisionar un antígeno bajo condiciones fisiológicas puede ser usada en la presente invención. Deseablemente, el antígeno es aprisionado en un complejo con proteína transportadora vinculada en la ausencia de unión covalente significativa entre el antígeno y la proteína transportadora. La ausencia de unión covalente significativa, se refiere a no más de un 50% del antígeno que está siendo covalentemente unido a una proteína transportadora. En modalidades deseables, no más de un 40%, 30%, 10% ó 5% del antígeno está covalentemente unido a una proteína transportadora. El antígeno/ complejo proteínico puede contener otro compuesto, tal como alumbre, y este otro compuesto, en modalidades deseable, pueden aprisionar el antígeno y la proteína transportadora.

Las proteínas transportadoras usadas en las vacunas de la invención deseablemente son proteínas que, ya sea solas o en combinación con un antígeno, provocan una respuesta inmune en un sujeto. Deseablemente, la proteína transportadora contiene múltiples epítopes restringidos de MCH clase II, reconocidos por una célula T ayudante. Deseablemente, los epítopes son capaces de inducir una respuesta de célula Th en un sujeto, e inducir a las celular B a que produzcan anticuerpos contra todo el antígeno de interés. Los epítopes usados como se describe en esta invención, incluyen cualquier determinante sobre un antígeno que es responsable de su interacción específica con una molécula de anticuerpo o su fragmento. Los determinantes epitópicos usualmente consisten de agrupaciones de superficie activas químicamente de moléculas tales como amino ácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Para tener propiedades inmunogénicas , una proteína o polipéptido generalmente es capaz de estimular las células T. Sin embargo, una proteína transportadora que carece de un epítope reconocida por una célula T, puede ser también inmunogénica .

Al seleccionar una proteína transportadora que se conoce por provocar una respuesta inmune fuerte (ej., es altamente inmunogénica), una población diversa de sujetos puede ser tratada mediante una composición de vacuna de matriz proteínica aguí descrita. La proteína transportadora deseablemente es suficientemente foránea para provocar una fuerte respuesta inmune a la vacuna. Típicamente, la proteína transportadora usada es una molécula que es capaz de impartir inmunogenicidad al antígeno de interés. En una modalidad deseable, una proteína transportadora es una que es inherentemente altamente inmunogénica . Por lo tanto, una proteína transportadora que tiene un alto grado de inmunogenicidad y es capaz de maximizar la producción de anticuerpos al (los) antígeno (s) que puede(n) hacer complejo con la misma, es deseable.

Varias proteínas transportadoras de la invención incluyen, ej . , toxinas y toxoides (químicos o genéticos), que pueden ser o no mutantes, tales como la toxina del ántrax, PA y DNI ( PharmAthene , Inc.), toxoide de difteria (Massachusetts State Biological LAbs ; Serum Institute of India, Ltd.) o CRM197, toxina del tétanos, toxoide tetánico (Massachusetts State Biological LAbs; Serum Institute of India, Ltd.), fragmento Z de toxina de tétanos, exotoxina A o mutantes de la exotoxina A del Pseudomonas aeruginosa, flagelina bacteriana, neumolisina, una proteína de membrana externa de Neisseria meningitidis (cepa disponible del ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, Va.)), proteína Hcpl de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli, toxina tipo shiga, proteína humana LTB, un extracto proteínico de células bacterianas totales, y cualquier otra proteína que pueda ser reticulada por un vinculante. Deseablemente, la proteína transportadora es la subunidad B de la toxina del cólera (disponible de SBL Vaccin AB) , toxoide de difteria o CRM197 (Connaught, Inc.), toxoide tetánico o Fragmento C (disponible de Sigma Aldrich) , DNI o bet-galactosidasa del E. Coli (disponible de Sigma Aldrich) . Otras proteínas transportadoras deseables incluyen albúmina de suero bovino (BSA) , P40, y riboflavina de pollo. (A menos que se indique lo contrario, las proteínas transportadoras ejemplares están comercialmente disponibles de Sigma Aldrich) . Otras proteínas transportadoras ejemplares son los . APs (péptidos multi-antigénicos) , que son péptidos ramificados. Mediante el uso de un MAP, la densidad reticulante se maximiza debido a los múltiples residuos de amino ácidos ramificados. Un residuo de amino ácido deseable para fines de reticulación, que pueden ser usados para formar un MAP, es, pero no está limitado a, lisina, que tiene un grupo libre de amino ácidos en su cadena lateral.

Tanto el BSA como la hemocianina de lapa clave (KLH) han sido comúnmente usados como transportadores en el desarrollo de vacunas al experimentar con animales. Las proteínas transportadoras que han sido usadas en la preparación de vacunas terapéuticas incluyen, pero no están limitadas a, un número de toxinas de bacterias patogénicas y sus toxoides. Ejemplos incluyen toxinas de difteria y de tétanos, y sus toxoides correspondientes médicamente aceptables . Otros candidatos son proteínas antigénicamente similares a las toxinas bacterianas referidas como materiales de reacción cruzada (CRMs por sus siglas en inglés) . Las proteínas transportadoras útiles en la práctica de la invención también pueden incluir cualquier proteína no derivada de humanos y que no está presente en cualquier sustancia de alimento humano.

En modalidades deseadas de la invención, las proteínas que forman estructuras de tipo anular se usan para la producción de PCMV. Dichas proteínas incluyen la proteína Hcpl de Pseudomonas aeruginosa, las "subunidades B" no tóxicas de la toxina del cólera, la enterotoxina lábil al calor del Escherichia coli , y la toxina tipo shiga. Dichos complejos proteínicos de tipo anular pueden formar "perlas en cadena" en donde las cadenas de PS lineales penetran el canal central de estos complejos proteínicos con forma anular. Después de la reticulación proteínica, dichos complejos se prevé que serán particularmente estables. Los datos estructurales de las proteínas sugieren que estos canales centrales son lo suficientemente grandes para que las cadenas de PS ingresen fácilmente. Por ejemplo, el canal central del anillo Hcpl héxamérico es de 42 Angstroms, lo cual es suficientemente amplio para acomodar fácilmente diversas cadenas de polisacáridos de 5.5 Angstroms de ancho (Mougous et al., Science, 312 (5579) :1526-1530 (2006)). Alternativamente, los anillos proteínicos pueden ser ensamblados alrededor del PS (ej . , de subunidades de una proteína transportadora monomérica que se ensambla de manera natural a anillos bajo condiciones químicas físicas particulares). Dichas proteínas monoméricas que se pueden ensamblar en anillos se conocen en la materia e incluyen, por ejemplo, la pneumolisina (Walker et al., Jnvecfc. Immun. , 55(5):1184-1189 (1987); Kanclerski and Mollby, J. Clin. Microbiol., 25 (2) :222-225 (1987)), listeriolisina O (Kayal y Charbit, FEMS Microbiol. Rev., 30:514-529 (2006); engaud et al., Infect. Immun., 55 (12 ): 3225-3227 (1987)), DNI, ántrax PA, Hcpl, subunidad B de toxina de cólera, la subunidad B de toxina de shiga, y numerosas moléculas relacionadas conocidas en la materia y hechas por varios microorganismos .

En otra modalidad deseable, los agonistas de receptores tipo Toll (TLR) se usan como proteínas transportadoras. La activación de receptor tipo Toll (TLR) es importante para dar forma a la respuesta inmune adaptativa y puede jugar un papel en la maduración de afinidad de la respuesta de anticuerpo, cambio de isotipo, y memoria inmunológica . La flagelina (FLA) de Vibrio cholerae es un agonista de TLr. Más de 20 mgs de proteína de FLA han sido purificados de Escherichia coli recombinante y muestran ser un activador de TLR potente en un ensayo de inducción de macrófagos IL-6. En adición, una proteína de Streptococcus pneumoniae bien conservada llamada "neumolisina" , también ha demostrado activar el TLR4 y, adicionalmente, es un antígeno protector. Por lo tanto, esta proteína también puede ser usada como una proteína transportadora de matriz proteínica.

Además, las mezclas de proteína de membrana externa (OMP por sus siglas en inglés) (ej., las OMP de Neisseria meningitidis) se usan como la proteína transportadora para la vacuna conjugada de HIB producida por Merck, y los extractos proteínicos de las células bacterianas completas de Streptococcal pneumoniae han demostrado ser al menos parcialmente protectoras en modelos de infección animal. En modalidades deseables de la invención, estas mezclas proteínicas pueden ser usadas como proteínas transportadoras.

En una modalidad deseable, la composición de vacunas se hace usando una proteína transportadora que tiene, ej . , al menos dos residuos de lisina u otros residuos que están desbloqueados y que pueden ser reticulados mediante modificación química. En otras modalidades deseables, la proteína transportadora es un multímero (ej . , una que contiene al menos 5 subunidades ) .

En otra modalidad, el DNI se usa como la proteína transportadora debido a que no es tóxico, y no deja necesidad alguna para volverlo menos tóxico antes de su uso. Más aún, el uso del DNI es deseable debido a que el DNI también puede inducir una respuesta inmune protectora al B . anthracis, además de la respuesta inmune protectora provocada al antígeno de interés. También, el DNI no tiene uniones de disulfuro internas. Dichas uniones son susceptibles a la reducción de borohidruro, lo que podría desnaturalizar la proteína y resultar en la pérdida de epítopes que inducen el anticuerpo neutralizante de la toxina del ántrax.

Antígenos de Interés Las composiciones de vacuna de la invención y los métodos para hacer y administrar dichas vacunas pueden usarse para cualquier antígeno de interés, ej . , un polisacárido, polialcohol, o poli amino ácido. Deseablemente, el antígeno de interés no transporta grupos primarios que puedan ser destruidos por las reacciones químicas empleadas por el método de fabricación de vacunas, ej . , la desnaturalización de un antígeno causada por la destrucción de uniones de disulfuro de antígeno mediante lar educción de borohidruro. Los antígenos ejemplares de interés incluyen, pero no están limitados a polímeros orgánicos, tales como polisacáridos (e . , polisacáridos que tienen al menos 18 residuos), fosfopolisacáridos , polisacáridos con amino azúcares con sustituciones de N-acetilo, polisacáridos que contienen azúcares sulfonilatadas , otros azúcares modificados con sulfato, o azúcares modificados con fosfato, polialcoholes , poli amino ácidos, ácidos teicoicos, cadenas laterales 0 de lipopolisacáridos . Los antígenos ejemplares de interés también incluyen polímeros orgánicos capsulares incluyendo aquellos sintetizados por microbios, ej . , bacteria, hongos, parásitos, y virus, y después purificados para formar dicha fuente biológica usando métodos estándares. Antígenos ejemplares de interés incluyen polímeros orgánicos capsulares microbianos incluyendo aquellos purificados de organismos bacterianos tales como las especies Bacillus (incluyendo el B. anthtracis) (Wang and Lucas, Infect. Immun., 72 ( 9 ): 5460-5463 (2004)), Streptococcus pneumoniae (Bentley et al., PLoS Genet., 2(3):e31 (2006); Kolkman et al., J. Bichemistry, 123:937-945 (1998); y Kong et al., J". Med. Microbiol., 54:351-356 (2005)), Shigella (Zhao et al., Carbohydr. Res., 342 (9 ): 1275-1279 (2007)), Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi , Streptococcus pyogenes, Escherichia coli (Zhao et al., Carbohydr. Res., 342 (9 ): 1275-1279 (2007)), y Pseudomonas aeruginosa, y organismos de hongos tales como Cryptococcus y Candida, así como muchos otros microorganismos (ver, ej . , , Ovodov, Biochemistry (Mosc), 71 (9) :937-954 (2006); Lee et al., Adv. Exp. Med. Biol . , 491:453-471 (2001); y Lee, Mol. Immunol . , 24 (10 ): 1005-1019 (1987)). Los antígenos ejemplares de interés también incluyen polímeros que no son de ocurrencia natural y por lo tanto no tienen origen no biológico.

Los antígenos particulares de Streptococcus pneumoniae incluyen polisacárido capsular tipo 1 (ej . , 1-g o 1-q) , 2 (ej . , 2-g, 2-q, o 2-41A) , 3 (e . , 3-g, 3-q, 3-c, o 3-nz), 4, 5 (ej., 5-q, 5-c, 5-qap, o 5-g) , 6A (ej . , 6A-g, 6A-cl, 6A-c2, 6A-n, 6A-qap, 6A-6B-g, 6A-6B-q, o 6A-6B-s), 6B (ej . , 6B-c, 6A-6B-g, 6A-6B-q, o 6A-6B-S) , 7F (ej . , 7F-7A) , 7A (ej., 7A-cn o 7F-7A) , 7B (ej . , 7B-40), 7C (ej . , 7C-19C-24B) , 8 (ej., 8-g o 8-s), 9A (ej . , 9A-9V) , 9L, 9N, 9V (ej . , 9A-9V) , 9V y 14, 10F (ej . , lOF-q, lOF-ca, o 10F-10C) , 10A (ej., 10A-17A o 10A-23F) , 10B (ej . , 10B-10C) , 11F, 11A (ej., HA-nz o 11A-11D-18F) , 11B (ej . , 11B-11C) , 11C (ej . , 11B-11C. o HC-cn) , 11D (ej . , 11A-11D-18F) , 12F (ej . , 12F-q o 12F-12A-12B) , 12A (ej., 12A-cn, 12A-46, o 12F-12A-12B) , 12B (ej., 12F-12A-12B) , 13 (e . , 13-20), 14 (ej . , 14-g, 14-q, 14-v, o 14-c) , 15F (ej . , 15F-cnl o 15F-cn2), 15A (ej., 15A-cal, 15A-ca2, o 15A-chw) , 15B (e . , 15B-C, 15B-1BC, 15B-15C-22F-22A) , 15C (ej . , 15C-ca, 15C-ql, 15C-q2, 15C-q3, 15C-S, 15B-15C, o 15B-15C-22F-22A) , 16F (ej . , 16F-q O 16F-nz), 16A, 17F (e . , 17F-n y 17F-35B-35C-42 ) , 17A (ej . , 17A-ca O 10A-17A), 18F (ej., 18F-ca, 18F-W, o 11A-11D-18F) , 18A (ej., 18A-nz o 18A-g) , 18B (ej., 18B-18C) , 18C (ej . , 18B-18C) , 19F (ej., 19F-gl, 19F-g2, 19F-g3, 19F-q, 19F-n, o 19F-c) , 19A (ej., 19A-g, 19A-, O 19A-ca) , 19B, 19C (ej . , 19C-cnl, 19C-cn2, o 7C-19C-24B) , (ej . , 13-20), 21 (e . , 21-ca o 21-cn) , 22F (ej . , 15B-15C-22F-22A) , 23F (ej . , 23F-C, 10A-23F, o 23F-23A) , 23B (ej., 23B-C o 23B-q) , 24F (ej., 24F-cnl, 24F-cn2, o 24F-cn3), 24A, 24B (e . , 7C-19C-24B) , 25F (ej., 25F-38), 25A, 27, 28F (ej . , 28F-28A o 28F-cn) , 28A (ej., 28F-28A), 29 (ej . , 29-ca o 29-q) , 31, 32F (ej . , 32F-32A) , 32A (ej . , 32A-cn o 32F-32A) , 33F (ej . , 33F-g, 33F-q, 33F-chw, 33F-33B, o 33F-33A-35A) , 33A (ej . , 33F-33A-35A) , 33B (ej., 33B-q, 33B-S, o 33F-33B) , 33D, 34 (ej . , 34-ca o 34s) , 35F (ej., 35F-47F) , 35A (ej . , 33F-33A-35A) , 35B (ej., 17F-35B-35C-42) , 36, 37 (ej . , 37-g o 37-ca) , 38 (ej . , 25F-38), 39 (ej . , 39-cnl o 39-cn2), 40 (ej . , 7B-40), 41F (ej., 4lF-cn o 41F-s) , 41A (ej . , 2-41A) , 42 (ej . , 17B-35B-35C-42), 43, 44, 45, 46 (ej . , 46-s o 12A-46), 47F (ej . , 35F-47F), 47A, 48 (ej . , 48-cnl o 48-cn2), o Número de Acceso a GenBank AF532714 o AF532715.

Se hace mención particular a los polisacáridos de Streptococcus pneumoniae seleccionados del grupo que consiste del tipo capsular 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44, o 46.

Composiciones de Vacuna Las composiciones de vacuna de la invención, incluyendo los PCMVs, pueden ser usadas en combinación, por ejemplo, en vacunas pediátricas. En adición, las composiciones de vacuna de la invención pueden ser usadas para vacunar contra, por ejemplo, la infección por Pneumococcus, infección por Haemophilus influenzae tipo B ("HiB"), infección por Streptococcus (grupos A y B) , infección por meningococo (ej . , Neisseria meningitides) , y puede ser usada como vacunas de antígeno O de bacterias negativas a Gram {ej . , Pseudo onas aeruginosa, Francisella tularensis, especies Shigella, especies Salmonella, especies Acinetojacter, especies Burkholderia, y Escherichia coli) .

La formación de vacunas deseablemente incluye al menos una proteína transportadora, uno o más antígenos de interés, y un transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable (ej . , fosfato de aluminio, cloruro de sodio, agua estéril) . Una composición de vacuna también puede incluir un sistema adyuvante para mejorar la inmunogenicidad de la formulación, tal como aceite en un sistema de agua y otros sistemas conocidos en la materia u otros excipientes farmacéuticamente aceptables. Un transportador / complejo antígeno que es insoluble bajo condiciones fisiológicas, es deseable para liberar lentamente el antígeno después de su administración a un sujeto. Dicho complejo es deseablemente administrado en una suspensión que contiene excipientes farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, el transportador/complejo antígeno también puede ser soluble bajo condiciones fisiológicas.

Típicamente, la vacuna de matriz proteínica está en un volumen de alrededor de 0.5ml para inyección subcutánea, 0.5 mi para inyección intramuscular, 0.1 mi par inyección intradérmica, ó 0.002-0.02 mi para administración percutánea. Una dosis de 0.5 mi de la vacuna de matriz proteínica puede contener aproximadamente de 2-500 g del antígeno aprisionado con aproximadamente 2-500 ug de la proteína transportadora. En una modalidad deseable, en una dosis de 0.5 mi, aproximadamente 10 ug del antígeno son aprisionados con aproximadamente 10 ug de la proteína transportadora. La proporción molar del antígeno con la proteína transportadora, deseablemente está entre 1 a 10 (ej . , 1 parte de antígeno a 2 partes de transportador o 1 parte de antígeno a 3 partes de transportador, etc.) y de 10 a 1 (ej . , 3 partes de antígeno a 1 parte de transportador o 2 partes de antígeno a 1 parte de transportador, etc.) . En una modalidad deseable, la proporción molar del antígeno al transportador es de 1 a 1. Alternativamente, la proporción por peso seco del antígeno con la proteína transportadora, deseablemente está entre 1 a 10 y 10 a 1 (ej . , 1 a 1 por peso seco) .

Debido a que los péptidos o conjugados pueden ser degradados en el estómago, la vacuna es deseablemente administrada por vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal o intradérmica) . Mientras que la administración por un medio que penetra físicamente la capa dérmica es deseable (ej . , una aguja o abrasión) , las vacunas de la invención también pueden ser administradas mediante absorción transdérmica .

En particular, las vacunas de la invención pueden ser administradas a un sujeto, ej . , mediante inyección intramuscular, inyección intradérmica, o inmunización con los adyuvantes inmunes apropiados . Las vacunas de la invención pueden ser administradas, una o más veces, frecuentemente incluyendo una segunda administración diseñada para acelerar la producción de anticuerpos en un sujeto para evitar la infección por un agente infeccioso correspondiente al antígeno incluido en la vacuna. La frecuencia y cantidad de la dosis de la vacuna para obtener la respuesta inmune deseada o el nivel de inmunidad, depende.de la actividad específica de la vacuna, y puede ser fácilmente determinada por la experimentación de rutina. Por ejemplo, para un infante, un calendario de vacunación puede ser tres dosis de 0.5 mi cada una con intervalos de aproximadamente cuatro a ocho semanas (iniciando a los dos meses de edad) seguida por una cuarta dosis de 0.5 mi a aproximadamente doce a quince meses de edad. Una quinta dosis entre los cuatro y seis años de edad puede ser deseable para algunas vacunas.

Mientras que la edad a la que la primera dosis se administra generalmente es a los dos meses, una vacuna puede ser administrada a infantes tan jóvenes como 6 semanas de edad. Para los adultos, dos o más dosis de 0.5 mi dadas en intervalos de 2 a 8 semanas, generalmente son suficientes para proporcionar protección a largo plazo. Una dosis aceleradora es dada deseablemente cada diez años a los adultos previamente inmunizados y los niños de más de once años de edad.

Las formulaciones pueden presentarse en contenedores de unidad de dosis o muíti dosis, por ejemplo, ampolletas y frascos sellados pueden ser almacenados en una condición de congelado seco (liofilizado) que requiere únicamente la adición del transportador estéril de líquido inmediatamente antes del uso. Las vacunas de la invención pueden ser formuladas en vehículos farmacológicamente aceptables, ej . , gel de hidróxido de alumbre, preparación adyuvante, o salina, y después administrada, ej . , mediante inyección intramuscular, inyección intradérmica, o inmunización transcutánea con los adyuvantes inmunes apropiados .

La invención también incluye juegos que incluyen una vacuna aquí descrita (ej . , una PCMV) . Los juegos de la invención también pueden incluir instrucciones para, el uso de los juegos en los métodos de vacunación aquí descritos.

La eficacia del calendario de inmunización puede determinarse usando métodos estándar para la medición de la concentración de anticuerpos en el sujeto. En general, las concentraciones medias de anticuerpos (deseablemente concentraciones de IgG) de aproximadamente 1 ug/ml se consideran indicativas de protección a largo plazo.

La invención se describe más adelante por referencia a ejemplos específicos, modalidades y figuras, cuyo fin es el de ilustrar la invención y no limitar su alcance. Los siguientes ejemplos no deben considerarse como limitativos .

La invención proporciona composiciones de vacuna que contienen un antígeno de interés aprisionado con una matriz de proteína transportadora, los métodos para hacer dichas vacunas y los métodos de adminis ración de vacuna. Se ha descubierto que la inmunogenicidad de la composición, y por lo tanto su efectividad como vacunas, puede ser mejorada controlando o seleccionando el tamaño de partículas de la matriz de proteína transportadora.

Ejemplo 1: El efecto del tamaño de las partículas sobre una composición de vacuna matriz se investigó usando como un antígeno el polisacárido capsular de polisacárido de S. pneumoniae tipo 14 (PPS-14) y usando como proteína transportadora la forma de mutante negativo dominante (DNI) del antígeno protector de B . anthracis (PA) expresado de Escherichia coli como se describió por Benson et al. (Biochemistry, 37:3941-3948 (1998)).

El antígeno de polisacárido (PPS 14) y la proteína transportadora (DNI) se mezclaron a una proporción de peso de 1:1 y estuvieron presentes a 7.5 mg/ml por cada componente. La reticulación de la proteína transportadora de DNI se inició mediante la adición de glutaraldehído como un agente reticulante. Dos mezclas de reacción de reticulación se hicieron: una que tiene una concentración final de glutaraldehído de 0.05% y una que tiene una concentración final de glutaraldehído de 0.25%. La reacción de reticulación fue llevada a cabo en un volumen total de 0.5 mi mediante su incubación a 4°C durante 23 horas. En ese punto, el cianoborohidruro de sodio, que reduce las bases de Schiff, se agregó a una concentración de 20 mg/ml y la mezcla de reacción fue incubada durante una hora adicional .

Una porción de la mezcla de reacción de 0.25% de glutaraldehído fue aplicada a una columna de fraccionamiento de tamaño de gel de 25 mi de agarosa reticulada Sepharose® CL-2B (Sigma-Aldrich) para separar la composición de vacuna matriz de PPS 14:DNI con base en el tamaño de partícula. El fraccionamiento se llevó a cabo usando 10 mM de tampón de fosfato que contiene 150 mM de NaCl .

Dos grupos de partículas de vacuna matriz de PPS 14:DNI se aislaron para mayor evaluación. El primer grupo consistía de las 3 fracciones (fracciones de 1 mL) que contienen el volumen vacío (grupo 1) y un grupo de dos fracciones (grupo 2) que hace eluciónron de la columna entre el volumen vacío y la posición de la proteína monómero de DNI (83 kD) (ver, Figura 1) . El DNI hace elución alrededor de la posición de 24 mL en la Figura 1. El Grupo 1 y el Grupo 2 fueron investigados más mediante índice refractivo, cromatografía de dispersión de luz láser multi-ángulo (SEC-MALS-RI) . En el Grupo 1, el tamaño de partículas varió de 120 a 200 nm de diámetro; en el Grupo 2, el tamaño medio de partículas fue de 63 nm de diámetro. La composición de los grupos se muestra en la Tabla 1: Tabla 1 - Composición de los Grupo3 1 y 2, partículas de vacuna matriz de PPS 14: DNI Grupo DNI FPS 14 Proporción Dosis de Dosis de (ug/µ?) ( ? 1) DNI/FPS 14 PPS 14 PPS 14 (ug) en (ug) en 2ug de 5ug de DNI DNI 1 0.32 0.15 2.10 0.95 2.40 2 0.21 0.21 1.00 2.00 5.00 Las partículas más grandes de DNI en el Grupo 1 contenían mucho menos an ígeno (PPS 14) que las partículas más pequeñas del Grupo 2. Las partículas del Grupo 2 consistían de 86% de PPS 14 y 14% de proteína de DNI como se determinó por el software MALS (Astra, Wyatt Technologies) (datos no mostrados) . Las composiciones se probaron para confirmar que el antígeno de PPS 14 fuera aprisionado por la reacción de reticulación. Se prepararon cinco composiciones y se sujetaron a SDS-PAGE: Composiciones 1. Grupo 1 (2.4 ug de PPS 14: DNI, tamaño de partículas 200-120 nm) 2. Grupo 2 (5.0 ug de PPS 14: DNI, tamaño medio de partículas 63 nm) 3. Mezcla de reacción de PCMV total (reticulado, 0.25% de glutaraldehído, no fraccionado) 4. Mezcla de reacción de PCMV total (reticulado, 0.05 % de glutaraldehído, no fraccionado) 5. Control: DNI únicamente (reticulado) del Grupo 1 del Grupo 2.

Como se muestra en la Figura 2, las composiciones 1-4 mostraron reticulación extensiva de la proteína transportadora de DNI como se demostró por el intercambio de bandas a especies de mayor peso molecular en SDS-PAGE. La composición 4 (mezcla de reacción de PCMV total reticulada con 0.05% de glutaraldehído) mostró la reticulación del DNI pero demostró un rango más amplio de bandas que variaban de especies de menor peso molecular hasta bandas de mayor peso molecular {cf. Carriles para las Composiciones 1, 2 y 3).

Para confirmar que el antígeno PPS 14 permaneció asociado con la matriz reticulada de DNI, una prueba de ELISA de captura de DNI fue llevada a cabo, en la que las formulaciones de vacuna de PPS 14: DNI se les permitió unirse al anticuerpo de ratón inmovilizado de captura de anti-DNl (hecho en casa) durante 2 horas a temperatura ambiente. El material no unido fue lavado con PBS-0.5% Tween-20 (PBST) y anticuerpo de conejo anti-PPS 14 (Miravista Diagnostics) se usó para detectar polisacáridos que permanecían asociados con la proteína de matriz de DNI capturado. La inmovilización de las composiciones de matriz de DNI fue confirmada usando un anticuerpo anti-DNI de conejo (regalado por John Collier, Harvard Medical School) . El anti-PPSl4 de conejo o el anticuerpo anti-DNI de conejo se detectó mediante incubación con anticuerpo monoclonal anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma) y visualizado por la adición de sustrato de fosfato de p-nitrofenilo. En experimentos de control, una composición de únicamente PPS 14 (no asociado con DNI) y una composición de DNI reticulado (sin antígeno de polisacárido) a la que se agregó PPS 14 exógeno se llevaron a cabo simultáneamente en el ensayo. En el paso final de detección, no se observó PPS 14 en estos grupos de control (ver, Figura 3B) . En contraste, cuando se incubó el anticuerpo de captura anti-DNI con las composiciones de PCMV 1-4, el PPS 14 dentro de la matriz de DNI fue detectable por el anticuerpo de detección específico de PPS 14. Esto confirma que el antígeno de PPS 14 permanece asociado con la matriz de DNI reticulada .

La señal de detección (OD 405) en concentración en aumento de composición de prueba es trazada en las Figuras 3A (detección anti-DNI) y 3B (detección anti-PPS) . Refiriéndonos a la Figura 3B, el PCMV preparado con 0.05% de glutaraldehído (Composición 4) mostró una señal de detección más débil con el anticuerpo de detección de anti-PPS 14, lo que puede corresponder al rango más amplio de tamaños moleculares de especies en el gel de SDS-PAGE. Las composiciones del Grupo 1 y el Grupo 2 (Composiciones 1 y 2) y la mezcla de reacción de PCMV total reticulada con 0.25% de glutaraldehído (Composición 3) mostraron migración con especies de mayor peso molecular en el gel de SDS-PAGE (Figura 2). Estas muestras (Composiciones 1-3) también mostraron la detección más alta de PPS 14 en la prueba ELISA de captura (Figura 3-B) .

La inmunogenicidad de las formulaciones de PCMV se probó : Composiciones Inoculas 1. Grupo 1 + alumbre (2.4 pg PPS 2. Grupo 2 + alumbre (5.0 pg PPS 3. PCMV total (0.25% de glutaraldehído) + alumbre 4. PCMV total (0.05 % de glutaraldehído) + alumbre 5. Control : 5 pg de antígeno de PPS 14 solo (sin alumbre) Las composiciones inoculas de PCMV incluyendo un adyuvante de alumbre (170 ]ig de alumbre por dosis) fueron inyectadas (5 ]ig de DNI) en un volumen de 100 \iL por vía intraperitoneal en ratones usando el siguiente régimen de dosificación (ver Tabla 2, más adelante). Un grupo de control de ratones fue también inmunizado con 5 ug de antígeno de PPS 14 solo. Un grupo de ratones sin tratamiento, sin vacunar, fue también incluido como un grupo de control .

Las respuestas de IgG de suero específico anti-PPS 14 se ensayaron mediante ELISA de PPS 14 y se trazaron como concentraciones individuales y concentración geométrica media de punto final (GMT) . Como se ve en la Figura 4, la composición inocula 1 (fracciones del Grupo 1 adyuvadas por alumbre a 2.4 ug de PS) , teniendo tamaños de partículas de PCMV de PPS 14:DNI que varían de 200 nm a 120 nm de diámetro, sorprendentemente resultaron ser tan inmunogénicas o superiores a la composición inocula 2 (fracciones del grupo 2 adyuvadas por alumbre a 5.0 µg de PS) , teniendo un tamaño de partícula medio de PCMV de PPS 14:DNI de 63 nm de diámetro. La inmunogenicidad comparable de las partículas de PCMV de mayor tamaño, a la mitad de la dosis de antígeno aprisionada, en comparación con las fracciones del grupo 2 de menor tamaño, indica que el tamaño de la partícula de PCMV afecta la inmunogenicidad o potencia de la composición de vacunas.

El experimento fue repetido usando 2 ig del grupo 2 adyuvado por alumbre (0.95 ug de PPS 14), comparado con 2 \ig de PPS 14 solo. Como se muestra en la Figura 5, las concentraciones de anti-PPS 14 indican que la composición de vacunas de mayor tamaño de partículas (ej., Grupo 1, con tamaños de partículas que varían de 120 a 200 nm de diámetro) mostraron inmunogenicidad superior aún cuando la dosis de antígeno era de menos de la mitad del inoculo de antígeno únicamente (0.95 ug de PS vs . 2.0 ug de PS) .

Las concentraciones medias geométricas de punto final de las anteriores inmunizaciones se compararon (Tabla 3, siguiente) y trazaron (Figura 6).

*GMT 17 veces más alto comparado con el control en el día 38 (3 inmunizaciones en los días 0, 14, 28).

**GMT 127 veces más alto comparado con el control en el día 38 (3 inmunizaciones en los días 0, 14, 28).

Los resultados indican que las composiciones de vacuna de tamaño de partícula más grande fueron más inmunogénicos que los controles o la composición compuesta del grupo de tamaño de partícula pequeño, aún a dosis significativamente reducidas de antígeno (ej . , 0.95 µg PS vs . 2.4 ig PS & 5.0 ]ig PS en los dos experimentos) , indicando, además, que el tamaño de partículas de la proteína transportadora reticulada tiene un significado relevante en la respuesta inmune anfitriona con el antígeno transportado (aprisionado) .

Ejemplo 2 i Una composición de vacuna matriz se preparó usando como antígeno el antígeno Vi de polisacárido de Salmonella typhi (extraído de la cepa Ty2 serovar Typhi de Salmonella entérica) y usando como proteína transportadora la forma mutante negativa dominante (DNI) del antígeno protector de B. anthracis (PA) expresado del Escherichia coli, para hacer la vacuna de matriz capsular proteínica Vi:DNI (PCMV de Vi : DNI ) . El antígeno polisacárido (Vi) y la proteína transportadora (DNI) se mezclaron a una proporción de peso de 1:1 y estuvieron presentes en 7.5 mg/ml para cada componente. La reticulación de la proteína transportadora de DNI fue iniciada mediante la adición de glutaraldehído como un agente reticulante a una concentración final de glutaraldehído de 0.25%. La reacción reticulante fue llevada a cabo en un volumen total de 0.5 mi mediante la incubación a 4°C durante 23 horas. En ese momento, el cianoborohidruro de sodio, que reduce las bases de Schiff , fue añadido a una concentración de 20 mg/ml y la mezcla de reacción fue incubada una hora adicional . Una porción de la mezcla de reacción fue aplicada a una columna de fraccionamiento de tamaño de gel de agarosa reticulada de 25 mi Sepharose® CL-2B (Sigma-Aldrich) para separar la composición de vacuna de matriz de Vi:DNI con base en el tamaño de las partículas . El fraccionamiento fue llevado a cabo usando 10 mM de tampón de fosfato que contiene 150 rnM de NaCl . Cuatro grupos de fracciones que hicieron elución de PCMV de Vi:DNI fueron aislados para mayor evaluación. ( Ver, Figura 7 ) .

Los cuatro grupos fueron investigados aún más mediante dispersión dinámica de luz (DLS) . El tamaño de partículas para cada grupo de fracción se muestra por arriba del grupo correspondiente de la Figura 7. Para el Grupo 1, el tamaño de partículas se calculó a 179 nm. El tamaño de partículas en el Grupo 2 fue de 171 nm de diámetro. El tamaño de partículas en el Grupo 3 fue de 198 nm de diámetro, y el tamaño de partículas en el Grupo 4 se calculó a 185 nm de diámetro. La dispersión dinámica de luz proporciona el tamaño de los componentes más grandes en las fracciones agrupadas . Si no proporciona un rango de tamaño de partículas, tampoco proporciona una lectura sobre el porcentaje de partículas al tamaño más grande.

Las composiciones que comprenden los Grupos 1-4 se usaron para inmunizar los ratones de acuerdo con el siguiente protocolo.

Composiciones inoculas 1. Grupo 1 + alumbre 2. Grupo 2 + alumbre 3. Grupo 3 + alumbre 4. Grupo 4 + alumbre 5. Mezcla de reacción de PCMV total (sin fraccionar) + alumbre 6. Control: 10ug de antígeno de PS de i solo (sin alumbre) Las composiciones inoculas de PCMV incluyendo un adyuvante de alumbre (170 ug de alumbre por dosis) se inyectaron (10 ug por proteína en un volumen de ???µ? por vía intraperitoneal en los ratones que usan el siguiente régimen de dosis (ver Tabla 4 abajo) ) . Un grupo de control de ratones también fue inmunizado con 10ug de antígeno de polisacárido de Vi (PS de Vi) solo. Un grupo de ratones sin tratamiento, sin vacunar, también se incluyeron como un grupo de control .

Las respuestas de suero de IgG anti-Vi específico de PS se ensayaron mediante ELISA de Vi y se trazaron como concentraciones individuales y puntos finales GMT. Refiriéndonos a las figuras 8 y 9, los sueros de ratones inmunizados con la Composición 1 (Grupo 1, adyuvante de alumbre) y la Composición 2 (Grupo 2, adyuvante de alumbre) Vi:DNI PCMVs indicaron respuestas inmunes de IgG superiores anti-PS de Vi en comparación con los sueros de ratones inmunizados con la Composición 3 (Grupo 3, adyuvante de alumbre), Composición 4 (grupo 4, adyuvante de alumbre), o Composición 5 (PCMV total sin fraccionar, adyuvante de alumbre) . La Figura 9 y la Tabla 5 más adelante muestran las concentraciones medias geométricas superiores de los ratones inmunizados con el Grupo 1 o el Grupo 2 Vi: DNI PCMVs en comparación con los ratones inmunizados con el Grupo 3, Grupo 4 y no Vi-DNI PCMV no fraccionado, de las que los grupos fueron tomados .

Los tamaños de partículas son más grandes en los grupos 1 y 2 y pueden también aprisionar polisacárido de Vi más eficientemente que las partículas más pequeñas tales como aquellas en los grupos 3 y 4.

Ejemplo 3 Otro experimento más sobre una vacuna de matriz capsular proteínica de PPS 14:DNI de tamaño fraccionado fue llevado a cabo, siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 pero en una escala más grande. Un antigeno de polisacárido (PPS 14) y prote na transportadora (DNI) fueron mezcladas a una proporción de peso de 1:1 y estuvieron presentes a 7.5 mg/ml para cada componente. La reticulación de la proteína transportadora de DNI fue iniciada mediante la adición de glutaraldehído como un agente reticulante a una concentración final de glutaraldehído de 0.25%. La reacción de reticulación fue llevada a cabo en un volumen total de 1.5 mi al incubarla a 4°C durante 23 horas. En ese momento, el cianoborohidruro de sodio, que reduce las bases de Schiff, se agregó a una concentración de 20 mg/ml y la mezcla de reacción fue incubada una hora adicional.

Una porción de la mezcla de reacción de PPS 14-.DNI PCMV se aplicó una columna de fraccionamien o de tamaño de gel de 100 mi de agarosa reticulada Sepharose® CL-2B (Sigma-Aldrich) para separar la composición de vacuna matriz de PPS 14: DNI con base en el tamaño de partícula. El fraccionamiento se llevó a cabo usando 10 mM de tampón de fosfato que contiene 150 mM de NaCl .

Cuatro grupos de partículas de vacuna matriz de PPS 14: DNI se aislaron para mayor evaluación. Refiriéndonos a la Figura 10, las fracciones recolectadas se indican mediante líneas verticales cortas a lo largo del eje-x. El agrupamiento de fracciones se indica mediante sombreado.

La cantidad de antígeno de PPS presente en las fracciones fue determinada usando un ensayo de ácido fenol -sulfúrico para carbohidratos. La cantidad de DNI presente en las fracciones fue determinada mediante absorbencia de UV28o. La proporción de DNI a PPS 14 en las fracciones fue determinada. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Las fracciones se seleccionaron y agruparon para mayor investigación como sigue: Grupo 1 - fracciones 14, 15 - contenido de DNI 0.74 mg/ml.

Grupo 2 - fracción 16 - contenido de DNI 0.63 mg/ml Grupo 3 - fracciones 17, 18, 19 - contenido de DNI 0.31 mg/ml Grupo 4 - fracciones 32, 33, 34 - contenido de DNI 0.20 mg/ml La composición de antígeno y proteína transportadora de los grupos se muestra en la Tabla 7: La integridad de reticulación de las fracciones agrupadas de PPS 14: DNI PCMV y la composición del PCMV total, de la que las fracciones derivaron, se analizó mediante SDS-PAGE (4-12% gel Bis-Tris) y teñido azul de Coomassie (ver, Figura 11) . Como se muestra en la Figura 11, la fracción agrupada y la reacción de PCMV total mostraron reticulación extensiva de la proteína DNI, como se demostró por la falta de migración hacia el gél de apilamiento. La apariencia de un frotis por debajo del pocilio para la composición de PPS 14: DNI PCMV indica la presencia de especies de menor peso molecular en estas muestras .

Los grupos de fracción de PPS 14: DNI PCMV y composición de vacuna de matriz de PPS 14: PCMV total (sin fraccionar) se caracterizaron también usando ELISA de captura de DNI con sondas con suero anti-PPS 14 para determinar si el antígeno de PPS 14 permanece aprisionado y expuesto a la superficie (ver, Figura 13). Brevemente, a las formulaciones de vacuna se les permitió unir el anticuerpo de captura anti-DNl inmovilizado en soporte sólido. El material no unido fue lavado y se usó anticuerpo anti-PPS 14 de conejo policlonal (Miravista Diagnostics) se usó para detectar en antígeno PPS 14 que permaneció asociado con la proteína de matriz de DNI. Un anticuerpo de detección de anti-DNI de conejo fue usado para demostrar que las formulaciones de vacuna matriz fueron, de hecho, capturadas por el anticuerpo de captura de DNI .

El PPS 14 fue detectado en todos los grupos 1-4 de fraccionamiento de PCMV. De manera interesante, menos antígeno de PPS-14 fue detectado en el Grupo 4, sugiriendo que había menos PPS 14 en el aprisionamiento. Este resultado es consistente con el gel de SDS-PAGE que mostró evidencia de especies de menor peso molecular en el Grupo 4. A la concentración usada en la ELISA de captura, la señal del antígeno de PPS 14 para la composición de PCMV total fue tenue, sin embargo, la presencia de PPS 14 en la matriz transportadora fue claramente detectada cuando una concentración mayor de composición de PCMV total (sin fraccionar) fue incubada con el anticuerpo de captura de DNI (datos no mostrados) . En contraste, cuando se retículo el DNI con PPS 14 añadido exógenamente, fue incubado con el anticuerpo de captura de DNI, no hubo detección alguna por parte del anticuerpo de PPS 14, indicando la falta de aprisionamiento del PPS 14 exógeno por el DNI reticulado (Figura 13A, cuadrados abiertos (?) ) . Los grupos 1-4 y el control de DNI reticulado fueron unidos por el anticuerpo de captura de DNI (Figura 13B) . La composición de PCMV total fue también unida por el anticuerpo de captura de DNI y detectado con anticuerpo de detección de DNI cuando mayores concentraciones de composición de PCMV fueron incubadas con el anticuerpo de captura (datos no mostrados) . Por lo tanto, la ELISA de captura de DNI demostró que no hubo aprisionamiento relevante y localización de superficie de PPS 14 dentro de la matriz proteínica de DNI .

Las fracciones que comprenden los Grupos 1-4 del experimento se usaron para inmunizar a los ratones de acuerdo con el siguiente procedimiento. Las composiciones fueron preparadas a partir de las fracciones agrupadas y el PPS 14: DNI PCMV total, sin fraccionar, incluyendo adyuvante de alumbre se prepararon para estudios de inmunización.

Composiciones Inoculas Grupo 1 0.5 de Grupo 1 (vacío izquierdo) + alumbre (6) Grupo 2 2 ug de Grupo 1 (vacío izquierdo) + alumbre (6) Grupo 3 0.5 ug de Grupo 2 (vacío medio) + alumbre (6) Grupo 4 2 ug de Grupo 2 (vacío medio) + alumbre (6) Grupo 5 0.5 ug de Grupo 3 (vacío derecho) + alumbre (6) Grupo 6 2 g de Grupo 3 (vacío derecho) + alumbre (6) Grupo 7 0.5 ug de Grupo 4 (pico al final) + alumbre (6) Grupo 8 2 g de Grupo 4 (pico al final) + alumbre (5) Grupo 9 0.5 ug de Composición de PCMV total+ alumbre (6) Grupo 10 2 ug de Composición de PCMV total+ alumbre (5) Grupo 11 - control positivo: 0.5 ]ig de antígeno de PPS 14 solo (5) Grupo 12 - control positivo: 2 \ig de antígeno de PPS 14 solo (6) Grupo 13 - control comparativo: Prevnar® (vacuna conjugada heptavalente comercial) (5) Grupo 14 - control negativo: Sin tratamiento, sin vacunar (5) Las dosis anteriormente están listadas por cantidad de proteína transportadora (DNI).

La vacuna contra la neumonía Prevnar®, fabricada y comercializada por Wyeth (Madison, NJ, EUA) , es una vacuna conjugada convencional con adyuvante de alumbre que contiene 2 \xg de PPS 14 junto con otros seis antígenos de polisacáridos de S . pneumoniae , todos reticulados con un total de 20 ig de CR 197, como una proteína transportadora. Mediante el uso de la vacuna Prevnar® como una vacuna de control, las respuestas inmunes a PPS 14 provocadas por las vacunas de matriz capsular proteínica fraccionada por tamaños (PCMVs) fue directamente comparada con la respuesta específica de PPS-14 provocada por una vacuna conjugada convencional. Un grupo de ratones sin tratamiento también fue incluido como un grupo de control .

El calendario de inmunización está establecido en la Tabla 8 : Las respuestas de suero IgG específico de anti-PPS 14 se ensayaron mediante ELISA de PPS 14 y se trazaron como concentraciones individuales y GMT de punto final. {Ver, figura 12) .

Refiriéndonos a la Figura 13A, los sueros de ratones inmunizados con los Grupos 1-4 o el PCMV total mostraron respuestas IgG específicas de PPS 14 marcadamente más altas que los sueros de ratones inmunizados con PPS 14 únicamente a 0.5 \ig, particularmente los Grupos 1 y 2, que se determinó que contenían 0.03 \ig de PS y 0.06 \ig de antígeno de PS, respectivamente. La Figura 13A muestra la respuesta IgG específica anti-PPS 14 siguiendo la inmunización con los Grupos 1-4 y el PCMV total con 0.5 µg de DNI; la Figura 13B muestra la respuesta IgG específica anti-PPS 14 siguiendo la inmunización con los grupos 1-4 y el PCMV total con 2.0 pg de DNI. Las concentraciones de IgG específicas de PPS-14 incrementó con el tiempo en los sueros de ratones inmunizados con los Grupos 1-4 o PCMV total en relación con los sueros de ratones inmunizados con 0.5 ug de PPS14 por sí solo.

La Figura 14 ilustra las concentraciones de punto final anti-PPS 14 en el Día 38 (muestra sanguínea #3) para las inmunizaciones a 0.5 ig de DNI, y las concentraciones medias geométricas del Día 38 se muestran en la Tabla 9, en seguida : Es importante notar las concentraciones de antígeno de anti-PPS 14 logradas por la inmunización con las fracciones de vacuna matriz comparadas con la inmunización usando el antígeno solo. Los resultados confirman la ventaja en términos de inmunogenicidad logrados al aprisionar el antigeno en un transportador de proteína reticulado.

Las fracciones que tienen las partículas de DNI más grandes (Grupos 1-3) mostraron significativamente mayor inmunogenicidad que el antígeno solo o hasta el Grupo 4 (caracterizado por partículas de proteína transportadora de DNI de menor peso molecular en comparación con los grupos 1-3) o la composición de vacuna de PPS 14 total: DNI (que contienen todos los rangos de tamaños de partículas) . Estos resultados son especialmente sorprendentes cuando se considera que el contenido de las composiciones de antígeno aprisionado del Grupo 1, 2 y 3 fue de 3-17 veces más bajo que otras composiciones de PCMV (Grupo 4 y PCMV total) y el control de sólo antígeno de PS .

En comparación con la vacuna Prevnar® convencional, los Grupos 1 y 2, que contenían partículas de proteína transportadora de mayor tamaño, provocaron respuestas anti-PPS 14 comparables. Esta respuesta de anti-PPS 14 comparable es notable dado que la dosis real de antígeno de PPS 14 administrada para los Grupos 1 y 2 de PCMV fue relevantemente menor que la dosis de PPS 14 contenida en Prevnar®: alrededor de 66 veces menos que el antígeno de PPS 14 en la dosis del Grupo 1 en comparación con la dosis de Prevnar®, y alrededor de 33 veces menos de antígeno de PPS 14 para la dosis del grupo 2, en comparación con la dosis de Prevnar®.

La Figura 15 ilustra concentraciones de punto final de anti-PPS 14 en el Día 38 (muestra sanguínea # 3) para las inmunizaciones a 2 ig de DNI, y las concentraciones medias geométricas del Día 38 se muestran en la Tabla 10, siguiente.

Nuevamente, las concentraciones de antígeno anti-PPS 14 logradas mediante la inmunización con las fracciones de vacuna de matriz fueron superiores a aquellas logradas por la inmunización usando el antígeno solo. Los resultados confirman la ventaja en términos de inmunogenicidad logradas al aprisionar el antígeno en un transportador de proteína reticulado.

Las fracciones que tienen las partículas de DNI reticuladas más grandes (Grupos 1-3, ver Fig. 11) mostraron inmunogenicidad significativamente mayor al antígeno por sí solo o hasta el Grupo 4 (caracterizado por partículas de proteína transportadora de DNI de menor peso molecular en comparación con los Grupos 1-3) o la composición de vacuna de PPS 14: DNI total (que contiene todos los rangos de tamaño de partículas). Estos resultados son especialmente sorprendentes cuando se considera que el contenido de antígeno aprisionado de las composiciones de los Grupos 1, 2 y 3 fue de 3.7-16.7 más bajo que las otras composiciones de PCMV (Grupo 4 y PCMV total) y el control de solo antígeno de PS .

Los Grupos 1, 2 y 3, que contenían partículas transportadoras de DNI reticuladas de mayor tamaño, provocaron respuestas anti-PPS 14 en el mismo orden que con la vacuna convencional Prevnar®. Esta respuesta anti-PPS 14 comparable es notable, dado que la dosis real de antígeno de PPS 14 administrada en los Grupos 1, 2 y 3 de PCMV fue relativamente menor que la dosis de PPS 14 contenida en las inyecciones de Prevnar®: alrededor de 17 veces menos PPS 14 para el Grupo 1, alrededor de 9 veces menos PPS 14 para el Grupo 2, y alrededor de 4 veces menos PPS 14 para el Grupo 3.

Refiriéndonos nuevamente a la Figura 15, las concentraciones colectivas de IgG específico de PPS 14 incrementan en los ratones inmunizados con grupos fraccionados de PCMV, composición PCMV sin fraccionar, o Prevnar® en comparación con los sueros de ratones inmunizados solo con PPS 14. Los ratones inmunizados solo con el antígeno de PPS 14 muestra que las concentraciones de IgG específico de PPS 14 se reducen con el tiempo en ambos niveles de dosis, 0.5 ig y 2 µg de PPS 14. Esto sugiere que las respuestas de "memoria inmunológica" fueron provocadas por la inocula del PCMV y de Prevnar®.

Estos datos indican que la presentación del antígeno capsular como parte de una vacuna matriz, no sólo es más eficiente que la inmunización solo con antígeno, sino que puede ser más eficiente que las vacunas conjugadas convencionales. Esto tiene implicaciones importantes para los procesos de formulación de vacunas, indicando que la reglamentación juiciosa del tamaño de partículas de matriz puede simplificar dramáticamente el diseño de la vacuna y el proceso de producción, y puede reducir de manera notable la cantidad de antígeno requerido para provocar una respuesta inmune protectora.

Es evidente que el permitir la reacción reticulante de la proteína transportadora en presencia del antígeno deseado para continuar produciendo partículas de matriz más grandes (ej . , > 100 nm de diámetro) aprisiona el antígeno de manera muy eficiente. También, la producción de tamaños de partículas transportadoras reticuladas más grandes (o la selección de una fracción de alto peso molecular de la reacción) sustancialmente mejora la inmunogenicidad de la composición de PCMV, aún cuando las partículas contienen muy pocas cantidades de antígeno. Los datos muestran que el fraccionamiento de tamaño de la composición de PCMV y los animales inmunizadores con las partículas de tamaño más grande pueden inducir respuestas de IgG específicas de anti-PS mejoradas que son comparables con las respuestas inducidas por las vacunas conjugadas convencionales. Más aún, estos datos indican que las respuestas inmunes de memoria provocadas por las vacunas conjugadas convencionales (e . , Prevnar®) , también pueden obtenerse mediante inmunización con un PCMV.

Estos datos de tamaños de partículas de PCMV, de Prevnar®, controlados, indican que la optimización del tamaño de partículas de PCMV y la optimización de la cantidad de antígeno de polisacárido aprisionado y presentado por la composición de PCMV puede llevar a mayor mejora de la respuesta específica de antígeno anti-PS para eclipsar potencialmente la respuesta inmune provocada por dichas vacunas convencionales como Prevnar®. El incrementar la proporción del antígeno transportado a proteína transportadora en la composición de vacuna final, puede lograrse al ajustar la proporción entre antígeno de polisacárido y proteína transportadora antes de llevar a cabo la reacción de vinculación de proteína transportadora. El fraccionamiento de los polisacáridos por sí solos antes de la incorporación en las matrices de PCMV, también puede incrementar las respuestas inmunes obtenidas.

Ejemplo 4 Una composición de vacuna de matriz usando polisacárido Vi Citrobacter freundii y proteína transportadora de DNI para producir un Vi: DNI PCMV. El polisacárido (Citrobacter freundii Vi) y la proteína transportadora (DNI) se mezclaron a una proporción de peso de 1:1 y estuvieron presentes a 7.5 mg/ml para cada componente. La reacción de reticulación fue llevada a cabo a un volumen de 1.5 mi, siendo añadido glutaraldehído como un agente de reticulación a una concentración final de 0.25%, y la mezcla de reacción incubada a 4°C durante 23 horas. En este punto, cianoborohidruro de sodio, que reduce las bases de Schiff, se agregó a una concentración de 20 mg/ml y la mezcla de reacción incubada una hora adicional.

Una vacuna conjugada fue preparada como un control comparativo usando 0.9 mg/ml de antígeno de Vi conjugado con albúmina de suero bovino.

Una porción de la mezcla de reacción de PC V de Vi:DNI fue aplicada a una columna de fraccionamiento de tamaño de gel de agarosa reticulada de 100 mi Sepharose® CL-2B (Sigma-Aldrich) para separar la composición de vacuna de matriz de Vi:DNI con base en el tamaño de las partículas. El fraccionamiento fue llevado a cabo usando 10 mM de tampón de fosfato que contiene 150 mM de NaCl. Cuatro grupos de fracciones que hicieron elución de PCMV de Vi:DNI fueron aislados para mayor evaluación. (Ver, Figura 16) .

Las fracciones individuales (Figura 16) se evaluaron mediante ELISA de captura de DNI (Figura 17) y los resultados determinaron cómo las fracciones eran eventualmente agrupadas para hacer las composiciones de inmunización. El Vi fue detectado en todas las formulaciones fraccionadas de PCMV (Figura 17A, fracciones 13-25) y en el PCMV total, sin fraccionar, después de la captura por anticuerpos de anti-DNI inmovilizados. El Vi fue detectado de manera más fuerte en la Fracción 13, correspondiente a las partículas de mayor tamaño que hicieron elución de la columna. La detección del Vi fue esencialmente equivalente para las fracciones remanentes que fueron probadas, con la tendencia general siendo la de que las primeras fracciones que contenían partículas de DNI reticulado de mayor tamaño eran ligeramente más detectables, presentando antígeno de Vi de superficie, más que las últimas fracciones que contenían partículas de DNI más pequeñas. Esto, presumiblemente, se debe a que las partículas de menor tamaño aprisionan menos Vi. El PS de Vi también se detectó en la mezcla de reacción de PCMV total de la que derivaron estas f acciones. En contraste, cuando el DNI reticulado con PS de Vi añadido exógenamente era incubado con el anticuerpo de captura anti-DNI, no hubo detección alguna por parte del anticuerpo específico de Vi debido a que la falta de aprisionamiento de Vi. Las fracciones individuales de Vi:DNI, el Vi: DNI sin fraccionar, y el control de DNI reticulado fueron todos unidos por el anticuerpo de captura anti-DNI a un grado similar (Figura 17B) . Por lo tanto, la prueba de ELISA de captura de DNI demostró que hubo un nivel detectable de aprisionamiento, Vi localizado en la superficie en la matriz proteínica de Vi: DNI.

Las fracciones que mostraban PS de Vi aprisionado, presente, se agruparon y usaron para preparar composiciones inoculas (Figura 17, barras sombreadas). La integridad reticulante fue analizada mediante SDS-PAGE y tinción de azul Coomassie (Figura 18). Las fracciones agrupadas y la mezcla de reacción de PCMV total contenían especies de DNI reticulado de peso molecular muy alto que no migraban visiblemente hacia el gel de apilamiento, sin que, al contrario, permanecían en los pocilios de carga. El DNI no reticulado formó una banda de menor peso molecular (flecha inferior) . La cantidad de DNI presente en las fracciones se determinó mediante absorbencia de UV28o- La proporción de transportador/antígeno fue estimada con base en las proporciones de PCMVs de PS 14: DNI y la cantidad de antígeno de Vi presente en una dosis de 10 ig basada en el DNI fue calculada como se establece en la Tabla 11: Las fracciones agrupadas y los controles relacionados fueron preparados para su uso en experimentos de inmunización: Composiciones Inoculas: 1. Grupo 1 (10 ug de DNI) + alumbre 2. Grupo 2 (10 ug de DNI) + alumbre 3. Grupo 3 (10 ug de DNI) + alumbre 4. Grupo 4 (10 ug de DNI) + alumbre 5. 10 ug de DNI / PCMV total + alumbre 6. 5 ug de PS de Vi-BSA conjugado + alumbre 2 ug de antígeno de Vi derivado de S. Typhi solo (control) 7. 2 u de antigeno de Vi derivado de Citrobacter freundii solo (control) Las composiciones se inyectaron intraperitonealmente en los ratones usando el régimen de dosificación estándar (tres inyecciones en intervalos de dos veces por semana) mostrado en la Tabla 12. El control comparativo de vacuna conjugada de Vi-BSA contenía 0.9 mg/ml de Vi covalentemente unido a BSA. Un grupo de ratones sin tratamiento, sin vacunar, fueron también incluidos como control .

Las respuestas de IgG de suero específico anti Vi-PS se ensayaron mediante ELISA de Vi y se trazaron como concentraciones individuales y GMT de punto final. {Ver, Figura 19) .

LA Figura 19 muestra la cinética de la respuesta de IgG específica anti-Vi siguiendo la inmunización con 10 g de DNI para los grupos de PCMV fraccionados o el PCMV total. Los sueros de ratones inmunizados con las partículas de DNI reticuladas más grandes (Grupos 1-3) desarrollaron respuestas de IgG específicas de Vi mayores que los sueros de ratones inmunizados con 10 ]ig de Vi solamente. En comparación, las respuestas de anticuerpos específicas de Vi generadas con la inmunización con el Grupo 4 (partículas de DNI más pequeñas) o el PCMV total son similares a cuando los ratones se inmunizaron con Vi solamente. Las concentraciones de IgG específico de Vi incrementaron con el tiempo en los sueros de ratones inmunizados con los Grupos 1-3 en relación con los sueros de ratones inmunizados con 10 ig de Vi solo.

Cuando el régimen de inmunización fue completado, la respuesta de IgG específica de Vi en el día 41 (Figura 20) , ej . , 2 semanas después de la última inmunización, se calculó como concentraciones geométricas medias recíprocas (GMTs), establecidas en la siguiente tabla: Los ratones inmunizados con PCMV del Grupo 1, 2 ó 3, desarrollaron GMT de IgG específico anti-Vi de 2 a 3 veces más alto que los ratones inmunizados solamente con Vi. En contraste, la inmunización con el conjugado de Vi-BSA indujo GMT de IgG específico de Vi 10 veces mayor en comparación con la inmunización únicamente con Vi. El conjugado de Vi y el PCMV de Vi, cada uno indujeron niveles de anticuerpos de anti-Vi que eran mayores que el Vi solo. El conjugado de Vi-BSA (5 pg de Vi) provocó concentraciones de anticuerpos de anti-Vi mayores que las formulaciones de PCMV que contienen menos antígeno de Vi (Ver Figura 16 y Tabla 11) . Con un polisacárido menos inmunogénico (PS) tal como un Vi, en comparación con el PPS 14 de S. pneumoniae, factores tales como tamaño de partícula y dosificación pueden afectar la inmunogenicidad comparada con la inmunización del PS de Vi por sí solo. Se calculó, con base en las cantidades de proteína similar a PS obtenidas de la determinación del fraccionamiento del PCMV de PPS-14 DNI debido a que los perfiles de elución eran similares), que la cantidad de PS de Vi en el Grupo 1 de PCMV fraccionado de tamaño (-0.66 ig) fue de 13%, el Grupo 2 (~1 \ig) fue de 20% y el Grupo 3 (~ 5 \ig) fue del 40% de la cantidad de dosis de Vi en el conjugado de Vi-BSA. Por lo tanto, aunque el conjugado de Vi provocó aproximadamente de 4-6 veces la concentración recíproca de anticuerpo de anti-Vi (2263) de grupos de PCMV de Vi:DNI, si la respuesta es normalizada para la dosis, entonces el Grupo 1, el Grupo 2 y el Grupo 3 de PCMV de Vi: DNI provocan concentraciones de anticuerpos de anti-Vi recíprocas de 3030, 2625 y 1515, respectivamente. Por lo tanto, las composiciones de PCMV de Vi: DNI de tamaño fraccionado eran comparables con algo un poco mejor que un conjugado de proteína Vi.

También, se hace notar que la inmunización de este ejemplo comparó composiciones de vacuna basadas en diferentes proteínas transportadoras: BSA vs . una matriz de DNI. La elección de la proteína transportadora podría tener un efecto sobre la inmunopotencia de las formulaciones . Además, no se determinó si el Vi usado para preparar el conjugado y las PCMVs eran los mismos, y la antigenicidad e inmunogenicidad de los antígenos de Vi de diferentes fuentes, puede ser distintivamente diferente.

Colectivamente, para el antigeno de Vi, los datos de los Ejemplos 2 y 4 indican: (i) que la PCMV formulada con mayores concentraciones de reactivos en donde los productos son cambiados a especies de mayor peso molecular, aprisiona al polisacárido de manera más eficiente; (ii) que el continuar con la reacción para generar partículas de mayor tamaño (> 120 nm de diámetro) mejora la inmunogenicidad, y (iii) que el fraccionamiento de tamaño de la reacción de PCMV y la inmunización de animales con las partículas de mayor tamaño induce concentraciones comparables con un conjugado de Vi/proteína y mayores concentraciones que el Vi solo.

Ejemplo 5 Los ratones de los grupos de inmunización del Ejemplo 1 se mantuvieron para un experimento de memoria inmunológica . Los sueros adicionales fueron recolectados en puntos de tiempo posteriores durante siete meses para monitorear la cinética de la respuesta inmune anti-PPS 14. Finalmente, los ratones fueron acelerados con PCMV homologa o formulaciones de PPS 14 y los sueros fueron ensayados para el desarrollo de una respuesta inmune de memoria ayudante con base en células T (dependiente Th) .

Aproximadamente 7 meses después del régimen de inmunización de tres dosis del Ejemplo 1, los ratones fueron acelerados con las composiciones indicadas en la tabla siguiente: l las respuestas inmunes de ensayo de IGG anti-PPS 14. El Día 239 (4 días después de la aceleración) el punto de tiempo fue elegido debido a que, si las respuestas inmunes de memoria fueran provocadas , entonces un incremento correspondientes los anticuerpos específicos de IgG serían evidentes. El Día 260 (3 semanas después de la aceleración) el punto de tiempo fue elegido porque, si las respuestas de memoria fueran provocadas, entonces las concentraciones de anticuerpos de IgG continuarían en incremento. En general, el IgG específico de PPS-14 permaneció relativamente alto siguiendo el régimen de inmunización de PCMV de PPS 14:DNI inicial, como se indica por el GMT alto de pre-aceleración que varía de 152,691 a 334,531 (Tabla 14, columna 3). Un incremento en los anticuerpos de IgG específicos de PPS 14 se observó cuatro días después de la aceleración sólo en los animales inmunizados con PCMV en comparación con los ratones inmunizados solo con antígeno de PPS 14 (Tabla 14, columna 3 vs . columna 4) . Consistente con estos datos, la respuesta de aceleración se incrementó de manera significativa en el punto de tiempo de 3 semanas en los ratones inmunizados con PCMV (GMT de 816,890 u 863,756), en donde los ratones inmunizados sólo con PS desarrollaron ningún incremento, o mínimo, en el IgG específico de an i-PPS 14 (Tabla 14, columna 5) .

Para explorara aún más si el PPS 14 formulado con PCMV provoca una respuesta de memoria Th, la proporción de igG-a-lgM fue ensayada y determinada (ver, Figura 21) . Las vacunas de polisacáridos solos típicamente provocan igM y niveles bajos de IgG, en donde las vacunas conjugadas de polisacáridos-proteínas provocan niveles sustancialmente más altos de IgG. En general, el igM es más "no-específico" que el IgG en su afinidad de unión de antígeno. Por lo tanto, una proporción menor de IgG-a-IgM en animales no tratados se observó, indicando la presencia de niveles de fondo de anticuerpo no específico en este grupo. La inmunización con PPS 14 solo, indujo más de una respuesta inmune específica de anti-PPS 14 en comparación con los animales sin tratamiento, generando IgG más específico que el IgM (IgG: IgM, -1:1). En agudo contraste, los ratones inmunizados con las formulaciones del Grupo 1 y del Grupo 2 de PCMV de PPS 14: DNI provocaron IgG relevantemente más alto en comparación con el IgM, alrededor de 10-100 veces de cambio en proporción, comparado con los ratones inmunizados solamente con PS .

De estos resultados, notamos que los animales inmunizados con PCMV de PPS 14: DNI, desarrollaron un incremento en el IgG específico de PPS 14 después de que se les diera una inmunización aceleradora alrededor de 7 meses después de un régimen inicial de inmunización de 3 dosis. Los sueros recolectados 4 días y 3 semanas después de esta aceleración indican fuertemente el desarrollo de una respuesta inmune dependiente de Th o de "memoria" . Más aún, la proporción IgG: IgM de los ratones inmunizados con formulaciones de PCMV de PPS 14: DNI (Figura 21) soportan aún más la observación de una respuesta de memoria provocada .

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende (1) un antígeno de interés y (2) una proteína transportadora, en donde dicha proteína transportadora está reticulada para formar una matriz proteínica, dicho antígeno de interés está aprisionado por dicha matriz proteínica, y dicha composición . está comprendida de partículas de matriz proteínica que tienen un tamaño medio de partículas mayor a 100 nm de diámetro.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende partículas de matriz proteínica que tienen un diámetro de tamaño de partícula de más de 120 nm, de más de medio 170 nm, de más de 200 nm, de más de 500 nm, de más de 1000 nm, de más de 2000 nm, o mayor .

3. La composición de la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende partículas de matriz proteínica que tienen un diámetro medio de tamaño de partículas de 100 nm a 2000 nm.

4. La composición de la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende partículas de matriz proteínica que tienen un rango de tamaño de partículas de 100 nm a 2000 nm.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, en donde la proporción molar del antígeno a la proteína transportadora está entre 1 a 10 y 10 a 1.

6. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho antígeno de interés comprende dos o más antígenos .

7. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho antígeno de interés es un polisacárido .

8. La composición de la reivindicación 7, en donde el polisacárido es seleccionado del grupo consistente de un polisacárido de Streptococcus pneumoniae, polisacárido de Francisella tularensis , polisacárido de Bacillus anthracis , polisacárido de Haemophilus influenzae, polisacárido de Salmonella typhi , polisacárido de Citrojbacter freundii , polisacárido de especies de Salmonella , polisacárido de Shigella, o polisacárido de Neisseria meningitidis .

9. La composición de la reivindicación 8, en donde el polisacárido de Streptococcus pneumoniae se selecciona del grupo consistente del tipo capsular 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44, ó 46.

10. La composición de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, en donde la proteína transportadora se selecciona del grupo consistente de toxoide de difteria, CRM197, toxoide tetánico, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa o un mutante de la misma, subunidad de toxina B de cólera, fragmento C de toxina del tétanos, flagelina bacteriana, neumolisina, una proteína de membrana externa de Neisseria menningitidis, proteína Hcpl de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli, toxina tipo shiga, proteína LTB humana, listeriolisina 0, un extracto proteínico de las células bacterianas totales, el mutante inhibidor negativo dominante (DNI) del antígeno protector de Bacillus anthracis, o beta-galactosidasa de Escherichia coli.

11. Un método para hacer una composición inmunogénica que comprende (i) la mezcla de un antígeno de interés con una proteína transportadora para formar una mezcla y (ii) reticular dicha proteína transportadora para formar uña matriz proteínica transportadora que aprisione dicho antígeno de interés, en donde no más de un 50% de dicho antígeno de interés está reticulado con dicha proteína transportadora en dicha composición, y (iii) eliminar de la composición resultante las partículas de matriz proteínica que tengan un diámetro medio de tamaño de partículas de menos de 100 nm.

12. El método de la reivindicación 11, en donde, en el paso (iii) las partículas de matriz proteínica que tienen un diámetro de tamaño de partículas mayor a 120 nm, mayor a 170 nm, mayor a 200 nm, mayor a 500 nm, mayor a 1000 nm, o mayor a 2000 nm, son seleccionadas.

13. El método de la reivindicación 12, en donde las partículas de matriz proteínica seleccionadas tienen un diámetro medio de tamaño de partículas en el rango de desde 100 nm a 2000 nm.

14. El método de la reivindicación 12, en donde las partículas de matriz proteínica seleccionadas tienen un diámetro medio de tamaño de partículas en el rango de desde 200 nm a 1000 nm.

15. El método de la reivindicación 12, en donde las partículas de matriz proteínica seleccionadas tienen un diámetro medio de tamaño de partículas en el rango de desde 120 nm a 200 nm.

16. Un método para hacer una composición de vacuna de matriz proteínica que comprende (i) la mezcla de un antígeno de interés con una proteína transportadora y (ii) la iniciación de una reacción reticulante con un agente reticulante que retícula los grupos funcionales en dicha proteína transportadora, y (iii) la selección de dicha mezcla de reacción de las partículas de matriz proteínica que tengan un diámetro medio de tamaño de partícula de más de 100 nm.

17. El método de la reivindicación 16, en donde las partículas de matriz proteínica seleccionadas tienen un diámetro medio de tamaño de partículas de más de 120 nm, de más de 170 nm, de más de 200 nm, de más de 500 nm, de más de 1000 nm o de más de 2000 nm.

18. El método de la reivindicación 16, en donde las partículas de matriz proteínica seleccionadas tienen un diámetro medio de tamaño de partículas en el rango de desde 100 nm a 2000 nm.

19. El método de la reivindicación 17, en donde las partículas de matriz proteínica seleccionadas tienen un diámetro medio de tamaño de partículas en el rango de desde 200 nm a 1000 nm.

20. Un método para vacunar un sujeto contra un agente infeccioso, dicho método comprendiendo la administración de una composición de acuerdo con la reivindicación 1, a un sujeto en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmune.